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Rev Biomed 1995; 6:33-46.

Las tcnicas de unin para medir

hormonas.

Rubn C. Montes-Prez.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autnoma de Yucatn.Mrida, Yucatn,

Mxico.

RESUMEN.
En la actualidad, mediante las tcnicas de
unin se realizan cotidianamente la deteccin de
hormonas as como tambin de otro tipo de
biomolculas que se encuentran en cantidades muy
pequeas en fludos biolgicos. Son varias las
tcnicas de unin, algunas de stas son: los
inmunoanlisis, el ensayo de enlace competitivo
con protena transportadora y el ensayo de unin
con receptor. La tcnica que frecuentemente se ha
utilizado es el radioinmunoanlisis. A partir de 1960,
ao en que Yalow y Berson dieron a conocer
esta tcnica, otros grupos de investigacin la han
desarrollado an ms. Sin embargo los principios
tericos sobre los que se fundamenta han
permitido el avance de tcnicas derivadas de la
misma como el enzimoinmunoanlisis,
fluoroinmunoanlisis y viroinmunoanlisis. En el
presente documento se revisan las caractersticas
de los ensayos de unin, en especial de los
inmunoanlisis, los tipos que existen y algunas
aplicaciones que tienen.

Palabras clave: ensayos de unin, hormonas,

inmunoanlisis, radioinmunoanlisis, RIA.

SUMMARY.
THE BINDING ASSAYS FOR MEASURING
HORMONES. Today the binding assays are used
to measure hormones and other biomolecules which
exist in low quantities in biological fluids. There
are several binding assays including: immunoassays,
competitive protein binding assay and receptor
binding assay. The technique most commonly used
is the radioimmunoassay (RIA). In 1960 Yalow
and Berson first reported the immunoassay
technique, and since then other investigators have
further developed RIA. However, the theoretical
principles of binding assays have been the basis to
produce new RIA-derived techniques; for example
enzymoimmunoassay (EIA), fluoroimmunoassay
(FIA) and viroimmunoassay (VIA). This report
reviews the characteristics, types and applications
of binding assays, especially immunoassays in animal

Solicitud de sobretiros: Rubn C. Montes-Prez. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma de Yucatn. Apartado
Postal 4-116. Itzimn. C.P. 97100, Mrida, Yucatn, Mxico.
Recibido el 14/Abril/94. Aceptado para publicacin el 17/Nov./94.

Vol. 6/No. 1/Enero-Marzo, 1995.

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RC Montes-Prez .
reproduction.
Key words: binding assays, hormones,
enzymoimmunoassay, RIA, radioimmunoassay.

INTRODUCCION.
Los anlisis bsicos para detectar
compuestos qumicos en materiales biolgicos
son tres: biolgicos, fisicoqumicos y de unin. Los
anlisis o tcnicas de unin se han definido como
aquellos que utilizan molculas que se enlazan
especfica y reversiblemente a las sustancias que
interesen detectar o cuantificar (1). Estas tcnicas
se utilizan frecuentemente para cuantificar molculas
que estn presentes en fluidos biolgicos, en
concentracin de nanogramos por mililitro (10-9 g/
mL) o de picogramos por mililitro (10-12 g/mL). Se
consideran como ensayos estructuralmente
especficos, es decir miden la cantidad de masa de
la sustancia de inters, independientemente de su
efecto fisiolgico. Por esta situacin este tipo de
anlisis
permite cuantificar molculas
biolgicamente activas en cantidades sumamente
pequeas, procedimiento que todava a mediados
de siglo era complicado (2). En la actualidad existen
junto con esta tecnologa otras ms como la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
(3) o la cromatografa de gas-lquido (4), que son
capaces de medir cantidades de masa a estas
concentraciones o an menores, pero que todava
no han logrado ser ampliamente disponibles para
uso cotidiano como es el radioinmunoanlisis (RIA)
(5).
LOS ENSAYOS DE UNION.
El RIA, como un ejemplo de los ensayos de
unin, tambin se le ha denominado ensayo de
saturacin, anlisis de desplazamiento, anlisis de
enlace insaturado, anlisis de fraccin no enlazada,
radioensayo de dilucin, anlisis competitivo,
radioensayo de enlace competitivo y ensayo
Revista Biomdica

inmunoradiomtrico. La naturaleza de esta

metodologa ha permitido que se le asignen tales
nombres (2). Todos los ensayos de unin, se
caracterizan por estar constituidos por tres
componentes bsicos, la molcula enlazadora
(ligador o unidor), la molcula que se desea
enlazar (analito o ligando) y otro ligando
marcado (trazador). En la actualidad algunas
tcnicas de unin marcan al ligador en vez del
ligando; en cualquier caso siempre est presente
el trazador ya sea como ligando o ligador.
La molcula ligadora debe ser capaz de unirse
nicamente con aquella que interesa medir. Es decir
debe ser especfica. Adems la unin tiene que ser
suficientemente estable, propiedad que se le
denomina afinidad (6). Esto permite al unidor
enlazarse con un tipo de molcula a pesar de
existir varias molculas estereoqumicamente
semejantes.
Cuando se utilizan anticuerpos como
ligadores, el anlisis recibe el nombre de
inmunoanlisis; si es un receptor se llama ensayo
receptor o si es una protena transportadora, se
denomina ensayo de protena de enlace
competitivo (CPBA) (7). Se han diseado anlisis
de unin que emplean en cada caso uno de estos
unidores, sin embargo, el principal obstculo para
hacer prctico estos ensayos es la carencia de altas
cantidades del unidor que presenten elevada
afinidad y especificidad (1). Por esta razn se
utilizan principalmente anticuerpos policlonales o
monoclonales. Los primeros se producen en altas
cantidades a travs de la inmunizacin activa de
conejos, cuyos, borregos, caballos o gallinas (8,9).
Los anticuerpos monoclonales se obtienen por la
fusin de plasmacitoma con linfocitos B de algn
animal inmunizado previamente. Los hibridomas
resultantes forman clonas que producen un tipo de
inmunoglobulinas dirigidas hacia un especfico
determinante antignico (10). Una ventaja
adicional que tiene la utilizacin de estos
anticuerpos es la posibilidad de seleccionarlos por

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Tcnicas de unin.
la afinidad y especificidad hacia cada uno de los
determinantes antignicos y no contra todos
aquellos que constituyen el inmungeno (1).
Cuando la sustancia que interesa medir es
una hormona, droga o metabolito presente en el
fluido biolgico, recibe el nombre de ligando y es la
molcula que no est marcada. A sta se le llama
ligando fro. El trazador es el mismo ligando,
pero marcado, ya sea con radioistopo, enzima,
virus o compuesto fluorescente (1). La marca
sirve para detectar el complejo de unin formado
entre el ligando de la muestra biolgica con el
ligador. Originalmente se us como marca al yodo
radiactivo 131 (I-131) y al tritio (H-3). Sin embargo
la baja eficiencia del conteo de la radiacin emitida
y el efecto de la extincin del centelleo ha
originado que se sustituyan por yodo-125, que
no presenta las desventajas anteriores (11). Las
tcnicas de unin que utilizan como componentes
a anticuerpos y ligandos radiactivos son los RIA.
Por otro lado, si la marca es una enzima que
mediante la reaccin con el sustrato especfico
produce color, el cual se detecta por absorcin
de luz, entonces se llama enzimoinmunoanlisis
(EIA). Los viroanlisis utilizan a virus como marca
y los fluoroinmunoanlisis (FIA) compuestos

Figura 1.- Desplazamiento de la unin del anticuerpo con el

trazador por diferentes cantidades de analito.

fluorescentes (12-14).
CINETICA DEL INMUNOANALISIS.
Se tomar como modelo de la cintica de los
ensayos de unin al RIA que utiliza anticuerpos
que se comportan como si presentaran un sitio de
unin (6,15-17). El anlisis consiste en colocar
conjuntamente el anticuerpo (Ac), el antgeno
(Ag) y trazador (Ag*) en tubos de ensayo bajo
condiciones fisicoqumicas controladas, como son:
temperatura, volumen, acidez y concentracin, para
que el Ac se una con el Ag y con el Ag*. Se forma
as el complejo de unin Ag:Ac, como se muestra a
continuacin:
Ag + 2 Ac + Ag* <
> Ag:Ac + Ag*:Ac
Formado el complejo, se procede a mantener
constantes la cantidad de Ac y Ag*, pero variar
la cantidad de Ag de la manera que se describe en
la figura 1.
En el caso (a) la cantidad de Ag (ligando
fro) es cero, porque no est presente. Entonces
todo el complejo contendr nicamente al
trazador. La emisin de radiacin del complejo
ser alta. En (b) la presencia de 3 molculas de
Ag frente a 6 de Ag* produce competencia
entre Ag y Ag* para unirse con el Ac y por
consecuencia el desplazamiento de dos molculas
de Ag* por Ag al formarse los complejos.
Entonces la cantidad de radiacin emitida por
el complejo disminuye.
En (c) y (d) el desplazamiento del Ag* por
Ag es mayor ya que el Ag est en mayor proporcin
y en cada caso disminuir gradualmente la radiacin
que emitan los complejos formados.
La figura 2 representa el proceso arriba
descrito.
La formacin de los complejos se realiza de
acuerdo a la Ley de Accin de Masas (18) que
describe cuantitativamente las velocidades de
asociacin y disociacin de los complejos hasta
alcanzar el equilibrio. Partiendo de que los ligadores contienen slo un sitio de unin, entonces

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las velocidades de asociacin (V1) y disociacin
(V2) son:
V1
Ac + Ag <
> Ac : Ag
V2
[1] V1 = K1 [Ac][Ag]
V2 = K2 [Ac:Ag]
Donde [ ] es la concentracin molar del
producto o del reactivo. K1 y K2 son las constantes
de proporcionalidad de la reaccin de formacin
y disociacin del complejo, Keq es la constante de
equilibrio o constante de afinidad del anticuerpo.
Cuando se alcanza el equilibrio en la reaccin para
la formacin del complejo, entonces ambas
velocidades son iguales, por lo tanto, se obtiene la
siguiente igualdad:
V1 = V2
[2] K1 [ Ac ][ Ag] = K2 [ Ag:Ac ]
Reordenando la igualdad para colocar
constantes y variables de cada lado, se obtendr la
siguiente ecuacin:
[ Ac:Ag ]
[3]
Keq =
[ Ac ][ Ag ]
En este momento se puede medir la fuerza
que mantiene la unin entre el ligador y el
ligando. Para conseguirlo es preciso transformar
los resultados mediante un tratamiento
matemtico, que consiste en estimar el cociente
unido/libre, que representa el trmino [Ag:Ag]/
[Ac] [Ag] (B/F), y la expresin molar del Ag
unido. Para obtener los resultados se deben
separar las molculas radioactivas que no estn
unidas al anticuerpo. Esta se llama fraccin
libre (F), ya que la fraccin unida (B) es la
considerada en el complejo. Una de tantas
formas de eliminar la fraccin libre es aadiendo
carbn activado finamente granulado al tubo de
ensayo donde se realiz la reaccin. Las
partculas de carbn fijan sobre su propia
superficie molculas pequeas. Si el Ag* y el
Ag son tambin pequeas, se adherirn
empleando la centrifugacin (19) se podrn
separar ambas fracciones y se medir la radiacin
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Figura 2. Curva de desplazamiento de la unin del trazador con

el anticuerpo por cantidades crecientes de analito.

procedente de los complejos (B) o la proveniente

de los sobrenadantes (F).
La emisin radiactiva se mide en un contador
de radiacin adecuado, entonces se podr obtener
la razn B/F. Al representar B/F contra la
concentracin se observar una grfica como la
que se muestra en la figura 3.
La grfica corresponde a una recta cuya
interpretacin tiene que ser con base a la reaccin

Figura 3. Grfica de Scatchard lineal.

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Tcnicas de unin.
de Ag con Ac, la Ley de Accin de Masas y los
modelos lineales. Para conseguirlo debemos partir
de la reaccin en equilibrio es decir de la ecuacin
[3], donde el numerador representa la fraccin unida
y el denominador la libre. Sin embargo el Ac se
haya en cantidad constante durante todo el proceso,
cantidad llamada Ac total (Act), repartido entre la
fraccin libre y unida. Por lo tanto podemos definir
al Act como:
Act = Ac libre + Ac unido.
entonces: Ac libre = Ac total - Ac unido.
[Ac] = [Act-Ac:Ag]
sustituyendo en [3] se tiene entonces que:
[Ag:Ac]
Keq =
[Ag] [Act-Ag:Ac]
Despus de despejar los trminos, la ecuacin
obtenida es:
[Ac:Ag]
[4] Keq [Act] - Keq [Ag:Ac] =
[Ag]
De esta manera se obtiene la ecuacin
lineal, cuya constante de afinidad es el valor de la
pendiente y el intercepto al origen es el producto
de la constante con el total de los sitios de unin
del anticuerpo o sea la cantidad de anticuerpo en
nM.
La grfica lineal se denomina grfica de
Scatchard (20), la cual est interpretada mediante
la ecuacin [4]. Es de gran utilidad para determinar
la cintica de la reaccin inmunolgica, as como la
afinidad del anticuerpo. Sin embargo tiene otra
utilidad, que consiste en estimar las cantidades de
ligando, cuando se conservan uniformes las
cantidades de trazador, unidor y afinidad, siempre
y cuando el anticuerpo tuviera un comportamiento
lineal en el sistema (1). Como esto ltimo
frecuentemente no sucede, a causa de que se
utilizan anticuerpos policlonales en la que cada
clona tiene diferente valor de Afinidad, entonces
los diseos de los inmunoanlisis se realizan

mediante pruebas de diluciones del anticuerpo en

combinacin con diferentes cantidades de masa
radiactiva y a veces con diferentes tiempos de
incubacin. Con esto se buscan procesos adecuados
para la separacin de la fraccin unida de la libre,
hasta obtener el diseo que exhiba notorio
desplazamiento del trazador por el ligando fro,
para que se elabore posteriormente la curva
estndar y poder cuantificar el ligando en muestras
problema (21, 22).
ESTIMACION DE LA CONCENTRACION DE
LIGANDO EN LAS MUESTRAS.
Los datos obtenidos del procesamiento de las
muestras biolgicas por medio de RIA son
posteriormente manejadas o transformadas para
estimar las cantidades de ligando a travs de la
elaboracin de curvas de calibracin. Existen varios
procesos de reduccin de datos para elaborar las
curvas de calibracin, entre ellas se pueden nombrar
(23, 24):
1. Relacin de la radiacin en cuentas por minuto o
segundo (cpm o cps) emitida por la fraccin unida
o libre con la concentracin de ligando no marcado
(dosis) o del logaritmo de la concentracin del
ligando (cpm B o F vs dosis o log dosis).
2. Porcentaje de la proporcin de las cpm de la
fraccin unida/cpm de la radiacin total en relacin
con la dosis o el logaritmo de la dosis (% B/T vs
dosis o log dosis).
3. Porcentaje de la proporcin de las cpm de la
radiacin de la fraccin unida/fraccin libre en
relacin con la dosis o logaritmo de la dosis (% B/F
vs dosis o log dosis).
4. Porcentaje de la proporcin de las cpm de la
fraccin libre /fraccin unida en relacin con la
dosis o logaritmo de la dosis (% F/B vs dosis o log
dosis).
5. Porcentaje de la proporcin cpm de la fraccin
unida/radiacin en la fraccin unida al anticuerpo
en ausencia de ligando no marcado (B0) con relacin
a la dosis o logaritmo de dosis (% B/B0 vs dosis o
log dosis).
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6. Transformacin Logit-Log, que es la relacin
entre logaritmo de % B/B0 y logaritmo de la dosis
(Logit % B/B0 vs Log dosis).
De las anteriores una de las que ms
frecuentemente se utiliza es la ltima. Con esta
transformacin, se obtiene una grfica lineal cuyo
manejo para la estimacin de dosis es
relativamente simple, puesto que se puede hacer
a partir de la misma grfica o de la ecuacin
ajustada por mnimos cuadrados. Sin embargo
Chase (25) argumenta varias inconvenientes cuando
se usa este tipo de reduccin de datos, el principal
consiste en que existe curvatura en la grfica despus
de haber sido transformados los datos. Esto conlleva
un error por ajuste al cual se le debe aadir el error
experimental. En consecuencia eleva la variacin
en la estimacin de las cantidades de ligando. Esto
se puede descubrir a travs de cambios en los valores
estimados de ligando con respecto a los reales,
tanto en niveles alto y bajo de la curva. Este
comportamiento imposibilita predecir en cual regin
de la grfica Logit-log se pueden esperar mayores
cambios para la estimacin de dosis. Por tal motivo
Maciel (26) propone que la ponderacin de la
regresin es el procedimiento necesario para
disminuir el error por ajuste. Por esta razn se
argumenta que la recta en grfica logit-log no es
verdaderamente lineal y se han propuesto usar otras
transformaciones de variables como el modelo
logstico de cuatro parmetros (26), el cual evita
tres principales limitaciones de la transformacin
logit-log. Primero, las cantidades ms bajas y altas
de la curva estn constituidas como parmetros y
no son valores que se extienden al infinito como
sucede en la transformacin logit-log. Segundo, se
pueden ajustar con ms exactitud los datos sin
necesidad de emplear transformaciones
complicadas en las cuales estn involucrados los
valores de los extremos de la curva. Finalmente,
al no haber mtodos complicados para la reduccin
de datos no hay error por ajuste de variables. Este
mtodo era anteriormente muy complicado para

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usarse rutinariamente, actualmente existen

programas en computadora que lo pueden realizar
con mayor rapidez (26).
TIPOS DE INMUNOANALISIS.
Se pueden agrupar en dos clases, de acuerdo
al proceso de unin. Cuando el ligador enlaza al
ligando o a otro ligador sin ocurrir
desplazamiento de la unin del trazador con el Ac,
entonces se denominan inmunoanlisis no
competitivos. Por ejemplo, los ensayos de
inmunoadsorcin con enzima ligada (ELISA )
para detectar anticuerpo contra Toxoplasma gondii
(27), y contra rotavirus humanos (28). Si al unir el
ligando ocurre desplazamiento del trazador,
entonces son inmunoanlisis competitivos, tal
como ocurre con el RIA, EIA o FIA para cuantificar
hormonas (13, 29, 30).
Existen actualmente varias modalidades del
RIA, las cuales difieren en la manera de separar la
fraccin libre (F) de la unida (B); se pueden
agrupar de acuerdo a la cintica del anticuerpo.
Cuando ste est inmovilizado se dice que el
inmunoanlisis es en fase slida. Lo contrario indica
que se haya soluble (fase lquida). Los
anticuerpos inmovilizados se fijan covalentemente
o por adsorcin a la superficie de una partcula
slida o al fondo del tubo o al pozo si fuera EIA.
En estos casos, la fraccin libre se desecha
mediante una simple decantacin del volumen
en que se realiz la incubacin, quedando
depositado dentro del tubo nicamente la fraccin
unida. Cuando el proceso utiliza anticuerpos
solubles, entonces ambas fracciones deben separarse
por precipitacin del complejo o de los ligandos
libres. Cuando ocurre la separacin de los complejos,
se utilizan agentes precipitantes de protenas,
como el polietilnglicol (PEG), sulfato de amonio o
de sodio, florisil o segundo anticuerpo (dirigido contra
el anticuerpo del complejo formado) (21,31,32);
cuando se pretende separar la fraccin libre, entonces
se procede a precipitar al ligando libre y al trazador

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Tcnicas de unin.
libre tambin, se realiza a travs de la adsorcin
de stos con partculas de carbn activado, tierra
de Fuller o talco y centrifugando para retirar la
pastilla, la cual est formada por partculas que
contienen adherida a la superficie, el trazador y
ligando no radiactivo. Este procedimiento es til
cuando la fraccin libre est constituida por
molculas de bajo peso molecular, alrededor de
500 a 1000 d. La separacin del complejo tambin
se realiza a travs de la cromatografa de
afinidad utilizando protena C (33).
Otro de los aspectos importantes de esta
metodologa es el diseo. En la actualidad han
surgido una amplia gama de diseos que van
desde el clsico, llamado de saturacin en el
equilibrio (figura 4), que consiste en colocar
simultneamente en contacto al anticuerpo con el
trazador y ligando fro o muestra los cuales
inician en competencia la reaccin inmunolgica.
Otra modalidad se denomina ensayo secuencial
donde la reaccin de unin lo realizan primero el
anticuerpo frente a la muestra o al ligando
fro. Posteriormente se aade el trazador que
se unir en los sitios libres de unin del Ac,

Figura 4. Tipos de inmunoanlisis.

siguiendo la Ley de Accin de Masas (33,34). Un

diseo ms es el ensayo inmunoradiomtrico
(IRMA) (34) en el cual no ocurre el proceso de
desplazamiento del trazador sino que se utiliza
nicamente la unin del anticuerpo a dos sitios de
unin distintos que posee el ligando. Entonces la
marca est en el anticuerpo, una poblacin de
anticuerpos est inmovilizado y la otra est marcada
y soluble. Cuando se une el anticuerpo inmovilizado
con el ligando, se fija el complejo al soporte y
posteriormente se une el anticuerpo marcado a
otro sitio libre, quedando el ligando unido al
complejo, en una estructura llamada sandwich.
Para conseguir tal estructura es necesario disponer
de anticuerpos monoclonales -cada clona identifica
slo uno de los dos sitios de unin- y de un
soporte insoluble en medio acuoso polar. Sin
embargo estos sistemas de RIA o EIA no son
eficientes cuando el ligando corresponde a un
hapteno, ya que stos no tienen dos o ms
determinantes antignicos. Es decir no hay dos o
ms lugares donde se enlace el trazador (35).
Cada poblacin de anticuerpos monoclonales, se
enlaza a un determinante antignico hacia el cual
fue inducido su formacin, dejando libre el otro
sitio de unin. Este ltimo sitio ser ocupado por el
trazador (anticuerpo marcado) el cual corresponde
a otro anticuerpo monoclonal. Cuando el
sandwich se ha formado entonces la fraccin
unida ser directamente proporcional a la cantidad
de radiacin emitida por el complejo. Este diseo
facilita el manejo de datos porque evita la excesiva
transformacin de variables, por lo tanto disminuye
el error por manipulacin de datos y simplifica la
estimacin de dosis (cantidad de ligando presente
en la muestra) (36).
Otro sistema de inmunoanlisis es el doble
anticuerpo en fase slida (DASP). En este tipo
de sistema se utiliza al segundo anticuerpo
inmovilizado, de tal manera que ste es una
antigamaglobulina inducida contra la especie en
donde se produjo el primer anticuerpo. Por
ejemplo, si el primer anticuerpo es antihormona
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producido en conejo, entonces el segundo
anticuerpo es antigamaglobulina de conejo,
producido
en
oveja. El segundo anticuerpo
(antigamaglobulina de conejo) se fija a partculas
slidas, como por ejemplo partculas de sephadex.
Luego se somete a incubacin con el primer
anticuerpo, previamente se incub el primer
anticuerpo con la mezcla de ligando fro con el
trazador para que ocurra el desplazamiento,
obtenindose as un sandwich, donde el primer
anticuerpo est en medio, este procedimiento es
relativamente simple sin embargo no se ha
popularizado (37).
Ultimamente ha surgido otra modalidad
llamada enzimoinmunoanlisis amplificado. El
rasgo distintivo de ste, radica en la formacin de
un puente entre el complejo y la marca. En otras
palabras, el trazador est compuesto de dos
fracciones: una que se une al ligando y otra donde
se encuentra la marca; entre ambas fracciones existe
un puente donde se amplifica la respuesta; tal
puente forma un sistema a parte de ligador y
ligando. Por ejemplo: se tiene al anticuerpo
inmovilizado a la pared del fondo del tubo, se
aade el ligando fro o muestra, se deja incubar
para que ocurra la reaccin, se forma el
complejo luego se aade posteriormente la
fraccin 1 del trazador (Ft1) luego se aade la
fraccin 2 del mismo (Ft2) en donde se encuentra
la marca. Queda el complejo final de la siguiente
manera:
soporte : anticuerpo : antgeno - Ft1 : Ft2 : marca
El puente Ft1 : Ft2 normalmente lo
constituyen otro tipo de ligadores distinto al
sistema inmunolgico, como
son
el
de
biotina:avidina. En este ejemplo la Ft1 estar
constituido por un conjugado de anticuerpo con
biotina y la Ft2 por otro conjugado de avidina
con marca (36). Este sistema aumenta la
sensibilidad de 20 a 100 veces. Este sistema se
utiliza en ELISA para deteccin de anticuerpos y
antgenos, en el caso preciso de la deteccin de
hormonas como esteroides. Ellis y col (38)
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desarrollaron un EIA amplificado para detectar

progesterona en leche. En este proceso el
producto obtenido por la catlisis de la enzima
contenida en la marca se usa para producir otro
sustrato que es catalizado por una segunda
enzima que desarrolla color. De este manera la
seal se puede amplificar varias veces, con esto
aumenta la sensibilidad del ensayo.
Como se mencion anteriormente, los
ensayos de unin no competitivos comnmente
se utilizan para la deteccin de anticuerpos, en
stos el sistema es de fase slida, mediante el uso
de conjugado anticuerpo:enzima. Tambin se les
denomina ELISA. Se inicia fijando el antgeno a
la pared del fondo del pozo, posteriormente se
deja incubar con la muestra que puede o no
contener al anticuerpo dirigido hacia tal
antgeno, si lo contiene entonces los determinantes
antignicos sern enlazados por el anticuerpo. La
cantidad de complejo formado estar en funcin
de la cantidad de molculas de anticuerpo especfico
hacia el antgeno presente en la muestra. Para
detectar la cantidad de complejos formados, se
aade un segundo anticuerpo dirigido contra el
anticuerpo de la especie analizada, el cual est
conjugado a la enzima. Este anticuerpo tambin
ser una antigamaglobulina unida a peroxidasa o
beta galactosidasa, que son las enzimas ms
frecuentemente usadas, el nuevo complejo estar
constituido por antgeno enlazado al anticuerpo
de la muestra -si es que existe- y el segundo
anticuerpo que est conjugado con la enzima la
cual ahora ser sometido a la accin cataltica con
el sustrato especfico, durante la reaccin
enzimtica se producen compuestos coloridos
que absorben luz cuando son iluminados a
cierta longitud de onda, de tal manera que la
absorbancia de cada pozo est en funcin directa
de la cantidad de conjugado. Por lo tanto, la
absorbancia tambin est determinada por la
cantidad de anticuerpo en estudio, presente en la
muestra. Los valores de absorcin de luz de las
muestras problema sern comparadas con la

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Tcnicas de unin.
absorbencia de los sueros probados como positivos,
que contienen anticuerpos contra el antgeno, y con
respecto a sueros que contienen anticuerpos contra
el antgeno en estudio. De esta manera se califica la
positividad o negatividad de las muestras (39,40),
(figura 5).
Existe otras tcnicas inmunoqumicas
relacionadas directamente con los Inmunoanlisis,
como la inmunocitoqumica (41) y de radio
receptor. En el primero el sistema est
constituido por anticuerpo marcado con algn
radionclido o enzima
altamente especfico
hacia un antgeno que puede ser cualquier
macromolcula en algn organelo celular, por
ejemplo. El anlisis consiste bsicamente en poner
en contacto al anticuerpo con las clulas donde
se pretende rastrear la presencia de una molcula
involucrada en determinada va metablica,
principalmente enzimas (por ejemplo el citocromo
P-450) o algn antgeno de superficie. Si tal
molcula se haya presente entonces se enlazar y
se detectar la marca (42).
El anlisis de radio receptor es semejante a
RIA, pero en este caso el ligador es el receptor y
no el anticuerpo (1). Los receptores se obtienen a

partir de homogenados del tejido fresco o cortes

ultradelgados del mismo, los cuales sern
parcialmente purificados para luego utilizarse como
ligadores frente al ligando marcado y no marcado.
Con estos componentes se elabora una curva de
calibracin para medir ligando en fluido biolgico;
pero el receptor tiene la desventaja de que puede
baja especificidad y por lo tanto puede enlazar otros
ligandos qumicamente semejantes (43).
APLICACIONES DE LOS ENSAYOS DE
UNION.
Son varios los campos de la investigacin
bsica donde se utilizan los ensayos de unin,
como por ejemplo para la deteccin de receptores,
componentes de vas metablicas o la identificacin
de componentes macromoleculares citoplsmicos,
nucleares o sobre superficies y membranas
intracelulares. Algunas tcnicas utilizadas para
conseguir estos objetivos son la inmunocitoqumica
directa o indirecta (41, 42, 44) y radiorreceptor
(1, 43).
Otras tcnicas
de
unin como la
cromatografa de afinidad, la inmunoelectroforesis
y la inmunotransferencia (Immunoblot) han sido de
gran valor para caracterizar macromolculas,
como por ejemplo complejos multienzimticos
(6,31) y formas moleculares hormonales agregadas
(45, 46). El Southern Blot es otro ejemplo de
anlisis por unin para identificar cadenas de
polinucletidos (47).
La tcnicas ms populares de los ensayos
de unin estn representados por el RIA y el EIA
-tambin llamado ELISA-. Las actividades
agronmicas, clnicas y zootcnicas han usado
estas tcnicas. Por ejemplo en fitopatologa se ha
utilizado el ELISA para detectar virus del mosaico
de la manzana o el virus de la patata A e Y
(39). En Medicina se ha utilizado el RIA para la
deteccin de drogas como la digoxina o morfina
(48,49), y en la Medicina Veterinaria para la
deteccin de anticuerpos contra enfermedades

Figura 5. Prueba de ELISA indirecto.

Vol. 6/No. 1/Enero-Marzo, 1995.

42
RC Montes-Prez .
virales o bacterianas, as como tambin para el
seguimiento de la actividad endcrina del tiroides o
las adrenales (39,50,51). Particularmente en
reproduccin animal existen numerosos trabajos
donde mediante la cuantificacin de hormonas se
comparan perfiles hormonales tanto de machos
como hembras (52).
Concretndonos a esta ltima, se puede
mencionar que los ensayos de unin, se han
u t i l i z a d o frecuentemente para realizar el
diagnstico temprano en ganado bovino, ya
que a travs del RIA o EIA se pueden detectar
niveles fisiolgicamente altos de progesterona en
plasma sanguneo o leche, de los 21 a 24 das
despus del servicio (53), indicando de esta
manera que la hembra probablemente est
gestante. En caso contrario, cuando los niveles de
progesterona detectados son bajos, entonces la
vaca no est gestante (54) (figura 6). Los trabajos
realizados en este aspecto indican que existe un
100% de efectividad para el diagnstico negativo
y del 80 al 97% de eficiencia para el diagnstico
positivo de gestacin. En este ltimo caso, el
porcentaje que es menor con respecto a la no
gestacin, puede ser debido a varios factores, uno
de stos es la mortalidad embrionaria temprana

Figura 6. Perfil de progesterona en vacas.

Revista Biomdica

(55, 56).
El seguimiento de la actividad ovrica en el
posparto se puede realizar a travs de la
cuantificacin de la progesterona sangunea o
lctea, la cual es til para determinar el reinicio
de la actividad cclica ovrica despus del parto
(57).
La medicin de progesterona tambin es de
gran utilidad en los programas de inseminacin
artificial, sincronizacin de estros y transferencia
de embriones, ya que permite detectar la presencia
de cuerpo lteo funcional producto de la ovulacin
y que es indispensable para la implantacin del
embrin (56,58,59). Por otra parte tambin facilita
el diagnstico de algunas patologas reproductivas.
Actualmente se pueden utilizar tcnicas rpidas de
RIA o EIA para cuantificar hormonas, cuya duracin
es de 2 a 3 horas y que permiten disponer de la
informacin el mismo da que se toma la muestra
(61).
COMENTARIOS FINALES.
Los ensayos de unin en este momento se
han tecnificado y simplificado a tal grado que es
posible hacer uso de stos sin tener amplio
conocimiento de sus bases tericas ni del
procedimiento. Sin embargo, los principales
problemas radican en el elevado costo de adquisicin
y la dificultad para obtenerlos, ya que la mayora
son de manufactura extranjera. Por otra parte, el
retraso con el que algunos distribuidores surten los
estuches, puede ocasionar que los reactivos lleguen
a su destino con una fecha prxima a su caducidad,
debido a que el trazador tiene una vida media
relativamente corta. Sin embargo, hasta ahora no
se cuenta con estuches comerciales para medir una
gran cantidad de biomolculas de importancia
biolgica o mdica, razn por la cual es conveniente
que los investigadores puedan establecer sus propias
tcnicas inmunoanalticas.

43
Tcnicas de unin.

AGRADECIMIENTOS.
Al Qumico Jorge Alvarez y al M.C. Ricardo
Ak por las valiosas sugerencias para la preparacin
del presente documento.

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