PRODUCCIN E IDENTIFICACIN DE PIRUVATO Y ACETALDEHDO
DURANTE LA FERENTACIN DE LA !LUCO"A POR LEVADURA# OB$ETIVO !ENERAL Demostrar experimentalmente la produccin de piruvato y acetaldehdo por fermentacin de la glucosa utilizando levadura. OB$ETIVO" E"PECFICO" 1).- Comprobar la formacin de cido pir!vico durante la fermentacin de la glucosa por levadura. ").- #dentificar la presencia del cido pir!vico a partir de glucosa utilizando la prueba del nitroprusiato de sodio y "$ % - dinitrofenilhidracina. &).- Demostrar la formacin de acetaldehdo a partir de glucosa e identificarlo usando la prueba de la piperidina FUNDAENTO% 'a gluclisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a (tanol y C) " $ y* a cido lctico dependiendo del organismo +ue lo efect!e$ como siendo en el primer caso las levaduras las responsables. ,mbas rutas de fermentacin son similares hasta la formacin de piruvato$ manteniendo id-nticas las etapas de conservacin de energa +ue conducen a la formacin de ,./. 'a gluclisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa +ue conduce a la produccin de ,cetil -Co, y a su oxidacin en el ciclo del cido ctrico$ sino +ue tambi-n proporciona una va importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. 'a caracterstica de la gluclisis de proporcionar ,./ en ausencia de oxgeno es de significado crtico biom-dico$ por+ue permite al m!sculo es+uel-tico hacer un traba0o sumamente eficiente a!n cuando la oxidacin aerbica se vuelva insuficiente$ a la vez +ue los te0idos con capacidad glucoltica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. #nversamente el m!sculo cardaco$ +ue est adaptado al traba0o aerbico$ tiene una capacidad glucoltica relativamente deficiente y supervivencia escasa ba0o condiciones de is+uemia. 1ay un n!mero pe+ue2o de enfermedades en las +ue las enzimas del sistema glucoltico como por e0emplo la piruvato cinasa muestran actividad deficiente3 estas anomalas se manifiestan principalmente como anemias hemolticas. (n las c-lulas cancerosas +ue proliferan con rapidez$ la gluclisis procede a una velocidad mucho mayor +ue la re+uerida por el ciclo del cido ctrico$ por tanto$ se produce ms piruvato +ue el puede ser metabolizado. (l resultado es una produccin excesiva del lactato$ +ue favorece un entorno local relativamente cido en el tumor$ situacin +ue puede tener implicaciones con ciertos tipos de terap-utica contra el cncer. .ambi-n se produce acidosis lctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa. ATERIAL 14 tubos de ensaye de 1& x 144 1 gradilla para tubos de ensayo % tubos de centrifuga 1tripie 1 mechero 5unsen 1 anillo metlico 1 tela de asbesto & pipetas de 6 ml. graduadas. " vasos de precipitados de "64 ml 1 vaso de precipitado de 744 ml " pinzas para tubos de ensaye 1 propipeta EQUIPO 1 centrfuga 1 5a2o de agua a &89 C o incubadora 1 :ortex REACTIVO" ;osfato de sodio dibsico <=a " 1/) % ) 4.6 > ;osfato de potasio monobsico <?1 " /) % ) 4.6 > @uspensin de levadura <144 g * l en =a " 1/) % ) @uspensin de levadura <144 g* l en ?1 " /) % ) @uspensin de levadura <144 g* l en agua Alucosa <144 g* l) =itroprusiato de sodio <64 g* l )B /C(/,C(@( ,=.(@ D( D@,C 1idrxido de amonio @ulfato de amonio =a)1 <144 g* l) 1idrocloruro de "$% E dinitrofenilhidracina <solucin saturada en 1Cl ">) /iperidina <&4 g*l en solucin acuosa) Fcido tricloroac-tico <144 g* l) Nota% La &i'o()ci*+ &, (,-a&)ra ', .r,.arar ,( &/a &, (a .rctica PROCEDIIENTO% 012- FORACIN DE PIRUVATO A PARTIR DE !LUCO"A 1.- (n dos tubos de ensayo pipetear 6 ml de solucin de glucosa 3t)4o' A 5 B) ".- (n el t)4o A agregue 6 ml de suspensin de levadura en solucin ligeramente alcalina de =a " 1/) % y al t)4o B agregue 6 ml de suspensin de levadura en solucin ligeramente cida de ?1 " /) % &.- Colo+ue los tubos , y 5 en un ba2o >ara a &89 C durante 1 hora %.- ,2ada a cada tubo " ml de solucin de cido tricloroac-tico$ mezcle vigorosamente y centrifugue durante 14 minutos a "644 r.p.m. 6.- @epare el sobrenadante y !selo para la determinacin de piruvato 612- IDENTIFICACIN DEL PIRUVATO a1 R,acci*+ co+ +itro.r)'iato &, 'o&io (n un tubo de ensaye agregue " ml del sobrenadante hervido previamente a 1 gr de sulfato de amonio slido ,gregar dos gotas del reactivo nitroprusiato de sodio <reci-n preparado) y mezclar vigorosamente De0ar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidrxido de amonio concentrado$ hasta la formacin de dos capas. @i hay piruvato se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos l+uidos. 'a formacin de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloracin azul o verdosa$ caracterstica de la reaccin con piruvato. 41 D,t,r7i+aci*+ &, .ir)-ato co+ 684-&i+itro9,+i(:i&raci+a ,gregue 1 ml de solucin saturada de "$%-dinitrofenilhidracina a " ml de sobrenadante >ezcle fuertemente y colo+ue " o & gotas de la mezcla en un tubo de ensayo ,gregue 1 ml de solucin de =a)1 <144 g*l) y diluya con agua hasta 6 ml. 'a aparicin de un color ro0o indica la presencia de piruvato Cepetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series
;12- FORACIN DE ACETALDEHDO A PARTIR DE !LUCO"A
(n dos tubos de ensayo marcados como C 5 D pipetear 6 ml de solucin de glucosa$ agregue a cada uno de ellos 6 ml de suspensin de levadura en agua. ,l tubo D a2ada 4.6 g de sulfito de sodio. >ezcle vigorosamente e incube los dos tubos a &89 C durante 1 hora. Centrifugue$ separe el sobrenadante$ mezcle " ml del sobrenadante con 4.6 ml de solucin fresca de nitroprusiato de sodio y " ml de piperidina acuosa$ y agite. @i hay acetaldehdo presente se observar una coloracin azul OB"ERVACIONE"BGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG RE"ULTADO"BGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG COENTARIO" Y CONCLU"IONE" GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG CUE"TIONARIO 1. HIu- finalidad tiene adicionar a la suspensin de levadura =a " 1/) % y ?1 " /) % J ". H/or+u- deben estar los tubos en ba2o mara a &8KC por &4 minutos. &. H/or+u- se adiciona .C, <Fcido .ricloro ,c-tico) al 14LJ %. (scriba la reaccin para la segunda reaccin. #ndicando la funcin del =a)1. 6. H(xpli+ue y es+uematice las reacciones +ue intervienen en la gluclisis anaerobiaJ 7. (s+uematice la mol-cula de cido pir!vico. 8. HCuntos enlaces fosfato de alta energa surgen en el catabolismo de la glucosa tanto aerbica como anaerobiaJ M. HIue es metabolismo$ catabolismo y anabolismoJ N. (s+uematice y expli+ue el ciclo de Cori. 14. HIu- importancia tiene la glucosa en el traba0o muscularJ BIBLIO!RAFA 5io+umica prctica. David .. /lummer. (ditorial >cAraO - 1ill. 1NM1. =elson D'$ Cox >>. "441. 'ehninger principios de bio+umica. &P edicin. (diciones )megaB 5arcelona. >atheOs C?$ :an 1olde ?(. ,hern ?A. "447. 5io+umica. &P edicin. /erason ,ddison QesleyB >adrid. >urray C?$ Aranner D?$ CodOell :Q. "448. 1arper. 5io+umica ilustrada. 18P edicin. >anual >oderoB >-xico. @tryer '$ 5erg R>$ .ymoczSo R'. "44&. 5io+umica. 6P edicin. (ditorial Cevert-B 5arcelona.