Informe Trabajo Prctico 3

Tcnicas de Biologa Celular y

Molecular

Docente: Valeria Sabaj
Integrantes:
Felipe Corts Ch.
Pablo Cotera A.

Grupo 2A
Septiembre 2014

Introduccin
Los niveles de estudio de la Biologa actual difieren ampliamente de las primeras
observaciones microscpicas celulares realizadas por Van Leeuwenhoek en 1660. En el
presente ,el anlisis biolgico se realiza a nivel molecular; estableciendo relaciones
entre los distintos compuestos que conforman la clula, siendo de principal importancia
la expresin de protenas, RNA y DNA. Para poder mesurar estas cantidades
moleculares, se han desarrollado tcnicas que permiten cuantificar y amplificar (en el
caso del DNA) estos compuestos. En esta experiencia se utilizarn dos tcnicas: La
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), que permite amplificar segmentos de
DNA y la Electroforesis en geles de Agarosa y Poliacrilamida , que permite separar por
masa y/o carga tanto DNA como Protenas.
Objetivos
-Objetivo General: Comprender, Describir y Aplicar los principios de las tcnicas de
PCR y Electroforesis
-Objetivos Especficos:
-Experimento 1:
- Determinar que protena fue cargada en cada carril, a partir del anlisis
del Gel de Electroforesis.
- Realizar anlisis matemtico a partir de la informacin obtenida,
obteniendo conclusiones vlidas.
- Calcular el Peso Molecular de las impurezas presente en la muestra.
-Experimento 2:
- Determinar la expresin de mRNA de Utrofina y GAPDH en C
2
C
12
C
57
- mdx
-Realizar anlisis densitomtrico de los Geles de Agarosa obtenidos.
-Realizar anlisis matemtico a partir de la informacin obtenida,
obteniendo conclusiones vlidas.





I.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes

1. Describa en que se basa este mtodo, algunas de sus aplicaciones y limitaciones

La electroforesis es una tcnica para separar molculas usando como criterio su
movilidad en un gel, comnmente de agarosa o de poliacrilamida, como en este caso. Se
hace circular una corriente elctrica a travs del gel, y esta a su vez crear un campo
magntico. Este campo magntico ejercer la fuerza que mover a las molculas hacia
el nodo en este caso, al estar las protenas cargadas negativamente. As vemos como
molculas con cargas mayores se movilizarn ms rpido.
Por otro lado, el medio por el que se movilizan las protenas, el gel, tendr una
estructura reticular tridimensional, as oponiendo resistencia al paso de las molculas,
ms an a aquellas ms grandes, con un mayor PM. La forma de las molculas tambin
influir en la resistencia que oponga el gel a su paso.
As surge la primera limitacin de ste mtodo: Si el movimiento de las protenas est
condicionado por una serie de factores, no puedo conocer ninguno de los valores
exactos, si no ms bien una ponderacin de ellos. Para sobrellevar esta limitacin, las
protenas se someten a condiciones desnaturantes. Estas consisten en tratamiento con
SDS, un detergente, y agentes reductores de grupos sulfhidrilos, como el -
mercaptoetanol. Estos tratamientos modificaran la estructura terciaria de la protena,
confirindole una forma filamentosa. Aniones del SDS se unirn a las protenas
dndoles fuertes cargas negativas, convirtiendo sus cargas propias en despreciables. De
esta manera se estandarizan las variables de carga y forma, y la velocidad de las
protenas a travs del gel ser solo dependiente de sus respectivos PM.
Ahora podemos conocer el PM de cualquier protena comparando su migracin relativa
con aquella de protenas patrn, de PM previamente conocido. Por esto la electroforesis
se usa en una amplia gama de ocasiones, por ejemplo para comparar muestras de ADN
en pruebas forenses o de paternidad y para conocer experimentalmente el PM de una
protena aislada o presente en una mezcla.









2. Confeccione una tabla de valores consignando los pesos moleculares de las
protenas patrones, sus respectivos logaritmos y las migraciones relativas de ellas.


Tabla 1. Protenas patrn, sus PM, Log(PM) y migracin relativa en el gel.
Protena PM (kDa) Log(PM) Migracin Rel.
Lycozyme 17,6 1.25 1
Soybean trypsin inhibitor 26,8 1.43 0.827
Carbonic anhydrase 34,0 1.53 0.712
Ovalbumin 47,8 1.68 0.5
Bovine cerum albumina 72,9 1.86 0.288
Phosphorylace B 101,4 2.01 0.231


3. En un grfico del log(PM) de las protenas patrones v/s la migracin relativa de ellas,
dibuje la curva de calibracin.

Grfico 1. Log (PM) Protenas Patrn v/s su migracin relativa



y = -1.0801x + 2.35
R = 0.9841
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
M
i
g
r
a
c
i

n

R
e
l
.

(
m
m
)

Log(PM)
Migracin Rel.
Linear (Migracin Rel.)
4. Indique qu tubo contena ovoalbmina purificada, ovoalbmina impura y cul es el
extracto de hgado.

Cmo ya sabamos, el tubo N1 contena una serie de protenas patrn, cuyos PM
conocamos de antemano. Comparando las dems muestras con sta, podremos
dilucidar qu contena cada tubo.

El tubo N2 presenta una sola banda, al nivel de la ovoalbmina en las protenas patrn,
por lo tanto este tubo contena ovoalbmina pura.

El tubo N3 presenta una banda a este mismo nivel, adems de otra con una menor
migracin relativa. As sabemos que es ovoalbmina y algo ms, por lo que ser la
ovoalbmina con impureza.

Finalmente, el tubo N4 presente una gran cantidad de bandas, lo que nos dice que era
una mezcla de muchas protenas y otros compuestos, lo que coincide con el extracto de
hgado.


















5. Calcule el PM de la impureza presente en la muestra problema.

La migracin relativa de la impureza es 17/52 = 0.327
Reemplazando en la frmula de la curva de calibracin, tenemos:
0.327 = -1.0801 x Log(PM) + 2.35
Reordenamos:
-1.081 Log(PM) = -2.023
Despejamos:
Log (PM) = 1.87


Imgen 1. Gel de Policramida con Protenas
PM=74.13 kDa

II. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y electroforesis en gel
de Agarosa.
1.Describa en que se basa este mtodo
El propsito final de esta experiencia es realizar un anlisis semicuantitativo de la
cantidad de mRNA para Utrofina en distintos tipos celulares. Para cumplir el objetivo
propuesto se utilizaron dos tcnicas de la Biologa Celular : la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR) y la Electroforesis.
La reaccin en Cadena de la Polimerasa es una revolucionaria tcnica de la Biologa
Celular y Molecular que tiene como fin la amplificacin in vitro de una regin
especfica del DNA.
El fundamento de esta tcnica se basa en la utilizacin de la enzima DNA polimerasa ,
para obtener mltiples copias del DNA original. En esta experiencia se utiliz la enzima
Taq DNA pol. extrada de la bacteria Thermis Aquaticus, que tiene la particularidad
de resistir altas temperaturas sin denaturarse y ser apta para la sntesis a partir de
Primers.
Una vez que se tiene la cadena de DNA original denaturada ( separada en sus 2 hebras),
es necesaria la presencia de este Oligonucletido Partidor (primer) para que se una al
primer nucletido de la seccin del DNA que se desea replicar. Los partidores delimitan
la seccin de DNA a replicar, caracterstica que le entrega la especificidad a esta
tcnica (en esta experiencia se utilizan partidores para Utrofina y GAPDH ). La unin
del Partidor a la cadena permite que la DNA pol comience a sintetizar, dado que esta
enzima solo puede polimerizar a partir de un extremo OH-3` libre.
Un segundo elemento necesario es la presencia de desoxiribonucleotidos-trifosfato
(dNTP) , nucletidos necesarios para la sntesis de la nueva hebra. Se aaden a la
reaccin tambin un Buffer especfico para regular el pH ptimo al cual funciona la
enzima e iones divalentes como el Mg
+2
, aadido como MgCl
2.
La replicacin del DNA se realiza a travs de ciclos regulados por temperatura. Una vez
que se disponen los elementos necesarios para el inicio de la reaccin se dispone la
muestra en un Termociclador. Este dispositivo es programado para alcanzar distintas
temperaturas en distintos intervalos de tiempo, realizando una cantidad de ciclos
determinada. Esta diferencia de Temperatura permite en primer lugar la denaturacin
del DNA y posteriormente alcanzar la temperatura ptima para el funcionamiento de la
DNA pol.
En el caso de que se requiera conocer el nivel de mRNA de alguna secuencia especfica,
se debe disponer de una cantidad inicial de cDNA o DNA complementario. Este tipo
de DNA es obtenido gracias a la accin de la enzima Transcriptasa Reversa que
sintetiza cDNA a partir de un mRNA maduro ( por esta razn se puede hacer una
equivalencia entre cDNA y mRNA en el anlisis de resultados).
Una vez obtenidos los resultados del PCR se debe analizar la cantidad de DNA
obtenido. Para esto se utiliz la Electroforesis.

La Electroforesis es otra tcnica de la Biologa Celular y molecular que tiene como
finalidad permitir la separacin de molculas respecto a dos criterios principales:
tamao y carga elctrica. Se basa en la migracin de muestras en una placa de gel de
composicin especfica para la molcula que se desea estudiar. Esta placa es inducida
con un campo elctrico ,que permite la migracin.
En el caso del DNA, dado que este presenta una carga negativa la separacin se
produce por el tamao de la molcula. El gel utilizado es de Agarosa y presenta una
tincin de Bromuro de Etidio. Este compuesto se intercala en el DNA y permite
observarlo cuando es estimulado con luz UV. Se suele aadir un patrn de peso
molecular para tener una referencia respecto al resultado final de las placas.
Una vez realizada la Electroforesis , las placas de Gel son fotografiadas y sometidas a
un anlisis densitomtrico a travs de un Software especializado ( ImageJ). Esta
aplicacin finalmente permite calcular las reas en donde se concentra la molcula en
estudio. A partir del procesamiento matemtico de los resultados y la informacin
disponible en la literatura cientfica es posible establecer relaciones respecto a la
normalidad de la expresin de ciertos DNA en distintos tipos celulares.

2.Grafique el nivel de mRNA de Utrofina v/s tipo celular.
A partir del anlisis densitomtrico realizado al gel obtenido (Img.2) con el Software
ImageJ , se obtienen los siguientes resultados:


Imagen2. Gel de Agarosa con electroforesis para Utrofina (U) , GAPDH (G) y estndar de
peso molecular para DNA (E). La disposicin de las bandas es U
c2c12
- U
c57
U
mdx
E-
G
c2c12
- G
c57
G
mdx





Tabla 2. rea de Utrofina y GAPH segn tipo celular




Tabla 3. rea de Utrofina y GAPH segn tipo celular , Razn Utrofina /GAPDH y
Porcentaje (%) respecto a C
2
C
12








Tipo celular rea bandas Utrofina (pixeles
2
) rea bandas GAPDH(pixeles
2
)
C
2
C
12
63537,19 55391,84
C
57
94370,33 83253,97
mdx 95103,97 45300,12
Tipo celular rea bandas
Utrofina (pixeles
2
)
rea bandas
GAPDH(pixeles
2
)
Razn
Utrofina/
GAPDH
% con respecto
a clulas C
2
C
12

C
2
C
12
63537,19 55391,84 1,147049638 100%
C
57
94370,33 83253,97 1,133523482 98,82%
mdx 95103,97 45300,12 2,099419825 183,03%
Grfico 2. Porcentaje de expresin de mRNA de Utrofina segn tipo celular( respecto a
clulas C
2
C
12
) . Normalizado respecto a GAPDH.

3.- Realice una comparacin del nivel de mRNA de Utrofina en cada tipo celular
La experiencia se realiz intentando establecer alguna relacin entre la expresin de la
protena Utrofina en distintos tipos celulares. Los tipos celulares utilizados fueron C
2
C
12
(Clulas de mioblastos de ratn normal (Mus Musculus)), C
57
( Clulas de miotubos de
ratn normal) y mdx ( Clulas de miotubos de ratn distrfico). La expresin proteica se
cuantifico a partir de la cantidad de cDNA para Utrofna y GAPDH obtenido despus
del PCR y la Electroforesis ( en Tabla 2).
Segn la informacin encontrada en la literatura, en casos de Distrofia Muscular, el gen
que codifica para la protena Distrofina est mutado , teniendo como consecuencia una
dificultad para la regeneracin tisular y una prdida progresiva de masa muscular. En
estos casos, se ha observado una expresin compensatoria de protenas con funcin
similar a la Distrofina , siendo una de estas la Utrofina.
Para normalizar los resultados se compar con la expresin de mRNA de GAPDH
(Gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa), gen constitutivo implicado en la la
gluclisis. La cantidad de mRNA para este gen debera ser similar entre los distintos
tipos celulares, por tanto permite corregir los posibles errores al disponer la cantidad
inicial de cDNA en el PCR. Adems, se establece como 100% la expresin de Utrofina
en tipo celular control C
2
C
12 .
El procesamiento matemtico de dicha informacin se
encuentra en la Tabla 3.
De acuerdo a la informacin expuesta en el Grfico 2, se observa una sobreexpresin de
mRNA para Utrofina en las clulas mdx (183%), en comparacin con los tipos celulares
de control. Dicha informacin concuerda con el planteamiento terico del resultado.
C2C12 C57 mdx
Tipos Celulares 100% 98.82% 183.03%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
180%
200%
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
%

La expresin de mRNA en C
57
es consistente con el planteamiento terico, dado que es
similar a la expresin obtenida en cepa control C
2
C
12 ,
observando una diferencia de
1,18% entre ambas cepas celulares.
Conclusiones
El resultado final del experimento 1 fue positivo, ya que se cumplieron los objetivos
propuestos de identificar los contenidos de cada muestra y determinar el PM de la
impureza presente en el tubo N3. Sobretodo, fue una manera prctica de aprender como
llevar a cabo una electroforesis correctamente, y cules son los usos que se le dar a este
procedimiento en el futuro. El PM de la impureza coincide con su desplazamiento, ya
que sta migr levemente ms que la Bovine cerum albumina teniendo un PM 0.5 kDa
menor (segn lo calculado). En cuanto a maneras de mejorar este experimento, se
sugiere realizar las mediciones sobre el gel mismo en vez que desde la pantalla del
computador para una mayor exactitud. Tambin hubiera sido bueno hacerlas apenas
estuvieran listos los geles para evitar que se rompiera un carril y se desplazaran las
bandas como ocurri con la muestra N1.
En el caso del segundo experimento, se concluye que los resultados obtenidos estn
dentro de los planteados en el supuesto terico, obteniendo una alta expresin de
Utrofina en clulas de Ratn Distrfico (mdx) en comparacin a los otros tipos
celulares. La consistencia de los resultados entre muestras es clave para obtener un
anlisis correcto. Es necesario disponer de un patrn de trabajo claro y preciso para
evitar errores de procedimiento y anlisis, tanto en la realizacion del PCR como en el
montaje de los carriles de Electroforesis. Un factor importante a controlar es la
concentracin inicial del cDNA que se entrega , dado que a pesar que se normaliza con
otra muestra , puede producir diferencias significativas en el anlisis de los resultados.
Adems, es necesario establecer un patrn de procesamiento densitomtrico ms
acotado, dado que se pueden producir conclusiones errneas a partir de resultados que
en la prctica estn dentro de lo correcto.