PREPARO DE LMINAS HISTOLGICAS

Ana Lcia Tosta Ribeiro, Anderson Carrijo da Costa,

Cntia Ruiz Denadai, rika Maria Antonino Fonseca,
Fabiana Peghim, Janayne Aparecida Pentino,
Luiz Alves Rodrigues, Priscila Maria Antonini,
Teresinha de Jesus Borin de Carvalho,
Vanessa Cristina Mazzi
Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos

INTRODUO
O mtodo mais comum usado em histologia vegetal permite a obteno
de preparados histolgicos permanentes (lminas) para estudo ao microscpio
ptico. Nesse instrumento os objetos so examinados por transparncia e
como rgos muito delgados so raros, a maioria precisa ser reduzida a cortes
finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscpio.
Estes cortes so feitos com um micrtomo, mas antes de serem cortados os
tecidos devem passar por uma srie de tratamentos.
Obviamente, o que se deseja levar ao microscpio um preparo no qual
os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma

estrutura e composio qumica que possuam quando vivos. Mas apesar dos
cuidados tomados, esse ideal no alcanado plenamente, observando-se em
todos os cortes histolgicos certos artefatos decorrentes do processamento que
sofreram.
A fim de evitar a destruio das clulas por suas prprias enzimas, ou
por bactrias, os tecidos removidos devem ser adequadamente tratados
imediatamente aps a sua retirada. Esse tratamento denominado fixao. A
principal funo dos fixadores insolubilizar as protenas dos tecidos.
Para obteno dos cortes, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos
por substncia de consistncia firme. As substncias mais usadas para essa
finalidade (meios de incluso) so a parafina e as resinas plsticas.
Os

tecidos

devem

sofrer

uma

srie

de

tratamentos

antes

da

impregnao. Na primeira etapa do processo, denominada desidratao, a

gua extrada dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de
concentraes crescentes de etanol, geralmente de 70%, at etanol puro
(100%).
Em seguida, o etanol substitudo por um lquido miscvel e geralmente
usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substncias tornam-se
translcidos,

razo

por

que

essa

etapa

denominada

clareamento.

Mergulham-se, ento, os tecidos em parafina fundida numa estufa a 60C.

Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam, e os espaos anteriormente
ocupados pela parafina ficam livres. Coloca-se o tecido num recipiente
contendo um pouco de parafina fundida e deixa-se solidificar, formando-se um
bloco de parafina com o tecido no seu interior (incluso).
Os blocos de parafina, contendo os tecidos includos, so seccionados pela
navalha de ao do micrtomo, obtendo-se geralmente cortes de 6 a 8 m de
espessura.
A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao
microscpio ptico. Devido a isso, foram introduzidos mtodos para a colorao

dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e destacados uns dos
outros.
A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como cidos
ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes
nos tecidos.
A hematoxilina comporta-se como um corante bsico, ligando-se s
estruturas basfilas dos tecidos. A hematoxilina cora em azul os ncleos
celulares e outras estruturas de natureza cida, como regies do citoplasma
ricas em RNA e espessamentos celulares de celulose.
Ao estudar um corte histolgico no microscpio, preciso ter em mente
que a estrutura das clulas e tecidos est alterada pela tcnica histolgica. As
etapas

da

tcnica

clareamento,

histolgica,

impregnao

subseqentes

colorao),

tambm

fixao

(desidratao,

introduzem

algumas

modificaes nos tecidos, que no devem dificultar a caracterizao das

estruturas estudadas.
Alm disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstculo ao estudo
tridimensional dos tecidos e rgos. Para se chegar a compreender a
arquitetura tridimensional de um rgo ou tecido, torna-se necessrio o estudo
de cortes realizados em diferentes direes.

MATERIAIS E MTODOS
Para a realizao dos cortes histolgicos, foram cortados e retirados
segmentos no 1/3 proximal da regio laminar, retirando cerca de 1 cm 2 cada
pea nas folhas de Hibiscus rosacinencis L. com auxlio de uma rgua e
tesoura. Estes pedaos de folhas foram submetidos s seguintes metodologias:

Metodologia I:

Utilizou-se a mesma tcnica para os cortes histolgicos de tecido animal,

procedendo desidratao, clareamento, impregnao, incluso e a colorao
com o auxilio de cassete

(Lupe), pinas, bqueres, cronmetro, proveta,

estufa, geladeira, micrtomo, lminas, lamnulas, resina Permount

Scientific)

microscpio

para

visualizao

Consistindo-se na passagem dos cassete

dos

cortes

(Fisher

preparados.

(Lupe) (onde contm a pea da

planta) nas seguintes substncias e nos tempos indicados:

DESIDRATAO:
lcool
lcool
lcool
lcool
lcool
lcool
lcool
lcool

70%
75%
80%
85%
90%
absoluto I
absoluto II
absoluto / xilol

30
30
30
30
30
30
30
30

minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos
minutos

CLAREAMENTO:
Xilol I
Xilol II
Xilol III

20 minutos
20 minutos
20 minutos

IMPREGNAO:
Parafina I
Parafina II
Parafina III

30 minutos
30 minutos
30 minutos

Aps estes procedimentos, realizou-se a incluso da pea no molde de

parafina, onde ela inclusa no centro do molde at completa solidificao,
resfriada e levada a geladeira por no mnimo 40 minutos. A pea moldada de
acordo com o tamanho do micrtomo, sendo realizado os cortes de 7 m que
so levados ao banho-maria na temperatura entorno de 50C. Os cortes so

colocados na lmina e corados com a hematoxilina (HE), seguindo os tempos

necessrios:
Xilol I
Xilol II
lcool absoluto
lcool absoluto
lcool 90%
lcool 70%
gua
Hematoxilina
gua
lcool 70%
lcool absoluto
lcool absoluto
Xilol I
Xilol II
Xilol III

I
II

I
II

7 minutos
7 minutos
passagem
passagem
passagem
passagem
2 minutos
2 minutos
2 minutos
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem

Feita a colorao, as lamnulas foram fixadas nas lminas com permount,

estando pronta para a visualizao no microscpio.

METODOLOGIA II:
Aplicou-se a tcnica anterior mudando somente o tempo de permanncia
do xilol no clareamento, de 20 minutos para 10 e 5 minutos. Na colorao, de
7 minutos para 3 e posteriormente para 1minuto, seguindo normalmente as
outras etapas at visualizao.
METODOLOGIA III:
Quando as peas das plantas foram removidas, elas ficaram por cerca de
12 horas no formol para que fosse realizada a fixao e prosseguiu-se
normalmente com a desidratao, clareamento, impregnao e colorao da
metodologia anterior.
METODOLOGIA IV:

As peas foram colocadas por 10 minutos na gua destilada, 20 minutos

no xilol, incluidas no molde de parafina e ento foram feitos os cortes no
micrtomo.
METODOLOGIA V:
As

peas

contidas

no

cassete

(Lupe)

passaram

pelos

seguintes

procedimentos:
gua destilada
10 minutos
Xilol
20 minutos
Descansou at que o xilol tenha escorrido.
Xilol

20 minutos
Depois foram colocadas em parafina e levadas para a estufa a 56C. Fez-

se a incluso nos moldes, esperou-se secarem e foram levadas para a

geladeira. As peas foram moldadas no micrtomo e feitos os cortes, tiradas
do banho-maria e passadas para as lminas, fazendo-se a colorao nas
seguintes substncias:
Hipoclorito
Hematoxilina
gua de torneira
Lugol

7 minutos
1 minuto
lavagem
1 minuto

As lamnulas foram fixadas nas lminas com Permount

(Fisher

Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VI:
Utilizou-se o procedimento da desidratao, clareamento, impregnao e a
incluso da metodologia I, e cortes no tamanho de 20, 25 e 40 m.
Para a colorao foram usadas as seguintes substncias e tempos:
Xilol
Xilol

I
II

1 minuto
1 minuto

lcool absoluto I
lcool absoluto II
lcool 90%
lcool 70%
gua de torneira
Hipoclorito
gua de torneira
Lugol
Hematoxilina
gua de torneira
lcool 70%
lcool 90%
lcool absoluto I
Xilol I
Xilol II
Xilol III

passagem
passagem
passagem
passagem
lavagem
5 minutos
lavagem
1 minuto
38 segundos
lavagem
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem

Aps a colorao as lamnulas foram colocadas nas lminas com Permount

(Fisher Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VII:
Fez-se

mesmo

procedimento

da

metodologia

substncias e tempos na colorao:

Xilol I
Xilol II
lcool absoluto I
lcool absoluto II
lcool 90%
lcool 70%
gua de torneira
Lugol
Hematoxilina
gua de torneira
lcool 70%
lcool 90%
lcool absoluto I
lcool absoluto I
Xilol I
Xilol II

3 minutos
3 minutos
passagem
passagem
passagem
passagem
lavagem
5 minutos
38 segundos
lavagem
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem
passagem

V,

mudando

as

Xilol

III

passagem

Foram colocadas as lamnulas e visualizadas ao microscpio.

RESULTADOS
Todas as Metodologias I a VI descritas e testadas, no produziram cortes
bons, montados em lminas para visualizao ao microscpio ptico adequadas,
tornando-se difcil a distino dos tecidos a serem estudados.
As figuras abaixo mostram os cortes obtidos com a Metodologia VII que
mostrou-se a mais indicada para o estudo de cortes da regio laminar de
folhas de vegetais.
Figura 1
Figura 2
Figura 3

Dependendo da finalidade a que se destina pode-se montar os cortes em

lminas para observao imediata ou em lminas ditas permanentes. Neste
estudo obtivemos os melhores cortes semi-permanentes com a Metodologia
VII.
Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorreu do fato de
que, quando se cora um preparado histolgico, dependendo da tcnica
empregada, apenas alguns aspectos das estruturas teciduais so evidenciados.
difcil o preparo de uma lmina que mostre todos componentes celulares e
todos os detalhes dos tecidos.

Leia mais sobre a produo de lminas vegetais em:

a) Junqueira, L. C.; Carneiro, J.; Histologia Bsica, 8 edio, Editora
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995.
b) Esau, K., Anatomia das Plantas com Sementes; Editora Edgard Blucher,
S.P.,1974.

Figuras e legendas

Figura 1: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com lugol no tamanho de 20 m.

Figura 2: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.

Figura 3: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.