ESTRUCTURA DEL CRISTAL DEL DOMINIO DEL N-ACETILMANOSAMINA

QUINASA GNE
Introduccin:
El GNE (UDP-GlcNAc 2-epimerasa/ManNAc 6-quinasa), contiene un dominio epimerasa N
terminal ! un dominio quinasa "- terminal# El Dominio epimerasa con$ierte el UDP
GlcNAc a Nacetil manosamina (ManNAc) que es %os%ori&ada en la 6ta posici'n por el
dominio quinasa# El GNE es la (nica prote)na *umana que contiene un dominio quinasa
perteneciente a la %amilia del +,- (+epresor, ,+., /uinasa)#
El GNE es una en&ima 0i%uncional es importante para la 0ios)ntesis del acido sialico# 1os
2cidos sialicos son monosac2ridos de 3 car0onos que son altamente e4presadas en la
super%icie de c5lulas Eucariotas adem2s est2n presentes en 6lucoproteinas ! 6lucolipidos est2n
in$olucradas en %unciones 0iol'6icos como en los procesos de reconocimiento celular#
.i6#7 mol5culas cla$es de a&(car en la $)a de 0ios)ntesis de acido sialico#
8res prote)nas iso%ormas *an sido descritas por el GNE *umano, donde la iso%orma 7 es
responsa0le del suplemento 02sico del acido sialico# 9so%orma 2 ! : reducen la acti$idad de la
epimerasa manteniendo casi intacto la acti$idad de la quinasa ! pueden a;ustar la producci'n
de acido sialicos#
Estado oligo!rico d!l doinio "inaso GNE
Pre$ios estudios de mutaciones suprimidas *a su6erido que el dominio <inaso GNE , es
responsa0le de la dimeri&aci'n, mientras que un se6mento de residuos entre los dominios
<inaso ! epimeraso (+esiduos :6=-:>2) , es un lu6ar potencial para la trimeri&aci'n #
El l'0ulo "-8erminal ( +esiduos ?==-?7? en $erde)
El l'0ulo N-8erminal (+esiduos @?A-@3>, se pierde en el
mapa de densidad electr'nica ! son presentados , como una
l)nea punteada ne6ra)
Estructura 6eneral del dominio <inaso del GNE
El dominio <inaso del GNE, %ue cristali&ado con : mol5culas, un an2lisis con;unto su6iere
que 2 de las : mol5culas se dimeri&an a tra$5s del l'0ulo "#
+epresentaci'n del d)mero del dominio <inaso
del GNE
+epresentaci'n +i00on de la estructura
dimerica del dominio <inaso, los l'0ulos N ,
son mostrados de color a&ul, ! los l'0ulo " de
ro;o#
Mientras la tercera mol5cula se dimeri&a ! ocurre un ple6amiento de la mol5cula a tra$5s
del mismo l'0ulo "#
Un an2lisis de cristalo6ra%)a re$ela la e4istencia de un *e42mero cristalo6r2%ico que puede
ser producido en un do0le ple6amiento rotacionalmente sim5trico, es aplicada a las :
mol5culas en la unidad asim5trica#
En este *e42mero los l'0ulos N de las : mol5culas <inaso apuntan al mismo lado del
plano de *e4ameri&acion#
Be42mero cristalo6r2%ico de la GNE
1os l'0ulos N del d)mero son mostrados de a&ul, mientras que el l'0ulo " en ro;o#
El l'0ulo N de la tercera mol5cula que %orma un d)mero con una mol5cula
sim5tricamente relacionada se muestra de color ma6enta ! la del l'0ulo " de
amarillo#
1as : mol5culas sim5tricamente relacionadas est2n de plomo#
Cisita desde a0a;o del *e42mero cristalo6r2%ico tras un 6iro de 3= D
1os l'0ulos N de cada d)mero est2n locali&ados en el lado opuesto del *e42mero ! es
consistente con la proposici'n de que el se6mento interdominio ( residuo :6=- :>2) es el
lu6ar para la trimeri&acion#
COM#ARACION ESTRUCTURAL CON LOS MIEM$ROS DE LA %AMILIA RO&
Para reali&ar la comparaci'n estructural de *omolo6)a del Dominio GNE /uinasa, con otros
miem0ros de la %amilia +,-, se uso el ser$idor "A8.A8, el cual re$elo @ puntos principalesE
PDFG, PDF74c:, PDF7&=A ! PDF7&6r, los cuales tiene en com(n contener al moti$o uni'n-
&incH otros *alla&6os 0asados en estos @ puntos determinaron que el PDF G##se encuentra en
N-acetilmanosamina del E. coliH el PDF74c:E %orma parte de la estructura de .ructoquinasa
de Bacillus subtilisH PDF7&=AE representa los representa los residuos unidos al atomo de &inc
de la estructura de la %amilia +,-, el cual es un re6ulador transcripcional *omolo6o a Mlc del
E. coli ! PDF7&6rE representa los sitios de uni'n de los residuos al atomo de &inc en la
estructura Mlc de E. coli. 1le6ando a la conclusi'n que el doinio GNE /uinasa con;u6a 0ien
con la estructura Mlc de E. coli, es decir el N-1o0ulo del Dominio /uinasa GNE se alinea
con el E-Dominio de Mlc ! el "-1o0ulo del Dominio /uinasa GNE se alinea con el ,-
Dominio de MlcH el ,-Dominio de Mlc es responsa0le de la ,li6omeri&acion de la prote)na
Mlc, en una %orma mu! similar a la dimeri&aci'n del GNE /uinasa a tra$5s del "-1o0uloH sin
em0ar6o estas @ estructuras no contienen li6amento de a&(car, el cual a!udara a %ormar un
sustrato que ser$ir2 de enlace para el GNE, para e$aluar este posi0le sitio de enlace se alineo
la secuencia del Dominio /uinasa GNE con la del Glucoquinasa unido a 6lucosa#
MA#EO ESTRUCTURAL DE LA MUTACIONES RELACIONADAS CON LAS
EN%ERMEDADES GNE
El mapeo de las mutaciones sin sentido relacionados a la en%ermedad en la estructura del
dominio quinasa re$elaron que los sitios de mutaci'n pueden ser clasi%icados en @ 6rupos
0asados en el lu6ar como sonE 9nter%ace en el dimero, *elices interlo0ulares, super%icie de
prote)nas, o dentro de otros elementos estructurales di%erentes#
-Mutacion 'unti(or! ti'o I !n !l doinio )uinasa d!l GNE: Entre los residuos tenemos
9AA?, GAA3, CA?2 ! GA?6 que est2 locali&ado en el inter%ace de dimeri&acion del lo0ulo " !
la mutacion de estos residuos pueden inter%erir con la dimeri&acion del dominio <inaseH es
decir que no de;a %ormar dimeros#
Ademas la locali&acion de este 6rupo de residuos esta in$olucrados en la uni'n del sustrato de
a&ucar# 1as mutaciones de estos residuos puede tam0ien ademas a%ectar indirectamente la
a%inidad de la union del sustrato de a&ucar del dominio <inaso#
-Mutacion 'unti(or! ti'o II !n !l doinio )uinasa d!l GNEE Entre los residuos inclu!en
estos locali&ados en las *elices inter%aciales entre los lo0ulos N !
" ( NA73, AA2@, .A2>, G?=> ! M?72) lo cual a%ecta la uni'n del A8PH adem2s la mutacion de
estos residuos pueden cam0iar el mo$imiento interlo0ar durante la catalisis ! ademas tam0ien
a%ectar la acti$idad quinase de la proteina#
- Mutacion 'unti(or! ti'o III !n !l doinio )uinasa d!l GNE: "ontiene los residuos
PA77 este tiene la mas alta acceci0ilidad relati$a del sol$ente (I@=J) a lo lar6o de 2: sitios
mutaciones ! es locali&ado en una re6ion cur$a de la estructura# Este residuo a%ecta la
le4i0ilidad a la *ora de %ormar los 6rupos ma!ores de la GNE en el estado oli6omerico#
- Mutacion 'unti(or! ti'o I* !n !l doinio )uinasa d!l GNE: Estos residuos inclu!en
todo el resto de los sitios de mutacion# 1as mutaciones de estos residuos interrumpirian los
elementos estructurales secundarios en sitios dados de mutacion, ! pueden inter%erir con las
interacciones *idro%o0icas de los elementos estructurales secundarios que esta0ili&an la
estructura cuaternaria proteicaH es decir a%ecta la esta0ilidad de la prote)na#
Desde la identi%icacion de la relacion del entre las mutaciones GNE ! Miopatia autosomica
recesi$a por cuerpos de inclusi'n(B9FM) , mas de 6= mutaciones *an sido encontradas
asociadas al B9FM# Entre estas mutaciones 2A mutaciones sin sentido en 2: sitios unicos
%ueron *allados en el dominio <inase de la proteina GNE#
INCLUSION MIO#ATIA +EREDITARIA DEL CUER#O ,+I$M-:Kon trastornos
neuromusculares caracteri&adas por de0ilidad muscular que se desarrolla en los adultos !
;'$enes# 1a inclusi'n miopat)as *ereditaria del cuerpos inclui!e tanto autos'mica recesi$a !
autos'mica dominante (9FM7) trastornos musculares que tienen una e4presi'n $aria0le
( %enotipo ) en pacientes indi$iduales, pero todos comparten caracter)sticas estructurales
similares en los m(sculos, en donde los cu2driceps son uno de los musculos que se de0ilitan
Una %orma autosomica recesi$a como Nona<a miopat)a distal, esta asociada a la alteraci'n del
6en GNE (UDP-N-acetil6lucosamina-2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa), implicada
en la ruta 0iosint5tica del 2cido si2lico, es decir, ori6inando carencia de acido sialico#
Clonacin d! ADN . !/'r!sin 0 'uri(icacin d! 'rot!1nas
Para la clonaci'n del ADNc $a necesitar de un $ector para que pueda asi tener una
replicaci'n aut'noma e in6resar a la c5lula *ospedadora ! por medio ! por medio de una
in%ecci'n $iral $a permitir 6enera un numero ele$ados de copias de 6enes
El $ector utili&ado en este caso es E# coli porque 6aranti&a una in%ecci'n $iral superior al que
los palsmodium adem2s porque la E# coli su cod'n es 'ptimo con el 2cido sialico (GNE)#
1a prote)na se so0re e4presa en la E#coli , tiene que ser culti$ada en un medio de 8erri%ic
Frot*, lue6o se procede a 0a;ar la temperatura a 7AD " lue6o a las c5lulas se le inducen
=,AmM de isopropil 7 tio 0- 6alactopiran'sido ! se de;a crecer adicionalmente por una
noc*e# 1ue6o esas c5lulas son lle$adas a centri%u6aci'n, se con6elan con nitr'6eno l)quido !
se si6ue almacenando a >=D" *asta su puri%icaci'n#
1as c5lulas se descon6elan ! se re suspenden con 8amp'n de BEPEK (PBL?,A) ! se
complementan AmM de imida&ol, lue6o se procede a una lisis ! centri%u6aci'n (cu!o
prop'sito es de separar las mol5culas se6(n su tamaMo), 1as prote)na que se o0tiene por
centri%u6aci'n $an a ser captadas por Ni- N8A perlas ! lue6o $an a ser eluidas con 8amp'n de
BE+PEK, la prote)na eluida $a contener el GNE que se puri%ica adicionalmente por
Kupderde4- ?A cromato6ra%)a de e4clusi'n por tamaMo#
1as %racciones que %ueron eluidas se ;untan ! se almacenan en 8amp'n de BE+PEK para que
puedan ser usadas en lacristali&acion#
1A "+9K8A19NA"9,N O DE8E+M9NA"9,N DE EK8+U"+U+A
1A "+9K8A19NA"9,N#- es un proceso mediante el cual las mol5culas se $an ordenar
%ormando estructuras de cristal, el m5todo requiere quela prote)na ten6a una concentraci'n de
2 a A= m6/ml# A la cual se aMade soluciones con pB especi%ico con intenci'n de disminuir la
solu0ilidad ! 6enerar los cristales, e4iste di$ersos t5cnicas para la reali&ar cristali&aci'n de
mol5culas, en el tra0a;o se usa la t5cnica de 6ota sentada con di%usi'n de $apor para la cual se
coloca una 6ota de prote)na !a puri%icada ! conser$ada con una concentraci'n de @=m6/ml a
una estructura seme;ante a silla que enca;a en el interior de un posilla#
El primer paso para determinar la estructura tridimensional de cualquier mol5cula por
di%racci'n de ra!os 4 es conse6uir cristales adecuados, el cual se somete a di%racci'n, el 54ito
depender2 muc*o de los cuidados que ten6amos para o0tener los cristales#se dice que muc*as
mol5culas importantes no aparecen en 0anco de datos de la prote)na por que *an %allado los
intentos de tener cristales adecuados#
Una $e& que se o0tiene el cristal, se produce un patr'n de di%racci'n por irradiaci'n de ra!os
4# este patr'n consiste en miles de puntos que son datos crudos la posici'n e intensidad de
cada punto es determinada las %ases de la ondas que %orman, cada punto de0en ser tam0i5n
determinados para producir una mapa de densidad electr'nica# Esta ima6en se interpreta al
construir un modelo estructural inicial de prote)na# 9nterpretando la %unci'n de la densidad
electr'nica ! completar el modelo o0teniendo las posiciones de tomos restantes ! por ultimo
se de0e re%inar el molde a;ustando todas las posiciones at'micos para conse6uir que el patr'n
de di%racci'n calculada con dic*as celdas sea lo mas parecido posi0le al patr'n de di%racci'n
e4perimental ! %inalmente $alidar ! representar la estructura o0tenida ! 6uardar en un 0anco
de datos para que sea usado por los dem2s pro%esionales