Prueba TSI

El agar TSI se utiliza para diferenciar distintos tipos de bacterias entricas Gram negativas con base, en
la capacidad de estas para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa con formacin de cido y tambin para
la produccin de H2S, cuando un microorganismo fermentador utiliza la glucosa todo el medio de
acidifica (color amarillo) (Forbes, 2009).
Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados
y esta caracterstica es la que se puede diferenciar entre estas, las enterobacterias.
La fermentacin es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aerbicas (superficie inclinada) y
anaerbicamente (capa inferior). En la superficie inclinada la glucosa (monosacrido) es catalizada
inicialmente por medio de ciclo anaerobio Embden-Meyerhof utilizado por anaerobios y aerobios, para
dar acido pirvico y posteriormente ser degradado a CO2, H2O y energa. La lactosa primero ser
degradada a sus monosacridos (glucosa y galactosa) (caldern, 2000)
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentracin 10 veces mayor de
lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azcar, ya
que las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes como constituyentes de las bacterias, y stas
pueden obtener mayor energa por utilizacin del azcar ms simple.
Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de EmbdenMeyerhof. La utilizacin de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estra, donde el oxgeno
presente acta como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones
de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa
disponible a piruvato, comenzar a metabolizar el piruvato a travs del ciclo aerbico de Krebs (sobre
la estra), formando productos finales cidos. El cido en el medio hace virar el amarillo del indicador
de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubacin, la zona de la estra y el fondo del tubo
inoculado con un fermentador de glucosa tendrn un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta
la glucosa, el fondo permanecer rojo (indicando que no hay variacin del pH) o se alcalinizar (lo que
puede visualizarse por un color rojo algo ms intenso que del medio original), demostrando que la
bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.
Despus de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la
lactosa o sacarosa comenzar a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces ms lactosa que glucosa,
las bacterias encontrarn sustrato suficiente para continuar la formacin de productos finales cidos.
Luego 18 24 horas de incubacin todo el medio TSI permanecer de color amarillo. Esta reaccin se
denomina cido sobre cido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La
produccin de gas provocar la ruptura de la columna de agar o la empujar hacia la parte superior, de
modo que un fermentador de lactosa que produce gas dar una reaccin A/A ms gas (H2S) (caldern,
2000).
La bacteria serratia se cultiv en profundidad y superficie inclinada posteriormente se observ que esta
no causo un cambio significativo en el medio, este se alcalinizo en el fondo y en la superficie inclinada
cambio el color amarillo claro, segn esto se puede detectar que hubo fermentacin (aerobia) partir de
glucosa y produccin de cido porque el fondo esta de color rojo (alcalino) esto indica que no hubo
variacin de pH entonces la prueba ha de ser negativa para esta bacteria como se puede ver en la
Imagen 1.

Imagen 1. Agar TSI Serratia

Comparando la prueba de las otras enterobacterias imagen 2. (1. Serratia, 2. Klebsiella, 3. E Coli, 4.
Salmonella, 5. Proteus) se puede observar que la Klebsiella es un fermentador de la glucosa, el E.coli
fermenta la glucosa y hay produccin de H2S por el color oscuro del fondo, la Salmonella fermenta la
glucosa por el color rojo en la superficie inclinada y H2S en el fondo y Proteus no fermentan la glucosa
ni producen gases y la Serratia fermenta la glucosa y produce acido en la superficie del agar inclinado.
Imagen 2. TSI bacterias

Lisina Descarboxilasa
Esta prueba se utiliza para determinar si un bacilo gramnegativo descarboxila o desamina la lisina,
adems de la formacin de cido sulfhdrico (H2S). La descarboxilacin es la separacin de un grupo
carboxilo de molculas orgnicas como los aminocidos, con liberacin de CO2, que permite
neutralizar los ambientes cidos, esta descarboxilacin de la lisina ocurre en ambientes anaerbicos
(fondo del tubo) (Alarcn, 2001).
En la prueba Lisina/Hierro se puede detectar la produccin de la lisina descarboxilasa ya que se
produce una reaccin coloreada por un cambio de pH del medio, que tiene como indicador Purpura de
Bromocresol. Un cambio de color original del medio (violeta) hacia amarillo en el fondo indica que los
cidos de la fermentacin de la glucosa bajan el pH del medio. Si el microorganismo produce lisina
descarboxilasa, la accin de esta enzima sobre la lisina dar lugar a la cadaverina que neutraliza los
cidos orgnicos formados por fermentacin de la glucosa, y el fondo del medio vuelve a estado
alcalino (violeta). La desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que en presencia del citrato
amnico frrico y una coenzima, flavina mono nucletido, se manifiesta por la aparicin del color rojo
en el agar inclinado. En cuanto a la produccin de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado
negro e insoluble de sulfato ferroso que se debe a la utilizacin de sales de hierro (Forbes, 2009).
Comparando las imgenes del antes y despus en la Tabla 1 de los 5 grupos (1: Serratia, 2: Klebsiella,
3: Escherichia Coli, 4: Salmonella, 5: Proteus), se puede observar que las bacterias Serratia,
Klebsiella, E. Coli y Salmonella presentaron color violeta en el agar, lo cual indica que son positivas
para la descarboxilacin de la lisina, ya que presentan la enzima lisina descarboxilasa, en cuanto a la
bacteria Proteus se observa que presento un cambio de color de violeta a amarillo y en la superficie un
tono rojizo, lo cual indica que es negativa para la descarboxilacin de la lisina, pero positiva para la
desaminacin de la lisina por presencia de la enzima lisina desaminasa. En cuanto a la formacin de
acido sulfhdrico es positiva para las bacterias Proteus y Salmonella puesto que presentaron
ennegrecimiento del medio debido al sulfuro de hierro producido.

Citrato de Simons
El citrato de sodio es una sal del acido ctrico, compuesto orgnico simple que se encuentra como uno
de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden
obtener energa de fuentes diferentes de la fermentacin de hidratos de carbono, con el citrato como
nica fuente de carbono, la medicin de esta caracterstica es importante para identificar muchos
miembros de la familia Enterobacteriaceae. Esta prueba de Citrato de Simons se usa para determinar
la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono,
generalmente los microorganismos que emplean el citrato como nica fuente de carbono, utilizan sales
inorgnicas de amonio como nica fuente de nitrgeno (Koneman y Allen, 2008). El metabolismo del
citrato realizado por algunas bacterias requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa
(citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y de
transportadores como citrato permeasas. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxilacetato
y acetato; productos que son convertidos enzimticamente a piruvato y CO2. Durante esta reaccin el
medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio

para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de
color del indicador de pH (Azul de bromotimol) del medio de verde a azul. El crecimiento suele hacer
virar el indicador azul de bromotimol del verde al azul, y es negativo cuando hay ausencia de
crecimiento permaneciendo con el color original (verde) (Forbes, 2009).
Como se muestra en la Tabla 1. Para la prueba Citrato de Simons, las bacterias Klebsiella y Salmonella
presentan viraje de color de verde al azul lo cual indica que son positivas para esta prueba ya que tienen
la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de nitrgeno; en cuanto a las bacterias Serratia, E.
Coli y Proteus no presentaron cambio de color lo cual indica que son negativas a esta prueba ya que no
hay desarrollo bacteriano.

Prueba Indol
El indol es una prueba que se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio est en capacidad de
desdoblar el indol de la molcula de triptfano; el indol es uno de los componentes de la degradacin
metablica del aminocido triptfano. La degradacin es intracelular mediante un sistema enzimtico
llamado triptofanasa. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptfano con produccin de indol, acido piruvico y amoniaco. El indol se acumula en el medio de
cultivo como un metabolito de desecho, mientras que el resto de la molcula del triptfano (piruvato y
NH4+) es usada para satisfacer necesidades nutricionales. El indol puede detectarse en el medio de
cultivo, por adicin del reactivo de Kovac (p-dimetil-aminobenzaldehido), el cual reacciona con el
indol en unos segundos, dando un compuesto rojo insoluble en agua (Rodrguez, 2005). En el agar SIM
de la Tabla 1, se puede observar de las 5 bacterias solo la bacteria Proteus presento un tono rojizo en la
superficie del agar lo cual indica que es positiva y las dems son negativas para la prueba indol.
Prueba de movilidad
La prueba de motilidad es usada para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias son
mviles por medio de flagelos. Las bacterias mviles pueden contener un nico flagelo o muchos
flagelos y su ubicacin vara segn las especies bacterianas y las condiciones del cultivo. Esta prueba
es llevada a cabo en un medio de cultivo semislido (SIM), donde a su vez es evaluada la produccin
de indol y de acido sulfhdrico por lo microorganismos. Las bacterias mviles producen un
enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos,
mientras que las inmviles permanecen en la lnea de inoculacin (MacFaddin, 2000). Como se
observa en el agar SIM en la tabla 1. Las 5 bacterias presentaron turbidez en el medio lo cual indica la
presencia de flagelos, para la bacteria Salmonella se observa un ennegrecimiento del medio el cual es
producido por la presencia de acido sulfhdrico.
Urea de Christensen
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir la enzima ureasa,
que hidroliza la urea. Algunas bacterias pueden utilizar la urea como fuente de nitrgeno, caracterstica
de gran valor taxonmico. La ureasa bacteriana, enzima constitutiva, cataliza la conversin de urea en
dixido de carbono (CO2) y amoniaco (NH3). Este ltimo acta como fuente de nitrgeno; adems,
capta protones, transformndose en amonio, que alcaliniza el medio de cultivo. La reaccin se detecta
incorporando rojo de fenol como indicador de pH, el cual vira fucsia a pH alcalino. La ureasa se detecta
en medios como el caldo de Stuart y el agar de Christensen. El primero es mas tamponado y, por lo
tanto, detecta las bacterias con mayor actividad de ureasa; el segundo el cual fue con el que se trabajo,

el cual tiene menos amortiguador y pone de manifiesto una actividad de ureasa ms dbil y ms
rpidamente (Rodrguez, 2005). Como se muestra en la Tabla 1 en los agares de Urea la bacterias
Klebsiella y Proteus presentaron un viraje de color de amarillo a Fucsia el cual indica que son positivas
a la prueba de Urea de Christensen ya que producen la enzima ureasa, en cuanto a las otras tres
bacterias al no presentar cambio de color son negativas para esta prueba.

Bibliografa
Alarcn, Luis R. 2001. Manual de prcticas de microbiologa bsica y microbiologa de alimentos.
Programa de nutricin. Editorial UACJ. Mxico. P 37.
Forbes, Betty A. 2009. Diagnostico Microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 12 Edicin.
Buenos Aires. P 222, 232.
Koneman, Elmer W., Allen, Stephen. 2008. Diagnstico Microbiolgico: Texto Y Atlas En color.
Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires- Argentina. P1396.
MacFaddin, J.F. 2000. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica.
Tercera Edicin. Editorial Panamericana. Buenos Aires-Argentina. P 306.
Rodrguez, C.E., Gamboa, C.M., Hernndez, C.F. 2005.Bacteriologa General: Principios Y prcticas
de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. P 281, 295.
Caldern Vicente, Pascual Rosario. 2000, Microbiologa Alimentaria, Metodologa para alimentos y
bebidas. 2 Edicin. Editorial Diazdesantos. Madrid Espaa. pp. 131, 132.
Forbes, Betty A. 2009. Diagnostico Microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 12 Edicin.
Buenos Aires. P 245, 246