SECUENCIACIN DEL ADN

Secuenciar una molcula de ADN consiste en determinar en qu orden se disponen los

cuatro nucletidos (A, T, C y G) que componen la molcula.
El primer mtodo diseado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam
y Walter Gilbert en 1977. Es un mtodo qumico que somete la molcula de DNA a
distintos mtodos de ruptura. Cada mtodo escinde la molcula all donde haya un
nucletido especfico. Este mtodo es bastante laborioso y, hoy en da, ha sido
sustituido por mtodos enzimticos que, adems, se pueden llevar a cabo de forma
automatizada.
El mtodo de Sanger fue diseado por Fred Sanger en 1977. Tambin se conoce como
mtodo didesoxi o secuenciacin por terminacin de la cadena. Es un mtodo
enzimtico que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su
hebra complementaria. Se necesitan los siguientes componentes:

un ADN de cadena sencilla que acta como molde

un cebador para iniciar la sntesis de ADN
los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
la enzima ADN-polimerasa
los cuatro didesoxirribonucletidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y
ddTTP) que son incorporados por la ADN polimerasa a la nueva hebra pero, una
vez incorporados, impiden la adicin de nuevos nucletidos.

La secuenciacin se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el

cebador, los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un
didesoxirribonucletido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso.
En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la
reaccin se detiene, de manera que se generan fragmentos de distinta longitud, todos
ellos con el mismo ddNTP terminal. Los diversos fragmentos se separan en funcin de
su tamao mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, una tcnica que permite
separar fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un slo nucletido. A partir del gel
se puede reconstruir la secuencia que se ha sintetizado, que es complementaria a la
secuencia del molde. Mediante esta tecnologa, se puede determinar la secuencia de
molculas de ADN de hasta 800 nucletidos de longitud.

MEJORAS EN EL MTODO DE SANGER

Introduciendo ligeras variaciones en el mtodo original de Sanger se ha conseguido
automatizar el proceso. Esta es la principal razn de que se siga utilizando este mtodo
hoy en da, a diferencia del mtodo de Maxam y Gilbert, que ya apenas se utiliza.
Las mejoras introducidas son las siguientes:
1.- Los ddNTP terminadores de cadena estn marcados fluorescentemente. Cada
ddNTP se marca con un fluorforo distinto, que no interfiere en la reaccin de la
polimerasa y que emite luz con una longitud de onda caracterstica. De este modo, y la
reaccin se lleva a cabo en un slo tubo, no en cuatro.
2.- Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible
automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma
exponencial el nmero de fragmentos generados, cada uno marcado con una molcula
fluorescente que emite luz de distinto color, en funcin del ddNTP terminal. Por eso, a
este mtodo tambin se le conoce como secuenciacin cclica.

3.- La separacin de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es

ms rpida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos tamaos llegan al
final del capilar, donde son excitados con un lser y se detecta la fluorescencia
emitida por el ddNTP terminal. El color de esta fluorescencia determina de qu
nucletido se trata. El grfico resultante se denomina electroferograma, en el que se
observan picos de diversos colores. Cada color indica qu nucletido ocupa cada
posicin en la molcula de ADN o, lo que es lo mismo, su secuencia.

PIROSECUENCIACIN
La pirosecuenciacin es otro mtodo enzimtico que permite determinar la secuencia
de una molcula de ADN. Se necesitan los siguientes componentes:

un ADN de cadena sencilla que acta como molde

un cebador para iniciar la sntesis de ADN
tres desoxirribonucletidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) ms
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATPS, un derivado del dATP que es
utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no es reconocido por la
luciferasa).
cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que aade un nuevo
desoxirribonucletido trifosfato a la cadena naciente genera una molcula de
PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS),
luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y
genera un fotn de luz visible) y apirasa (que degrada los nucletidos que no se
han incorporado a la cadena naciente y el ATP generado por la sulfurilasa).
adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
luciferina

La pirosecuenciacin es un mtodo de sntesis, porque la secuencia del molde se

determina a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Para determinar cul es la
base que se aade durante la sntesis se lleva a cabo, en riguroso orden, una serie de
reacciones enzimticas:

1.- El cebador hibrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro

enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa) y de los
sustratos APS y luciferina.

2.- Se aade uno de los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (por ejemplo,

dCTP) a la mezcla de reaccin anterior. Si resulta ser el complementario a la
hebra molde, se incorporar a la nueva cadena de ADN y se producir una
molcula de PPi por cada desoxirribonucletido incorporado (ya que puede
haber varias bases iguales seguidas en la secuencia del molde). Si no es el
complementario al molde, se aade otro desoxirribonucletido trifosfato (por
ejemplo, dGTP). Si es el correcto, se formar PPi y si no, se aade un tercero
(por ejemplo, dTTP). Si es el correcto, se formar PPi y si no, se aade dATPS
que, ahora s, ser incorporado a la nueva cadena de ADN.

3.- En presencia de APS, la ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP. Este ATP
provoca la conversin de luciferina en oxiluciferina mediante la enzima
luciferasa. Esta reaccin genera una cantidad de luz visible proporcional a la
cantidad de ATP consumido. Esta luz es captada por un fotodetector, dando
lugar a un pico en el pirograma. La altura del pico es proporcional al nmero de
nucletidos que se han incorporado.

4. La apirasa degrada todos los desoxirribonucletidos trifosfato (y el dATPS)

que no se han incorporado, as como el exceso de ATP producido por la reaccin
de la ATP sulfurilasa. Durante la pirosecuenciacin, no se aade un nuevo

desoxirribonucletido trifosfato (etapa 2) hasta que la apirasa haya degradado

por completo todos los nucletidos no incorporados y el ATP.