CLONAGEM MOLECULAR E TRANSFORMAO BACTERIANA

I - INTRODUO
Atualmente muito comum ouvirmos falar de clonagem em meios de
comunicao que atingem o grande pblico. tambm bastante comum
assistirmos a discusses sobre tica e importncia da clonagem entre pessoas
que pouco sabem sobre a parte tcnica do que esto discutindo e, muitas
vezes, tambm sabem pouco sobre os objetivos dos pesquisadores com os
experimentos que so mostrados de forma sensacionalista na mdia. Esta
situao acaba dificultando o julgamento final: quem clona do Bem ou do
Mal?
O termo clonagem pode ser entendido como o processo de fazer cpias exatas
de um organismo ou de qualquer elemento. Portanto, quando dizemos que a
ovelha Dolly um clone, queremos dizer que ela uma cpia exata de outra
ovelha.
Para obter este tipo de cpia, a clonagem iniciada com clulas e, por esta
razo, chamada clonagem celular.
O caso que vamos examinar, no consiste em fazer cpias de uma clula, mas
de uma molcula em particular. A clonagem de uma molcula (e no mais uma
clula ou um organismo) chamada clonagem molecular, assunto deste texto.
A molcula a ser clonada uma molcula de DNA. Alm disto, o termo
utilizado, neste caso, no mais para se referir a todo o processo de cpia da
molcula, mas apenas etapa inicial de ligao do inserto no vetor. Vetor?
Inserto? Ligao? Vamos por etapas.

Vetores so molculas de DNA plasmidial (plasmdios) dupla-fita, circular, que
tm replicao independente da do DNA genmico da bactria. Os plasmdios
so passados de gerao para gerao e podem ser facilmente introduzidos
em bactrias que no os contenham. Logo, se grudarmos um fragmento de
DNA (como, por exemplo, o gene que contm a informao para produo de
insulina), em um vetor e o introduzirmos na bactria, o gene da insulina
passar a ser copiado cada vez que o vetor replicado. Os pesquisadores
chamam os fragmentos especficos de genes de insertos e o processo de
grudar o inserto em vetores, de ligao. O vetor que contm um inserto
chamado de vetor recombinante, ou ento de construo, e o processo de
introduzir o vetor recombinante na bactria, para que ela o copie, chamado
de transformao bacteriana.

II CLONAGEM MOLECULAR
Antes de clonarmos um gene, temos que obt-lo em quantidade suficiente para
realizar o processo de lig-lo ao vetor. Para a obteno precisamos ter
informaes sobre este gene: sua seqncia de nucleotdeos, organismos que
o contenham e tecidos em que encontrado. A obteno do gene ou do cDNA
de interesse (o nosso inserto) pode ser feita por PCR, RT-PCR ou outras
tcnicas equivalentes, que so determinadas de acordo com o material de
partida com o qual estamos trabalhando. Se o material de partida DNA
podemos utilizar PCR; se RNA, temos que usar RT-PCR.
s vezes clonamos genes com a inteno de express-los em um organismo.
Expressar um gene significa produzir a protena que ele codifica. Quando
estamos trabalhando com genes de eucariotos e a inteno utilizar estes
genes para serem expressos em bactrias, temos que levar em conta que
estas, como procariotos, no so capazes de distinguir exons de introns. Esta
incapacidade leva as bactrias a produzir uma protena errada quando h
introns presentes no gene que pretendemos expressar. Nestes casos, o
problema pode ser contornado clonando o cDNA e no o gene inteiro. cDNA
uma seqncia de DNA obtida de uma polimerizao utilizando RNAm como
molde e que, portanto, contm somente os desoxirribonucleotdios
correspondentes aos exons.
Aps a obteno do inserto, temos que ter em mos o vetor j pronto para a
clonagem. Os vetores so plasmdios que recebem este nome porque
transportam o inserto para dentro da bactria. Na verdade, os vetores so
plasmdios modificados pelos cientistas para maximizar suas possibilidades de
uso como ferramenta de Engenharia Gentica. Aos plasmdios foram
adicionados alguns acessrios, como stios mltiplos de clonagem (SMC),
cassetes de resistncia a antibiticos, marcadores para seleo e outros.
O stio mltiplo de clonagem consiste em uma regio que contm stios para
vrias enzimas de restrio, o que permite que este vetor possa ser aberto por
vrias enzimas. importante lembrar que para ligar duas molculas de DNA
que tenham sido clivadas de forma coesiva necessrio que estas duas
molculas tenham sido clivadas com a mesma enzima de restrio.
Cassetes de resistncia a antibiticos so genes que codificam fatores que
bloqueiam a ao de antibiticos como, por exemplo, a enzima b-lactamase.
Quando produzida, esta enzima destri os antibiticos que contm em sua
estrutura um anel b-lactmico: penicilina, ampicilina e derivados. As bactrias
que contm este cassete so capazes de crescer em meio contendo aqueles
antibiticos. Isso nos d uma grande vantagem, pois permite que cultivemos
bactrias em meio de cultura contendo antibiticos e possamos selecionar
somente aquelas que contenham os vetores que nos interessam. Esta uma
estratgia explorada diariamente nos laboratrios de pesquisa no mundo todo,
evitando que bactrias do ar contaminem experimentos.
Marcadores de seleo so genes que codificam enzimas, como a b-
galactosidade, por exemplo, e que se localizam sobre o stio mltiplo de
clonagem (SMC). Quando um inserto clonado no SMC o gene da b-
galactosidase interrompido e deixa de produzir a referida enzima. A b-
galactosidase uma enzima que catalisa a converso de substratos
cromognicos incolores em compostos coloridos. Logo, adicionando estes
substratos ao meio e observando se a colnia bacteriana produz compostos
coloridos podemos saber quais colnias na placa contm o vetor recombinante.
Esta caracterstica pode ser explorada para a identificao de vetores que
realmente receberam um inserto.
Agora que j temos vetor e inserto, proceder clonagem uma estratgia
simples. Basta misturar os dois em propores adequadas, adicionar a enzima
DNA ligase e incubar para que a ligao ocorra. Existem clculos que levam
em conta a massa dos DNAs e seu tamanho em pares de base para saber a
proporo exata que deve ser utilizada de vetor e inserto em uma reao de
ligao mas, na prtica, uma dose de empirismo acaba fazendo com que se
deixe os clculos de lado.
Aps a reao de ligao temos que fazer cpias desta construo que tanto
trabalho nos deu e para isto utilizamos as bactrias.

III TRANSFORMAO BACTERIANA
A transformao bacteriana o processo de inserir um vetor, recombinante ou
no, em uma bactria e recebe este nome porque geralmente quando
realizamos este processo estamos conferindo caractersticas novas bactria,
como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo
antibiticos. A bactria com novas caractersticas dita transformada.
Basicamente, existem dois procedimentos para realizar a transformao
bacteriana: a eletroporao e a transformao com cloreto de clcio.
A eletroporao uma tcnica na qual se misturam bactrias e o vetor em um
nico tubo e aplica-se um choque eltrico na mistura, com o objetivo de
desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor na bactria. Ela
ento rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37C para
que possa se recuperar aps o choque.
A transformao com cloreto de clcio tem o mesmo objetivo. As bactrias e o
vetor so misturados com uma soluo de cloreto de clcio e sofrem um
choque trmico. Os ons clcio tm a funo de neutralizar as cargas negativas
do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela
membrana no momento do choque trmico (que, portanto, tem a mesma
funo do choque eltrico).
Aps a transformao, as bactrias so incubadas em condies adequadas
para que possam se multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio slido, para
que colnias possam ser isoladas. A identificao das colnias recombinantes
feita utilizando as caractersticas conferidas pelos plasmdios. Uma vez
identificada a bactria que contm a construo de interesse dentre as vrias
plaqueadas, basta transferir a colnia para meio lquido para que se obtenha
milhes de cpias da bactria e, conseqentemente, da construo.

1. Considerando os esboos de um plasmdeo e de um fragmento de DNA abaixo,
como seria possvel clonar este DNA no plasmdeo?
Leve em conta que o fragmento de DNA foi isolado com os oligos 1 e 2. O primer 1
foi desenhado com um stio de BamHI e o primer 2 com stio de XhoI como
adapatadores.