ESTUDIO TOXICOLOGICO

NUTRISIM
Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo -
Envejecimiento, Enfermedades
Neurodegenerativas.
CIBO-IMSS. Guadalajara, Mxico
Dr. en Ciencias. Genaro G. Ortiz.
NUTRISIM
Arginina
Lisina
Colina
Cloruro de Amonio
Cloruro de Calcio
Cloruro de Magnesio
ESTUDIO TOXICOLOGICO
NUTRISIM
100 ratas (250 g. de peso) de la cepa
Wistar
Grupos de 10 ratas por dosis administrada
La administracin ser por va
intraperitoneal
ESTUDIO TOXICOLOGICO
NUTRISIM
Curvas de Kaplan Meyer
Anlisis histopatolgico y Macroscpico
post- morten
Hgado
Rin
Pulmn
Anlisis Bioqumico

ESTUDIO TOXICOLOGICO
NUTRISIM
0.1 ml
0.2 ml
0.3 ml
0.4 ml
0.5 ml
1 ml
2 ml
3 ml
4 ml
5 ml
Dosis Administrada
Resultados
Por Observacin

No se present ninguna muerte.
Ninguna alteracin en su patrn de conducta

Resultados
Hematologa y Bioqumica

En todos los animales estudiados no se
apreci ninguna modificacin de los valores
normales tanto de la citologa hemtica
como de la qumica sangunea.
Resultados
Anlisis Estructural
Los rganos estudiados: hgado, pulmn y
rin; no mostraron ninguna modificacin
en el patrn citoestructural como
citoarquitectnico

Resultados
Anlisis Morfolgico
No se apreci ninguna alteracin en la
laparotoma y toracotoma; no encontramos
lquidos en cavidades ni datos de
degeneracin, congestin o edema en
ninguno de los grupos estudiados.
Estudio Estructural y
Bioqumico del posible efecto
protector del Nutri-Sim en
cerebros de Gerbos (Mongolian
gerbils - Meriones unguiculatus)
sometidos a isquemia-
reperfusin.
Dr. Rolando Romero Dvalos
Lic. Luis Alfredo Romero Tirado.
BIO-SIM S. A. de C. V., Mxico

Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo -
Envejecimiento, Enfermedades
Neurodegenerativas.
CIBO-IMSS. Guadalajara, Mxico
Coordinador Dr. Genaro G. Ortiz.
La Enfermedad Isqumica
Cerebrovascular ( EVC )
Patologa que surge como resultado de
la alteracin de los vasos sanguneos
que suministran su flujo al cerebro.
3 causa de muerte en el mundo.
FACTORES
Hipertensin
Cardiopatas
Tabaquismo
Diabetes mellitus
Consumo de alcohol
La vida sedentaria
La obesidad
Anticonceptivos orales.
ISQUEMIA - REPERFUSION
La isquemia es la ausencia o disminucin del aporte
sanguneo por un determinado tiempo, que lleva a un
dao celular, en ocasiones no muy especfico y
delimitado. Por otro lado, la reperfusin, es el perodo
que sigue a la isquemia, y que se caracteriza por una
reoxigenacin cerebral acompaada del restablecimiento
del aporte sanguneo. As pues, durante la isquemia se
genera un dao al producirse radicales libres y en la
reperfusin el dao puede ser mayor cuando se
distribuyen estos radicales libres a travs de la sangre.
HIPOTESIS
El Nutri-Sim proteger del dao oxidativo
al cerebro de gerbos despus de la isquemia
reperfusin.
HIPOTESIS NULA
El Nutri-Sim no proteger al cerebro
del dao oxidativo generado al realizar
isquemia-reperfusin en gerbos.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto antioxidante del
Nutri-Sim en cerebros de gerbos
(Mongolian gerbils: Meriones
unguiculatus) despues de realizar
isquemia-reperfusin.
Objetivos particulares
Demostrar que existe dao neuronal (agudo
y crnico) al realizar el modelo de
isquemia-reperfusin en gerbos.
Demostrar que existe estrs oxidativo en el
modelo de isquemia-reperfusin en gerbos.
Estudiar el papel Nutri-Sim como
protector, en los procesos de isquemia-
reperfusin cerebral.
VARIABLES
Independientes
Nutri-Sim
Dependientes
Peroxidacin de Lpidos de Membrana
Oxido Ntrico (Nitratos y Nitritos)
Glutatin Peroxidasa
Estructura celular
MATERIAL
120 animales de la especie Meriones
unguiculatus (Gerbos)
Anestsicos
Droperidol
Ketamina


DETERMINACIONES
Concentracin de protenas totales:
Mtodo Bradford.
Peroxidacin de lpidos de membrana, 4-
Hidroxialquenos (HA) y malonaldehdos
(MDA)
Oxido Ntrico, mtodo de Griess
Glutatin Peroxidasa

GRUPOS A ESTUDIAR
1. Testigo
2. Testigo Manipulado
3. Isquemia-Reperfusin
4. Isquemia Reperfusin mas Nutri-Sim
5. Nutri-Sim
PROCEDIMIENTO
Grupos 3 y 4 se sometern a una isquemia de
5 minutos
A los 90, 120 minutos y 7 das de
reperfusin se sacrificarn con una N de 8
animales por cada tiempo.
Rpidamente se extraer el cerebro y sangre
del animal para realizar los estudios
experimentales
TECNICAS
Anestesia con droperidol 2.5 mg/Kg S.C
5 minutos despus se inyecta ketamina
50mg/Kg I.M.
Tricotoma de cuello.
Incisin horizontal sobre la base del cuello, se
diseca hasta llegar a cartidas de ambos
lados, se separa con una seda (se les colocan
pinzas para la isquemia y se retiran a los 5
minutos).
ESTUDIO ESTRUCTURAL
Fijaremos por inmersin con paraformaldehido
al 4 % amortiguado en solucin de Fosfatos
0.1M
Se deshidratarn en alcoholes en forma
ascendente y se incluirn en paraplas-plus se
cortarn a 6 micras y se teirn con
hematoxilina y eosina.
Se analizarn en un foto microscopio Zeiss
Axioscop del que se tomarn fotografas.
ESTUDIOS BIOQUIMICOS
Se realizarn en homogenizados de cerebro (area hipocampal).
Se utilizarn los kits comerciales de la casa Oxford Biomedical Research
para medir peroxidacin lipdica, Glutatin peroxidasa.
Para la determinacin de nitritos y nitratos se utilizar el reactivo de
Griess.
Se toma tejido homogenizado descongelado 1:10, se centrifuga 14,000
rpm por 10 minutos a 4 C, se guardan alcuotas a -20C para calcular los
niveles de nitritos y nitratos (utilizaremos la enzima de la casa Sigma).
Se incuban en placas a temperatura ambiente por 20 minutos. A 10 ml de
muestra se les agrega 10 ml de Griess (sulfanilamida 1%, 5% de cido
fosfrico y NEDA 0.1% en 1:1).
Se lee a una absorbancia de 550nm. La concentracin de nitritos y
nitratos ( 0-15 nmol/ml) se calcula por comparacin con las absorbancias
de las disoluciones estndar, conocidas de nitrato y nitrito sdico en agua.
RESULTADOS
PEROXIDACIN DE LPIDOS
XIDO NTRICO
GLUTATIN PEROXIDASA
MORFOLOGA
ANLISIS MACROSCPICO
ANLISIS MICROSCPICO

PEROXIDACIN DE LPIDOS
LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 90 MIN
0
5
10
15
20
25
30
35
40
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
PEROXIDACIN DE LPIDOS
LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 120 MIN
0
10
20
30
40
50
60
70
80
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
PEROXIDACIN DE LPIDOS
LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 7 DIAS
0
2
4
6
8
10
12
14
16
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
XIDO NTRICO
OXIDO NITRICO, 90 MIN (Nitratos y Nitritos)
0
50
100
150
200
250
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
XIDO NTRICO
OXIDO NITRICO, 120 MIN (Nitratos y Nitritos)
0
50
100
150
200
250
300
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
XIDO NTRICO
OXIDO NITRICO, 7 DIAS (Nitratos y Nitritos)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
GLUTATIN PEROXIDASA
GLUTATION PEROXIDASA, 90 MIN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparicin NADPH / Min /mg/Pr
GLUTATIN PEROXIDASA
GLUTATION PEROXIDASA, 120 MIN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparicin NADPH / Min /mg/Pr
GLUTATIN PEROXIDASA
GLUTATION PEROXIDASA, 7 DIAS
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparicin NADPH / Min /mg/Pr
MORFOLOGA
Clulas Piramidales
0
5
10
15
20
25
30
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA
5Perfusion 90
ISQUEMIA
5Perfusion
120
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 90
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion
120
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
MORFOLOGA
Clulas Hipercromticas
0
5
10
15
20
25
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA
5Perfusion 90
ISQUEMIA
5Perfusion
120
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 90
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion
120
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
MORFOLOGA
Clulas Gliales
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA
5Perfusion 90
ISQUEMIA
5Perfusion
120
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 90
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion
120
NUTRI-SIM
ISQUEMIA
5Perfusion 7
das
TESTIGO
ISQUEMIA 90
ISQUEMIA 120
ISQUEMIA 7 DIAS
ISQUEMIA + NS 7 DIAS
EFECTO PROTECTOR DE
NUTRI-SIM