Engenharia Gentica

1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrio
3. Vetores de clonagem
- Plasmdios
- Bacterifagos
- Cosmdeos
4. Etapas de clonagem molecular
5. Aplicaes
Contedo
HISTRICO
Watson & Crick
Estrutura do
qumica do DNA
(1953)
Nature, 25 - Abr - 1953
Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)
Ian Wilmut
clonagem de mamfero
(1997)
HISTRICO
Prtica clnica
Testes genticos
(1995...)
PGH
Conhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)
Transgenia
(1995...)
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O que um DNA recombinante?
- uma molcula de DNA formada pela ligao de duas molculas
de origens diferentes (Ex. DNA de planta ligado a um plasmdio)
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ENZIMAS DE RESTRIO
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W. Alber
H. Smith D. Nathans
Uma enzima de restrio ou endonuclease de restrio
um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre
que identificar uma seqncia particular de nucleotdios
que seja o stio de restrio da enzima;
Descritas em 1970,
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ENZIMA DE RESTRIO
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Enzimas de Restrio
- Stio de reconhecimento seqncia palindrmicas
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
- Reconhecem de 4 a 8 pb
- Cortes com extremidades abruptas / coesivas
- Clonagem molecular - ~ 1.073 enzimas diferentes
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ENZIMAS DE RESTRIO
Tipos de cortes:
- Produo de terminais coesivos (adesivos, protuberantes)
- Produo de terminais abruptos (ou cegos)
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NarI
~~~~~~
181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC
TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG
241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT
TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA
301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT
ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA
HindIII PstI
~~~~~~~ ~~~~~~
361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG
AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC
XbaI BamHI KpnI EcoRI
~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~
421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT
TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA
ENZIMAS DE RESTRIO
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37
0
C, 1 hora,
com tampo
adequado
ENZIMAS DE RESTRIO
EcoRI
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TIPOS DE VETORES
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PLASMDEOS
Sequncias circulares de DNA.
Reproduzem-se de forma autnoma;
Encontram-se no citoplasma de certas
bactrias.
Elementos genticos
extracromossmico.
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o isolamento e a propagao em um
organismo de molculas idnticas de
DNA
CLONAGEM MOLECULAR
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CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO
RECOMBINANTE
1. Obteno do DNA a ser clonado
2. Preparao do vetor
3. Ligao do vetor com o inserto
4. Transformao da bactria
5. Seleo dos clones recombinantes
1.Obteno do DNA a ser clonado
94
0
C por 5 min
94
0
C por 1 min
55
0
C por 1 min
72
0
C por 1 min
72
0
C por 5 min
4
0
C
35 ciclos
PCR
2. PCR Reao em cadeia da Polimerase:
Permite produzir in vitro um grande nmero de molculas de
DNA iguais, a partir de uma pequena amostra de sangue, osso,
pele, esperma,plos, etc.
Prof Reisila Mendes
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3.Preparao do vetor
Digesto
Purificao
Plasmdeo Circular
Plasmdeo linear
Digesto com
Enzimas de
restrio
Extremidades coesivas
Fragmento
de DNA -
inserto
DNA
plasmidial -
vetor
LIGASE
4. Ligao
Construo do DNA Recombinante
Molcula de DNA de
um plasmdeo circular
Clivagem com
enzima de
restrio
Molcula de DNA de um plasmdeo
linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligao covalente
pela DNA ligase
Molcula de DNA
plasmidial contendo
o inserto
Insero em
uma clula
hospedeira
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Clonagem Molecular
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APLICAES
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ANIMAIS TRANSGNICOS
2. Animais transgnicos usados como biofbricas de
determinadas substncias de interesse mdico, no estudo de novos
e melhores processos para a compreenso, preveno e
tratamento das doenas cardiovasculares, autoimunes,
neurolgicas e outras doenas humanas.
Vtor tem duplicado o gene do receptor
B2 da bradicinina, uma substncia
associada a processos inflamatrios e
hipertensivos, responsvel pela proteo
do corao.
O porco da esquerda, transgnico, foi
obtido a partir da insero de um
gene fluorescente da gua-viva que
lhe conferiu focinho e patas amarelos
Vetor de Expresso em
Eucariotos
VETORES PLASMIDIAIS
Simulador de epilepsia
Simulador de obesidade
Simulador de Alcaptonria
Suno produtor de
hemoglobina humana
Caprino produtor de droga
anticncer
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa), a Universidade de Braslia
(UnB) e o Hospital de Apoio de Braslia,produziu no leite de camundongos transgnicos
o fator IX humano, uma protena responsvel pela coagulao do sangue.
Cientistas criaram um porco com
sangue humanos nas veias.
Cientistas australianas implantaram
clulas humanas da prstata em
camundongos para estudar tratamentos
contra o cncer de prstata. O
procedimento ocorreu em 2006 e foi o
primeiro do tipo.
Pesquisadores da Argentina criaram, em
2008, uma vaca transgnica cujo leite
contm a protena humana do
crescimento. A substncia produzida por
vacas tem sido usada em tratamentos do
nanismo.
Salmo transgnico cresce
10x mais rapidamente que o
normal.
Ratos com enzima de bactria
transformaram gordura em gs
carbnico e mantiveram-se
magros mesmo comendo mais.
PLANTAS TRANSGNICAS
Milho transgnico Bt ( Bacillus thuringiensis)resistente
ao ataque de insetos;
Soja transgnica Roundup-Ready da Monsanto
Arroz dourado rico em betacaroteno
da Ingo Potrykus
Tomate longa-vida, de amadurecimento
demorado
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Plantas Transgnicas
Fotografia de planta do tabaco com gene de
vagalume
Curiosidade: os cientistas conseguiram
introduzir, na planta do tabaco, um
gene de vagalume capaz de sintetizar
a enzima luciferase que catalisa, nesse
inseto, a degradao da luciferina
(protena que produz luz). O gene
clonado em plasmdeo multiplicou-se
em bactrias e, depois de purificado,
foi injetado na clula de fumo. O gene
modificado passou para o DNA da
planta, que, quando regada com
luciferina, emitia luz como o vagalume.
Imagem: Autor desconhecido / GNU Free
Documentation License.
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Golden Rice
Alimento bsico para 60% da populao mundial;
Dentre os gros comestveis, possui o cdigo gentico mais curto;
Contm grandes quantidades de beta-caroteno, que convertido
no organismo em vitamina A;
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Desvantagens
Aumento das reaes alrgicas;
As plantas que no sofreram modificao gentica
podem ser eliminadas pelo processo de seleo natural;
Aumento da resistncia aos pesticidas e gerando maior
consumo deste tipo de produto;
Matar populaes benficas como abelhas, minhocas e
outros animais e espcies de plantas;
Sementes estreis
- Patenteadas por grandes empresas
- Agrotxico especfico
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Decreto n 4.680, de 24 de abril de 2003
Na comercializao de alimentos e ingredientes alimentares destinados
ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a
partir de organismos geneticamente modificados, com presena acima do
limite de um por cento do produto, o consumidor dever ser informado
da natureza transgnica
desse produto.
Legislao
Terapia gnica ou
geneterapia:
Consiste em introduzir no
organismo de uma pessoa
que tenha uma doena
gentica, clulas contendo
o alelo normal
correspondentes ao alelo
causador da doena.
Csar e Sezar
Revista poca,3/10/2011
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DNA fingerprint: impresso digital gentica
O resultado da eletroforese uma imagem fotogrfica
semelhante a um cdigo de barras ou impresso digital:
o DNA fingerprint. Observe a imagem!
Filme de bandas de DNA
Equipamento para eletroforese em gel
Imagem: Jeffrey M. Vinocur / GNU Free
Documentation License.
Imagem: Mnolf / GNU Free Documentation License.
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Aplicaes prticas de DNA
fingerprint
Descubra quem o
pai da criana!
Fonte:
http://aprendaki.webcindario.com/testes/images/an5.GIF
Teste de paternidade: compare
os cdigos de barra da me e da
criana com o cdigo de barra
dos dois provveis pais. A criana
deve ter 50% do padro de
barras da me e 50% do padro
de barras do pai.
A popularidade do DNA se
deve, entre outros fatores,
aos testes de paternidade
propagados pela mdia.
Me Criana Homem A Homem B
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Teste de paternidade.
Identificao de pessoas
em investigaes
policiais ou judiciais.
Aconselhamento
gentico.
Para realizar o exame de DNA,
basta ter qualquer amostra
biolgica, como pele, cabelo,
sangue, smen, entre outras.
Os testes que utilizam
DNA fingerprint so to
seguros que fornecem
99,9% de certeza.
Observe que as trs bandas de
DNA de origem paterna (no
encontradas na me) ocorrem no
homem B.
Se voc respondeu homem B,
parabns!
BIOLOGIA, 3 Ano do Ensino Mdio
Tecnologias de manipulao do DNA: riscos
e benefcios
Me Criana Homem A Homem B
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5. Clonagem reprodutiva
1981 camundongos clonados de clulas da linhagen germinativa;
1997 ovelha Dolly;
2001 1 clone de embrio humano(6 clulas);
Clonagem teraputica
Utiliza a tcnica para o tratamento de doenas as genticas e as
degenerativas como diabetes, infartos, leses na medula espinhal,
etc.
Csar e Sezar
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Projeto Genoma Humano
O Projeto Genoma Humano (PGH) foi um dos grandes feitos da
histria da Gentica e sua concluso se deu em abril de 2003.
Com a utilizao de tecnologias muito sofisticadas, foi possvel
mapear o DNA humano em 99,99%. So aplicaes do PGH:
Produo de remdios que atuam com mais
eficcia e de forma especfica.
Identificao de genes que causam ou
predispem doenas genticas e cncer.
No aconselhamento gentico, anlise das
chances de um casal ter filhos portadores de
anomalias hereditrias.
Identificao de genes que predispem
doenas metablicas como diabetes.
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o genoma humano contem 3,2 bilhes de
nucleotdeos 25.000 Genes
o tamanho mdio dos genes de 3.000 bases,
mas varia muito, sendo o maior deles o gene da
distrofina com 2,4 milhes de pares de bases
a funo de cerca de 50% dos genes descobertos
desconhecida
a sequncia do genoma humano 99,9%
exatamente a mesma em todas as pessoas
sequncias repetidas que no codificam
protenas constituem mais do que 50%do genoma
humano.
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Homem (Homo sapiens) 3.2 bilhes 25.000
Camundongo (M. musculus) 2.6 bilhes 25.000
Hera (A. thaliana) 100 milhes 25.000
Verme (C. elegans) 97 milhes 19.000
Mosca das frutas (D. melanogaster) 137 milhes 13.000
Levedura (S. cerevisiae) 12.1 milhes 6.000
Bactria (E. coli) 4.6 milhes 3.200
Vrus da imunodeficincia Humana (HIV) 9700 9
FIM