Manual de Prcticas

Sistemas Pelgicos y Bentnicos

Juan Luis Gmez Pinchetti y Javier Arstegui Ruiz
Dpto. Biologa, Universidad de Las Palmas de G.C.
Edificio de Ciencias Bsicas, Campus Universitario de Tafira
35017 Las Palmas de Gran Canaria
Introduccin
El objetivo general de esta prctica es disear y realizar un experimento que
consiste en el seguimiento, utilizando tcnicas de laboratorio relativamente
sencillas, de los parmetros de crecimiento de una especie fitoplanctnica en
condiciones de cultivo y bajo condiciones de estrs.
Con este estudio se pretende que los alumnos se familiaricen con las tcnicas
de medida de oxgeno disuelto en agua para obtener datos de produccin y
respiracin, extraccin de pigmentos fotosintticos, realizacin de contajes
celulares y medidas espectrofotomtricas, as como con el diseo y desarrollo
de experimentos en el laboratorio.
Las prcticas se desarrollarn en tres fases. En una primera fase se realizar el
diseo de los experimentos por parte del grupo de prcticas, fijando:
1.- Las caractersticas del cultivo:
n La especie a cultivar (entre varas propuestas)
n Medio de cultivo a emplear
n Condiciones de irradiacin, fotoperiodo y temperatura
2.- Las condiciones de crecimiento/factores de estrs:
n Efecto de (entre varias propuestas):
Limitacin de nutrientes (nitrgeno o fsforo)
Efecto de la adicin de sustancias txicas (metales pesados o
herbicidas) en concentraciones determinadas
3.- Los parmetros que se van a muestrear, principalmente:
n Crecimiento del cultivo: tasa de crecimiento y capacidad de carga del
cultivo estimada por contaje celular
n Densidad ptica del cultivo
n Determinacin espectrofotomtrica de clorofilas, carotenoides y
feopigmentos
n Clculo del ndice de Margalef
n Produccin neta, produccin bruta y respiracin
Posteriormente se realizar una explicacin de las tcnicas a utilizar durante el
desarrollo de la prctica y se comenzar todo el trabajo prctico / experimental
de la misma.
En la tercera fase, una vez finalizado el desarrollo experimental, el alumno
deber realizar un informe en forma de artculo cientfico en el que se
presenten los antecedentes, resultados y las conclusiones obtenidas.
El presente manual de prcticas, en sus diferentes versiones, trata de ser una
gua completa para el desarrollo de la prctica, de forma que el grupo de
trabajo pueda trabajar, recopilar los datos y elaborar el informe de prcticas de
forma independiente.
Material y mtodos
Diseo del experimento
El experimento planteado se desarrollar de acuerdo con el siguiente diseo:
Eleccin de la cepa para el cultivo (ver Cepas)
Establecer el tratamiento a aplicar durante el desarrollo del experimento:
c Limitacin de nutrientes: c Fsforo
c Nitrgeno
c Adicin de metales: c Cadmio (CdCl
2
)
c Cobre (CuCl
2
)
c Plomo (PbCl
2
)
c Selenio
c Otros (especificar )
c Adicin de herbicidas: c DCMU
c Otros (especificar )
Establecer las concentraciones de cada tratamiento (no olvidar las
unidades):
c Control (sin modificacin)
c Cultivo N1:
c Cultivo N2:
Establecer el momento de la modificacin/adicin del tratamiento
seleccionado. Lo correcto sera realizarlo una vez que el cultivo alcanza la
fase exponencial tarda lo que se determina estudiando los parmetros de
crecimiento (contaje celular, densidad ptica)
Preparacin de medio de cultivo (3 L) en matraces de capacidad 5 L y por
duplicado para cada uno de los diferentes tratamientos (total 18 L: 6 L por
tratamiento)
Establecer las condiciones de cultivo en la cmara de cultivo:
c Irradiacin:..................... moles fotones m
-2
s
-1
c Fotoperiodo:................... L:O
c Temperatura:.................. C
c Aireacin: c Si c No
Realizar muestreos diarios para analizar cada uno de los parmetros de
estudio. Los muestreos deben realizarse de la forma ms homogenea
posible, siguiendo la siguiente metodologa:
1.- Agitar el cultivo con suavidad, para obtener una distribucin homognea de
las clulas en el medio, y que la muestra sea lo ms representativa del estado
del cultivo
2.- Tomar el volumen necesario de cultivo de forma representativa, y
mantenerlo en un vaso de precipitado, en condiciones de luz y temperatura lo
ms parecidas a las establecidas para el cultivo.
Cepas
Las diferentes especies y cepas que se utilizan en las sucesivas prcticas han
sido obtenidas del BANGAL (Banco Nacional de Germoplasma de Algas) y
pertenecen a la Divisin Chlorophyta (algas verdes):
c Chlorella pyrenoidosa
c Scenedesmus subspicatus
c Chlamydomonas pyrenoidosa

Figura 1.- Aspecto de Chlorella, Scenedesmus y Chlamydomonas (Lund y Lund, 1995)
Descripcin general de los gneros:
Chlorella (especies dulceacucolas o marinas): verde, no-mvil y sin flagelo.
Clulas esfricas de talla media, 2-10 m de dimetro, dependiendo de la
especie y con un cloroplasto en forma de copa. Se reproducen formando entre
2 y 8 clulas hijas en la clula madre que son expulsadas al exterior
dependiendo de las condiciones del medio. Algunas especies son utilizadas en
acuicultura como alimento de rotferos y daphnias.
Scenedesmus (especies dulceacucolas): verde, no-mvil que generalmente se
agrupa formando colonias de 4 clulas. Talla media entre 12-14 m de ancho y
15-20 m de largo. Las clulas son elpticas o lanceoladas y algunas presentan
espinas. Cada clula se reproduce dando lugar a una nueva colonia de 4
clulas. No se usa generalmente como fuente de alimento.
Chlamydomonas (especies dulceacucolas o marinas): verde, con capacidad de
movimiento. Tamaos que varan entre 6-11 m de ancho y 7-14 m de largo,
con dos flagelos en una de las zonas polares. Las clulas se mueven de forma
rpida y presentan un movimiento en forma de sacudida. Clulas de forma
esfrica o alargada. Cuando las clulas hijas estn siendo formadas, la clula
madre puede perder los flagelos y secretar un muclago transparente. La clula
madre da lugar a 2-8 clulas hijas. En este estado del ciclo celular se pueden
formar precipitados debido a la mayor densidad con respecto al medio. Usada
como alimento para rotferos.
Medios de cultivo
Para llevar a cabo el cultivo de una especie fitopianctnica en condiciones
controladas, es necesario preparar un medio de cultivo, que le sirva como
fuente de nutrientes para el crecimiento. El procedimiento para la preparacin
de los diferentes medios de cultivo, especficos para cada cepa, est
estandarizado y uno de los puntos importantes es la esterilizacin de los
medios y soluciones para evitar el crecimiento de bacterias u otros organismos
que puedan contaminar el cultivo.
Las soluciones madre descritas para cada medio de cultivo se aaden
teniendo en cuenta los volmenes del medio que vamos a preparar y una vez
aadidas y disueltas procederemos a aadir el volumen indicado de la cepa
con la que vamos a trabajar.
Para el cultivo en laboratorio de las tres especies con las que vamos a trabajar
se utiliza el conocido como Medio Mnimo (Sueoka, 1960) cuya composicin se
presenta en la tabla 1.
Tabla 1.- Composicin del Medio Mnimo para el cultivo en laboratorio de Chlorella,
Scenedesmus y Chlamydomonas spp.
Sal
Sol.
"madre"
(g / L)
Dilucin
(ml / L)
Solucin 1
NH
4
Cl
CaCl
2
2H
2
O
MgSO
4
16.00
2.04
4.00
25
Solucin 2
K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
37.42
14.52
25
Solucin Trazas
EDTA
ZnSO
4
7H
2
O
H
3
BO
3
MnCl
2
4H
2
O
FeSO
4
7H
2
O
CoCl
2
6H
2
O
CuSO
4
5H
2
O
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
50.00
22.00
11.40
5.06
4.99
1.61
1.57
1.10
1
Contaje celular
En los experimentos con cultivos fitoplanctnicos es necesario tener un
control de la evolucin de la abundancia en el nmero de clulas para poder ir
relacionando los parmetros que se estn estudiando en el cultivo con las
distintas fases de crecimiento del mismo, con la densidad, o hacer ndices
normalizados con respecto a la biomasa.
De forma general, y como observamos en la siguiente figura, la evolucin en el
crecimiento de un cultivo presenta una serie de fases que se interpre-tan de la
siguiente manera:
Fase A.- Periodo de latencia o adaptacin: no hay aumento significativo de la
densidad celular
Fase B.- Periodo de crecimiento exponencial
Fase C.- Periodo de retardo: desaparece el crecimiento exponencial
Fase D.- Periodo estacionario: no hay cambios significativos de la densidad
celular con respecto al tiempo
Fase E.- Fase de senescencia
Figura 2.- Evolucin ideal del crecimiento (n clulas) de un
cultivo con respecto al tiempo
La forma ms sencilla de estimar la abundancia del cultivo es el recuento
celular, que no es ms que un contaje de las clulas contenidas en un volmen
conocido del cultivo. Para realizar este contaje se utiliza un porta-objetos
especial, denominado Cmara Thoma (ver figura 3).
Este porta-objetos tiene grabada una rejilla, mediante la cual se facilita el
contaje de clulas en el microscopio.
Figura 3.- Cmara Thoma para el contaje del nmero de clulas
Caractersticas de la cmara de contaje (Cmara Thoma):
400 celdillas pequeas con S=0.0025 mm
2
/ celdilla
Agrupadas en 16 celdas con S= 0.0625 mm
2
/ celda
Superficie Total = S
T
= 1 mm
2
Altura con cubre-objetos = 0.1 mm
Volumen Total de la cmara V
T
= 0.1 mm
3
Metodologa:
1.- Se obtiene un pequeo volumen (3 mL), lo ms homogneo posible, de la
muestra tomada del cultivo. Se aaden dos gotas de lugol (5 g I
2
+10 g KI+100
mL H
2
O) para fijar las clulas (as evitando que se muevan y sea complicado
contarlas) y se agita para que la fijacin sea completa.
2.- Mediante una pipeta Pasteur se llena la Cmara Thoma, previamente
cubierta con un cubre-objetos, teniendo cuidado de que la muestra se
distribuya de forma homognea y sin burbujas, y se sita en un microscopio
ptico. Se coloca el objetivo de menor aumento y se enfoca. Para enfocar bien
el microscopio hay que mover muy lentamente el macrmetro, con cuidado y
paciencia, no hay que desplazar mucho el macrmetro del lugar de enfoque del
objetivo previo. Repetir la operacin con el objetivo de aumento ptimo para la
visin de la cmara y la muestra.
3.- Una vez enfocado es necesario contar las clulas que se encuentran en el
interior de las celdillas grabadas en la Cmara Thoma. Hay 16 celdas grandes
(aprox. del tamao del campo completo del microscopio a los
mximos aumentos), cada una de las cuales encierra 25 celdillas pequeas
(para facilitar el contaje). Cada celdilla pequea tiene una superficie de 0.0025
mm
2
y tenemos en total 400 celdillas (1 mm
2
). Una vez situado el cubre-objetos
y llena la cmara con muestra tendremos una altura / profun-didad de 0.1 mm.
Por lo tanto el volumen total de la cmara ser 0.1 mm
3
.
Es necesario contar todas las celdillas, en el caso de clulas que se
encuentren sobre las lneas de una celdilla, se toma como criterio contar las
que estn sobre las lneas superior y derecha de un cuadro y no contar las que
estn sobre las lneas inferior e izquierda. Realizar el contaje por triplicado.
Ejemplo: 500 clulas / 0.1 mm
3
= 5000 cel / mm
3
Multiplicando x 10
3
= 5 x 10
6
cel / cm
3
= 5 x 10
6
cel / mL
Densidad ptica
Se trata de relacionar la absorbancia de luz de un cultivo con la concentra-cin
de las celulas. La medida se realiza directamente en una cubeta con cultivo y
midiendo la absorbancia a 660 y 750 nm para corregir la turbidez. La relacin
entre concentracin de clulas y absorbancia es prcticamente lineal. Puede
establecerse esta relacin con datos de abundancia celular obtenidos mediante
contaje.
Metodologa:
1.- Se toma una muestra del cultivo en un vaso de precipitado, teniendo gran
cuidado de que sea homognea y representativa del contenido celular del
cultivo.
2.- Se hace un blanco con agua destilada a 750 y 660 nm, se mide la
absorbancia del cultivo a 750 y 660 nm y se resta a los valores de la
absorbancia del cultivo los valores de la absorbancia del blanco de agua
destilada. El valor obtenido es el dato de la densidad ptica del cultivo.
Realizar la medicin por triplicado.
DO = A
660
A
750
Pigmentos
La determinacin de la concentracin de pigmentos fotosintticos, tanto en
muestras de agua dulce como en muestras marinas, se realiza para estimar la
biomasa y las caractersticas fotosintticas de los organismos auttrofos.
La clorofila a es el principal pigmento fotosinttico presente en todas las
especies de fitoplancton. Sin embargo y por varios factores (principalmente las
variaciones en los ndices C:Chla) no es un indicador adecuado para estimar la
biomasa de fitoplancton. A pesar de ello, su medida resulta imprescindible para
la interpretacin de otros parmetros (como la produc-cin primaria) ya que
permite el clculo de determinadas funciones de los organismos por unidad de
biomasa.
Otros pigmentos, con estructuras qumicas muy similares a la clorofila a
(clorofila b, clorofila c y varios carotenoides como la fucoxantina, violaxantina y
neoxantina) tienen una funcin directa en la fotosntesis, mejorando la
absorbancia de la luz y la transferencia de los electrones hacia la clorofila a e
incluso jugando un papel de foto-proteccin (zeaxantina y luteina) frente a altas
intensidades de luz. La relacin entre distintas clases de pigmentos es
indicativa tanto de la composicin taxonmica de la muestra, como del estado
fisilogico de la comunidad.
Existe no obstante un problema al realizar este tipo de clculos, la concen-
tracin de cada pigmento por unidad de clulas no es constante. El fito-
plancton tiene la capacidad de adaptar las concentraciones de pigmentos en su
interior de acuerdo con su estado fisiolgico, la cantidad y calidad de la luz
disponible y otros factores fsicos y qumicos, como puede ser la salinidad.
La cuantificacin espectrofotomtrica de los distintos tipos de pigmentos se
basa en la lectura, mediante un espectrofotmetro, de la densidad optica a las
longitudes de onda en las que la absorbancia de luz es mxima para un
determinado pigmento. Con el espectrofotmetro se mide la extincin de la luz
al atravesar una cubeta en la que se ha colocado un extracto de pigmen-tos
celulares, es decir la intensidad de luz que absorben estos pigmentos a una
determinada longitud de onda (), que est directamente relacionada con la
concentracin de estos pigmentos en el extracto (Ley de Beer).
El problema es que en el extracto se encuentra una mezcla de los pigmentos
contenidos en la clula, y las absorbancias de stos se suman. Mediante una
serie de coeficientes se transforman estas densidades opticas en
concentraciones pigmentarias de los diferentes pigmentos (clorofilas y
carotenoides principalmente).
Productos de degradacin de la clorofila
Adems los productos de degradacin de la clorofila pueden formar una
fraccin importante del contenido total de pigmentos del fitoplancton que existe
en una muestra de agua de mar. Estos productos son el resultado de los
procesos de digestin del zooplancton que convierten la clorofila en
feopigmentos (feoforbidos y feofitina) as como de los procesos de
descomposicin orginados por las enzimas hidrolticas del fitoplancton que
pueden convertir la clorofila en clorofilida. El coeficiente de absorcin de este
ltimo pigmento es el mismo que el de la clorofila y por lo tanto no puede ser
estimado por espectrofotometra. Sin embargo, pueden determinarse los
feopigmentos al presentar un espectro de absorcin ms bajo que la clorofila
en la region de los 665nm. Para ello, se mide la extincin a 665 y 750 nm antes
y despus de la transformacin de toda
la clorofila de la muestra en feopigmentos.
Para la transformacin se acidifica la muestra (pH=2.5) aadiendo 2 gotas de
cido a la cubeta, se agita y se mide la extincin a 665 y 750 nm. Se corrige la
turbidez de la muestra restndole el valor de 750 nm a la extincin obtenida a
665 nm (antes y despus). De esta forma se elimina el
efecto de la dispersion de la luz por las partculas en suspensin.
Para calcular la concentracin de clorofila a y feopigmentos se utilizan las
ecuaciones de Lorenzen (1967).
Indice de Margalef
Se denomina Indice de Margalef a la relacin A
430
/A
665
(relacin carotenoides /
clorofila). Para su clculo, se dividen directamente las absorbancias leidas a
estas longitudes de onda. Este ndice proporciona una relacin entre una zona
del espectro en la que absorben todos los carotenoides y aquella en que
nicamente absorbe la clorofila. El ndice de Margalef vara de acuerdo con la
composicin taxonmica y el estado fisiolgico de la poblacin. En general, en
situaciones anmalas o limitantes, el indice aumenta. Tambin se aprecia un
aumento del mismo a lo largo de la sucesion de especies, lo que corresponde a
la aparicin de especies con tasa de renovacin ms lenta.
Metodologa:
Para el proceso de extraccin y cuantificacin de pigmentos se debe trabajar
en un lugar en cierta penumbra, sin que incida la luz intensa sobre el filtro o el
frasco de la acetona ya que los pigmentos son muy sensibles
a la luz.
1.- Se filtran 20 mL de cultivo sobre un filtro de fibra de vidrio (GF/F) (este es el
volumen V que hay que expresar en litros). Se utiliza para ello
un sistema de filtracin estandar. Es necesario eliminar el agua que queda en
los filtros colocndolos sobre un papel de filtro. El volmen de filtrado debe ser
seleccionado cada da dependiendo de la concentracin de
biomasa del cultivo, para que el filtro no quede muy verde y los pigmentos se
extraigan y cuantifiquen correctamente.
2.- Se introduce el filtro en un bote de vidrio y se aaden 10 mL de
acetona al 90% (este es el volumen del extracto v que hay que expresar en
mL). Hay que poner especial cuidado en que el filtro quede totalmente
sumergido en la acetona para que se extraigan bien los pigmentos.
3.- Se guarda el bote de vidrio con el filtro en la nevera y en oscuridad.
4.- Esperar 24 horas a que los pigmentos se extraigan completamente en la
acetona y continuar con el anlisis espectrofotomtrico.
Anlisis Espectrofotomtrico:
1.- Si se dispone de una centrfuga de laboratorio, despus de homogeneizar la
muestra con filtro incluido en un mortero, se distribuye el homogeneizado en
tubos de centrfuga y se realiza la separacin del extracto / precipitado
centrifugando a 5,000 rpm durante 10 min. Otra posibilidad es filtrar el extracto
acetnico sobre un filtro GF/F para separar el extracto acetonico que contiene
los pigmentos del resto. Ambos procesos sirven para eliminar las partculas en
suspensin que interfieren en la medida de la absorbancia.
2.- Seguidamente se llena una cubeta de espectrofotometra con el extracto
acetnico filtrado. Hay que tener cuidado de no perder volumen de extracto en
estas operaciones para poder realizar algunas repeticiones.
3.- Se lee la absorbancia a 750 nm en el espectrofotmetro, el valor debe ser
inferior a 0.015, en caso de que fuera mayor indicara que hay demasiada
materia en suspensin, sera necesario volver a filtrar (repetir el procedimiento
desde el paso 4).
4.- A continuacin, se leen las absorbancias a 430, 480, 510, 630,
647 y 664nm. Despus se lava la cubeta con acetona al 90% y se llena de
acetona para realizar una lectura para corregir la absorbancia debida al
disolvente en cada una de las longitudes de onda (Blanco). Apuntar los datos
obtenidos.
5.- Aadir 2 gotas de cido a la cubeta y agitar bien para degradar los
pigmentos, medir la extincin a 665 y 750 nm.
Ecuaciones de Jeffrey y Humphrey (1975) (los resultados se obtienen en mg /
m
3
):
Clorofila a = v x [(11.85 x A
664
) (1.54 x A
647
) (0.08 x A
630
)] / V
Clorofila b = v x [(21.03 x A
647
) (5.43 x A
664
) (2.66 x A
630
)] / V
Clorofila c = v x [(24.52 x A
630
) (1.67 x A
664
) (7.60 x A
647
)] / V
Carotenos = v x [(7.60 x A
480
) (1.49 x A
510
)] / V
Ecuaciones de Lorenzen (1967) (los resultados se obtienen en mg / m
3
):
Clorofila a = v x [26.7 x (A
665
A665a)] / V
Feopigmentos = v x [26.7 x (1.7 A665a A
665
)] / V
donde: v = volumen del extracto acetnico en mL
V = volumen de cultivo filtrado en L
A665a = extincin a 665 nm depus de acidificar
Indice de Margalef = A
430
/ A
665
Medidas de produccin
Medidas del oxigeno disuelto en agua
El oxgeno es un elemento muy relacionado con el metabolismo de la mayora
de los seres vivos, y por ello su determinacin en el medio acutico, puede
aportar informacin muy valiosa sobre los procesos biolgicos que en l se
producen.
La concentracin de oxgeno disuelto en el agua se debe entre otros
procesos a equilibrios entre la produccin de oxgeno por actividad auttrofa y
el consumo por actividad hetertrofa. Esto permite que mediante unos sencillos
dispositivos experimentales podamos estimar ndices de respiracin,
produccin bruta y produccin neta.
Clculo de la produccin
La produccin primaria puede ser determinada a partir de las variaciones en
la concentracin de oxgeno, en muestras de agua de mar incubadas en
botellas claras y oscuras. La metodologa no est exenta de problemas:
1.- debemos admitir que la fotorrespiracin no influye en las variaciones
2.- y si asumimos que la respiracin no se ve afectada por la ausencia de luz,
en la botella oscura habr una prdida de oxgeno debida al consumo por
respiracin.
3.- En la botella clara tendrn lugar, por el contrario, tanto procesos
fotosintticos como respiratorios, de tal forma, que si admitimos que la
eliminacin de oxgeno se debe solamente a la respiracin del fitoplancton y el
incremento, a los procesos fotosintticos, con unas sencillas sumas y restas
podemos obtener datos sobre produccin bruta, produccin neta
y respiracin.
A pesar de su simpleza, este mtodo presenta algunos inconvenientes que se
derivan, principalmente del confinamiento de la muestra en una botella
relativamente pequea, como son:
1.- el agotamiento de nutrientes,
2.- la proliferacin de bacterias debido a la presencia de un sustrato (en este
caso el interior de la botella), y
3.- la posible estratificacin que pueda tener lugar en el interior de la botella.
Poder realizar este tipo de experimentos exige disponer de un mtodo de
anlisis del oxgeno disuelto en el agua preciso y sencillo.
El mtodo Winkler
Desde que L.W. Winkler (1988) describiera un procedimiento qumico para
la determinacin de oxgeno en disolucin, este mtodo, con algunas
modificaciones, ha sido uno de los ms utilizados, no slo por su sencillez y
bajo costo, sino por ser adems una de las tcnicas de mayor exactitud.
Existen otra serie de mtodos, como los basados en la utilizacin de
electrodos, que se apoyan en "tablas de saturacin" preparadas a partir de
datos obtenidos por el Mtodo Winkler.
Los procesos qumicos del Mtodo Winkler tienen como objetivo final
obtener una cantidad de iodo disuelto proporcional a la cantidad de oxgeno
disuelto en agua que contena originalmente la muestra. La razn de elegir el
iodo no es otra que la iodometra es una titulacin que produce unos puntos
finales muy claros. Para obtener esta cantidad equivalente de iodo se realizan
dos pasos:
1.- Se aade a la muestra una solucin de manganeso divalente ms un lcali
fuerte, lo cual produce que cualquier cantidad de oxgeno disuelto existente
oxide rpidamente una cantidad similar de manganeso divalente a hidrxidos
de mayor valencia.
Mn(S0
4
) + 2 KOH K
2
SO
4
+ Mn(OH)
2
2 Mn(OH)
2
+ 0
2
2 MnO(OH)
2
2.- Cuando se acidifica la solucin en presencia de iones ioduro, el manganeso
oxidado vuelve a reducirse a su estado divalente y se oxida ioduro, liberando
iodo en una proporcin similar al oxgeno disuelto que en un principio haba.
Esta cantidad de iodo es lo que realmente se mide y esto se puede realizar por
medio de una valoracin qumica.
MnO(OH)
2
+ 2 H
2
SO
4
3 H
2
0 + Mn(S0
4
)
2
Mn(S0
4
)
2
+ Kl MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ I
2
La valoracin se suele realizar con tiosulfato de sodio previamente
estandarizado, y la reaccin que ste produce en la muestra es:
2 Na
2
S
2
0
3
+ I
2
Na
2
S
4
0
6
+ 2 NaI
La cantidad de oxgeno disuelto en el agua se obtiene mediante la siguiente
operacin:
ml O
2
/ litro = B/(B-2) x VNf/50 x 1000 x 8 x 22.4/32 x 1000
ml O
2
/ litro = 112000 B V N f / (B-2)
donde: B= volumen del frasco en mililitros
V= volumen utilizado de la solucin de tiosulfato sdico en litros
N= normalidad de la solucin de tiosulfato sdico
f= factor de correccin para N
Reactivos
1.- Solucin de sulfato manganoso: disolver 480 g de MnSO
4
4H
2
0 y enrasar
hasta 1 L con agua destilada. La solucin debe preservarse de la luz.
2.- Solucin alcalina de ioduro. Se disuelven:
1. 500 g de KOH en 500 ml de agua destilada
2. 300 g de KI en 450 ml de agua destilada.
Se mezclan estas dos soluciones con precaucin dejando enfriar. La solucin
debe preservarse de la luz.
3.- Solucin indicadora de almidn al 1%.
4.- Solucin cida: cido sulfrico 5M (llevar 280 ml de H
2
SO
4
hasta 1 L con
agua destilada).
5.- Solucin de IO
3
K (0.01 N).
6.- Solucin de tiosulfato sdico 0.01 N (aproximadamente ya que se
estandariza posteriormente)
Ensayo en Blanco
Dado que el mtodo se basa en reacciones de xido reduccin, es sensible a la
presencia de sustancias oxidantes en los reactivos. Por ello, una vez
preparados los reactivos debe hacerse un ensayo en blanco con agua destilada
para comprobar si stos se hallan libres de sustancias oxidantes. A 90 ml de
agua destilada recin hervida (libre de gases) se agregan sucesivamente:
- 2 ml de HCI concentrado o 1 ml de H
2
SO
4
concentrado
- 1 ml de solucin alcalina de ioduro
- 1 ml de solucin de MnSO
4
Se mezclan y se aade 1 ml de solucin indicadora de almidn. Si aparece la
coloracin azulada es debido a la presencia de sustancias oxidantes, cuya
concentracin aproximada se puede valorar titulando con la solucin de
tiosuifato sdico. El volumen empleado en la titulacin debe ser menor que 0.1
ml.
Estandarizacin
Como se indica anteriormente la solucin de tiosulfato debe ser estandarizada
antes de su utilizacin. El factor de correccin f se determina de la siguiente
forma:
A 50 ml de la prueba en blanco se le aaden 5 ml de solucin de IO
3
K 0.01
N, se deja reposar unos 2 minutos y se valora con tiosuifato. Para realizar el
clculo del factor f.
f = N
1
x V
1
/ N
2
x V
2
= 5 x 0.01 / V
2
x 0.01
Botellas B.O.D.
Un elemento fundamental de la determinacin del oxgeno son las botellas
B.O.D. (Demanda Biolgica de Oxgeno). Se trata de unas botellas con cierre
de tapn esmerilado, que sirven para encerrar un volmen muy preciso de
agua en la que realizar las incubaciones.
El elemento ms carcterstico de las botellas es el tapn esmerilado, que
cierra de forma precisa y hermtica la botella. Estas botellas no estn
construdas para contener todas el mismo volumen de agua, pueden variar
unos pocos mililitros, por esa razn es necesario calibrar el volmen de cada
una de las botellas, de la forma ms precisa posible para poder realizar con
precisin los clculos de oxgeno disuelto.
La calibracin de stas botellas se realiza gravimtricamente, pesando las
botellas vacas, y volvindolas a pesar llenas con agua destilada de gran
pureza, en condiciones muy controladas de temperatura. Con la diferencia de
pesos de las botellas y conociendo la densidad del agua a la temperatura de
pesado se puede determinar el volumen de la botella con una precisin
cercana a 10 l.
Metodologa:
Clculo de la produccin
1.- Tomar 3 botellas BOD:
- Asegurarse de que estn perfectamente limpias y secas.
- Comprobar que coinciden los nmeros de las botellas y los tapones.
- Apuntar los nmeros de las botellas usadas como Inicial, Clara y Oscura.
- Tomar los volmenes para cada una de ellas
2.- Agitar suavemente la muestra tomada del cultivo para que la distribucin
sea homognea.
3.- Con una manguera llenar las botellas con la muestras del cultivo
hasta rebosarlas, con cuidado de no producir burbujas, ni derramar un excesivo
volumen del cultivo.
4.- Tapar las botellas, asegurndose de cerrar cada botella con su tapn
correspondiente y de no dejar burbujas de aire dentro.
5.- Guardar la botella clara en las condiciones del cultivo, junto con la oscura
completamente preservada de la luz envuelta en papel de aluminio. Ambas se
guardan en una cubeta con agua puesta al efecto para evitar los cambios
bruscos de temperatura
6.- Rpidamente fijar el oxgeno de la botella inicial (ver Procedimiento Winkler)
y tomar el tiempo. Dejar incubando las botellas clara y oscura durante un
tiempo (que variar diariamente dependiendo de la cantidad de biomasa que
haya en el cultivo).
7.- Tomar las botellas clara y oscura, fijar el oxgeno, tomar el tiempo
y medir la cantidad de oxgeno (ver Procedimiento Winkler). En ambos casos
apuntar los datos.
Procedimiento Winkler
1.- Previamente al anlisis comprobar que se tienen todos los reactivos, que la
bureta est llena de tiosulfato, y que se dispone de un erlenmeyer de 50 ml,
una pipeta para cada reactivo y una probeta de 50 ml para tomar la solucin a
valorar. Es recomendable usar bata.
2.- Fijacin del oxgeno de la botella:
- Aadir 1 ml de Mn
2
SO
4
- Aadir 1 ml de solucin alcalina
- Cerrar la botella con cuidado para no atrapar burbujas, y agitar vigorosamente
- Esperar 5 minutos y volver a agitar vigorosamente la botella
- Esperar a que el precipitado se sedimiente ocupando menos de 1/3 del
volmen total.
3.- Aadir 1 ml de solucin cida, el precipitado se disolver cambiando a un
color ms oscuro. Cerrar la botella con cuidado y agitar hasta que se disuelva
todo el precipitado.
4.- Tomar 50 ml del contenido de la botella en un erlenmeyer y valorar con
tiosulfato mientras se agita. Cuando la solucin comience a tomar un color
transparente se aaden unas gotas de almidn, y este virar a un azul
oscuro, continuar la titulacin hasta que la disolucin se vuelva completamente
transparente.
5.- Tomar nota del volumen del tiosulfato utilizado en la valoracin.
Clculos:
B; Volumen de la botella DBO en ml = B:
V; Volumen de tiosulfato aadido en la valoracin en l = V:
Normalidad del tiosulfato = N:
Factor de correccin = f:
H
1
; H
2
; H
3
; Horas de fijacin de cada botella
ml O
2
/ litro = 112000 B V N f / (B-2)
para:
I (Botella Inicial)
C (Botella Clara)
O (Botella Oscura)
P
Neta
(ml O
2
/ l h) = C I / (H
2
H
1
)
P
Bruta
(ml O
2
/ l h) = C O / [(H
3
+H
2
)/2 H
1
]
R (ml O
2
/ l h) = I O / (H
3
H
1
)
Bibliografa recomendada
Alveal, K, Ferrario, ME, Oliveira, EC, Sar E. 1995. Manual de mtodos
ficolgicos. Universidad de Concepcin, Chile. 863 pp.
Hoff, FH, TW Snell. 1999. Plankton culture manual (Neslen, J. Ed.) 5 edicin.
Florida Aqua Farms Inc. 160 pp.
Jeffrey, SW, Humphrey, GF. 1975. New spectrophotometric equations for
determining chlorophylls a, b, c
1
and c
2
in higher plants, algae and natural
phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanz. 167:191-194.
Lorenzen, CJ. 1967. Determination of chlorophyll and phaeopigments by
spectrophotometric equations. Limnol. Oceangr. 23:11 -52.
Lund, H, Lund, JWG. 1995. Freshwater algae. Their microscopic world
explored. Biopress Ltd. Bristol, 360 pp.
Consejos tiles para la elaboracin
del informe de prcticas
El siguiente apartado pretende ser una breve gua para que el alumno, una vez
realizado el trabajo de laboratorio y analizados los resultados, elabore el
informe de la prctica de una forma clara, concisa y con estructura de artculo
cientfico. En este informe escrito se describen principalmente los
antecedentes, la metodologa, los resultados y las conclusiones a las que el
trabajo experimental ha dado lugar.
La estructura ms corriente para elaborar un informe de este estilo comprende
los siguientes apartados fundamentales:
1.- Ttulo: el menor nmero posible de palabras que describan
adecuadamente el contenido del artculo/informe
2.- Nombre del autor con su direccin de correo electrnico
3.- Resumen (no ms de 100 palabras): un resumen bien preparado permite
al lector identificar rpida y exactamente el contenido del documento,
determinar el inters y decidir as si tiene que leer el trabajo en su
totalidad
4.- Introduccin: su finalidad debe ser suministrar suficientes antecedentes
para que el lector pueda comprender y evaluar los resultados del estudio
sin necesidad de consultar publicaciones anteriores sobre el tema. Hay
que manifestar breve y claramente cul es el propsito al escribir el
artculo, eligiendo las referencias cuidadosamente para suministrar los
antecedentes ms importantes.
5.- Material y Mtodos: hay que describir de forma detallada el diseo
experimental y la metodologa empleada, de tal forma que otro investigador
competente pueda repetir los experimentos. La redaccin cuidadosa de
esta seccin es importante porque de acuerdo con el mtodo cientfico,
para que los resultados obtenidos sean valorables, deben ser
reproducibles; y para que puedan ser reproducibles es necesario dar la
informacin para que otros puedan repetir los experimentos. Y recuerda,
no copies literalmente la metodologa descrita en el Manual de prcticas.
6.- Resultados y Discusin: estas secciones pueden ser escritas juntas o por
separado, aunque por simplificacin en este caso es recomendable
escribirlas juntas; a medida que se presentan los resultados se discuten.
Para presentar los resultados de forma coherente, primero se debe hacer
una descripcin amplia de los experimentos de forma general pero sin
repetir los detalles experimentales ya descritos en la seccin Material y
Mtodos. En segundo lugar, hay que presentar los datos. Muy importante!:
hay que ofrecer los datos representativos y no los interminablemente
repetitivos. Utilizar tablas o figuras (escribe una leyenda para cada una de
ellas), dependiendo de cmo creas que se interpretan mejor tus resultados.
Ten en cuenta la claridad, la brevedad y utiliza las unidades correctas tanto
en las tablas como en las figuras.
Para escribir la discusin, trata de presentar los principios, relaciones y
generalizaciones que los resultados indican. Seala las excepciones o las
faltas de correlacin y delimita los aspectos no resueltos. Muestra como
concuerdan (o no) los resultados e interpretaciones con los trabajos
anteriormente publicados. Expn las consecuencias tericas del trabajo y
sus posibles aplicaciones prcticas.
7.- Conclusiones: formula las conclusiones a las que has llegado de la forma
ms clara posible y resume las pruebas que respaldan cada conclusin.
8.- Bibliografa: deben enumerarse slo las referencias importantes, que hayan
sido consultadas y utilizadas en la redaccin del texto. Es muy interesante
que realices una bsqueda actualizada de la bibliografa relacionada con el
tema en el ASFA (Aquatic Sciences and Fisheries Abstracts) que tienes
disponible en la Biblioteca. Ctalas en el texto y en la Bibliografa de forma
correcta: si no lo has hecho nunca, fjate como lo hacen otros autores en
revistas cientficas con prestigio y que puedes encontrar en la Biblioteca
(Marine Biology, Marine Ecology Progress Series, Aquaculture).
Una ltima recomendacin: no pierdas el tiempo preparando una portada para
el trabajo, no es necesario; lo importante es lo que has escrito y cmo lo has
escrito.
Si te interesa conocer ms informacin sobre el tema recomendamos la
siguiente referencia:
Day, RA. 1990. Cmo escribir y publicar trabajos cientficos. Organizacin
Panamericana de la Salud. The Oryx Press, Phoenix, AZ. 214 pp.