Facultad de Biologia: Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO
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AUTOMATIZACION
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Fecha: 2010.05.18 09:35:47 -05'00'
FACULTAD DE BIOLOGIA
IDENTIFICACIN DE GENES INVOLUCRADOS EN LA ASIMILACIN DE
POLIURETANO (Hidroform ) EN Comamonas testosteroni CBQ1
TESIS
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE
BIOLOGO
PRESENTA
NANCY BARAJAS GARCA
Director de tesis: D.C. Jess Campos Garca

Co-Director: M.C. Alma Laura Daz Prez
Morelia Michoacn, Enero de 2010
Con todo mi amor y cario dedico este trabajo a las personas que me impulsaron
a buscar nuevas metas y sobre todo a cumplirlas, Mis Paps.
Rodolfo Barajas Moreno
Y
Soledad Garca Medina
AGRADECIMIENTOS
Agradezco primeramente a Dios por ser mi mejor amigo, mi fortaleza,

darme todo lo que tengo y no dejarme caer nunca.
Al Dr. Jess Campos Garca por darme la oportunidad de formar parte de
su equipo de trabajo, por sus enseanzas y apoyo en la realizacin de este
trabajo.
A las M.C Alma Laura Daz Prez y M.C Erendira Vargas Zepeda, por su
ayuda en la fase experimental de este trabajo, gracias por compartir su
conocimiento conmigo.
A mis hermanos, Pedro, Cristina, Claudia, Rodolfo, Bibiana y Carmelita,

porque han sido mi gran inspiracin y fuente de superacin y por ellos se que vale
la pena luchar da a da.
A Jaime, por ser quien eres y brindarme tu confianza y amistad.
A mis amigos de la Universidad, a todos y a cada uno de ellos por

permitirme conocerlos y ser parte de su vida. Por ayudarme y estar conmigo a lo
largo de la carrera, y aun despus...
Agradezco a los miembros de la mesa revisora de este trabajo. Al Dr. Miguel

Martnez Trujillo y al M. C. Hugo Faras Chagoya por su dedicacin y sugerencias.
Y a Ti por haber aparecido y cambiado mi vida
Gracias a todos!!
PARTE DEL TRABAJO EXPERIMENTAL SE REALIZO EN EL:
Laboratorio de Biotecnologia Microbiana del Instituto de Investigaciones

Qumico Biolgicas de la UMSNH, bajo la asesora del Dr. Jess Campos Garca y
formo parte del proyecto del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa
(CONACYT) No SEP-2004-C01-46547 Expresin y caracterizacin de los
productos del opern gny de Pseudomonas euruginosa, involucrados en el
catabolismo de isoprenoides acclicos
Y EN EL:
Laboratorio de Microbiologa del Instituto de Investigaciones Qumico

Biolgicas de la UMSNH con el apoyo del Dr. Carlos Cervantes Vega.
Abreviaturas
GC-MS
NMP
PUR
PS-PUR
PE-PUR
TDI
PURasa
MB+PURh
YES
LB
CL
AL
Gas Chromatography Mass Spectrometry

N-metil-2-pirrolidona
Poliuretano
Polister Poliuretano
Politer Poliuretano
2,4-toluendiisicianato
Poliuretanasa
Medio Basal con Hydroform como nica fuente de
carbono
Yeast Extract Salts
Luria Bertani
Caldo Luria-Bertani
Agar Luria-Bertani
RESUMEN
El poliuretano (PUR) es un polmero artificial que se sintetiza a partir de la

condensacin de polioles y di-isocianatos. Los polioles utilizados en esta sntesis
pueden ser de tipo politer o polister, dependiendo del poliol que se utilice se
generan polister poliuretanos (PS-PUR) o politer poliuretanos (PE-PUR). El
PUR es utilizado ampliamente en la industria de los materiales para construccin y
en la fabricacin de pinturas y recubrimientos y en muchos otros sectores.
Si bien son muchas sus aplicaciones, la produccin masiva de PUR trae

consigo la generacin de grandes cantidades de desechos para los cuales no
existe an un mtodo adecuado de eliminacin, aunque se ha considerado a la
biodegradacin o biorremediacin como una alternativa. En la actualidad existen
reportes de degradacin microbiana del PUR por hongos y bacterias.
Oceguera-Cervantes., (2005), Aisl una cepa bacteriana identificada como

Comamonas testosteroni, capaz de crecer en un medio de cultivo con sales,
suplementado con una resina de poliuretano hidrosoluble (Hydroform ) como
nica fuente de carbono (MB+PUR). El objetivo de este trabajo fue identificar los
genes de Comamonas testosteroni CBQ1 involucrados en la asimilacin de PUR
con la finalidad de conocer a nivel molecular el mecanismo degradativo de este
compuesto.
Utilizando mutagnesis al azar con el transposn Himar1::GmR sobre la
cepa de Comamonas testosteroni CBQ1 se obtuvo una biblioteca de 811 mutantes
de las cuales fueron seleccionadas 12 por su incapacidad de crecer en PUR como
fuente de carbono; de estas se descartaron 7, al no mostrar amplificacin del
transposn en la prueba de PCR, quedando finalmente solo 5 en las cuales se les
demostr la presencia del transposn por hibridacin tipo Southern.
Posteriormente se clonaron, secuenciaron y analizaron las regiones gnicas

interrumpidas por el transposn en las 5 mutantes. El anlisis informtico permiti
identificar dos genes (A y B), correspondientes a la familia de las Prolil
oligopeptidasas, enzimas que rompen los enlaces peptdicos de las protenas;
cabe mencionar que una prueba adicional que se realiz a las mutantes fue la
identificacin de las actividades enzimticas proteasa y esterasa, relacionadas con
la degradacin del PUR.
I. I N T R O D U C C I N
Como resultado de las diferentes actividades humanas, el aumento poblacional y

el rpido crecimiento de la industria en el curso de los ltimos 30 aos, la
contaminacin del ambiente se ha intensificado; esto debido entre otras razones a que
los microorganismos no pueden metabolizar algunos de los complejos productos
residuales de la industria qumica (Altamirano, 2001). Por lo que en la actualidad se ha
recurrido a nuevas tcnicas de eliminacin de estos residuos de lenta degradacin;
entre ellas se encuentra la biorremediacin, que al ayudar a formar productos finales
sencillos aprovechando la capacidad metablica de agentes biolgicos contribuye a
disminuir la cantidad de tales qumicos en el ambiente, (Cortn y Viale, 2006) dicho de
otra manera el objetivo de la biorremediacin es eliminar o al menos disminuir la
concentracin de sustancias potencialmente txicas, utilizando como parte fundamental
del proceso a los microorganismos (Cortn y Viale, 2006). En donde los
microorganismos utilizados son generalmente no-fotosintticos y ecolgicamente
ocupan el nivel trfico de los descomponedores, en el cual los hongos y las bacterias
son los componentes principales. (Cortn y Viale, 2006).
Entre los productos qumicos de lenta degradacin se encuentran cierto tipo de

alcanos ramificados, que tienen la caracterstica de ser molculas recalcitrantes, es
decir que persisten en el ambiente por periodos prolongados de tiempo (Pirnik et al.,
1974; Campos-Garca, 2000).
Dentro de este grupo de compuestos se encuentra el poliuretano PUR, desarrollado por

Otto Bayer al comienzo de la segunda guerra mundial, cuando se sintetiz primero
como sustituto del caucho o del hule (Oceguera et al., 2008).
Desde su introduccin comercial hace ms de 50 aos, el PUR ha sido el nicho

de los plsticos industriales (Ghazali et al., 2005). De manera que la generacin de
grandes cantidades de PUR ha llegado al grado de poder sustituir parcialmente la

madera o el metal por polmeros fcilmente moldeables y de bajo costo, con ello se
evita la tala excesiva de bosques y que los recursos naturales sean usados
eficientemente. (Oceguera-Cervantes et al., 2005)
1.1. Sntesis y usos del PUR

El PUR es un tipo de plstico utilizado como material base en varias industrias.
Es un polmero artificial que se sintetiza a partir de la condensacin de polioles y diisocianatos (Akutsu et al., 1998). Los polioles utilizados pueden ser de tipo politer o
polister, dependiendo del poliol que se utilice, se generan polister poliuretanos (PS PUR) o politer poliuretanos (PE-PUR). (Figura 1).
Figura 1. Reaccin de sntesis de poliuretano, La reaccin se ejemplifica con el 2,4-di-isocanato de

tolueno (TDI) y adipato de di-propilenglicol obteniendo como producto un PE-PUR (Modificado de
Oceguera-Cervantes, 2005).
El uso de los diferentes tipos de PUR vara de acuerdo a las caractersticas o

propiedades de ste. Estas son debidas al tipo de materias primas que se utiliza e
incluso a la temperatura a la que el proceso de sntesis se lleva a cabo, lo cual genera
productos que pueden ir desde redes entrecruzadas hasta fibras lineales o elastmeros
(Oceguera-Cervantes, 2005). Entre los polmeros de baja densidad se encuentran
espumas de poliuretano que se emplean como esponjas y materiales amortiguadores;
mientras que los polmeros de alta densidad, son utilizados como materiales para
construccin y lquidos utilizados en la industria de las pinturas y recubrimientos.
(Oceguera-Cervantes, 2005).
De manera general pocos gneros de microorganismos son capaces de asimilar

compuestos como el PUR. Recientemente se han identificado algunos gneros de
bacterias con dicha capacidad, como por ejemplo: Comamonas testosteroni CBQ1; la
cual es una bacteria gram-negativa, con forma de bacilo recto o ligeramente curveado
con flagelos polares y de gran versatilidad bioqumica. Se le ha encontrado en el suelo,
hbitat acuticos, en desechos de basura en proceso de descomposicin, en tejidos de
animales y vegetales. Por ello y por muchas otras ventajas Comamonas testosteroni
CBQ1 es un organismo ecolgicamente importante en la transformacin de muchos
compuestos. Se ha observado su capacidad de crecer en medios con sales, adicionado
con resinas de poliuretano hidrosoluble como nica fuente de carbono (OcegueraCervantes, 2005).
Oceguera-Cervantes (2005), realiz un estudio en el que aisl bacterias

provenientes de muestras de PUR en proceso de deterioro, las cuales fueron capaces
de crecer en un medio con poliuretano como nica fuente de carbono. Entre las
bacterias identificadas sta Comamonas testosteroni CBQ1. Utilizando pruebas en
medios de cultivo diferenciales se determin la actividad enzimtica de esterasa que
pudiera estar relacionada con la degradacin.
A pesar de las ventajas ambientales mencionadas, la generacin de este tipo de

materiales que facilitan la vida humana trae consigo nuevas complicaciones, como la
eliminacin de los desechos generados despus de la utilizacin de los productos
fabricados con materiales sintticos. El PUR an en condiciones de humedad, puede
tardar ms de un siglo en descomponerse y la incineracin resulta ser una tcnica
altamente contaminante y causa efectos negativos en el ambiente, tales como el
incremento de monxido de carbono en la atmosfera y la liberacin de compuestos
qumicos muy peligrosos como las dioxinas, el cloruro y cianuro de hidrgeno (Segura
et al., 2007).
Solo por mencionar, en Mxico se calcula que el promedio de produccin del

PUR en toneladas ha aumentado ao con ao 60992, en 1997; 65,091 toneladas en
1998; 74,099 toneladas en 1999; 69,152 toneladas en 2001; lo cual representa la
generacin de grandes cantidades de desechos para los cuales no existe un mtodo
adecuado
de
eliminacin
(http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/gacetas/422/envases.html?id_pub=422).
Aunque la va para el catabolismo para el poliuretano ha sido propuesta
mediante la identificacin de algunos de sus intermediarios y caracterizacin de algunas
de sus actividades enzimticas, aun se carece de informacin sobre los determinantes
gnicos implicados en tal proceso degradativo. Por lo cual el objetivo de este trabajo
consisti en identificar genes involucrados en el catabolismo del poliuretano en una
cepa identificada como degradadora del PUR, con la finalidad de contribuir al
conocimiento de los mecanismos degradativos microbianos involucrados.
1.2. Biodegradacin del Poliuretano
De manera general la biodegradabilidad de un compuesto depende de las
condiciones ambientales y su estructura qumica, ya que se ha observado que un
nmero elevado de grupos funcionales enlazados a estructuras comunes o en una
molcula orgnica dificulta el ataque microbiano, y por consecuencia aumenta su

persistencia en el ambiente; por lo que la naturaleza qumica de muchos plsticos los
hace resistentes a la biodegradacin microbiana.
Dentro de los plsticos, se ha encontrado que el PUR, puede ser biodegradado,
e incluso los del tipo PS-PUR son ms susceptibles a este proceso (Akutsu et al.,
1997).
En la actualidad existen reportes de degradacin microbiana del PUR,

especialmente por hongos, Darby y Kaplan (1968), reportaron que diversas especies de
hongos estaban involucradas en la degradacin de PUR aunque la degradacin por
parte de bacterias tambin ha sido estudiada. Entre los hongos involucrados se sabe
que algunas cepas de Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor,
Penicillium funiculosum, Aureobasidium pollulans, Tricoderma ps., Chaetomium
globosum, entre otros pueden degradar diferentes tipos de PUR (Oceguera-Cervantes,
2005), Ghazali et al., 2005) determinaron la habilidad del hongo Aspergillus. niger para
utilizar una espuma flexible de PUR a base de palma, en agar nutritivo mnimo y no
cuando se inoculo en agar con sales minerales MSA; demostrndose que sta espuma
solo puede ser degradada por el hongo en presencia de suficientes nutrientes.
Por otro lado, entre las bacterias en las que se ha reportado actividad
poliuretanoltica
(PURasa),
Corynebacterium
sp.,
se
Enterobacter
encuentran
cepas
agglomerans,
de
Pseudomonas
Comamonas
acidivorans,
sp.,
C.
testosteroni (Nakajima-Kambe et al., 1999). (Oceguera-Cervantes, 2005).
Teeraphatpornchai et al., (2002) aislaron varios microorganismos de muestras de

suelo, caracterizados por su habilidad de degradar diversos plsticos a base de
polister, identificando una cepa de Paenibacillus amylolyticus, con capacidad para
degradar estos compuestos; detectando tambin en el cultivo actividades enzimticas
tanto de proteasas como de esterasas, las cuales se relacionaron con la degradacin

de los plsticos.
Oceguera-Cervantes et al., (2007), aislaron dos cepas (BQ1 Y BQ8)
provenientes de desechos en descomposicin, por su capacidad de crecer en medio
mnimo suplementado con un PUR comercial (Hydroform) como nica fuente de
carbono; en donde la cepa BQ1 mostr un mayor crecimiento. Tal cepa fue identificada
mediante el anlisis de comparacin de secuencias del gen 16S rRNA como
Aliciclyphilus sp. A la par al PUR utilizado le fueron realizados anlisis de GC-MS, los
cuales mostraron un alto contenido de N-methylpyrrolidona (NMP), como aditivo y
constituyente principal; lo cual sugiere, que en la primera fase de crecimiento la bacteria
lo utiliza como fuente de carbono y nitrgeno. Realizando tambin ensayos de actividad
enzimtica mediante el uso de medios diferenciales, se detect la presencia de una
actividad enzimtica de tipo esterasa.
Debido a que las caractersticas fisicoqumicas del PUR difieren en gran medida
en funcin de su composicin, es difcil comparar las actividades degradadoras de
diferentes microorganismos debido a que el tipo de PUR utilizado en cada investigacin
puede ser diferente (Akutsu et al., 1998).
Dado lo descrito anteriormente se puede pensar que las actividades enzimticas

necesarias para la degradacin del PUR seran del tipo.
Figura 2. Posibles sitios de reaccin de actividades enzimticas capaces de atacar la estructura del
poliuretano (Oceguera-Cervantes, 2005)
1.3. Proteasas
Santerre et al., (1994) describieron que a partir de un estudio de mejoramiento de
poliuretano con fines mdicos, enzimas hidrolticas tales como la papaina o la
colesterol-esterasa eran capaces de atacar el poliuretano in vitro, pero que este ataque
no era considerable. Howard y Blake (1998), fueron los primeros en identificar una
actividad extracelular de tipo proteasa en P. fluorescens y posteriormente (Howard,
1999) describieron sus caractersticas a partir de la enzima purificada.
1.4. Ureasas
Pathirana (1983), detectaron actividades de tipo Ureasa relacionada con la
degradacin de PUR en hongos. Sin embargo, no existen reportes de actividades de
este tipo detectadas en bacterias. Un estudio posterior demostr que este tipo de
enzimas son capaces de degradar PUR, pero hasta ahora no se ha reportado su
purificacin (Santerre et al., 1994).
1.5. Esterasas
Akutsu y et al., (1998), identificaron una enzima que degrada un polister de
poliuretano, derivada de Comamonas acidovorans TB-35, la cual es una bacteria que
utiliza un PS-PUR como nica fuente de carbono. Esta enzima es un tipo de esterasa
donde la hidrlisis del polmero libera como productos de degradacin cido adiptico y
dietilen-glicol, los resultados indican que estas enzimas degradan el PUR en una
reaccin de 2 pasos: Absorcin hidrofbica por la superficie del PUR y mediante
hidrlisis del enlace ster del PUR.
En Comamonas acidovorans cepa TB35 se ha descrito una esterasa capaz de

atacar PS-PUR, la cual se localiza unida a la membrana plasmtica de la bacteria
(Akutsu et al., 1998).
La perdida de peso de cubos de PUR incubados con la enzima unida a

membrana extrada con detergente, fue dez veces mayor (1.3 mg) que la obtenida con
la enzima extracelular (0.1 mg) Santerre et al., 1994).
Ambas enzimas ya han sido purificadas y se ha determinado que atacan la
porcin ster del PUR. Sin embargo, la actividad que se encuentra unida a la
membrana es capaz de atacar los enlaces dentro de la molcula de PUR, mientras que
la esterasa extracelular ataca las porciones ster anterior a la polimerizacin en la
molcula de poli-adipato de polietilenglicol de la materia prima (Akutsu et al., 1998).
Al clonar el gen que codifica la enzima asociada a membrana y expresar la protena
recombinante en Escherichia coli se observ la presencia de la enzima extracelular, lo
cual sugiere que ambas enzimas provienen del mismo gen, solo que la extracelular ha
sido liberada al medio de cultivo debido a alguna modificacin postraduccional
desconocida (Shigeno-Akutsu et al., 1999).
Dada la estructura del PS-PUR las actividades enzimticas que podran actuar
sobre los diferentes enlaces del PUR seran de tipo proteasa, ureasa, esterasa y lipasa.
(Oceguera-Cervantes, 2005) En la Figura 2 se muestran los sitios de la molcula de
PUR en los cuales podran actuar dichas actividades enzimticas.
II. O B J E T I V O
GENERAL
Identificar genes de Comamonas testosteroni CBQ1 involucrados en la

asimilacin del poliuretano (Hydroform).
2.1.- Objetivos particulares

Obtener mutantes por medio de transposicin al azar mediante el transposn
Himar1::GmR.
Seleccionar mutantes incapaces de asimilar PUR.
Analizar las secuencias de nucletidos de los genes identificados.
Identificar los genes interrumpidos por el transposn.
Proponer un mecanismo de la participacin de los genes identificados en el mecanismo

de degradacin del poliuretano (Hydroform).
10
III. M A T E R I A L E S
METODOS
3.1. Medios de cultivo

Los medios de cultivo que se utilizaron fueron preparados de la siguiente
manera:
a) Caldo Luria-Bertani (CL): compuesto por NaCl 10 g/L, peptona de casena 10

g/L y extracto de levadura 5 g/L, ajustado a un pH final de 7.2.
b) Agar Luria-Bertani (AL): compuesto por CL, ajustado con un pH final de 6.8,
adicionando agar bacteriolgico 15 g/L.
c) Medio mnimo M9 con glucosa 20 g/L: Compuesto por Na2 HPO4 6 g/L, KH2
PO4 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH4 Cl 1 g/L, ajustando el pH A 7.2, MgSO4 2mM y
CaCl2 0.01mM. Cuando se utilizo en medio slido se adicion 15 g/L de agar
bacteriolgico.
El poliuretano utilizado en este trabajo se obtuvo bajo la forma comercial de
Hydroform, el cual corresponde a un PS-PUR o PE-PUR.
d) Medio basal (MB+PUR): Basado en el medio propuesto por Nakajima-Kambe

et al., (1995).
Solucin A (10x)
KH2 PO4
20.0 g
K2 HPO4
70.0 g
11
Solucin B (100X)
NH4NO3
g
MgSO4 7H20
g
100.0
10.0
Solucin de elementos traza

(1000X)
ZnSO4 7H20
10.0
g
CuSO4 7H2O
g
FeSO4 7H2O
g
MnSO44-6H2O
0.10
10.0
2.0
g
Las soluciones A y B se esterilizaron en autoclave a 120C por 20 minutos.

Posteriormente se prepar la solucin de elementos traza, la cual fue esterilizada por
filtracin. En 800 ml de agua estril se adicionarn en condiciones aspticas 100 ml de
solucin A, 10 ml de solucin B y 1 ml de solucin de elementos traza y se llev a un
volumen final de un litro. En su caso se adicion polvo de PUR como fuente de carbono
al 0.3 % al medio de cultivo.
3.2. Medios diferenciales para identificacin de las actividades enzimticas.

Para la deteccin especifica de las actividades enzimticas, cada cepa fue
cultivada en los siguientes medios diferenciales.
Medio YES (Howard et al., 1999).
12
Solucin A
K2HPO4
g
KH2PO4
g
Agua c.b.p
ml
50
25
1000
Solucin B
MgSO4
50 g
Agua c.b.p
ml
7H2O
1000
Solucin C
MnCl2 4H2O
1.000 g
CuCl2 2H2
0.014 g
ZnCl2
0.011 g
CoCl26H2O
0.020 g
Na2
MoO4
2H2O
FeCl3 6H2O
0.013 g
Agua c.b.p
0.075 g
500 ml
Se prepararon las soluciones B y C, y despus se esterilizaron por filtracin y se

guardaron a temperatura ambiente. Se prepar la solucin A y se diluyo 1:50 con agua
destilada, posteriormente se adicionaron 0.4g de NH4 Cl, 4.0g de gelatina y 20 mg de
extracto de levadura por litro y se esteriliz. A un litro de solucin C, se le adicion 15
g/L de agar y el pH fue corregido a 7.2.
13
Medio de Hidrlisis de Tween 80. (Oceguera-Cervantes, 2005): Composicin por

litro.
Solucin A
Agar
Peptona
NaCl
CaCl2
Tween 80
Agua destilada
c.b.p.
12.0 g
10.0 g
5.0 g
0.1 g
10 ml
1,000 ml
Preparacin:
Se adicionaron los componentes a un matraz, se calentaron hasta ebullicin y se
agitaron hasta disolucin total. Se tomaron alcuotas para su esterilizacin a 121 C por
15 minutos.
3. 3. Cepas y plsmidos.
Las cepas y los plsmidos que se utilizaron para la realizacin de este trabajo se
enlistan a continuacin en las tablas 1 y 2
14
Tabla1.- Cepas utilizadas en este trabajo.
Cepas
Comamonas
testosteroni CBQ1
P. aeruginosa
PAO1SR
Caractersticas
Referencias
Aislado bacteriano capaz de crecer en un medio

Oceguera-Cervantes (2005)
mnimo con PUR
Cepa resistente a estreptomicina
Wong y Mekalanos, (2000)
Escherichia coli
JM101
Cepa estandar de laboratorio supE, thi, (lacproAB) [F, traD36, proAB, laclq Z M15]
Yanisch-Perron et al., (1985)
Comamonas
testosteroni.
BGN-8
Mutante obtenida por transposicin CBQ1::

Himar1:: GmR
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-5

Himar1::GmR
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-9

Himar1:: GmR
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-14

Himar1:: GmR
Este Trabajo
Comamonas
testosteroni.
BGN-38

Himar1:: GmR
Este Trabajo
15
Tabla 2.- Plsmidos utilizados en este trabajo.
Plsmidos
pFac
pBluescriptII Sk
pRK2013
pB-82
pB-51
pB-91
pB-141
pB-381A
Caractersticas
Referencias
Plsmido suicida que contiene el transposn Mariner Wong

y
Himar1::GmR; ApR GmR
Mekalanos,
(2000)
Vector de Clonacin; ApR
Invitrogen,
Inc.
Plsmido auxiliar para conjugacin; tra+, mob+ ColE1, Figurski
y
KmR
Helinski,
(1979)
pBluescriptll SK ms un inserto Pstl de BGN8; Este trabajo
ApR,GmR
ApR,GmR
ApR,GmR
ApR,GmR
pBluescriptll SK ms un inserto Pstl de BGN381A; Este trabajo
ApR,GmR
16
Figura 3. Mapa del plsmido suicida pFAC. El transposn (Tn) Himar1:: Gm contiene un gen de
resistencia a gentamicina (Gm) flanqueado por dos secuencias de repetidos invertidos (IR). Tasa, gen
que codifica la transposasa. Ap, gen de resistencia a ampicilina. OriC, origen de replicacin para
Escherichia coli (Wong y Mekalanos, 2000).
17
Figura 4.- Diagrama del vector de clonacin pBluescript II SK (-). Fl (-) ori, origen de replicacin del fago
filamentoso fl. lacZ, porcin que codifica la - galactosidasa. MCS, sitio mltiple de clonacin, a la
derecha se indican los sitios de reconocimiento por las enzimas de restriccin. Plac, promotor del operon
de lactosa. ColE ori, origen de replicacin para Escherichia coli. Ap, gen de resistencia a ampicilina.
18
3.4. Mutagnesis por transposicin

Para la obtencin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 se utiliz el
mtodo de mutagnesis por transposicin (adaptado de Wong y Mekalanos, 2000) que
a continuacin se describe:
a) Un matraz de 50 ml conteniendo 20 ml de CL se inocul con 500 l de cultivo de
la cepa receptora Comamonas testosteroni CBQ1 crecido toda la noche a 37C
con agitacin y se incub durante 12-15 h a 42C con agitacin.
b) Por otro lado, un matraz con 24.5 ml de CL se inocul con 500 l de cultivo de la
cepa donadora E. coli S17-1 (pFAC) crecido durante 18 h a 37C con agitacin y
se incub a 37C con agitacin hasta alcanzar la fase logartmica de crecimiento
(D.O.590nm= 0.6-0.8).
c) Cuando el cultivo de la cepa donadora alcanz la fase logartmica de
crecimiento, se procedi a realizar los diferentes apareamientos entre sta y la
cepa receptora.
d) De ambos cultivos se tomaron alcuotas de 500 l, 1000 l y 1500 l y se
centrifugaron por 2 min a 10,000 rpm a temperatura ambiente, se decant el
sobrenadante y con los sedimentos resultantes se realizaron las mezclas de
apareamiento (donador::receptor): 1:1, 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, respectivamente.
e) Las mezclas se resuspendieron en vortex y se depositaron sobre filtros estriles
de nylon colocados sobre placas de AL.
f) Las placas se incubaron durante 24 h a 37C, para que los plsmidos sean
transferidos por conjugacin de la cepa donadora a la receptora.
g) Cada filtro fue suspendido en 3 ml de CL con vortex y se dejaron reposar 15 min
a temperatura ambiente.
19
h) Se realizaron diluciones 1:10, 1:100, 1:1,000 y 1:10,000, de cada apareamiento.

i) Se distribuyeron 100 l de cada una de las diluciones en placas de AL adicionado
con 100 g/ml de estreptomicina (Sm) y 100 g/ml de gentamicina (Gm). Las placas
se incubaron durante 24 h a 37C, y las colonias resultantes se sometieron a
pruebas de crecimiento en medio MB adicionado con Hydroform .
3.5. Conjugacin triparental

Para la conjugacin triparental de Comamonas testosteroni CBQ1 se procedi de la
siguiente manera:
a) Se crecieron en 4 ml de CL durante toda la noche a E.coli S17-1 (pRK2013)
(plsmido auxiliar), a E. coli (pFAC) (cepa donadora) y Comamonas testosteroni
CBQ1 (cepa receptora) a 37C con agitacin constante.
b) Se mezclaron en una relacin 1:1:1 y 1:2:2 (donadora: receptora y auxiliar).

c) Las mezclas de conjugacin se centrifugaron a 13,000 r.p.m durante 2 min y la
pastilla se resuspendi en 500 l de CL.
d) La mezcla de conjugacin se espatul sobre una placa de AL y se incub a 37
C durante toda la noche.
e) El cultivo sobre la placa de AL fue cosechado y resuspendido en 1 ml de CL, a
partir del cual se realiz una dilucin 1:10.
f) De la dilucin 1:10 se espatul 100 l sobre una placa de AL con 100 g/ml de
estreptomicina (Sm) y 10 g/ml de gentamicina (Gm). Se dejo incubar a 37C
durante toda la noche.
20
g) Las clonas obtenidas fueron resembradas y sometidas a los anlisis

correspondientes.
3.6. Aislamiento de DNA total (cromosmico) de las cepas de Comamonas

testosteroni CBQ1
Para el aislamiento de DNA cromosmico se utiliz el mtodo de CTAB
(Adaptado de Ausbel et al., 1999) que a continuacin se describe:
a) En 3 ml de CL se creci un cultivo bacteriano de la cepa de interes durante 18

20 h a 37C con agitacin constante, posteriormente se distribuy en tubos de
microcentrifuga o tubos eppendorf de 1.5 ml y se centrifug durante 2 min a
10,000 rpm.
b) Se decant el sobrenadante y al sedimento se le adicionarn 500 l de TE (Tris
50 mM EDTA 20 mM, pH 8.0). Se mezcl y centrifug en las condiciones antes
mencionadas. El sedimento se resuspendi en 450 l de TE.
c) Posteriormente se adicion 50 l de lisozima (10 mg/ml en TE) y se incub
durante 30 min a 37C. Se agreg 50 l de proteasa (proteinasa K 20 mg/ml)
incubando durante 15 min a 37C. Se adicion 50 l de SDS (dodecilsulfato de
sodio) al 10% y se incub por 30 min a 37C.
d) Posteriormente se adicionaron 100 l de Nacl 5M, se agit exhaustivamente por
30 s y se incub 5 min a 65C. Se adicionaron 80 l de CTAB (bromuro
hexadeciltrimetilamonio)/NaCl al 10% / NaCl 5 M) previamente calentado a 65C,
posteriormente se centrifug por 5 min.
e) Al sobrenadante se le adicion un volumen de cloroformo (1:1), se agit de 4-5
min y se centrifug 5 min A 12,000 rpm. Al sobrenadante se le adicion una
mezcla de fenol/cloroformo (1:1), se mezclo en vortex y se centrifug por 5 min.
21
f) Posteriormente al sobrenadante se le adicion un volumen de etanol/

isopropanol (60:40) absoluto y se mantuvo por 20 min a 80C.
g) El sedimento se lav tres veces con 1 ml de etanol al 70% y la pastilla se
resuspendi en 60 l de agua destilada.
h) Se agreg 5 l de RNasa y se incub 1 h a 37C, inactivando posteriormente la
RNAsa a 65C por 5 min. Estas muestras fueron almacenadas a 20C o
sometidas a corrimiento electrofortico.
3.7. Aislamiento de plsmidos

El aislamiento de DNA plasmdico con fines rutinarios se realiz a partir de dos
metodologas:
3.7.1. Aislamiento por lisis alcalina (modificado de Birnboim y Doly, 1997)
a) Un cultivo bacteriano crecido en 3 ml de CL durante 18-20 h a 37C con agitacin

constante se distribuy en tubos de centrfuga de 1.5 ml y se centrifug durante 2
min a 12,000 rpm a temperatura ambiente.
b) Se desech el sobrenadante y a la pastilla se le adicion 150 l de la solucin
STE (sacarosa 50 mM Tris-HCl 25 mM, pH 8.0 EDTA 10 mM) y 20 l de la
solucin de lisozima (20 mg/ml), se mezcl ligeramente e incub a 37C durante
5 min.
c) Posteriormente a la suspensin se le agreg 200 l de la solucin de lisis recin
preparada (NaOH 0.2 N SDS 1%), se agit suavemente y se mantuvo durante 10
min en hielo.
22
d) Transcurrido ese tiempo se adicion 150 l de la solucin de acetato de potasio

5 M pH 4.8, se mezcl ligeramente y se incub 10 min en hielo.
e) Se centrifug durante 2 min a temperatura ambiente (10, 000 rpm) y se transfiri
el sobrenadante a otro tubo. Se adicionaron 150 l de la mezcla 1:1 de fenolcloroformo y se mezcl vigorosamente.
f) Se centrifug durante 7 min y el sobrenadante se paso a otro tubo, al cual se le
agreg 500 l de etanol- 60% /isopropanol 40% fro, se mezcl y se incub
durante 10 min a 20C.
g) Se centrifug durante 1 min a temperatura ambiente, el sedimento se lav dos
veces con 500 l de etanol al 70% centrifugando durante 2 min entre cada
lavado.
h) Se recuper el sedimento y se sec a temperatura ambiente. Se resuspendi la
pastilla de DNA obtenida en 50 l de agua estril. Se adicion 5 l de RNasa, se
incub 30 min a 37C. Las muestras fueron almacenadas a -20C o sometidas a
corrimientos electroforticos en geles de agarosa.
3.7.2. Aislamiento de plsmidos por el sistema (Rapid Plasmid Purification

System Marligen Bioscence Inc.)
Los plsmidos conteniendo los fragmentos de DNA cromosomal de Comamonas
testosteroni CBQ1 interrumpidos por el transposn Himar1::GmR fueron aislados con el
kit Rapid Plasmid Purification Systems (Marligen Bioscience Inc.) de acuerdo al
protocolo Rapid Plasmid Miniprep Protocol especificado por el fabricante.
3. 8. Tcnica para el aislamiento de fragmentos de DNA de geles de agarosa

La recuperacin de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa se realiz
utilizando el kit Gel Extraction Systems (Marligen Bioscienc Inc) de la siguiente manera:
23
a) Se cort el fragmento del gel de agarosa conteniendo la banda de DNA a

recuperar.
b) Se pes el fragmento y se colocaron 400 mg de gel en el tubo eppendorf. Se

adicionaron 30 l de amortiguador L1 (amortiguador para la solubilizacin del
gel) por cada 100 mg de gel.
c) Se incub a 50C por 15 min, mezclando cada 3 min y se dejo incubar por 5 min
ms.
d) Se coloc una columna en un tubo de lavado de 2 ml. La columna se carg con

la mezcla del paso anterior y se centrifug a 12,000 rpm por 1 min.
e) Se adicionaron en la columna 500 l de amortiguador L1, se incub a
temperatura ambiente y despus de 1 min se centrifug a 12,000 rpm durante 1
min.
f) Se agregaron 700 l de amortiguador L2 (amortiguador de lavado conteniendo
etanol) en la columna y se incub a temperatura ambiente por 5 min, se
centrifug durante 1 min a 12, 000 rpm y se volvi a centrifugar por 1 min.
g) La columna se introdujo en un tubo eppendorf y se adicionaron 50 l de agua
destilada estril a 70C en el centro de la columna, se incub a temperatura
ambiente por 1 min y para recuperar el filtrado se centrifug a 12,000 rpm
durante 2 min.
3.9. Electroforesis en geles de agarosa

Al DNA plasmdico o cromosomal
les
fueron
realizados
corrimientos
electroforticos en geles de agarosa al 1% disuelta en amortiguador TAE (Tris-acetato
24
0.04 M EDTA 0.001 M. Los geles fueron colocados en una cmara de electroforesis
horizontal, y se sumergieron en el mismo amortiguador. Las muestras de DNA se
mezclaron con buffer de carga (azul de bromofenol al 0.25% y xylene cyanol FF al
0.25% en solucin de glicerol al 30%) y se descarg en los orificios del gel. El
corrimiento electrofortico procedi aplicando de 90 a 110 voltios por 40 a 60 min.
Posteriormente el gel fue teido con una solucin de bromuro de etidio al 0.01%
durante 5 a 10 min. Las bandas de DNA teidas se observaron en un transiluminador
de luz UV de onda corta. Las fotografas de los geles se tomaron por medio de un foto
documentador BioCaptMw Vilber Loumat.
El DNA del fago lambda digerido con la endonucleasa HindIII o con las
endonucleasas EcoRI y HindIII fue usado como marcador de tamao molecular de DNA
lineal.
3.10. Amplificacin de DNA por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

3.10.1. Oligonucletidos empleados. Los oligonucletidos diseados para amplificar
la secuencia del transposn Himar1 en las mutantes a PUR fueron sintetizados por la
compaa Invitrogen.
Para la amplificacin del transposn Himar1::GmR de aproximadamente 1 kb, se
emple el oligonucletido MarIN (5-TAC GTA ACA GGT TGG CTG ATA AGT CG-3),
el cual est diseado con base a las secuencias repetidas invertidas del transposn
(Wong y Mekalanos, 2000).
3.10.2. Amplificacin. La reaccin de amplificacin se realiz con la siguiente mezcla

de reaccin: como DNA molde para la amplificacin del transposn Himar1::GmR, se
utiliz el DNA total de las mutantes PUR (200 ng) o el DNA plasmdico (100 ng) de
pFAC, oligonucletido (30 pmoles/l), dNTPs (10 mM), 5 l de amortiguador de
reaccin 10X, (5 l) DNA polimerasa Pfx (1 unidad)(Invitrogen) en un volumen final de
25
50 l. La mezcla se someti a 35 ciclos de amplificacin en las siguientes condiciones:

94C/35 s (desnaturalizacin), 56C/35 s (alineamiento), 68C/1 min (polimerizacin) y
un ciclo final de polimerizacin de 68C/7 min. Para la amplificacin se utiliz un
termociclador Perkin Elmer modelo Gene Amp PCR System 2400. A continuacin las
muestras se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa para verificar la
amplificacin del transposn.
3.11. Tratamientos enzimticos de molculas de DNA

3.11.1. Restriccin de DNA con endonucleasas. El DNA fue digerido utilizando una
unidad de endonucleasa de restriccin por g de DNA en la solucin amortiguadora
correspondiente e incubando a 37C por un mnimo de 1 h o durante toda la noche.
Despus las mezclas de restriccin se sometieron a corrimiento electrofortico en un
gel de agarosa al 1% para determinar el tamao de los fragmentos obtenidos.
3.11.2. Ligacin de DNA. El DNA cromosmico de las mutantes digerido con la enzima
PstI fue ligado al el vector pBluescript II SK(-) linearizado con la misma enzima, en una
proporcin 5:1 (DNA cromosmico:vector) utilizando 500 ng del vector y la enzima DNA
ligasa del fago T4 (Promega). La reaccin de ligacin se llev a temperatura ambiente
por un periodo de 16 h (Sambrook et al., 1989). Esta mezcla de ligacin se utiliz para
transformar clulas competentes de E. coli JM101.
3.12. Transformacin de clulas competentes de E. coli

3.12.1. Preparacin de clulas competentes de E. coli. De un cultivo de la cepa de E.
coli JM101 crecido durante toda la noche se tomaron 4 ml para inocular 250 ml de CL
contenidos en un matraz de 1 L, y se incub h a 37C con agitacin constante hasta
obtener una densidad ptica a 590 nm entre 0.6 y 0.8 (D.O.
590 nm =0.6-
0.8)
26
Posteriormente se incub el cultivo en hielo durante 20 min, se distribuy en

alcuotas (35 ml) dentro de tubos para centrifuga (Falcon) y se centrifugaron durante 10
min a 5,500 rpm a 4C en una centrfuga Eppendorf.
Cada pastilla se lav dos veces con 50 ml de agua destilada estril fra, centrifugando a
5,500 rpm, 10 min a 4 C y el total de las clulas se resuspendieron en 2 ml de glicerol
estril al 10% fro.
Posteriormente se distribuyeron en alcuotas de 100 l en tubos de
microcentrifuga de 1.5 ml. Estas clulas se utilizaron inmediatamente para la
transformacin, o bien fueron almacenadas a -80C.
3.12.2. Electroporacin. A 100 l de las clulas competentes se les adicion de 1 a 5
l de mezcla de ligacin y se colocaron entre los electrodos de una celda en la cmara
del electroporador (BioRad) y se le aplic un pulso de 1.8 KV durante 4 milisegundos.
Inmediatamente despus de la electroporacin las clulas se transfirieron a 2 ml de CL
y se incubaron por 1 h a 37C con agitacin constante.
Posteriormente se distribuyeron 100 l en placas de AL adicionado con 100 g/ml de
ampicilina, (Ap) 15 g/ml de Gm para seleccionar las clonas con plsmidos
recombinantes. Las colonias obtenidas se crecieron en 4 ml de CL para realizarles
aislamiento y purificacin de DNA plasmdico.
3.13. Hibridacin tipo Southern.

3.13.1. Transferencia por capilaridad. Despus de hacer el corrimiento electrofortico
de las muestras de DNA en gel de agarosa, el gel se coloc en una solucin de Hcl
(0.25 N) por 10 min y despus fue enjuagado en agua destilada. Durante 30 min fue
sumergido en NaOH 0.5M Nacl 0.5M y despus se transfiri a la solucin de
neutralizacin (Nacl 1.5 M/Tris-Hcl 0.5 M, pH 7.5) durante 30 min. La membrana fue
cortada exactamente al mismo tamao del gel y se humedeci durante unos segundos
en agua destilada. La membrana fue equilibrada con la solucin de transferencia SSC
20X (Nacl 3 M/ citrato de sodio dihidratado 0.3 M, pH 7.0-8.0) durante 15 min. La
27
transferencia se hizo por el mtodo de capilaridad usando una solucin SSC 6X. El gel
se retir de la solucin de neutralizacin y se coloc invertido en el sandwich de
transferencia (Sambrook et al, (1989). La membrana de nylon hmeda se coloc sobre
el gel, se eliminaron las burbujas de aire que se formaron entre el gel y la membrana.
Se colocaron encima de la membrana 2 piezas de papel filtro del mismo tamao del gel
humedecidas en solucin SSC 2X.
Fueron colocadas sobre el papel filtro toallas de papel absorbente un poco mas
pequeas que el papel y se coloc un objeto de aproximadamente 1,500 g encima de
las toallas de papel. La transferencia transcurri durante toda la noche, reemplazando
ocasionalmente las toallas hmedas por secas.
Los residuos de agarosa fueron eliminados de la membrana enjuagndola en la
solucin SSC 2X, y la membrana se coloc sobre papel filtro durante unos segundos. El
DNA se fijo a la membrana con luz ultravioleta (UV) utilizando un crosslinker (UVC 500
UV Crosslinker Hoefer) mediante 2 ciclos a 700 k.J.
3.13.2. Marcaje de la sonda con digoxigenina. Para la reaccin de marcaje se

pueden utilizar desde 10 ng hasta 3 g de DNA lineal (DIG Ladeling Kit
with
digoxigenin-Dutp, alcali-labile Boehringer Mannheim). El DNA lineal puro se

desnaturaliz calentndolo en bao de agua hirviendo durante 10 min y se enfri
rpidamente en hielo. En un tubo eppendorf se adicionaron los reactivos del kit de
marcaje de la siguiente manera: 500 ng DNA a utilizar como sonda, 2 l de la mezcla de
hexanucleotidos, 2 l de la mezcla de dNTPs marcados, agua destilada estril hasta un
volumen de 19 l y 1 l de enzima Klenow. Se centrifug algunos segundos y se
incub durante 1 h a 37C. La reaccin se par adicionando 2 l de EDTA 0.2 M, pH 8.
El DNA marcado se precipit adicionando 2.5 l de LiCI (4M) y 75 l de etanol absoluto
fro.
La mezcla se enfri a -70C por 30 min y despus se centrifug a 12,000 rpm durante
15 min. La pastilla se lav con etanol fro al 70%, se sec durante algunos minutos y fue
disuelto en 20 l de agua destilada estril.
28
3.13.3. Tcnica de hibridacin. Una vez que el DNA fue transferido, se procedi a la
prehibridacin, que consisti en bloquear los sitios de unin no especfica a cidos
nucleicos en la membrana, con el propsito de obtener el menor fondo posible. La
membrana se humedeci durante algunos segundos en SSC 2X y se coloc dentro del
tubo de hibridacin adicionandole 20 ml de la solucin de hibridacin (12.5 ml de
amortiguador 1 estril) (cido malico 0.1 M/NaCl 0.15 M, pH 7.5) y 5 ml de solucin de
bloqueo al 10 % (reactivo bloqueador del kit disuelto en el siguiente amortiguador 6.25
ml SSC 20X, 0.25 ml N-laurilsarcosina, 0.025 ml de SDS al 20%, 0.975 ml de agua
destilada). Finalmente se incub con agitacin lenta a 55C durante 4 horas.
Procedimiento:
Se abri el tubo de hibridacin con la membrana para adicionar 10 l de la sonda
desnaturalizada a la solucin; posteriormente la membrana se incub con agitacin
lenta durante toda la noche a 55 C. Al cabo del tiempo de incubacin, la membrana fue
lavada a temperatura ambiente con 50 ml de solucin SSC 2X/SDS 0.1 % durante 5
min y 2 veces a 60C durante 15 min con solucin SSC 0.1X/SDS 0.1%.
3.13.4. Deteccin. Para la deteccin se utilizo el kit DIG Luminescent Detection Kit
(Boehringer Mannheim). La membrana se lav durante 5 min en solucin de lavado
Tween-20 al 0.3% disuelto en amortiguador 1(cido malico 0.1 M NaCl 0.15 M, pH
7.5). Se incub durante 30 min en solucin 2 (solucin de bloqueo al 1% diluida en
amortiguador 1). El concentrado de anticuerpos (anti-digoxigenina) se diluy 1:10,000
en la solucin 2. La membrana se incub durante 30 min en la solucin del paso
anterior. Se elimin la solucin de anticuerpos y se incub por 15 min 2 veces con 100
ml de la solucin de lavado. Despus de eliminar la solucin de lavado se incub
durante 5 min en 20 ml de la solucin 3 estril (Tris-Hcl 0.1 M NaCl 0.1 M, MgCl2 6H2O
50 mM, pH 9.5). La solucin concentrada de CSPD (Disodio 3-(4-metoxipiro{1,2dioxetano-3,2-(5 cloro) tricloro[3.3.1.113, 7 n) decan{ 4-il)fenil fosfato) se diluy 1: 100
(100 l ) en solucin 3 (10 ml).
29
La membrana se incub durante 5 min en la solucin de CSPD. Se seco el exceso de la

solucin de la membrana y se coloc unos segundos sobre papel filtro. La membrana
hmeda se coloc en una bolsa de plstico y se sell, incubndose durante 30 min a
37C. La membrana se expuso sobre una pelcula sensible a la luz (Kodak TMG/RA
durante toda la noche y despus la pelcula se revel por mtodos estndar.)
3.14. Secuenciacin
3.14.1 Oligonucletidos empleados. Para la secuenciacin de los fragmentos
interrumpidos por el transposn Himar1::GmR y clonados en el plsmido pBluescriptII
SK- se empleo el oligo MarOUT, (5-CCG GGG ACT TAT CAG CCA ACC-3), el cual
esta diseado de un extremo del transposn (Wong y Mekalanos, 2000).
3.14.2. Amplificacin de los fragmentos utilizando dideoxinucleotidos (ddNTPs)

Se mezclaron 300ng de DNA plasmdico aislado por el kit Rapid Plasmid Miniprep
protocol con 4 de la mezcla de terminadores Big Dye, 4ul de amortiguador de reaccin
2.5X y con 1 del oligonucletido Mart Out (30 pmol/ul) y se llevo a un volumen final de
20 con agua destilada.
La mezcla se someti a un ciclo de 94C/ 2 min y 25 ciclos de amplificacin bajo las
siguientes condiciones: 96C/ 30 seg (desnaturalizacin), 50C 30 seg (alineamiento) y
60C/ 4 min. (Extensin).
3.14.3. Purificacin de las muestras. Una vez finalizada la reaccin de extensin se

purifico la mezcla precipitando la muestra con etanol. Los productos de extensin se
resuspendieron en 20ul de buffer TSR (buffer para evitar la formacin de estructuras
secundarias), se mezclaron muy bien y posteriormente se calentaron a 95C por 2
minutos e inmediatamente se transfirieron al hielo durante 5 min. Finalmente se
pasaron a tubos de secuenciacin y se llevaron al secuenciador o se almacenaron a
20C.
30
3.15. Escrutinio para la identificacin de mutantes afectadas en el crecimiento en

MB+PUR.
Para la identificacin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 incapaces
de asimilar el poliuretano como nica fuente de carbono y energa, se prepararon
placas de AL y placas con MB+ PUR. Se sembraron por estra las 811 colonias
resultantes de la conjugacin en ambos medios y se incubaron a 30C durante 48 hrs.
Se observ la afeccin en la utilizacin del poliuretano por la falta de crecimiento en el
medio con MB+PUR, y las replicas de todas las colonias se recuperaron en las placas
de AL.
Aunque, en primera instancia no se haba puesto como objetivo en este trabajo,
tambin se realizaron pruebas de caracterizacin de las posibles actividades
enzimticas involucradas con la utilizacin del PUR por las bacterias poliuretanolticas,
mediante la utilizacin de medios diferenciales, para lo cual se llevaron a cabo los
siguientes procedimientos:
3.15.1. Actividad proteasa

a) 1.- Para detectar la actividad de proteasa, se cultivaron cada una de las
mutantes y la cepa silvestre en medio YES slido con gelatina.
b) 2.- Despus de 48 h de incubacin a 37C, se realiz la tincin de las placas,
aplicando una solucin de azul de Coomassie R-250 al 0.1% en cido acticometanol 3:1 y se dej en reposo durante 30 min.
c) 3.- Posteriormente se realiz un lavado de la placa con una solucin de cido

actico: Metanol 3:1 para retirar el colorante no asociado a la gelatina.
Para esta prueba se utilizaron las cepas de P. aeruginosa PAO1SR y E. coli DH5
como controles positivo y negativo, respectivamente.
31
3.15.2. Actividad Esterasa

a) 1.-Para detectar la actividad de esterasa se cultivaron cada una de las mutantes
y la cepa silvestre en medio Tween80, el cual contiene Tween80 y CaCl 2.
b) 2.-Despus de 120 h de incubacin a 37C, se observ la aparicin de halos
blanquecinos de precipitacin, alrededor de las colonias con actividad de
esterasa.
Para esta prueba se utilizaron las cepas de P. aeruginosa PAO1SR y E. coli DH5
como controles positivo y negativo, respectivamente.
32
IV. R E S U L T A D O S
Con la finalidad de localizar e identificar los genes de la cepa de Comamonas

testosteroni CBQ1 involucrados en la asimilacin de PUR, en este trabajo se decidi
emplear el mtodo de mutagnesis por transposicin.
4.1. Obtencin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1

Para la obtencin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1, primero se
verific que la cepa CBQ1 fuera capaz de asimilar el PUR como nica fuente de
carbono y energa, por lo que la cepa se creci en una placa de MB+PUR, preparado,
como se describe en Materiales y Mtodos. La placa se revis cada 24 h y despus de
48 h de incubacin a 30C se observ el crecimiento de la cepa.
La obtencin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 se realiz por el

mtodo de mutagnesis por transposicin al azar. Se utiliz la cepa E. coli S17-1
(pFAC), como donadora del transposn Himar1::GmR codificado en el plsmido suicida
pFAC (Figura 3) y Comamonas testosteroni CBQ1 como cepa receptora. Por medio de
conjugacin se transfiri el plsmido pFAC de la cepa donadora E. coli S17-1 (pFAC) a
la cepa receptora de Comamonas testosteroni. CBQ1 (como se describe en Materiales
y Mtodos). La seleccin de las clonas transconjugantes se realiz en placas de AL con
estreptomicina y gentamicina. De la mutagnesis por transposicin se obtuvo una
biblioteca de 1x106 mutantes, representando una frecuencia de transposicin de
aproximadamente 1 por 100 receptoras de Comamonas testosteroni CBQ1.
33
Figura 5.- Estrategia general de mutagnesis por transposicin. El plsmido suicida pFac (circulo azul)
R
contiene al transposn Himar1:: Gm (barras rosas) es transferido por conjugacin de la cepa donadora
E.coli S-17 (pFac) al cromosoma de la cepa receptora Comamonas testosteroni CBQ1. Las
transconjugantes se seleccionaron en los antibiticos Sm y Gm.
4.2. Seleccin de las mutantes incapaces de utilizar poliuretano (PUR)

De la biblioteca de mutantes se eligieron aleatoriamente 811 clonas, las cuales
fueron sometidas a escrutinio para seleccionar a las mutantes que de nuestro inters.
La seleccin se realiz sembrando las transconjugantes por estra en placas de
MB+PUR y una replica en AL con los antibiticos Gm y Sm. Se seleccionaron las
mutantes que mostraron incapacidad total o parcial para crecer en PUR en
comparacin con la cepa silvestre, Comamonas testosteroni CBQ1, utilizada como
control positivo.
34
De este escrutinio se seleccionaron 12 mutantes incapaces de crecer en PUR respecto

a la cepa silvestre.
Con la finalidad de descartar que alguna de las 12 mutantes seleccionadas fuera
una mutante auxotrfica se llev a cabo un segundo escrutinio sembrando por estra a
las mutantes seleccionadas en medio mnimo M9 adicionado con 0.2% de glucosa
como fuente de carbono y energa, la replica fue sembrada en AL en presencia de los
antibiticos Sm-Gm. De esta segunda seleccin no se descart ninguna de las 12
mutantes, puesto que todas fueron capaces de crecer ante este segundo medio de
seleccin.
4.3. Identificacin de las actividades enzimticas producidas por las bacterias que
crecen en PUR, empleando medios diferenciales
Para conocer qu actividad enzimtica presentaba la cepa silvestre de
Comamonas testosteroni CBQ1; la cual deba ser diferente a la presentada por las
mutantes, y que pudiera estar relacionada con la degradacin del poliuretano, cada una
de las mutantes fue cultivada en dos medios diferenciales, por triplicado, para la
deteccin especfica de las actividades de proteasa y esterasa.
4.3.1. Actividad de Proteasa. Para la deteccin de la actividad de proteasa, se utiliz

el medio YES, que es un medio mineral suplementado con extracto de levadura al que
se le adiciona gelatina como sustrato para determinar la actividad de proteasa. Las
cepas que son capaces de hidrolizar la gelatina por accin de una proteasa, se les
detectar sta actividad por medio de la tincin de la gelatina con azul de Coomassie.
Este colorante se asocia a los enlaces peptdicos de la gelatina no hidrolizada, por lo
tanto en las zonas donde hubo hidrlisis, no se observar coloracin azul. Sino un halo
transparente alrededor de la colonia bacteriana, correspondiente a la hidrlisis de la
protena.
35
Tanto las mutantes como la cepa silvestre fueron sembradas por estra en este
medio y la tincin fue aplicada despus de 48 h de incubacin. Se utiliz como control
positivo a P. aeruginosa PAO1SR la cual presenta el halo de hidrlisis y como control
negativo se utiliz a E. coli JM101, la cual no presenta halo de hidrlisis. (Figura 6).
Los resultados de la prueba de actividad de proteasa demostraron que no slo la

cepa silvestre (capaz de crecer en PUR) mostr actividad proteoltica, si no tambin las
mutantes 14 y 8 al presentar todas ellas el halo transparente alrededor de su
crecimiento, como ocurri con el control positivo de la prueba (Figura 6), mientras que
en el control negativo y en las dems mutantes probadas (38,5,9) no se observo el halo
despus de la tincin con azul de Coomassie (Figura 8), (Tabla 3).
Figura 6. Prueba de actividad de Proteasa. Las mutantes fueron sembradas por estria en medio YES. El
halo transparente alrededor de la colonia indica la hidrlisis de la protena. (1) Cepa silvestre (+); (2)
Mutante 38 (-); (3) Mutante 5 (-); (4) Mutante 9(-); (5) Mutante 14 (+); Mutante 8 (+)
4.3.2. Actividad de Esterasa. Para la deteccin de la actividad de esterasa se utiliz el

medio de Tween80, el cual contiene Tween80
y CaCI2. El Tween80
es una
36
molcula que contiene steres de cidos grasos y el CaCI2 se encuentra disociado en el

medio de cultivo en forma de Ca2+ y CI2- . La hidrlisis de los enlaces ster del
Tween80 genera como productos un grupo alcohol y un grupo cido. Al asociarse dos
molculas de cido a un in Ca2+ se produce una precipitacin de este complejo, la cual
es observada alrededor de las colonias con actividad de esterasa como un halo de
precipitacin, despus de un tiempo de incubacin. En esta prueba se utilizaron las
cepas de P. aeruginosa PAO1SR y E.coli DH5s como controles positivo y negativo.
Despus de 120h de incubacin se observ alrededor de la Cepa silvestre un halo de
precipitacin (halo blanquecino), indicando un resultado (+) para la hidrlisis de enlaces
ster, como lo indico el control (+) de la prueba (Figura 7) las mutantes 38, 5, 9, 8,
tambin presentaron halos de precipitacin (Tabla 3, Figura 7).
Tabla. 3 Actividades enzimticas presentadas en las mutantes.
ACTIVIDAD ENZIMATICA
CEPA
PROTEASA
ESTERASA
Comamonas testosteroni
CBQ1
Mutante 38
Mutante 5
Mutante 9
Mutante 14
Mutante 8
37
Figura 7. Prueba de Actividad Esterasa. Las mutantes fueron sembradas por estra en placas de medio
Tween 80 . El halo de precipitacin indica una prueba positiva. (1) Cepa silvestre (+); (2) Mutante 38(+);
(3) Mutante 5 (+), (4) Mutante 9 (+); (5) Mutante 14(-); (6) Mutante 8(+).
4.4. Amplificacin del transposn Himar1::GmR por PCR

Para determinar la presencia del transposn Himar1::GmR en las mutantes
incapaces de crecer en PUR y confirmar que esto se relaciona con la presencia del
transposn en su cromosoma, se hizo una amplificacin por PCR. Esto se efectu a
partir del DNA total de las mutantes utilizando el oligonucletido MarIN2 (Wong y
Mekalanos, 2000), el cual fue diseado con base a las secuencias repetidas invertidas
del transposn, amplificando la regin del transposn, correspondiente a -1 kb. Como
controles del experimento se utilizaron las cepas de E. coli S17-1 (pFAC) (control
positivo) y Comamonas testosteroni CBQ1 (control negativo).
Los productos de las reacciones de PCR fueron sometidos a corrimiento

electrofortico en un gel de agarosa para ser analizados. Se observ en la muestra
amplificada a partir del DNA de la cepa E.coli S17-1(pFac) un fragmento de ~1,
38
correspondiente al transposn Himar1 (Figura 8). De igual manera, se observ que a

partir del DNA de algunas mutantes (38, 5, 9,14, 8) se gener un fragmento amplificado
(figura 8), indicando que el transposn se encuentra presente en su cromosoma de
estas mutantes. En el carril correspondiente al producto de PCR de Comamonas
testosteroni CBQ1 no hubo amplificacin, lo que indic que en el genoma de esta
bacteria no hay una secuencia correspondiente al transposn. De las 12 mutantes a las
que se les realiz la amplificacin del transposn, 6 de ellas no mostraron amplificado,
por lo que se descartaron, quedando slo 5 clonas (figura 8).
6 7
8 9 10 11 12 13 14 15
Pb
23,200
8,300
7,510
2,300
2,050
1,300
947
819
Figura 8. Amplificacin del transposn Himar1::Gm
en las mutantes incapaces de asimilar PUR.
Fotografa del gel de agarosa mostrando los fragmentos amplificados por PCR. Carriles (1 y 4), marcador
de peso molecular de HindIII EcoR1, 2, amplificacin procedente de la mutante 38; (3), amplificacin a
partir de la mutante 5; (9), amplificacin a partir de la mutante 8,. (10), cepa silvestre la cual no muestra
banda de amplificacin. (11), amplificacin procedente de la mutante 14; y 14, amplificacin a partir de la
mutante (9). Muestras sin amplificacin (5, 6, 7, 8,10,12,13 y 15).
4.5. Deteccin del transposn por hibridacin tipo Southern Blot

Con la finalidad de comprobar que en el cromosoma la mutacin que causo la
incapacidad de las clonas para asimilar el compuesto probado se relaciona con la
39
presencia de una sola insercin del transposn Himar1::GmR se realiz hibridacin tipo
Southern empleando como sonda al mismo transposn amplificado por PCR y marcado
con digoxigenina.
Para realizar el anlisis tipo Southern, el DNA total de cada una de las mutantes
se aisl (Material y Mtodos) y posteriormente se cuantific por espectrofotometra. Se
digiri el DNA total de cada mutante con la enzima PstI, la cual no tiene sitios de
reconocimiento dentro del transposn, y se realiz un corrimiento electrofortico en gel
de agarosa, a la par con el DNA total de Comamonas testosteroni CBQ1 digerido con la
misma endonucleasa. Como controles positivos de la hibridacin se utiliz el plsmido
pFAC y un fragmento de 1 kb amplificado por PCR correspondiente al transposn
Himar1::GmR. Posteriormente, el DNA se transfiri a una membrana de nylon para
despus realizar la hibridacin DNA-DNA.
Una vez revelada la pelcula, en el carril correspondiente al DNA total de
Comamonas testosteroni CBQ1 no se observ banda de hibridacin (Figura 9, Carril 4),
como se esperaba, indicando que en su genoma no se encuentra ninguna secuencia de
DNA complementaria al transposn Himar1::GmR. Mientras que en los controles
positivos correspondientes al plsmido pFAC y el producto de PCR correspondiente a la
sonda presentaron bandas de hibridacin (figura 9, carril 2), En los carriles
correspondientes al DNA de las mutantes (Figura 9. Carriles 4-7) se observaron bandas
de hibridacin de tamaos diferentes sugiriendo que ocurrieron eventos de
transposicin en cada una de las mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 debido a
que contienen un fragmento de DNA complementario al transposn Himar1::GmR
(sonda) se observaron manchas de hibridacin de diferentes tamaos. Esto sugiere que
ocurrieron eventos de transposicin en distintos loci del cromosoma de Comamonas
testosteroni CBQ1, por lo que el transposn esta interrumpiendo diferentes genes.
40
Figura 9. Deteccin del transposn Himar1::Gm por hibridacin tipo Southern. Carril 1, DNA del fago
(HindIII); carril 2, plsmido circular pFAC; carril 3, fragmento de PCR correspondiente al transposn
Himar1:: Gm
(sonda). Las flechas azules indican la mancha de hibridacin. Carriles de 4 a 7 DNA total
de las mutantes digerido con PstI (cepa silvestre, Mutante 8, Mutante 9 y Mutante 38).
4.6. Clonacin de las regiones interrumpidas por el transposn

Una vez que se confirm que el transposn Himar1::GmR se encuentra en el
cromosoma de las 5 mutantes. Las regiones gnicas de las mutantes interrumpidas por
el transposn fueron clonadas para su posterior anlisis. Para ello se aisl el DNA total
de las mutantes y se digiri con la enzima PstI. El DNA total digerido se lig al vector de
clonacin pBluescriptII Sk (-) linearizado con la misma enzima (Materiales y Mtodos).
Con la mezcla de ligacin se transformaron clulas competentes de JM101,
seleccionando a las transformantes resistentes a ampicilina y gentamicina (resistencia
dada por el gen de resistencia a ampicilina del vector de clonacin y por el gen de
resistencia a gentamicina del transposn). Una vez obtenidas las clonas resistentes a
ambos antibiticos, se realiz aislamiento de DNA plasmdico de las transformantes. Se
lograron clonar los fragmentos de DNA interrumpidos de las cinco mutantes incapaces
de crecer en PUR: (Mutante 8, Mutante 5, Mutante 9, Mutante 14, Mutante 38).
Con la finalidad de comprobar que los plsmidos recombinantes presentan
fragmentos clonados, se les realiz un anlisis de restriccin con la endonucleasa PstI.
41
Las mezclas de restriccin fueron separadas por electroforesis en gel de agarosa. Se

observ que cada plsmido tena clonado entre uno y tres fragmentos de DNA, (Figura
10) adems los fragmentos de DNA fueron de tamaos diferentes. Todos los plsmidos
recombinantes presentaron una banda correspondiente al vector linearizado (2.9 kb).
Con estos resultados podemos sugerir que en los plsmidos clonados se encuentran
los fragmentos de DNA interrumpidos por el transposn Himar1::GmR y fragmentos
adicionales que pueden ser o no parte de la regin interrumpida. (Figura 10).
Figura 10. Caracterizacin de los plsmidos recombinantes procedentes de las mutantes de Comamonas
testosteroni CBQ1 a PUR, las cuales contienen las regiones gnicas interrumpidas por el transposn
R
Himar1::Gm . Gel de agarosa mostrando el anlisis de restriccin de los plsmidos recombinantes con la
enzima PstI. Carriles (1), Marcador de tamao molecular -HindIII, (2), pB-8.2, (3) pB-38. (4) pB-5; (5)
marcador de tamao molecular de -HindIII; (6) pB-9, (7), marcador de tamao molecular de -HindIII; (8)
pB-14.
4.7. Secuenciacin de las regiones interrumpidas por el transposn

Para identificar los genes interrumpidos por el transposn Himar1::GmR, los
fragmentos clonados en el vector pBluescriptIISk(-) se secuenciaron utilizando el
42
oligonucletido especfico MarOut (Daz-Prez et al., 2004). Las reacciones de

secuenciacin fueron realizadas como se describe en Materiales y Mtodos.
Se logr obtener la secuencia de 5 plsmidos recombinantes, correspondientes a

las mutantes Mutante 8, Mutante 5, Mutante 9, Mutante 14, Mutante 38, (Tabla 3) de los
cuales se tom la decisin en base a las secuencias obtenidas de los genes
identificados de trabajar solo con uno BGN9, la secuencia nucleotdica obtenida se
compar con el programa Blastx. El anlisis indic que la secuencia obtenida del
plsmido procedente de la mutante BGN9, alinea con una secuencia que corresponde a
los genes con nmero de acceso GeneBank YP428240.1 y ZP01388702.1 que
codifican para protenas hipotticas de la familia de las Prolil-oligopeptidasas. La
fraccin del gen A, codifica para una protena hipottica de Rhodospirillum rubrum, y el
gen B, para una protena hipottica de Geobacter sp.
GATAGTTTCTTGCTTCATTGAGGGTACGAATTCCGTAGAAATGCGCGTTCTCGCTCTGCCCGAGC
CCGCGAAGTTGCGGGAATATGAACCACATCCAGTGGGTCTGCTTCTTTCCGGCAAGGATCTCTT
CAATCGCGTTGTCAAAGATGCCGTCCTGCGCTTTGACAAAACGGTCTAGATGGTTGGTCATAGG
GCCTAACGTTTAAGGTAAGGGGCGCGCCGCTTGCGGTGCGTCCCGCTTGACCGAAATGTTATGC
GTTGGTTGTAGCAGGCGTCCCAATTCTGCAAAAAACTCGTTGCGATAAGACGCGCCATTAGCGTT
CAAACGGTGGTCTGCGCTGGGGTAGACACGGACGATGAGGTTATCCTTGCCTGCTTCTTTGAAC
TTCGTTTCGAGGAAATTTACGGACTCGACCGGAACACTCTGATCTTGCTCACCAATGCCGATCAG
AACGGGGATGTTCAATTTCAGAAGGTCAGCAATTGGGTCGATGTCCATGATGTCGGTCCACCAG
CGATAAGAGTTGCCGTACCAATTCTTTTCGATACTGCGAGGATCAGCGGTAATTTTCTCCCAGCC
CGAGTTGACATCGAACTGTATAGCGCCCTTTTGCCTGAGTGTGGCAAGTGATTTGCGCATTGAGT
AGCCGCCGCTGCCGATAATTGCGAGATGGGTGATCGCTGGAGACAGCCCGGCAACCTTGGCTG
CGGGCAACGCGCCTTCCGATACACCAACCAAGACGACGTTCTTCGGCTTGGGCGCAATGGAGCT
TATTTGCGTGGCAATAAACTCCGAATAGTCGGCAACCCATTGATTTGGATTGTTTACTAGATGAAA
TTCGTGACCGCAGTCGAACAACCCGGTAGAACGGTCAGGTACAAATCGCTTGTTGAGAACGAAA
ACGCGAGCATTGACCGTGAGGCCGCTGACGTAGCCAGGCATCACGG
43
Figura 11.- Secuencia de nucletidos obtenida a partir del plsmido pB-91 procedente
de la mutante BGN91. En azul se indica la secuencia de la fraccin del gen (B) y en rojo
la fraccin del gen (A), indicndose con verde el sitio de insercin del transposn
Himar1::GmR . En negro se muestra la secuencia no codificante.
Title
PssmId
pfam01738, DLH, Dienelactone hydrolase family..

65526
COG1073, COG1073, Hydrolases of the alpha/beta superfamily [General function predictio...
31271
COG0412, COG0412, Dienelactone hydrolase and related enzymes [Secondary metabolites bi... 30761
pfam00326, Peptidase_S9, Prolyl oligopeptidase family..
64203
COG0175, CysH, 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate sulfotransferase (PAPS reductase)... 30524
COG2267, PldB, Lysophospholipase [Lipid metabolism].
32448
Multi- EDom value

No 9e-06
No 1e-04
No 6e-04
No 0.007
No 0.010
Yes 1e-04
Figura 12.- A) Imagen representativa de la fraccin del Gen A y el gen B. B) Alineamiento de la protena
codificada por el gen B se observa los dominios con los que existe un mayor grado de identidad o
similitud.
44
(A)
5
LDRFVKAQDGIFDNAIEEILAGKKQTHWMWFIFPQLRGLGQSENAHFYGIRTLNEARNY 63
L+RFV AQ + D A+ E+ G+KQ+HWMWF+FPQ RGLG S A FYG+R+L+EAR Y
9 LERFVMAQTPLLDTALAELRQGRKQSHWMWFVFPQARGLGSSSTARFYGLRSLDEARAY 67
1
2
3
(B)
75
MPGYVSGLTVNARVFVLNKRFVPDRSTGLFDCGHEFHLVNNPNQWVADYSEFIATQISSI 60
MP YV GLTVNAR+FVLNKRFVPDRSTGLF CG EFHL NNP QW ADYSEFI QI S
MPSYVGGLTVNARIFVLNKRFVPDRSTGLFGCGQEFHLANNPEQWSADYSEFIVAQIGST 134
1 61
2
3 135
APKPKNVVLVGVSEGALPAAKVAGLSPAITHLAIIGSGGYSMRKSLATLRQKGAIQFDVN 120
AP P+N+VLVGVSEGAL A KVAG +PA+THLAIIGSGGYSMRKSL+TLR+KG I FDV
APTPRNIVLVGVSEGALTATKVAGSNPAVTHLAIIGSGGYSMRKSLSTLREKGLIWFDVE 194
1 121
2
3 195
SGWEKITADPRSIEKNWYGNSYRWWTDIMDIDPIADLLKLNIPVLIGIGEQDQSVPVESV 180
SGW+KI D RSIEK+WYGN YRWW+D+MDI+P+ D LKL IP+L+GIGEQD+SVPV+S
SGWKKIATDSRSIEKSWYGNPYRWWSDVMDIEPLPDFLKLYIPILVGIGEQDESVPVDSA 254
1
2
3
1
2
3
181
255
NFLETKFKEAGKDNLIVRVYPSADHRLNANGASYRNEFFAELGRLL
FLE+KFKEAGK+NL +RVYP+ADHRLNA G SYR EFFAEL +L
RFLESKFKEAGKNNLTLRVYPAADHRLNAAGTSYRGEFFAELSDIL
226
300
Figura 13.- Identificacin de los genes (A-B). A) Alineamiento de la secuencia de aminocidos obtenida
de la mutante BGN91, correspondiente a la fraccin del Gen A de R. rubrum, con nmero de acceso
GeneBank YP 428240.1, el cual muestra un 59% de similitud entre las secuencias. B) Alineamiento de la
secuencia correspondiente al Gen B, perteneciente a Geobacter sp. con nmero de acceso al GeneBank
ZP01388702.1, el cual muestra un 75% de similitud.
A continuacin se muestran los nucletidos secuenciados a partir de los

plsmidos recombinantes (Tabla. 4).
45
Tabla 4. Extensin nucleotdica secuenciada del total de las regiones clonadas en los plsmidos
recombinantes.
Mutante
Plsmido
Suma del tamao de los
Nmero de nucletidos
fragmentos clonados a
secuenciados
BGN-8
pB-8
1.8, 1.6, 0.5
1005
BGN-5
pB-5
2.1, 1.6,1.3, 0.9, 0.8
710
BGN-9
pB-9
8.1
948
BGN-14
pB-14
4.4
910
BGN-38
pB-38
3.2, 1.8, 0.5g
963
Tamao aproximado en kb.
Se encontr que el gen A, codifica para una protena hipottica de

Rhodospirillum rubrum, sta muestra homologa con una familia de protenas llamada
DUF1810. Esta familia de protenas an no est caracterizada, solamente la estructura
de alguno de sus miembros ha sido resuelta y adopta una estructura alfa helicoidal;
desconociendo por lo tanto su funcin. (http://www.ncbi.nlm.hih.gov).
4.8. Anlisis de la mutante del GEN B

El gen B, codifica para una protena hipottica / Hidrolasa que tiene una regin
Esterasa_lipasa la cual incluye entre sus miembros lipasas y colinesterasas, etc.
Perteneciendo a la familia de las esterasas. Estas enzimas actan sobre esteres
carboxlicos y su aparato cataltico involucra tres residuos (triada cataltica); una serina,
un glutamato o aspartato y una histidina.
46
Como ya se menciono los genes identificados en este trabajo codifican protenas

hipotticas pertenecientes a una familia de prolil- oligopeptidasas. Estas enzimas son
citoslicas, que se expresan en la superficie celular, cuyo peso molecular est entre los
80 KDa y pertenecen a una nueva clase de serinas peptidasas, se encuentran en una
gran variedad de rganos y especies (Szeltner, et al., 2000). De manera general la
familia de las prolil-oligopeptidasas regulan la actividad de pptidos con actividad
biolgica y pptidos hormonales. Tienen con un dominio cataltico c-terminal /
hidrolasa parecido al de lipasas y esterasas (Szeltner, et al., 2000).
Las peptidasas, antes conocidas como proteasas son enzimas que rompen los
enlaces peptdicos de las protenas, usan una molcula de agua para hacerlo y por lo
tanto se clasifican como hidrolasas. Se han identificado en organismos, donde se usan
para
la
digestin
la
reduccin
de
protenas
no
deseadas
(http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa). Por otro lado se ha encontrado que los

miembros de la familia de las oligopeptidasas participan en el procesamiento intestinal y
renal de pptidos que contienen prolina, en la adhesin celular, en el metabolismo
peptdico (incluyendo el metabolismo de las citosinas neuropeptdicas, factores de
crecimiento y quimiocinas) y en procesos inmunolgicos, especialmente la estimulacin
de clulas (Abbott, 2006).
Para poder absorber alimento del medio que les rodea y convertirlo en los
nutrientes que necesitan, las bacterias tienen que liberar enzimas que tengan la
capacidad de transformar los compuestos orgnicos en molculas ms pequeas, para
luego, poder absorberlas al interior celular Las enzimas que efectan la transformacin
son muy especializadas; esto es cada tipo degrada una clase especfica de
compuestos. Es bien conocido que todos los organismos requerimos carbono para
sobrevivir, ya que este es el elemento fundamental para sintetizar las biomolculas que
requiere el organismo, las enzimas son esenciales para extraer el carbono de los
compuestos que hay en el entorno de las bacterias. Akutsu et al., (1997) descubri que
las molculas del poliuretano contenan enlaces de ster, lo que significa que la
47
bacteria produce esterasas que atacan los enlaces ster del polmero, es decir la
enzima rompe estos enlaces y eso le permite aprovechar el polmero como nutriente.
(Figura 14).
Figura 14.- Modelo de degradacin del poliuretano PUR. Estructura del poliuretano, las flechas en rojo
indican los enlaces peptdicos, los cuales pueden ser atacados por enzimas de tipo esterasas, dichos
enlaces una vez hidrolizados, los subproductos obtenidos pueden ser utilizados por la bacteria para su
crecimiento.
En este contexto el gen B identificado en la mutante (BGN91) afectada en su

capacidad de crecer en PUR; y de acuerdo al anlisis de la protena codificada, la cul
mostro homologa con hidrolasas de la familia de las esterasas-lipasas, sugiere que
esta enzima podra hidrolizar los enlaces del tipo ester encontrados en la molcula de
PUR (Figura 2 y 14), y de esta manera la bacteria podra utilizar al polmero como
fuente de carbono y energa.
48
V. DISCUSIN
El poliuretano PUR es un tipo de plstico utilizado como material base en varias

industrias tanto de la construccin, como del calzado, pinturas, recubrimientos etc.
(Oceguera, Cervantes, 2005). La diversidad de estructuras y caractersticas del
poliuretano en diferentes reas y procesos juega un papel muy importante en la
sustitucin de la madera o el metal por polmeros fcilmente moldeables obtenidos a
bajo costo.
A pesar de las ventajas ambientales mencionadas, la generacin de este tipo de

materiales que facilitan la vida humana trae consigo nuevas complicaciones, como la
eliminacin de los desechos generados despus de la utilizacin de productos
fabricados con materiales sintticos.
El PUR contiene en su estructura qumica enlaces de tipo carbamato (uretano) y
dependiendo del tipo de PUR, puede contener enlaces ster o ter. Desde el punto de
vista qumico, estos enlaces podran ser atacados por actividades enzimticas de tipo
proteasa o esterasa.
Si bien es cierto que los plsticos y en particular el PUR no son biodegradables, existen
reportes de que los PS-PUR son sensibles a la biodegradacin ya sea por parte de
bacterias u hongos (Nakajima Kambe et al., 1999).
El objetivo de este trabajo fue identificar en el cromosoma de Comamonas
testosteroni CBQ1 genes involucrados en la asimilacin del poliuretano. Para ello se
planteo obtener mutantes incapaces de crecer en dicho medio, mediante el mtodo de
mutagnesis por transposicin, debido a que la inactivacin de genes mediante la
insercin de transposones es una herramienta til para aislar mutantes con dficit de
funciones especificas (Mathews y Van Holde,1998; Lewin, 2004).
49
Como herramienta gentica se empleo el transposn Himar1 porque ste no

requiere factores especficos del husped para su transposicin eficiente, por lo cual su
transferencia entre diferentes especies no se ve limitada (Zhang et al., 1998). Himar1 se
inserta prcticamente al azar en la secuencia blanco, al requerir solamente el
dinucleotido TA en el sitio de integracin (Lampe et al., 1998). Este transposn contiene
un gen de resistencia a gentamicina, permitiendo seleccionar las clonas que adquieren
este elemento, aislando colonias resistentes al antibitico (Wong y Mekalanos, 2000).
Para realizar el aislamiento de las mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1,
se utilizo una adaptacin del mtodo descrito por Wong y Mekalanos, (2000). El
plsmido pFAC fue transferido mediante conjugacin de la cepa de E. coli S17 (pFAC)
a la cepa de Comamonas testosteroni CBQ1. Se eligieron aleatoriamente 811 clonas,
las cuales fueron sometidas a escrutinio para seleccionar a las mutantes de nuestro
inters. La seleccin se realiz sembrando las transconjugantes por estra en placas de
MB+PUR y una replica en AL con los antibiticos Gm y Sm. Se seleccionaron las
mutantes que mostraron incapacidad total o parcial para crecer en PUR en
comparacin con la cepa silvestre, Comamonas testosteroni CBQ1, utilizada como
control positivo. De este escrutinio se seleccionaron 12 mutantes incapaces de crecer
en PUR respecto a la cepa silvestre.
Con la finalidad de descartar que alguna de las 12 mutantes seleccionadas fuera

una mutante auxotrfica se llev a cabo un segundo escrutinio sembrando por estra a
las mutantes seleccionadas en medio mnimo M9 adicionado con 0.2% de glucosa
como fuente de carbono y energa, la replica fue sembrada en AL en presencia de los
antibiticos Sm-Gm. De esta segunda seleccin no se descarto ninguna de las 12
mutantes, puesto que todas fueron capaces de crecer ante este segundo medio de
seleccin.
Para comprobar la presencia de Himar1::GmR en el cromosoma de las mutantes
PURS, se llev a cabo la amplificacin del transposn por PCR utilizando el
50
oligonucletido MarIN diseado en base a las secuencias repetidas invertidas

terminales del transposn (Wong y Mekalanos, 2000). Amplificando la regin de
transposn correspondiente aproximadamente a 1 kb con el oligonucleotido MarIN.
De las 12 mutantes a las que se les realiz la amplificacin del transposn 6 de
ellas no mostraron amplificado, por lo que se descartaron, quedando solo 5 clonas
demostrando as que en las 5 clonas restantes efectivamente el transposn Himar1 se
encuentra presente en su cromosoma (figura 8). Lo anterior sugiere que en las
mutantes se est interrumpiendo un gen, el cual es responsable de la prdida de la
resistencia al PUR.
Posteriormente para corroborar que ocurri una sola insercin del transposn
Himar1 en el genoma de las mutantes PURS, se llevo a cabo una hidridacin tipo
Southern. Los controles utilizados validaron el experimento, observndose manchas de
hibridacin en el producto de PCR con el DNA de Himar1 (control positivo), pero no as
con el DNA de Comamonas testosteroni CBQ1 (control negativo). En los carriles
correspondientes al DNA de las mutantes se observo una sola mancha de hibridacin,
lo que comprueba que efectivamente el transposn se inserto una sola vez en su
genoma (Figura 9).
Las manchas de hibridacin observadas fueron de diferentes tamaos, lo que
indica que el transposn se insert en diferentes sitios dentro del cromosoma (Figura
9), es decir, que en cada uno de los casos las mutantes PUR S tienen interrumpido un
gen diferente que participa en la susceptibilidad al PUR. Estos resultados concuerdan
con los reportados en otros trabajos, en los cuales se ha utilizado el elemento Himar1
como herramienta de transposicin, y observaron mediante hibridacin que este
elemento se inserta al azar una vez, en diferentes sitios del cromosoma (Zhang et al.,
2000, Ashour y et al., 2003, Stewart et al., 2004, Leal et al., 2004).
51
Este anlisis de hibridacin nos permiti determinar que en la mayora de las

mutantes PURS se encuentra el transposn insertado en el genoma, afectando algn
gen responsable del fenotipo de resistencia a PUR.
Para identificar el gen interrumpido por el transposn, se realiz la clonacin de
las regiones gnicas en el vector pBluescriptII Sk (-). Se lograron clonar los fragmentos
de DNA de cinco de las mutantes incapaces de crecer en PUR (Mutante 8, Mutante 5,
Mutante 9, Mutante 14 y Mutante 38). Se confirm que todos los plsmidos
recombinantes presentaron una banda correspondiente al vector linearizado (2.9 kb).
Con estos resultados podemos sugerir que en los plsmidos clonados se encuentran
los fragmentos de DNA interrumpidos por el transposn Himar1::GmR y fragmentos
adicionales que pueden ser o no parte de la regin interrumpida (Figura 10).
Posteriormente,
se
prosigui
realizar
la
secuenciacin
utilizando
el
oligonucletido MarOut diseado a partir de la secuencia de repetidos invertidos del

extremo 5 del transposn Himar1::GmR hacia la regin aledaa. Esto permiti conocer
la secuencia de la regin interrumpida.
De esta manera se logr obtener la secuencia de las regiones interrumpidas de
cinco plsmidos recombinantes, correspondientes a las mutantes 8, 5, 9, 14, y 38
(Tabla 4). A partir de los resultados obtenidos y de las comparaciones de las
secuencias, se determino trabajar slo con el plsmido BGN9.
As pues la secuencia obtenida del plsmido BGN9 procedente de la mutante 9,
codifica para protenas hipotticas de la familia de las prolil- oligopeptidasas, en donde
la fraccin del gen A codifica para una protena hipottica de Rhodospirillum rubrum y el
gen B para una protena hipottica de Geobacter sp. Esta familia de protenas regulan
la actividad de pptidos con actividad biolgica y pptidos hormonales, tienen un
dominio cataltico C- terminal / hidrolasa parecido al de lipasas y esterasas (Szelther
et al., 2000). As pues, las peptidasas, antes conocidas como proteasas son enzimas
que rompen los enlaces peptdicos de las protenas y para hacerlo utilizan una molcula
52
de agua, clasificndose como hidrolasas, estas enzimas pueden romper ya sea enlaces
peptdicos
especficos
hidrolizar
un
pptido
completo
aminocidos
(http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa).
Dado que algunas de las bacterias capaces de crecer en PUR presentan

actividades enzimticas de tipo esterasa (Akutzu, 1997) y otras de tipo proteasa
(Howard, 1998), en este trabajo se realizaron pruebas especficas, mediante el uso de
medios diferenciales, para detectar si las mutantes capaces de crecer en PUR,
presentaban algunos de estos tipos de actividades enzimticas. Ya que dependiendo
del tipo de PUR, puede contener enlaces ster o ter y desde el punto de vista qumico,
estos enlaces podran ser atacados por actividades enzimticas de tipo proteasa o
esterasa. Las cinco mutantes incapaces de crecer en PUR posean alguna(s) de las
actividades enzimticas previamente descritas que actan sobre el PUR (Figuras 6 y 7,
Tabla 4).
Se encontr, que las mutantes (8 y 14) presentaron actividad de proteasa, en
tanto que las mutantes (38, 5, 9 y 8) presentaron actividad de esterasa, cabe mencionar
que la mutante 8 fue la nica que present tanto actividad enzimtica de proteasa como
de esterasa. As mismo la mutante 14 fue la nica en mostrar prueba negativa a la
actividad de esterasa. La actividad de esterasa es la que ms comnmente se ha
encontrado en estudios de degradacin de PUR, debido probablemente a que en estos
trabajos se ha empleado PS-PUR para la seleccin y el anlisis (Ruiz, 1999; Howard,
1999; Nakajima-Kambe et al., 1999) y tambin al hecho de que los enlaces ster se
presentan en mayor proporcin que los enlaces carbamato, que podran ser atacados
por proteasas. En trabajos anteriores se han analizado incluso los productos de
degradacin del PUR, los cuales corresponden a compuestos provenientes de la
hidrlisis de enlaces ster (cidos y alcoholes) (Nakajima-Kambe et al., 1997). Ya que
el PUR empleado en este trabajo (Hydroform ) es de tipo polister, lo ms lgico es
suponer que dicha bacteria fue capaz de hidrolizarlo y utilizarlo para su crecimiento.
53
Puesto que se sabe que el PUR en proceso de deterioro podra albergar

microorganismos con tales actividades enzimticas capaces de hidrolizar los enlaces
correspondientes presentes en el PUR, para que as el microorganismo pudiera
utilizarlo como fuente de carbono o de nitrgeno. Para poder absorber alimento del
medio que les rodea y convertirlo en los nutrientes que necesitan, las bacterias tienen
que liberar enzimas que tengan la capacidad de transformar los compuestos orgnicos
en molculas ms pequeas, para luego, poder absorberlas al interior celular. Las
enzimas que efectan la transformacin son muy especializadas; esto es cada tipo
degrada una clase especfica de compuestos. Es bien conocido que todos los
organismos requerimos carbono para sobrevivir, ya que este es el elemento
fundamental para sintetizar las biomolculas que requiere el organismo, las enzimas
son esenciales para extraer el carbono de los compuestos que hay en el entorno de las
bacterias.
Akutsu et al., (1997) descubri que las molculas del poliuretano contenan
enlaces de ster, lo que significa que la bacteria produce esterasas que atacan los
enlaces ster del polmero, es decir la enzima rompe estos enlaces en pedazos ms
pequeos y eso le permite aprovechar el polmero como nutriente (Figura 14).
En este contexto el gen B identificado en la mutante (BGN9) afectada en su

capacidad de crecer en PUR; y de acuerdo al anlisis de la protena codificada, la cul
mostro homologa con hidrolasas de la familia de las esterasas-lipasas, sugiere que
esta enzima podra hidrolizar los enlaces ster presentes en la molcula de PUR
(Figura 2). Y de esta manera la bacteria podra utilizar al polmero como fuente de
carbono y energa.
54
VI. CONCLUSIONES
Este trabajo da informacin sobre los genes de Comamonas testosteroni CBQ1

involucrados en la asimilacin del poliuretano, los cuales no haban sido identificados.
Mediante el anlisis de la secuencia pudimos identificar dos genes (A y B), que
codifican para una protena hipottica de la familia de las prolil- oligopeptidasas, las
cuales regulan la actividad de pptidos activos biolgicos y tienen la capacidad de
romper ya sea enlaces peptdicos especficos o reducir un pptido completo a
aminocidos. Mediante las pruebas de actividad enzimtica relacionadas con la
degradacin del PUR se demostr cierta afinidad por una actividad tipo esterasa y
tomando en cuenta que las molculas del poliuretano contienen enlaces ster, esto
sugiere fuertemente que la bacteria produce esterasas que atacan los enlaces ster del
polmero, es decir la enzima rompe estos enlaces y eso le permite aprovechar el
polmero como sustrato.
55
VII. BIBLIOGRAFA
Akutsu, y Nakajima-Kambe T, Nomura N, T Nakahara . 1998. Purification and properties
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Bacterium Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 187: 1254-1265
(http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa)
59
INDICE
I. I N T R O D U C C I N ............................................................................................... 1
1.1. Sntesis y usos del PUR........................................................................................ 2
1.2. Biodegradacin del Poliuretano ............................................................................ 4
1.3. Proteasas .............................................................................................................. 7
1.4. Ureasas................................................................................................................. 7
1.5. Esterasas .............................................................................................................. 8
II. O B J E T I V O
G E N E R A L .............................................................................. 10
2.1.- Objetivos particulares ........................................................................................ 10

III. M A T E R I A L E S
M E T O D O S ............................................................. 11
3.1. Medios de cultivo ................................................................................................ 11

3.2. Medios diferenciales para identificacin de las actividades enzimticas. ........... 12
3. 3. Cepas y plsmidos. ............................................................................................ 14
3.4. Mutagnesis por transposicin ........................................................................... 19
3.5. Conjugacin triparental ....................................................................................... 20
3.6. Aislamiento de DNA total (cromosmico) de las cepas de Comamonas
testosteroni CBQ1 ...................................................................................................... 21
3.7. Aislamiento de plsmidos ................................................................................... 22
60
3.7.1. Aislamiento por lisis alcalina ............................................................................ 22

3.7.2. Aislamiento de plsmidos por el sistema (Rapid Plasmid Purification System
Marligen Bioscence Inc.) ............................................................................................ 23
3. 8. Tcnica para el aislamiento de fragmentos de DNA de geles de agarosa ......... 23
3.9. Electroforesis en geles de agarosa ..................................................................... 24
3.10. Amplificacin de DNA por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ........... 25
3.10.1. Oligonucletidos empleados. ......................................................................... 25
3.10.2. Amplificacin .................................................................................................. 25
3.11. Tratamientos enzimticos de molculas de DNA .............................................. 26
3.11.1. Restriccin de DNA con endonucleasas ........................................................ 26
3.11.2. Ligacin de DNA ............................................................................................ 26
3.12. Transformacin de clulas competentes de E. coli ........................................... 26
3.12.1. Preparacin de clulas competentes de E. coli ............................................. 26
3.12.2. Electroporacin .............................................................................................. 27
3.13. Hibridacin tipo Southern. ................................................................................. 27
3.13.1. Transferencia por capilaridad ......................................................................... 27
3.13.2. Marcaje de la sonda con digoxigenina ........................................................... 28
3.13.3. Tcnica de hibridacin ................................................................................... 29
3.13.4. Deteccin ....................................................................................................... 29
61
3.14. Secuenciacin ................................................................................................... 30

3.14.1 Oligonucletidos empleados ........................................................................... 30
3.14.2. Amplificacin de los fragmentos utilizando dideoxinucleotidos (ddNTPs) ...... 30
3.14.3. Purificacin de las muestras .......................................................................... 30
3.15. Escrutinio para la identificacin de mutantes afectadas en el crecimiento en
MB+PUR. ................................................................................................................... 31
3.15.1. Actividad proteasa.......................................................................................... 31
3.15.2. Actividad Esterasa ......................................................................................... 32
IV. R E S U L T A D O S...................................................................................... 33
4.1. Obtencin de mutantes de Comamonas testosteroni CBQ1 ............................... 33
4.2. Seleccin de las mutantes incapaces de utilizar poliuretano (PUR) ................... 34
4.3. Identificacin de las actividades enzimticas producidas por las bacterias que
crecen en PUR, empleando medios diferenciales ..................................................... 35
4.3.1. Actividad de Proteasa. ..................................................................................... 35
4.3.2. Actividad de Esterasa. ..................................................................................... 36
4.4. Amplificacin del transposn Himar1::GmR por PCR .......................................... 38
4.5. Deteccin del transposn por hibridacin tipo Southern Blot .............................. 39
4.6. Clonacin de las regiones interrumpidas por el transposn ................................ 41
4.7. Secuenciacin de las regiones interrumpidas por el transposn ........................ 42
62
4.8. Anlisis de la mutante del GEN B ....................................................................... 46

V. DISCUSIN .............................................................................................................. 49
VI. CONCLUSIONES .................................................................................................... 55
VII. BIBLIOGRAFA ...................................................................................................... 56

................................................................................................................................... 59
63

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UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO

Firmado digitalmente por

IDENTIFICACIN DE GENES INVOLUCRADOS EN LA ASIMILACIN DE

POLIURETANO (Hidroform ) EN Comamonas testosteroni CBQ1

NANCY BARAJAS GARCA

Director de tesis: D.C. Jess Campos Garca

Morelia Michoacn, Enero de 2010

Agradezco primeramente a Dios por ser mi mejor amigo, mi fortaleza,

A mis hermanos, Pedro, Cristina, Claudia, Rodolfo, Bibiana y Carmelita,

A Jaime, por ser quien eres y brindarme tu confianza y amistad.

A mis amigos de la Universidad, a todos y a cada uno de ellos por

Agradezco a los miembros de la mesa revisora de este trabajo. Al Dr. Miguel

Y a Ti por haber aparecido y cambiado mi vida

PARTE DEL TRABAJO EXPERIMENTAL SE REALIZO EN EL:

Laboratorio de Biotecnologia Microbiana del Instituto de Investigaciones

Laboratorio de Microbiologa del Instituto de Investigaciones Qumico

Gas Chromatography Mass Spectrometry

El poliuretano (PUR) es un polmero artificial que se sintetiza a partir de la

Si bien son muchas sus aplicaciones, la produccin masiva de PUR trae

Oceguera-Cervantes., (2005), Aisl una cepa bacteriana identificada como

Posteriormente se clonaron, secuenciaron y analizaron las regiones gnicas

Como resultado de las diferentes actividades humanas, el aumento poblacional y

Entre los productos qumicos de lenta degradacin se encuentran cierto tipo de

Dentro de este grupo de compuestos se encuentra el poliuretano PUR, desarrollado por

Desde su introduccin comercial hace ms de 50 aos, el PUR ha sido el nicho

grandes cantidades de PUR ha llegado al grado de poder sustituir parcialmente la

1.1. Sntesis y usos del PUR

Figura 1. Reaccin de sntesis de poliuretano, La reaccin se ejemplifica con el 2,4-di-isocanato de

El uso de los diferentes tipos de PUR vara de acuerdo a las caractersticas o

De manera general pocos gneros de microorganismos son capaces de asimilar

Oceguera-Cervantes (2005), realiz un estudio en el que aisl bacterias

A pesar de las ventajas ambientales mencionadas, la generacin de este tipo de

Solo por mencionar, en Mxico se calcula que el promedio de produccin del

molcula orgnica dificulta el ataque microbiano, y por consecuencia aumenta su

En la actualidad existen reportes de degradacin microbiana del PUR,

testosteroni (Nakajima-Kambe et al., 1999). (Oceguera-Cervantes, 2005).

Teeraphatpornchai et al., (2002) aislaron varios microorganismos de muestras de

tanto de proteasas como de esterasas, las cuales se relacionaron con la degradacin

Dado lo descrito anteriormente se puede pensar que las actividades enzimticas

En Comamonas acidovorans cepa TB35 se ha descrito una esterasa capaz de

La perdida de peso de cubos de PUR incubados con la enzima unida a

Identificar genes de Comamonas testosteroni CBQ1 involucrados en la

2.1.- Objetivos particulares

Seleccionar mutantes incapaces de asimilar PUR.

Analizar las secuencias de nucletidos de los genes identificados.

Identificar los genes interrumpidos por el transposn.

Proponer un mecanismo de la participacin de los genes identificados en el mecanismo

3.1. Medios de cultivo

a) Caldo Luria-Bertani (CL): compuesto por NaCl 10 g/L, peptona de casena 10

d) Medio basal (MB+PUR): Basado en el medio propuesto por Nakajima-Kambe

Solucin de elementos traza

Las soluciones A y B se esterilizaron en autoclave a 120C por 20 minutos.

3.2. Medios diferenciales para identificacin de las actividades enzimticas.

Medio YES (Howard et al., 1999).

Se prepararon las soluciones B y C, y despus se esterilizaron por filtracin y se

Medio de Hidrlisis de Tween 80. (Oceguera-Cervantes, 2005): Composicin por

Tabla1.- Cepas utilizadas en este trabajo.

Aislado bacteriano capaz de crecer en un medio

Wong y Mekalanos, (2000)

Yanisch-Perron et al., (1985)

Mutante obtenida por transposicin CBQ1::

Mutante obtenida por transposicin CBQ1::

Mutante obtenida por transposicin CBQ1::