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FacultaddeMedicina

TecnologaMdica



EstandarizacindelastcnicasPCRyPCRsscpparael
estudioydeteccindemutacionesenexonesdelgenSHOX
depacientesconbajaestaturaidioptica




Autores:PriscilaGarca
DanielParra
MauricioPoblete




Temuco,30deJuliode2014
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FacultaddeMedicina
TecnologaMdica



EstandarizacindelastcnicasPCRyPCRsscpparael
estudioydeteccindemutacionesenexonesdelgenSHOX
depacientesconbajaestaturaidioptica



Autores:PriscilaGarca
DanielParra
MauricioPoblete

Tutor:Dr.MarcoParedes


Temuco,30deJuliode2014
2

Agradecimientos

Gracias a nuestro tutor Dr. Marco Paredes Honorato, por su gua, su
instruccin, su buena pedagoga y por soportar nuestras falencias y apoyarnos en
todo momento, sin dudas su apoyo total durante nuestro trabajo permiti sacar
adelanteesteproyecto
Gracias al Laboratorio Linba y a todos los que all trabajan (Dani, Pancho,
Huala, Yuri, Ceci, Vane, Nati, Boris, Ester.. en fin a todos) por su ayuda, consejos y
la buena onda. Gracias en especial a Daniela Nuez por sus consejos, ayuda
prestadayalocosquillosaqueera.
Agradecer a nuestros familiares, amistades y seres queridos por todo su
apoyoduranteestetiempo.
Agradecer tambin a la sra. Vivian Cullen por todas las veces que le
pedimos las llaves para entrar al laboratorio y todas las fotocopias e impresiones
que nos brind, y a Juanito de la sala de lavado por su buena onda y por
ayudarnosaubicaranuestroprofesorcuandoestabaenreunionesoenclases.
Gracias especiales a nuestro compaero Oscar Aravena, por ayudarnos y
trabajar con nosotros en este proceso, su apoyo nos permiti ir avanzando de
granmaneraenelproyecto.



3
Resumen: El gen SHOX tiene importancia crucial en el desarrollo y crecimiento
fsico humano, por esto, incluso pequeas mutaciones son capaces de producir
enfermedades y deformaciones. Se ha encontrado una relacin entre las
mutaciones de este gen y personas diagnosticadas con talla baja idioptica, las
cuales no cuentan con un diagnstico real ni con tratamientos adecuados. En este
tiempo el diagnstico molecular se ha vuelto imprescindible y en el anlisis del
gen SHOX poco se ha avanzado en esta materia. Por esto se ha decidido
realizar una estandarizacin en tcnica de PCR y una valoracin en la PCR sscp
para la deteccin de mutaciones, de los exones del gen SHOX en pacientes con
baja estatura idioptica. Para esto, la tcnica de PCR ser optimizada,
analizando variables como la concentracin de primers, temperaturas, reactivos,
concentracin del gel, tiempo de corrido, voltaje, mtodo de tincin. De esta
manera se podr avanzar en el diagnstico certero y tratamientos pertinentes para
personascontallabajaidioptica.









4

ndice

Agradecimientos 3
Resumen... 4
Introduccin 6
Objetivosdelainvestigacin.. 11
Marcoterico. 12
Materialymtodos 16
Resultados. 25
Discusin 35
Conclusiones. 38
Referenciasbibliogrficas 40
Anexos 43

5
Introduccin

El crecimiento es un proceso regulado por diversos factores, tanto


genticos, hormonales y del ambiente. En los factores genticos se ha
identificado el importante papel que ocupa el gen SHOX (short stature homeobox).
El gen SHOX se expresa en el esqueleto en desarrollo especficamente en
fibroblastos de la mdula sea y en los condrocitos proliferantes e hipertrficos
[1], retardando la fusin de los cartlagos de crecimiento. Por esto, mutaciones del
gen SHOX, han sido relacionadas con la baja estatura idioptica, ya que en estos
casos, no habra este retardo de la fusin de los cartlagos, formndose el hueso
antes del tiempo correspondiente y producindose una baja estatura. La baja
estatura idioptica se define como: pacientes con una estatura de menos dos
desviaciones estndar en relacin al promedio estatural de la poblacin edad y
sexo en la que se identifica. Debe haber presentado peso y talla adecuados para
su edad gestacional al nacer, tener proporciones corporales normales, no existir
evidencias de patologas sistmicas crnicas, endocrinolgicas ni de orden
psiquitrico incluidos trastornos emocionales acentuados y debe tener una
adecuadaingestadealimentos.[13]
El gen SHOX fue descubierto en 1997 por Rao et Al, es un gen de tipo
homeobox de aproximadamente 40 kb presente en el extremo distal de la regin
PAR1aniveldeXp22.3eYp11.3,estcompuestopor7exones
6
El exn 1, constituido por 262 pb, no codifica y tiene la caracterstica de
presentar una regin polimrfica, un microsatlite con repeticiones del
dinucletido CA con un grado de heterocigosidad del 93% en la poblacin general
(Belin et al., 1998)[14]. La alta frecuencia de repeticiones conlleva a
predisposicin de mutaciones por delecin, descrita en portadores de talla baja
idioptica y en discondrosteosis de Lri Weill (Binder et al., 2000)[8]. El primer
exn codificante es el exn 2, el cual contiene al codn de iniciacin ATG en el
cual reside una isla CpG posee 708 pb y la porcin 5' no est traducida. Los
exones 3 y 4 poseen 209 pb y 58 pb respectivamente. El exn 5 est constituido
por 89 pb y los exones 6a y 6b poseen 1166 pb y 625 pb respectivamente con la
regin3'notraducida.
Por splicing alternativo de los exones 6a y 6b el gen resulta en dos
transcritos: SHOXa con 1870 pb que codifica para una protena de 292
aminocidos y SHOXb con 349 pb que codifica para una protena de 225
aminocidos[2].








7

Fig n1. Representacin esquemtica del gen SHOX, y sus dos formas
alternativas [3]. Los bloques representan los exones, UTRs en los bloques con
lneas horizontales, el homeodominio con turquesa y las regiones codificantes
congris.

En nuestro pas, alrededor del 23% de la poblacin se encuentra afectado


por talla baja, y se estima que la prevalencia de talla baja debida a deleciones de
SHOX en nios chilenos parece ser similar a la de estudios internacionales [4],
queengeneralsehanencontradodesdeun3aun15%[5].
La deteccin de las mutaciones ha tomado gran relevancia en los ltimos
aos, y en la bsqueda de nuevas formas y mtodos de deteccin que permitan
mejores resultados y en menores tiempos, las detecciones en el gen SHOX no
son la excepcin debido a la implicancia que tiene este gen en el desarrollo
estaturalhumano,entreotrascaractersticas.
8
Se han realizado diversos estudios donde se prueban diferentes tcnicas
para la deteccin de mutaciones en el gen SHOX, las que se basan
principalmente en la amplificacin de cidos nucleicos mediante la Reaccin en
cadena de Polimerasa o PCR, una de ellas es la tcnica de polimorfismo
conformacional de cadena simple o PCRsscp por sus siglas en ingls. Esta
tcnica consiste en el anlisis bajo condiciones no desnaturalizantes, donde una
hebra individual de DNA adopta una conformacin espacial especfica (se une a
ella misma). El cambio de una sola base nitrogenada induce una conformacin
diferente y mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida, estas mutaciones
puedenserdetectadas.
Fig. N2. Anlisis SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism).
Mutaciones puntuales simples pueden causar grandes diferencias en la
forma plegada de ADN de una sola hebra. Estas diferencias pueden ser
detectadascomodiferenciasenlamovilidadelectrofortica.[6]

9
Nuestra investigacin pretende estandarizar la tcnica de PCR para el
anlisis especfico de exones del gen SHOX y la tcnica PCRsscp para la
deteccin de micromutaciones de stos en personas diagnosticadas con talla
baja idioptica, para as facilitar el estudio de este gen. Si logramos lo propuesto,
ser un buen avance en el diagnstico asertivo para personas afectadas con talla
baja,ytambinsepodrnmejorarsusposibilidadesdetratamiento.



10
Objetivosdelainvestigacin
Objetivogeneral:
Estandarizar las tcnicas PCR y PCRsscp para el estudio y deteccin
de mutaciones en exones del gen SHOX de pacientes con baja estatura
idioptica,diagnosticadosenelHospitalHernnHenrquezAravena.

Objetivosespecficos:
Determinar la concentracin ptima de primers para la amplificacin de
exonesdelgenSHOXporPCR.
Determinar las temperaturas y los tiempos de las distintas etapas de la
PCR.
Determinar el mtodo de tincin que proporcione la mejor visualizacin de
losproductosengelesdeagarosaenelanlisisdeexonesdelgenSHOX.
Establecer las condiciones adecuadas para la purificacin de los
productosobtenidosdelatcnicaPCR.
Determinar la concentracin adecuada del gel de poliacrilamida para el
anlisisPCRsscpdeexonesdelgenSHOX.
Establecer el tiempo de corrida en electroforesis necesario para el
anlisisdelosproductosobtenidosdelPCRsscp.
Determinar el mtodo de tincin que proporcione la mejor visualizacin de
losproductosengeles depoliacrilamidaenelanlisisdeexonesdelgenSHOX.


11
MarcoTerico

La deteccin de mutaciones en el gen SHOX en individuos de baja
estatura idioptica puede ser realizada por varias tcnicas, las cuales durante el
paso de los aos han sido modificadas con el fin de buscar una tcnica que
permita lograr la deteccin de estas mutaciones en un tiempo menor y con
resultadosfiables.Entrelasdiversasformasdedeteccintenemos:
Estudios citogenticos: donde la tcnica a eleccin es la Hibridacin
fluorescente In Situ (FISH), esta consta de sondas especficas para los genes de
inters, permitiendo la deteccin de microdeleciones cromosmicas. Estas
sondas complementarias son marcadas con fluorocromo y visualizadas en un
microscopio de fluorescencia. La tcnica de FISH es una tcnica de alto costo, y
unadesusdesventajasesquenodetectamutacionespuntuales.
En el estudio de Funari y col. (2008) utilizando FISH se obtuvo que, en los
individuos normales con dos copias del gen SHOX, dos seales fluorescentes son
visibles en cada metafase. En deleciones de una copia, slo una seal es visible.
Estametodologanopermiteladeteccindepequeasdeleciones[2].
Las principales tcnicas para deteccin de mutaciones se basan Biologa
molecular,paraelestudiodelgenSHOXlasempleadashastaelmomentoson:
El estudio de Microsatlites, regiones de pequeos fragmentos de DNA
que se repiten de manera consecutiva, pudindose detectar pequeas
deleciones. Esta metodologa utiliza cebadores marcados con fluorescencia para
la reaccin de amplificacin de PCR y anlisis se realiza en un secuenciador
12
automtico. En ocasiones, es necesario estudiar a los progenitores, que no
siempre estn disponibles para distinguir entre los homocigotos con dos alelos
hemicigotosigualesdeloscualespresentanunaprdidadeunalelo[2].
Estudios recientes realizados el 2007 sobre poblaciones especficas han
determinado una frecuencia de mutaciones del gen SHOX de hasta un 22% [7],
mientras que estudios en Chile (ao 2007) han detectado que la mutacin se
encuentra en alrededor del 2 3% de los nios diagnosticados con talla baja
idioptica(TBI)[4].
La PCRSSCP, una variante de la PCR convencional, ha sido utilizada
para la deteccin de mutaciones en el gen SHOX. En el estudio realizado por
Binder y cols. utilizando SSCP para el screening de mutaciones de SHOX, obtuvo
buenos resultados frente a un screening previo de 91 pacientes. El anlisis de las
variables involucradas en la conformacin de cadena simple, se llev a cabo en un
aparato automtico de electroforesis Phast System, en dos condiciones diferente,
cada muestra se corri en un mini gel de acrilamida al 20% a 4 C y 15 C, las
hebras individuales se visualizarn por tincin de plata automtica. Sin embargo
estos estudios de deteccin, no eran capaces de detectar deleciones de pequea
escala en la regin pseudoautosmica, lo que causara la prdida completa de
SHOX[8].
En estudios posteriores se ha sealado que el mtodo (PCR sscp) en
condiciones ideales tiene una sensibilidad que vara de un 80 90% para
fragmentosdeADNmenoresa200paresdebases.[9]
13
Como se mencion anteriormente en el estudio de Binder y cols. [8] la
tcnica de SSCP tiene un buen rendimiento, aunque se menciona la limitante de
que ellos no pudieron detectar pequeas deleciones en la regin
pseudoautosmica, uno de los puntos a lo que apunta nuestra investigacin es
evaluar cambios en las variables de la tcnica de SSCP, ya sea variables al
realizar la PCR o variables al momento de evaluar una corrida electrofortica, con
el fin de poder optimizar la tcnica de SSCP e ir superando las limitantes que esta
pueda presentar. Diversos estudios indican cierta mejora en los resultados
obtenidosdespusdeaplicarmodificacionesenlatcnica.
En un estudio para la deteccin de SNP (Polimorfismo de nucletido
simple) en el gen ADIPOQ mediante optimizacin de SSCPHD de Gonzlez et al.
indican de que ellos optaron por ese mtodo debido al uso habitual en muchos
laboratorios de biologa molecular, indicando algunos parmetros que varan la
sensibilidad como composicin del gel, concentracin de DNA, contenido de
Guanina/Citosina del DNA, como tambin los fragmentos mayores a 200 pb en
donde la sensibilidad torna a ser menor segn Sheffield et al.. Sin embargo,
ajustando los parmetros nombrados, pudieron lograr una optimizacin del
mtodo y lograron analizar una secuencia de 298 pb con el resultado esperado
[10].
En otra investigacin realizada por Zhu et al.[11], ellos plantearon evaluar
como variable la concentracin de los primers a utilizar, tambin valoraron la
utilizacin de cada primer por separado (Forward primer & Reverse primer),
14
llegando a la conclusin que la movilidad electrofortica en la SSCP est
influenciada por las concentraciones del primer, tambin sugieren la adicin de
ambos primers para la PCR en una proporcin ptima de Ratio Molar de Primer a
producto de PCR 200:1 (concentracin de 3000 nM), esto no solo mejora la
sensibilidad de la SSCP mediante una reduccin del Reannealing del DNA, sino
que tambin excluye la interferencia de bandas intermedias causadas por primers
noincorporados[11].
Por todo esto creemos en la importancia de estandarizar los mtodos de
anlisis de este gen. Situacin que podra mejorar sustancialmente el diagnstico
de mutaciones del gen shox, y que, en ese escenario tambin podra mejorar las
posibilidadesdetratamientoparaaquellosafectadosportallabajaidioptica.[12]

15
Materialesymtodos
Tipodeinvestigacin:
Para la realizacin del estudio se implementar una investigacin de tipo
experimental de corte transversal, ya que se realizar la estandarizacin de
tcnicasanalticasydediagnsticosinseguimientodelospacientes.

Muestrapoblacionalymaterialbiolgico
El estudio se realizar sobre una muestra de 12 pacientes del hospital
Regional Hernn Henrquez Aravena de la ciudad de Temuco. El criterio de
seleccin fue que su estatura fuera menor a 2 desviaciones estndar de la media
(segn su edad) y estuvieran clnicamente diagnosticados con estatura baja
idioptica. A estos pacientes se les present un consentimiento informado previo
a la solicitud de una muestra de sangre venosa perifrica y adems, se obtuvieron
muestras controles de 4 voluntarios (2 de cada sexo), los cuales poseen una
estaturapromedionormal.

Procesamientodelmaterialbiolgico
ExtraccindeADN
Las muestras de sangre fueron procesadas para obtener DNA, mediante DNeasy
Blood&TissueKit(anexos)yelADNobtenidofuealmacenado.
Para ello, las muestras sanguneas de los pacientes fueron obtenidas y
conservadas en tubos con anticoagulante Heparina, se procedi a colocar en un
16
tubo eppendorf 20 l de proteinasa K junto con 100 l de sangre con
anticoagulante, se ajusto el volumen a 220 l con buffer PBS (Buffer fosfato
salino), se adiciono buffer AL (buffer de lisis), se utiliz vortex para mezclar bien y
se dej incubando por 10 minutos a 56C, posteriormente se adiciono 200 l de
etanol al 96100% y se mezcl utilizando vortex, el mix se transfiri a una
microcolumna montada en un tubo de microcentrfuga de 2 ml donde se realiz
una centrifugacin a 8000 rpm por 1 minuto luego se descart el filtrado, se
adiciono 500 l de buffer AW1 (buffer de lavado), luego se centrifug a 8000 rpm
por 1 minuto descartando el filtrado. La columna se transfiri a un nuevo tubo de
microcentrfuga de 2 ml donde se adiciono 500 l buffer AW2 (buffer de
desalinizacin) y se centrifug a 14000 rpm durante 3 minutos se descart el
filtrado y la microcolumna se mont en un tubo de microcentrfuga de 1.5 ml y se
adicion 50 l buffer AE (eluente) en el centro de la microcolumna, se incub por 2
minutos a temperatura ambiente (20 25 C) y se procedi a centrifugar por 1
minutoa8000rpm.

AmplificacinporPCR
A estas muestras de ADN se les amplificaron los distintos exones
codificantes del gen SHOX mediante el mtodo de PCR. Esto requiere de los
siguientescomponentes:
El templado de DNA de los pacientes que contiene la secuencia que
queremos analizar, Taq DNA polimerasa para la sntesis de las nuevas cadenas
17
de DNA que analizaremos, Primers especficos para los exones a analizar y los
sustratosdelaDNApolimerasanecesariosparalacreacindenuevascadenas.


Cadaciclocuentaconlossiguientespasos:
I) Desnaturalizacin del DNA, el DNA molde se incubada a alta
temperatura (92 98C, de 30 a 90 segundos), para separar las cadenas
complementarias,yasihacerlasaccesiblesalapareamientodelosprimer.
II) Alineamiento, la mezcla de reaccin es enfriada (50 60C, de 20 a 30
segundos) para permitir que los oligonucletidos iniciadores hibriden las
secuenciascomplementariasdelDNAblanco.
III) Extensin: se induce a temperatura intermedia (72C de 25 a 60
segundos), en la cual la DNA polimerasa copia el DNA entre las secuencias
correspondientesalosoligonucletidosiniciadores.
Estas tres etapas se repiten alrededor de 30 a 50 ciclos. Cuando cada
ciclo se completa, los fragmentos recin sintetizados sirven como DNA blanco.
Cadaciclogeneraunaacumulaciondesecuenciasamplificadas.

Verificacin de los Productos de PCR por electroforesis en gel de
agarosa
Los productos de amplificacin obtenidos de la PCR se visualizan a travs
de una electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polisacrido, producto
purificado de algas (composicin similar al agaragar). Se disuelve en caliente
18
(5060C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. Las
caractersticas mecnicas de estos geles hacen aconsejable la realizacin de la
electroforesis en horizontal, sumergidos en buffer. Las muestras se aplican en
pocillospracticadosdentrodelgel.
Para la visualizacin de nuestros productos de PCR se prepararon geles
de Agarosa a concentraciones de 1.6 y 2% para ello se prepar agarosa pesando
0.8 gr y 1.0 gr y disolvindola en 50 ml de buffer TAE 1x (Tris, acetato, EDTA)
respectivamente, luego se disolvi completamente la agarosa calentandola en un
horno de microondas. Finalmente se procedi a traspasarla a los moldes de
corridaelectrofortica.
Se vierte la solucin sobre el molde para hacer el gel y se posiciona el
peine para crear los pocillos de carga. Una vez enfriado y solidificado el gel, se
retiran los topes del molde y se depositan en la cmara de electroforesis
horizontal. Luego se cubre el gel con buffer de corrida asegurndose que quede
completamentesumergido.
Se preparan mezclando 10 l de producto de PCR de las muestras de
paciente agregandoles 2 l de buffer de carga (6x) y se cargan en los pocillos.
Tambin se carga un marcador de peso molecular y el control negativo en el cual
sesustituyeelDNAporaguadestilada.
Luego de cargar todas las muestras en los pocillos, se ajustan las clavijas
de la fuente de corriente en la posicin adecuada y se inicia la electroforesis a
19
100 Voltios durante 1 hora. Finalizada la electroforesis se procede a la tincin del
gelparavisualizarlasbandasdeDNA.
En un principio se realizaba la tincin con Bromuro de etidio donde se
deposita el gel durante 15 minutos en la solucin de bromuro de etidio, pero
posteriormente se cambi el procedimiento de tincin con bromuro de etidio a
utilizar Gel Red, el gel es depositado en una solucin de Gel Red (marca Biotium)
por 15 minutos para su visualizacin en el transiluminador, como variante de la
tincin con Gel Red se procedi a adicionar directamente a los geles de agarosa
el Gel Red, para ello a la preparacin de los geles se le adiciona 5 l de Gel Red
luego de haber calentado la agarosa en el horno microondas y se procede como
yaseindic.

Anlisis conformacionales por electroforesis en geles de
poliacrilamida
La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la
acrilamida y la bis acrilamida (N,N'metilnbisacrilamida), en una reaccin
iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El
radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de
acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas
al azar por la bisacrilamida, formndose as una red de porosidad bastante
uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las
concentracionesdelosmonmeros.
20
Los productos de PCR son desnaturalizados en cadena simples de ADN
mediante el uso de calor, luego renaturalizados para favorecer los apareamientos
intracatenarios y finalmente analizados en un gel de Poliacrilamida. Con esto, la
estructura de cada hebra de ADN de un amplicn adoptar una conformacin
dada, dependiente de la secuencia nucleotdica, que afectar su migracin en el
gel y esto es comparado con un patrn de bandas normales. As dos productos de
PCR con diferencias puntuales en su secuencias presentarn distintos patrones
electroforticos.

Para esto se realizaron geles de poliacrilamida a una concentracin de 6%
y 8%. Para el gel al 8% se procedi a mezclar 2.66 ml de Acrilamida/Bis al 30%,
5.27 ml de agua destilada, 2 ml de Buffer TBE 1x (tris, borato, EDTA), 70 l de
persulfato de amonio y 20 l de Temed, en un vaso precipitado, se mantuvo los
reactivos a bajas temperaturas al momento de realizar la mezcla, en el caso de los
geles al 6% solamente se modific el volumen de Acrilamida/bis de 2 ml y de
agua destilada a 5.97 ml respectivamente, los otros reactivos se mantuvieron con
losvolmenesyaindicados.

Geldepoliacrilamidautilizandotincindenitratodeplata
Se utiliz un protocolo para la tincin con nitrato de plata descrito por Duina Posso
Duque de la Unidad de Ecologia Genetica (UEG) del Instituto Venezolano de
Investigaciones Cientficas [15] . Se realizaron 7 pasos para la tincin de geles de
21
poliacrilamida con nitrato de plata, en primer lugar se procedi a fijar el gel
durante 20 minutos en una solucin fijadora (cido actico diluido), posterior a ello
se lav el gel tres veces cambiando el agua destilada cada vez, la duracin de
cada lavado fue de 2 minutos. En tercer lugar se procedi con la fase de tincin
del gel donde se dej escurrir el exceso de agua y se sumergi el gel en la
solucin de nitrato de plata en un recipiente de tincin cubierto con papel metlico
para evitar la exposicin de luz sobre el gel durante 30 minutos. Transcurrida la
media hora se retir el gel y se dej escurrir el exceso de nitrato de plata para
realizar un nuevo lavado con agua destilada durante 10 segundos, una vez lavado
se escurre el exceso de agua y se sumergi en la solucin reveladora (Carbonato
de sodio + formaldehdo 37% + Tiosulfato de sodio) y se agit suavemente
durante 3 5 minutos hasta que fueron apareciendo las bandas, posterior a ello se
extrajo el gel de la solucin reveladora se dej escurrir y se coloc en solucin de
parada (cido actico 10%) durante 10 minutos, finalmente se volvi a lavar con
aguadestiladadurante5minutos.

ExtraccindelDNA
Los productos de PCR despus de ser evaluados mediante electroforesis
en gel de agarosa y en los cuales se presenta ms de una banda de DNA, fueron
extrados directamente del gel. Especficamente la banda correspondiente al
fragmentodeinters.
22
Para ello se utiliz el AxyPrep DNA gel Extraction Kit de Axygen (adjunto
en el anexo), en donde primero se procedi a cortar el fragmento (banda a
estudiar) con un bistur estril, cuidando de extraer el solamente el fragmento
deseado, posteriormente el fragmento se mezcl con 350 l de buffer de
solubilizacin (buffer DEA) en un tubo Eppendorf, para mayor comodidad se
tritura el fragmento con un tip de micropipeta, despus se procedi a calentar en
una estufa a 75C para disolver completamente la agarosa durante 6 8 minutos,
una vez disuelta se adiciono 175 l de buffer de unin (DEB) Y 100 l de
isopropanol, posterior a ello el mix se deposit en una microcolumna armada en
un tubo de microcentrfuga de 2 ml con el fin de centrifugar 1 minuto a 12000 g,
una vez centrifugado se descart el filtrado y se adiciono 500 l de buffer de
lavado (buffer W1) y se vuelve a centrifugar a 12000 g por 30 segundos, se vuelve
a descartar el filtrado y se adiciono 700 l de buffer de desalinizacin con etanol
(buffer W2), se centrifug a 12000 g durante 30 segundo, una vez terminada la
centrifugacin el paso anterior se vuelve a realizar pero con una centrifugacin de
120000 g durante 1 minuto, posteriormente se descarta el filtrado y se realiz una
nueva centrifugacin a 12000 g durante 1 minuto, como paso final la columna se
transfiere a un tubo de microcentrfuga de 1.5 ml, a esta se le adiciono 30 l de
eluenteysecentrifugaa12000gdurante1minuto.

La purificacin puede ser mediante el uso de Kits o utilizando mtodos
manuales. Los kits de extraccin mayoritariamente se basan en el uso de
23
columnas y la elucin de la muestra, y los mtodos manuales se basan en la Lisis
alcalinaconprecipitacinconetanol.
Una vez realizada la extraccin y obtenidos los productos, estos se
enviaron a secuenciar a laboratorios especializados, en nuestro caso, los
productos obtenidos se enviaron a secuenciar al laboratorio Macrogen de Sel en
CoreadelSur.
Una vez obtenidas las secuencias de los productos desde Corea, se
realiza el anlisis de las secuencias de los productos de PCR, esto se realiza
mediante el software ClustalW2, en el cual se realiza un alineamiento de las
secuencias de los productos de los pacientes, los controles y de los exones
obtenidos desde el Genbank. Tambin se puede realizar un estudio de los perfiles
cromatogrficosvisualizadosporelprogramaChromasLite.












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ResultadosdelaInvestigacin

Se presentan los resultados ms importantes y concluyentes obtenidos en
estainvestigacin.


ComparacinBuffersdeamplificacinSapphireAmpFastPCRySYBR


Se realiz una PCR utilizando ambos reactivos en los mismos pacientes y
exones para comparar su desempeo para amplificar exones del gen SHOX. En
la amplificacin con el buffer SYBR (fig.3) se visualizan las bandas que se
buscaban en el exn 3 pero el exn 4 no presenta un patrn de bandas definido.
En la amplificacin con el buffer Sapphire Amp Fast PCR (fig.4) tambin se
visualizan las bandas que se buscaban en el exn 3 pero a la vez se observan
muchas bandas inespecficas. El exn 4 no present patrn de bandas esperado
ytambinpresentbandeoinespecfico.


25
AmplificacinconbufferSYBR

Figura3:Electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRdelgenSHOX.
ST:marcadordepeso,():controlnegativoexn3,P1:Paciente3exn3,P2:paciente
4exn3,P3:controlnegativoexn4,P4:paciente3exn4,P5:Paciente4exn4.

AmplificacinconbufferSapphireAmpFastPCR

Figura4:Electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRgenSHOX.
ST:marcadordepeso,1:controlnegativoexn3,2:Paciente3exn3,3:paciente4
exn3,4:controlnegativoexn4,5:paciente3exn4,6:Paciente4exn4.

26
De acuerdo con los resultados obtenidos se escogi como mtodo de
amplificacin el SYBR. Se procedi a realizar una amplificacin del exn 3 en
todos los pacientes. De esta amplificacin (fig. 5 y 6) se obtuvieron productos con
lascondicionesapropiadasparasuextraccin.
ProductosamplificadosSYBR.

Figura5:Electroforesisengeldeagarosaal1,6%,productosdePCRdelexn3
amplificadosconelbufferSYBR.ST:marcadordepeso,P1:paciente1,P2:paciente
2,P3:paciente3,P4:paciente4,P5:paciente5,P6:paciente6.


Figura6:Electroforesisengeldeagarosaal1,6%,productosdePCRdelexn3
amplificadosporelconelbufferSYBR.ST:marcadordepeso,P1:paciente7,P2:
paciente8,P3:paciente9,P4:paciente10,P5:paciente11,P6:paciente12.
27

SerealizlaextraccinporelmtodoAxyPrepDNAgelExtractionKit,ya
descrito,delosproductosobtenidosenlaPCRconbufferSYBRyverificadosen
electroforesisengeldeagarosa(fig.3y4).Serealizelprocesodeextraccinen
variasetapasyluegosecomprobaronmediantelaelectroforesisdeunapequea
porcindeproducto(5ul+1ulbufferdecarga)conlossiguientesresultados:

ProductosextradosdePCRpacientes6al12

Figura7:Electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRextradosdel
exn3dePCRdelgeldeagarosaconSYBR.ST:marcadordepeso,P6:paciente6,
P7:paciente7,P8:paciente8,P9:paciente9,P10:paciente10,P11:paciente11,P12:
paciente12

Enelprimerprocesodeextraccinselograronobtenerproductosdelos
pacientes6al12(Fig.7).Lasdemsmuestrasnolograronserextradas.
28
Seprocediarealizarunnuevoprocesodeextraccinparalospacientes1
al5siendofinalmenteobtenidosslolospacientes1,4y5(Fig.8)enloscuales
selograapreciarlabandaespecficaesperada.

ProductosextradosdePCRpacientes1,4,5

Figura8:electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRextradosdeel
exn3dePCRdelgeldeagarosa.ST:marcadordepeso,P1:paciente1,P4:paciente
4,P5:paciente5.

Enunnuevoprocesodeextraccinalospacientes1al5,seobtienen
productosdetodaslasmuestraspero,lospacientes1y2nopresentanbanda
alguna.


29
ProductosextradosdePCRpacientes1al5:

Figura9:electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRextradosdel
exn3dePCRdelgeldeagarosa.ST:marcadordepeso,P1:paciente1,P2:paciente
2,P3:paciente3,P4:paciente4,P5:paciente5.



ProductosextradosdePCRpaciente2


Figura10:electroforesisengeldeagarosa1,6%deproductosdePCRextradosdel
exn3dePCRdelgeldeagarosa.ST:marcadordepeso,P2:paciente2.
30
Finalmente se realiz una nueva extraccin de los productos amplificados
del paciente 2, nica muestra sin confirmacin de extraccin satisfactoria,
arrojando un resultado positivo (fig. 10). As se pudieron extraer correctamente los
productos de PCR del exn 3 del gen SHOX de todos los pacientes, aptos para
susecuenciacin.



31
RespectoalasdeterminacionesrealizadasmediantePCRsscp:
Se evaluaron diferentes concentraciones de poliacrilamida (4%,6%, 7%) en
los geles. El exn 6 se evalu mediante PCRsscp y se corrieron en un gel de
poliacrilamida al 4% junto a un marcador de peso molecular no denaturado (fig.
11). Los productos descendieron por todo el gel de corrida, imposibilitando la
apreciacindelasbandas.

Figura11:Electroforesisengeldepoliacrilamidaal4%deproductosdePCRsscpdel
exn6delgenSHOX.Secorripor100minutosa100volts.ST:marcadordepeso,
P2:paciente2,PV:vaco,P5:paciente5,P6:paciente6,P7:paciente7,P8:paciente8,
P9:paciente9,P11:paciente11
32

Figura12:Electroforesisengeldepoliacrilamida6%,corridoa100voltspor2horasde
productosdelexn5.ST:marcadordepesomolecular,():controlnegativo,P7:
paciente7,P1:paciente1,P6:paciente6,PC:pacientecontrol,P8:paciente8




Figura13:Electroforesisengeldepoliacrilamida6%,corridoa100voltspor2horasde
productosdepacientesdelexn5,.ST:marcadordepesomolecular,P1:paciente11,
P2:paciente7,P3:paciente4,P4:paciente3,P5:paciente2,P6:controlnegativo
33
El exn 5 se corri en un gel de poliacrilamida al 6% y al 7% (fig. 12 y 13
respectivamente) con distintos pacientes y controles. En ambos casos los
productosnofueronretenidosenelgelparaposibilitarelanlisisdebandeo.

TincindeNitratodeplata



Figura14:Electroforesisengeldepoliacrilamida6%contincindenitratodeplata,
corridoa100voltspor2horasdeproductosdepacientesdelexn2.P1:Paciente1,
P2:paciente2,P3:paciente3,P4:pocillovaco,P5:paciente4,P6:paciente5,P7:
paciente6

Serealizunapruebadelprotocolodetincinconnitratodeplata,paralos
pacientes 16 con el mtodo de PCRsscp (fig. 14), en cual se aprecia una gran
nitidez al momento de visualizar el gel. En esta determinacin se aprecian
correctamente las bandas, por lo que se concluye una correlacin entre la
concentracindelgelyelpesomoleculardelproducto.


34
Discusin

Se desarrollaron varias tcnicas y se evaluaron los diseos experimentales
utilizadosporotroslaboratoriosparaladeteccindemutacionesenelGenShox.

EvaluacinBufferdePCR
En primer lugar se evaluaron los buffers utilizados para realizar una PCR a
los 12 pacientes, se compar el buffer SYBR frente al buffer Sapphire Amp Fast
PCR, en los exones 3 y 4 del gen Shox en los pacientes 3 y 4. En la corrida
electrofortica se pudo apreciar que el buffer SYBR amplific en especfico la
banda del exn 3, sin apreciarse alguna otra banda inespecfica (fig. 3), frente al
buffer Sapphire Amp Fast PCR el cual tambin amplific para la banda del exn 3
pero con la diferencia de que se aprecian algunas bandas inespecficas (fig. 4).
En ninguno de los 2 geles se aprecia con claridad la banda del exn 4, esto
posiblemente debido a que el exn 4 esta conformado por 54 pb lo que lo hace
mascomplejoparasuvisualizacin.
Dado lo anterior se opt por usar el buffer SYBR, para realizar el estudio en
los12pacienteselresultadosemuestraenlaFig.5y6.
PurificacindelDNA
Luego de la electroforesis, se procedi a purificar los productos de PCR
del exn 3 de los 12 pacientes. Se realiz la extraccin por medio de corte con
bistur del fragmento en estudio, con el fin de obtener la banda especfica para una
35
secuenciacin. El mayor problema que se present fue preparar los geles con una
agarosa marca CSLAG100 de Cleaver Scientific Ltd de alto punto de melting
(sobre 70c), ya que despus de disolver la agarosa a 75C, el gel comenzaba a
polimerizar en pocos minutos y al momento de realizar la primera centrifugacin
en la microcolumna, estas se taparon por lo que no se pudo seguir con el
procedimiento durante la primera extraccin que se intent. Se pens que
posiblemente la estufa no era la adecuada para mantener constante una
temperatura de 75C, por lo que se utiliz otra estufa con la que se pudieron
realizar los primeros productos extrados, sin embargo algunas microcolumnas
igualmente se taparon. Se procedi a ocupar una agarosa de menor punto de
melting de la marca Gene Express para realizar la extraccin, con ello se pudo
realizar la extraccin de los pacientes que no haban podido ser extrados
(Fig.7,8,9,10).
Es importante el tipo de agarosa que se utiliza para poder realizar una
purificacin de DNA extrayendo el producto desde el gel de agarosas con elevado
punto de melting elevado conlleva a mayores inconvenientes (mayor uso de
reactivos,prdidadeDNA,mayortiempodetrabajo).
Como tambin usar el otro extremo de ocupar una agarosa con bajo punto
de melting conlleva a una nula estabilidad del gel al momento de realizar la
electroforesis.

36
PCRSSCP
Al realizar el estudio de PCR SSCP para el exn 5 del gen SHOX, se
utilizaron geles de poliacrilamida al 4% y al 6%. Se realiz una corrida
electrofortica de las muestras de DNA de los pacientes, los resultados se
aprecian en las figuras 11, 12, 13. En la fig. 11 no se evidencia una banda clara
para el exn 6, mientras que en las fig. 12 y 13, tampoco se visualizan bandas del
exn 5. Esto puede deberse a que la electroforesis se realiz durante 100 y 120
minutos respectivamente a 100 volts, lo que puede haber causado que estos
productos de amplificacin se hubiesen salido por extremo del gel debido a un
tiempo muy prolongado en la electroforesis, especialmente en el exn 5 que tiene
untamaode89pb.
Se recomienda evaluar diferentes tiempos en la corrida electrofortica as
como ir variando las concentraciones de los geles de poliacrilamida, esto segn
seaelrequerimientodelproducto(tamaodelexn)quesedeseeestudiar.
TincinconnitratodeplataenPCRSSCP
Se realiz la tincin con nitrato de plata para el mtodo de SSCP, donde se
utiliz un gel de poliacrilamida al 6%. De la fotografa de los productos de
pacientes obtenida Fig. 14, se puede determinar que la tincin es de mejor
resolucin para la visualizacin de geles de poliacrilamida, adems de comprobar
el protocolo utilizado. Se deben evaluar parmetros como concentraciones de los
geles, tiempos en la corrida electrofortica para poder evaluar la eficacia de esta
tincinparalatcnicadeSSCP.
37
Conclusiones

En los diversos protocolos y determinaciones llevados a cabo para
establecer las condiciones y caractersticas ms adecuadas para el anlisis del
gen SHOX se obtuvieron resultados variables, durante el desarrollo e
implementacin en las determinaciones se fueron presentando en varias
ocasiones diversos inconvenientes y contratiempos, entre los que ms denotaron
fueron complicaciones con los geles tanto de agarosa como los de poliacrilamida,
principalmente al evaluar las concentraciones ms adecuadas para realizar de la
mejor manera corridas electroforticas para visualizar los exones en estudio, con
ello se pudo desprender que la concentracin de agarosa al 1.6% es una
concentracin adecuada para realizar estudios del gen SHOX, junto con una
corrida electrofortica de 1 hora a 100 volts, y que una concentracin mayor como
2% o un mayor tiempo de corrida debieran ser utilizados con exones (amplicones)
deunmayortamao.
Dentro de ello fue de gran utilidad el tener inconvenientes con una agarosa
de alto punto de melting para la extraccin de productos extrados a travs de un
gel de agarosa, esto porque con ello se pudo establecer que agarosas con un
elevado punto de melting no son aptas para realizar extraccin de productos
desde un gel ya que se polimeriza rpidamente a temperatura ambiente y
obstruye las columnas de extraccin, esto conlleva a una prdida de tiempo,
38
reactivos y DNA el cual es limitado. En cambio una de bajo punto de melting se
mantienelquidapormstiempoatemperaturaambiente(sepolimerizamenos).
Con respecto a los geles de poliacrilamida de diferentes porcentajes P/V y
del mtodo PCRsscp se pudo evaluar geles de 4%, 6% y 7%, el trabajar con la
concentracin de 4% presenta la dificultad de manipular el gel implicando un
mayor riesgo de romper el gel dejndolo no apto para su uso, con
concentraciones de 6% y 7% aunque no se pudieron visualizar los productos si
deja la opcin para ir optimizando variables como concentraciones de los geles
de poliacrilamida, tiempos de corrida electroforticas, segn sean los
requerimientos para el estudio de los exones del gen SHOX. Tambin se realiz
el estudio de los productos con la metdica de PCRsscp con tincin de nitrato de
plata, en ello se evalu el protocolo de tincin de plata, el cual da una mayor
nitidez al momento de visualizar los geles que con otra forma de teir estos geles,
con ello se puede asentar los primeros pasos para realizar un estudio con mayor
profundidad sobre la utilizacin y optimizacin de esta tincin para el mtodo
PCRsscp.
En el estudio se determin que el buffer SYBR present una buena
visualizacin del patrn de banda que buscbamos, a diferencia del buffer
Sapphire Amp Fast PCR que nos present muchas bandas inespecficas, la
eleccin de un buffer por sobre otro permite tener mejores resultados al momento
de buscar una banda en especifico, o para poder realizar una correcta extraccin
delabandadeDNAdeintersdesdeelgel.

39
Referenciasbibliogrficas
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40
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41
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15. Duina Posso Duque. Protocolos de laboratorio Unidad de Ecologia Genetica
(UEG)delInstitutoVenezolanodeInvestigacionesCientficas,2009.



42
Anexos

ConsentimientoInformado
Deteccin de mutaciones del Gen SHOX (short stature homeobox) en pacientes
con baja estatura idioptica, mediante la tcnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction)SSCP(Singlestrandconformationpolymorphism)
InvestigadoresResponsables:Dr.MarcoParedes.
AlumnosTesistas:PriscilaGarcaDanielParraMauricioPoblete.

NombredelParticipante:

Se invita a participar en el estudio preliminar de bsqueda de mutaciones
enelgenSHOXenniosconTallaBajaIdioptica.
Sintaselibredehacersepartcipeono.
La talla es uno de los parmetros ms utilizados para la valoracin del
crecimiento durante el desarrollo postnatal humano, debido a que constituye un
indicador muy til del estado de salud de un nio, por lo tanto, una alteracin en el
crecimiento normal puede ser la primera manifestacin de alguna enfermedad. Es
decir,latallaestrelacionadaconelestadodesaluddelnio.
43
En los ltimos aos, varios estudios consolidan los defectos en el gen SHOX
como una principal causa de baja estatura. Frecuentemente este diagnstico
pasa desapercibido. El diagnstico basado en el hallazgo de defectos en el gen
SHOX permite establecer una causa de baja estatura, evitando la realizacin de
exmenes subsidiarios. El diagnstico permite tambin establecer un pronstico
aproximado de la altura final, indicar un tratamiento adecuado y ofrecer a la familia
consejeragentica.
Este estudio se realizar en el Laboratorio de Investigacin de
Biotecnologa Animal (LINBA) del Departamento de Ciencias Bsicas de la
Universidad de La Frontera de Temuco, pretende estudiar mutaciones del gen
SHOXenpacientespeditricosconTallaBajaIdiopticaenTemuco.
Los resultados de estos exmenes sern informados al mdico tratante de
los pacientes analizados, quien los podr relacionar con su condicin clnica y
respuestaaltratamiento.
La muestra obtenida de usted ser tomada como un control normal para
establecer un patrn de referencia para comparar el gen SHOX de una persona
deestaturanormalconeldeunapersonaconBajaEstaturaIdioptica.
En el caso de aceptar participar en el estudio, se registrarn algunos datos
mdicos de su ficha clnica y se tomarn muestras de 3 mL de sangre de forma
44
regular, por lo que el riesgo y molestias sern las habituales de una extraccin de
sangre.


IMPORTANTE
No habrn consecuencias adversas para usted si decide no
participar.
Cuandolodesee,puederetirarsedelestudio.
Notendrquerealizarningngastoparaentraralestudio
Norecibirpagoporsuparticipacin
Puedeexigiralinvestigadorelresultadodesusexmenes
Su identidad se mantendr en estricta confidencialidad por los
investigadoresduranteesteestudio
Los resultados obtenidos podrn ser utilizados en publicaciones o
presentaciones cientficas, manteniendo la reserva de identidad de
losparticipantes.

Si usted considera que esta informacin aclara sus dudas respecto a su
participacin en el estudio, le invitamos a firmar el Consentimiento Informado en la
hojaanexaaestedocumento.

45

CARTADECONSENTIMIENTOINFORMADO
Deteccin de mutaciones del Gen SHOX (short stature homeobox) en
pacientes con baja estatura idioptica, mediante la tcnica de PCR (Polymerase
ChainReaction)SSCP(Singlestrandconformationpolymorphism)
Yo........
he ledo y comprendo la informacin proporcionada en el documento anterior. He
sido informado de todos los procedimientos de obtencin y manejo de la muestra
que he puesto a disposicin, y de los objetivos de este estudio, y estoy al tanto
que los datos obtenidos del anlisis de mi muestra sangunea, sern utilizados de
formaticayresponsableenelestudiopresente.

FirmaFirmaTestigo
Yo..
he explicado al Sr(a).. los
objetivos de esta investigacin, he aclarado sus dudas en lo posible e informado
que la participacin de mi pupilo en este estudio, no pone en riesgo su integridad
fsicanipsicolgica.

FirmaInvestigador
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