Aquino, S. F. et al.

ARTIGO TCNICO

METODOLOGIAS PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE

METANOGNICA ESPECFICA (AME) EM LODOS ANAERBIOS
METHODOLOGIES FOR DETERMINING THE SPECIFIC METHANOGENIC ACTIVITY
(SMA) IN ANAEROBIC SLUDGES
SRGIO F. AQUINO
Professor do Departamento de Qumica, Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP

CARLOS A. L.CHERNICHARO

Professor do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

EUGNIO FORESTI
Professor do Departamento de Hidrulica e Saneamento, Universidade de So Paulo USP/So Carlos

MARIA DE LOURDES FLORNCIO DOS SANTOS

Professora do Departamento de Engenharia Civil, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

LUIZ O. MONTEGGIA
Professor do Instituto de Pesquisas Hidrulicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS
Recebido: 21/07/06

Aceito: 26/03/07

RESUMO

ABSTRACT

Esse artigo apresenta uma reviso sobre os diferentes protocolos para a determinao da atividade metanognica especfica
(AME) de lodos anaerbios. Os protocolos propostos se
diferem tanto em relao aos procedimentos adotados para a
incubao do lodo, quanto ao mtodo utilizado para quantificao do metano produzido durante o teste. So discutidos
os princpios dos mtodos manomtricos e volumtricos, e
descritos brevemente os protocolos de incubao do lodo,
de medio do metano e o procedimento para clculo da
AME obtida pelos mtodos mais utilizados pela comunidade
cientfica nacional.

This paper presents a review on the different methodologies to

determine the specific methanogenic activity (SMA) of anaerobic
sludges. The protocols available in the literature differ not only
regarding the procedures adopted to incubate the sludge, but
also in relation to the method utilized to quantify the methane
produced during the test. This paper discusses the principles of
manometric and volumetric methods, and briefly describes the
protocols mostly used by the Brazilian research community for
sludge incubation, methane measurement and calculation of
SMA.

PALAVRAS-CHAVE: Lodo anaerbio, dgesto anaerbia,

Atividade Metanognica Especfica, Testes AME.

KEYWORDS: Anaerobic sludge, anaerobic digestion, Specific

Methanogenic Activity; SMA tests.

INTRODUO
A atividade metanognica especfica (AME) pode ser definida como
a capacidade mxima de produo de
metano por um consrcio de microrganismos anaerbios, realizada em
condies controladas de laboratrio,
para viabilizar a atividade bioqumica
mxima de converso de substratos
orgnicos a biogs. A determinao
da capacidade do lodo anaerbio em
produzir metano importante porque
a remoo de eltrons equivalentes, ou
seja compostos reduzidos causadores
Eng. sanit. ambient.

da demanda qumica de oxignio

(DQO), da gua residuria a ser tratada s ocorrer de fato com a formao
do metano, que por ser praticamente
insolvel em gua, escapa facilmente
da fase lquida.
Desta forma, a AME pode ser
utilizada como um parmetro de monitoramento da eficincia da populao
metanognica presente em um reator
biolgico e, como tal, constitui-se
ainda em uma importante ferramenta
para o controle operacional de reatores
anaerbios (Foresti et al, 1999). O
conhecimento da AME do lodo de

192

determinado reator permite estabelecer,

em ltima anlise, a capacidade mxima
de remoo de DQO da fase lquida, e
por isso permite estimar a carga orgnica
mxima que pode ser aplicada com minimizao do risco de desbalanceamento
do processo anaerbio. Fazendo uma
anlise inversa, a AME permite determinar a massa mnima de lodo anaerbio
a ser mantida no reator para a remoo
de determinada carga orgnica aplicada.
Consequentemente o conhecimento da
AME possibilitaria a adoo de procedimentos mais racionais para o descarte de
lodo de sistemas anaerbios.

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

Os trabalhos de Valcke &

Verstraete (1983), De Zeeuw (1984)
e Dolfing & Bloemen (1985) foram
pioneiros no desenvolvimento e uso
dos testes de AME, como ferramenta
de caracterizao e avaliao de reatores
anaerbios. No Brasil, pesquisas sobre
o teste de AME comearam a ser feitas
cerca de dez anos depois, e a tese de
doutorado de Penna (1994) talvez tenha sido o primeiro trabalho brasileiro
devotado ao estudo das condies de
incubao e implantao do teste de
AME. Os artigos de Penna et al (1995)
e Monteggia (1997) foram de fato as
primeiras comunicaes cientficas
nacionais que discutiram a necessidade,
e propuseram uma metodologia, para a
harmonizao do teste de AME. No
obstante as contribuies desses autores,
o fato que h, na literatura nacional
e internacional, diferentes protocolos
para a determinao da atividade metanognica de lodos anaerbios. Os
protocolos diferem entre si tanto nos
procedimentos adotados para a incubao do lodo (concentrao de biomassa,
tipo e concentrao de substrato, relao alimento/microrganismo, tipo e
concentrao de nutrientes, tempo de
incubao, etc), quanto para a quantificao do metano produzido.
Em relao aos procedimentos de
incubao, observa-se que a comunidade cientfica utiliza diferentes concentraes iniciais de substrato e biomassa,
sendo que alguns pesquisadores preferem utilizar glicose como substrato, ao
passo que outros utilizam cido actico
ou uma mistura dos principais cidos
orgnicos intermedirios da digesto
anaerbia (cidos actico, propinico e
butrico). Em relao quantificao de
metano, h mtodos mais sofisticados,
como os que se empregam cromatgrafos a gs e/ou respirmetros interfaciados com micro-computadores,
bem como mtodos simplificados que
se baseiam na purificao do metano
do biogs seguida de sua determinao
volumtrica.
Em virtude da no existncia de
um procedimento padro para a determinao atividade metanognica, um
esforo da International Water Association (IWA) resultou na criao de um
grupo de especialistas para harmonizar
diversos protocolos de anlise, dentre
os quais se encontra a AME. Como
no h, at o momento, consenso em
relao melhor condio de incubao
do lodo anaerbio, bem como para a
Eng. sanit. ambient.

medio do metano produzido, no se

pode sugerir nesse artigo, um procedimento nico para a determinao da
AME. Sendo assim, o principal objetivo
dessa reviso apresentar os principais
mtodos utilizados pela comunidade
cientfica nacional e internacional para
a determinao da AME, dedicando-se
especial ateno ao princpio de cada
mtodo, aos principais equipamentos
necessrios para sua implantao, bem
como ao procedimento para clculo
da AME.
Torna-se importante esclarecer
que a falta de uma padronizao internacionalmente aceita para o teste
de AME dificulta, de certa forma, a
comparao dos resultados absolutos
obtidos a partir de cada metodologia
atualmente disponvel. Nesse sentido,
entende-se que os resultados obtidos
a partir de cada um dos mtodos ora
descritos devam ser utilizados muito
mais como base relativa de comparao
em cada local em que vier a ser aplicado
e levando-se em conta ainda o objetivo
principal de aplicao do resultado.
Em outras palavras, uma vez escolhido
um determinado mtodo para o teste
de AME, os resultados obtidos atravs
do mesmo sero muito mais teis em
termos comparativos, por exemplo,
entre determinadas condies e fases
operacionais de reatores anaerbios.
Portanto, a maior contribuio
deste artigo ser no sentido de fornecer
subsdios para a comunidade cientfica
e para os operadores de reatores anaerbios escolherem um determinado
mtodo para medio da AME do lodo,
alm da proposio de algumas padronizaes mnimas a serem empregadas
por qualquer mtodo que venha a ser
escolhido.

CONSIDERAES SOBRE
AS CONDIES DO
TESTE DE AME
Tipo e concentrao de
substrato
Para se avaliar, strictu sensu, a
atividade metanognica de determinado lodo deve-se aliment-lo com
substrato que suporte apenas a atividade metablica dos microrganismos
metanognicos. Como se sabe, a maior
parte do metano produzido, cerca de
70%, advm da clivagem do acetato
durante metabolismo dos microrganismos metanognicos acetoclsticos.

193

Os cerca de 30% restantes de metano

so produzidos por microrganismos
hidrogenotrficos a partir da reduo
do dixido de carbono. Desta forma,
muitos pesquisadores utilizam comumente sais de acetato ou cido actico
como substrato. O clculo da AME
atravs do uso de apenas acetato como
fonte de carbono e energia subestima
em no mnimo 30% a capacidade mxima de produo de metano, uma vez
que microrganismos hidrogenotrficos
tm maiores taxas de crescimento que
os acetoclsticos (Harper & Poland,
1986; Pavlostathis & Giraldo-Gomez,
1991) e certamente estaro presentes
em reatores reais devido degradao
de substrato mais complexo (protenas,
carboidratos e lipdeos) que resulta em
produo de hidrognio (H2) e gs
carbnico (CO2).
No sentido de se avaliar a atividade metanognica de ambos os grupos
de microrganismos, acetoclsticos e
hidrogenotrficos, alguns pesquisadores (Field et al, 1987; Florencio
et al, 1993; Alves et al, 2005) utilizam
uma mistura de cidos graxos volteis
(AGVs), comumente constituda de
acetato (C2), propionato (C3) e butirato
(C4), na proporo de 100:100:100 g/L,
respectivamente. A DQO resultante
da mistura de AGVs tem a proporo
de 24,3:34,4:41,3 % para C2, C3 e C4,
respectivamente. Nesse caso, o teste
avaliar no s a atividade dos microrganismos metanognicos, mas tambm
a capacidade sintrfica do sistema, ou
seja, a atividade dos microrganismos
que convertem propionato e butirato
em acetato. importante salientar que
a avaliao da atividade dos microrganismos sintrficos fundamental para a
boa operao dos digestores anaerbios.
Como os microrganismos metanognicos no produzem metano a partir
de propionato ou butirato, a queda de
eficincia de um reator anaerbio pode
estar mais relacionada baixa atividade
dos microrganismos sintrficos produtores de acetato do que atividade
de microrganismos metanognicos
consumidores de acetato.
Nessa linha de raciocnio alguns
pesquisadores defendem que um teste
de atividade do lodo anaerbio deva
avaliar todo consrcio microbiano,
e para isso o uso de substratos mais
complexos, como glicose, seria o recomendado, simulando o que ocorre
em um reator em escala real. De fato
o uso de glicose suportaria a atividade

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ARTIGO TCNICO

Metodologias para determinao da atividade metanognica

ARTIGO TCNICO

Aquino, S. F. et al.

metablica de microrganismos fermentativos (acidognicos), sintrficos

(acetognicos) e produtores de metano
(metanognicos), permitindo avaliar
a atividade do consrcio anaerbio
como um todo. Se o teste com glicose
evidenciar uma baixa produo de metano, ento novos testes com mistura
de AGVs ou com acetato poderiam ser
feitos para identificar que grupo(s) de
microrganismo(s) est(o) limitando a
degradao anaerbia.
Em relao concentrao do
substrato utilizado, importante ressaltar que o teste de AME deve ser feito
com excesso de substrato e nutrientes,
de forma que a cintica de degradao se
aproxime de uma reao de pseudo ordem zero, passando a depender apenas
da concentrao dos microrganismos
(inculo) presentes. Desta forma, o
importante que a concentrao de
substrato seja maior que o valor de
Ks, que no caso dos microrganismos
metanognicos acetoclsticos situa-se
na faixa de 11 a 421 mg/L de acetato
(Harper & Ohlland, 1986; Pavlostathis
& Giraldo-Gomez, 1991). Sendo assim
uma concentrao de 2 g/L de acetato
seria suficiente para garantir excesso de
substrato e, de fato, essa concentrao
o valor de referncia recomendado
por Monteggia (1997), que concluiu
que o uso de concentraes de cido
actico na faixa de 2 a 4 g/L resultaram
em valores mximos de AME.
Segundo Penna (1994), para
cada quantidade de biomassa, existe
uma faixa adequada de quantidade de
substrato, que varia com a natureza e
atividade do lodo. Ou seja, a relao
alimento/microrganismo que resulte
em maior valor de AME deve ser pesquisada caso a caso. Alm disso, Penna
(1994) chega a sugerir a utilizao,
como substrato durante o teste, da
prpria gua residuria que alimenta o
reator que forneceu o lodo para o teste.
Essa proposio decorre do fato de o
autor ter verificado que a AME obtida
com a gua residuria foi similar quela
obtida quando se usou uma mistura de
AGVs como substrato.

Concentrao inicial de
inculo
Assumindo-se que o substrato e os
nutrientes estaro presentes em excesso
durante o teste de AME, de se esperar
que a concentrao inicial de inculo
defina, em ltima instncia, a durao
Eng. sanit. ambient.

do teste. Ou seja, partindo-se de uma

concentrao maior de biomassa,
haver uma menor relao alimento/microrganimos (A/M), resultando
em degradao mais rpida do substrato disponvel, sendo a anlise inversa
verdadeira. Como o resultado final da
AME expresso de forma normalizada,
ou seja, levando-se em conta a massa
de inculo, a concentrao inicial de
lodo no deveria afetar o valor da AME
obtido. Tais fatos foram observados por
Monteggia (1997) que, investigando o
efeito da concentrao de microrganismos no teste de AME feito sob agitao,
concluiu que a faixa tima de valores
de AME ocorreu entre 2 e 5 g SSV/L
e que, para valores crescentes de SSV,
houve reduo significativa na durao
do teste, ao passo que, para valores de
SSV abaixo de 2 g/L ou superiores a
5 g/L, houve reduo apenas discreta
nos valores de AME. Rocha et al (2001)
salientam que se o ensaio conduzido
sem agitao, a concentrao de lodo
deve ser em torno de 2,0 gSSV/L para
se reduzir problemas com a difuso do
substrato.
Os resultados de Penna (1995)
so concordantes com os de Monteggia
(1997), ao mostrarem que a quantidade
de biomassa, na faixa de 2,5 a 20 g/L,
no influenciou no resultado da AME.
Entretanto, Penna (1995) mostrou que,
para testes de AME com lodo de esgoto
sanitrio, nas concentraes iniciais de
5,2 e 10 gSSV/L, os melhores valores
de A/M ficaram na faixa de 0,3 a
0,5 gDQO/gSSV. Para testes com lodo
a 20 gSSV/L, a melhor relao ficou na
faixa de 0,1 a 0,25 gDQO/gSSV, ao
passo que para lodo com 2,5 gSSV/L,
a faixa de 0,8 a 1,8 gDQO/gSSV foi
a que forneceu os maiores valores de
AME. Steil et al (2004) corroboram
a proposio de Penna (1995), de
que necessrio pesquisar para cada
lodo a relao A/M que fornece o
maior valor de AME, e mostraram que
0,25 gDQO/gSSV foi o valor de A/M
mais adequado quando a mistura de
AGVs foi escolhida como substrato.
Como o resultado do teste ser
expresso em termos da quantidade de
biomassa presente, a quantidade do
inculo usada, em tese, no precisaria
ser exatamente a mesma para diferentes
ensaios. O importante que se saiba
exatamente a concentrao do lodo presente em cada frasco para que se possa
calcular com preciso a massa inicial de
inculo. Por isso indispensvel que

194

se faa anlise dos slidos suspensos

volteis (SSV) no lodo utilizado como
inculo. Outro aspecto importante que
se deve ter em mente o crescimento
da biomassa durante o ensaio, que
interfere diretamente na determinao
do valor de AME, uma vez que a concentrao de SSV geralmente medida
no incio e no no final do teste. Para
minimizar este problema, devem ser
utilizadas concentraes relativamente
altas de lodo e baixas concentraes de
substrato (baixa relao A/M). Uma
alternativa seria fazer a anlise de SSV
tanto no incio quanto no final do teste,
e usar o valor mdio para calcular a
AME. Esse procedimento informaria,
ainda, se houve predominantemente
crescimento ou endogenia da biomassa
durante o teste.

Soluo de nutrientes
A soluo de nutrientes ideal,
ou gua de diluio, deve conter
macro (N-NH4+, P-PO43-, Mg, Ca) e
micro-nutrientes (Fe, Ni, Zn, Co...),
bem como alcalinidade (NaHCO3 ou
KH2PO4 + K2HPO4) e agente redutor
(Na2S.7H2O). No h consenso na
literatura em relao soluo nutricional a ser usada no teste de AME,
havendo inclusive a sugesto de alguns
pesquisadores para a no utilizao das
solues minerais e nutricionais, para
alguns tipos de lodo, como o caso
do lodo de esgoto sanitrio (Dolfing
& Bloemen, 1985; Penna, 1995). Tal
sugesto motivada pela decorrente
simplificao do teste, e tem como
premissas a pequena durao do teste e
a presena de nutrientes no lodo de esgoto sanitrio. Entretanto, a tendncia
na literatura nacional e internacional
a de se adicionar soluo nutricional
ao frasco de reao, conforme mostra a
Tabela 1, originalmente proposta por
Monteggia (1997) e complementada
aqui com outras referncias.
A soluo de nutrientes utilizada
por Souza et al (2005) uma adaptao do meio nutricional apresentado
em Chernicharo (1997), por incluir
os macro-nutrientes clcio e magnsio
(CaCl2.2H2O e MgCl2), os micronutrientes nquel e boro (NiCl2.6H2O e
H3BO3), e por reduzir a quantidade de
fsforo (K2HPO4 e KH2PO4) devido
substituio desse sistema tampo pelo
sistema bicarbonato (NaHCO3).
No sentido de harmonizar, em
termos de Brasil, a soluo nutricional a

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ser usada no teste de AME, recomendase que a soluo de nutrientes proposta

pela referncia X (ver Tabelas 1 e 2)
seja utilizada e complementada com
50 mg/L de extrato de levedura (fonte
de vitaminas). Embora tal procedimento no contribua para a simplificao
do teste, tal padronizao facilitaria a
comparao de resultados de diferentes grupos de pesquisa, uma vez que
eliminaria incertezas relacionadas
deficincia nutricional que poderiam
eventualmente surgir, a depender da
origem do lodo testado.

Tempo de incubao antes

da adio de substrato
Durante a execuo dos testes
de AME comum incubar frascos de
branco, ou seja, contendo gua destilada ao invs da soluo de substrato,
para se avaliar a produo residual de
metano devido ao decaimento endgeno, sendo a produo endgena descontada da produo observada nos frascos
contendo o substrato. Tal procedimento
pode levar a erros grosseiros no clculo
da AME, uma vez que a endogenia
observada no frasco contendo substrato
deve ser bem menor que aquela observada no frasco branco. Para eliminar a
incerteza do metano de origem endgena FDZ-Polanco et al (2005) sugeriram
a incubao do lodo por 7 dias a 35 oC,
antes que o substrato fosse adicionado,
para que o metano produzido pela
endogenia pudesse ser desconsiderado
no teste. Outros autores (James et al,
1990; Penna, 1994; Monteggia 1997;
Silva et al, 2005) tambm sugeriram a
incubao do lodo, na temperatura de
realizao do ensaio e na presena de
nutrientes e soluo tampo, previamente adio do substrato, todavia
por perodos menores, da ordem de 6
a 15 horas.
Ressalta-se que, dependendo das
condies operacionais do reator (Ex.
carga aplicada) no qual o lodo anaerbio foi amostrado, a produo de
metano endgena pode durar horas ou
dias. Uma prtica segura para garantir
que a endogenia no afete os resultados
da AME consiste em incubar o lodo,
na presena de nutrientes e na temperatura de realizao do teste, at que a
produo de metano se estabilize. S
ento o substrato seria adicionado para
incio do teste.
O teste de AME pode ser finalizado aps o consumo total do subsEng. sanit. ambient.

trato, ou seja, quando a quantidade de

metano acumulada for igual terica
(Penna, 1995), o que poderia levar de
horas a semanas. A maioria dos pesquisadores prefere adotar uma soluo mais
prtica, encerrando o teste quando a
produo acumulada de metano sai da
fase exponencial e entra na fase estacionria. Nesse caso preciso verificar se a
produo acumulada de metano ao final
da fase exponencial atingiu o mnimo
de 50% da produo terica.

Agitao e controle de
temperatura
Deve-se garantir, durante o teste
de AME, que haja suficiente contato
da biomassa com o substrato e que no
haja limitao de transferncia de massa
do substrato e nutrientes. Sendo assim
comum incubar os frascos de reao
sob agitao constante, muito embora
no haja na literatura resultados conclusivos sobre a influncia da agitao
intermitente, e do tipo de agitador utilizado (agitao orbital versus agitao
magntica) nos testes de AME. Penna
(1994) sugeriu que para lodo de esgoto
sanitrio seria possvel uma simplificao da metodologia substituindo a
agitao mecanizada contnua pela agitao manual intermitente. Resultados
preliminares de pesquisa em andamento
(Souto, 2006) demonstraram que se a
agitao magntica for muito intensa,
os valores de AME podem ser menores
que os valores obtidos com a agitao
orbital e com a agitao intermitente
(agitao dos frascos uma vez por dia).
Esses resultados parecem demonstrar
que a agitao muito intensa com barras
magnticas pode levar ruptura dos flocos microbianos, afetando consequentemente a transferncia de produtos e
substratos entre os microrganismos do
consrcio anaerbio.
Com relao temperatura, h
consenso na literatura de que o teste
de AME deva ser feito na faixa de 30
a 35 oC, para que os microrganismos
metanognicos mesoflicos tenham
as melhores condies de crescimento. Alguns pesquisadores utilizam a
temperatura de 30 oC (Chernicharo,
1997; Souza et al, 2005) enquanto
outros preferem a temperatura de 35 oC
(Alves et al, 2005; Monteggia, 1997;
FDZ-Polanco, 2005). Como o teste de
AME indica a capacidade de formao
de metano, o valor de AME obtido
pode ser usado para se determinar a

195

carga orgnica que poderia ser aplicada

no reator anaerbio contendo determinada massa de lodo. Contudo, deve-se
avaliar criticamente o resultado do
teste de AME, uma vez que os reatores
anaerbios em operao nas estaes de
tratamento ficam submetidos variao
sazonal de temperatura, e raramente
trabalham na faixa de temperatura ideal
para a atividade metanognica. Sendo
assim, o resultado de AME determinado em laboratrio pode superestimar a
capacidade de converso dos microrganismos metanognicos no reator
exposto a condies ambientais diferentes. Pesquisa em andamento (Souto,
2006) se prope a avaliar a influncia
da temperatura no resultado da AME,
possibilitando a determinao de coeficiente emprico que permita converter
os valores de AME obtidos a 30oC ou
35 oC para outras temperaturas.

MTODOS DE MEDIO
DO BIOGS
H diferentes mtodos para a medio de biogs produzido no teste de
AME, os quais podem ser classificados
em manomtricos ou volumtricos.

Mtodos manomtricos
Os mtodos manomtricos se
baseiam na medio da presso exercida
sobre um sensor (membrana trasdutora
de presso) acoplado ao frasco de reao. Dependendo da configurao do
sistema a presso medida pode ser devido mistura de gases do biogs, que
constitudo principalmente por metano
e dixido de carbono, ou devido somente ao metano. Como possvel, atravs
de calibrao do sistema, estabelecer
uma correlao entre a presso medida e
a quantidade de metano presente dentro
do frasco de reao, o registro dirio
da presso permite determinar a taxa
diria de produo de metano e, por
conseguinte, o valor da AME.
A grande vantagem do mtodo
manomtrico a possibilidade de se
acoplarem os medidores de presso
a microcomputadores, permitindo
assim o monitoramento instantneo
e a automao do processo, enquanto que a principal desvantagem est
relacionada ao custo de aquisio e
manuteno dos equipamentos. Um
exemplo de respirmetro apresentado
na Figura 1, e vrios autores j desenvolveram equipamentos semelhantes

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

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Metodologias para determinao da atividade metanognica

ARTIGO TCNICO

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Tabela 1 - Resumo dos nutrientes recomendados para testes de AME

Nutriente
(mg/l)

Referncia
(I)

(II)

(III)

(IV)

(V)

(VI)a (VII)a

(VIII)

(IX)

(X)

(XI)

(XII)

NH4Cl

1.000

73,6

500

500

40

174

500

73,6

500

500

2.235

280

(NH4)2SO4

13,6

13,6

NaHCO3

1.000

1e

KH2PO4

2.500

13,6

300

300

1.500

13,6

1.500

650

486

K2HPO4

1.000

400

400

1.500

1.500

150

Na2HPO4.2H2O

37

MgCl2

100

5,5

500

100

150

100f

CaCl2.2H2O

100

107

10

KCl

25

Na2SO4

Na2S.7H2O

100

50

50

50

0,25

Extrato levedura

200

50

200

Elementos trao

No

Sim

Resarzurinad

10.000 10.000 1.000

No

No

Sim

252

Sim

No

Sim

Sim

Sim

1 ml/L

1 ml/L

Simc

Simc

0,2

a) gua de torneira contendo aproximadamente 35 mg/l de ons clcio; b) adio de 1 ml de soluo de elementos trao descrito por Zehnder et al (1980);
c) soluo de micronutrientes (Tabela 2); d) indicador de potencial redox (pE) (incolor: baixo pE; rosa, roxo: alto pE); e) 1 g/gDQO; f ) adio na forma
de MgSO4.7H2O.
Referncias: I) Valcke & Verstraete, (1983) apud Monteggia (1997); II) De Zeeuw, (1984); III) Dolfing & Bloemen, (1985) apud Monteggia (1997); IV)
Dolfing, (1985) apud Monteggia (1997); V) Koster et al, (1986); VI) Koster & Cramer, (1987); VII) Monteggia (1997); VIII); Penna (1994); IX) Chernicharo (1997); X) Souza et al.. (2005); XI) Alvez et al (2005); XII) Florencio et al, (1993).

Tabela 2 Soluo de micronutrientes

Micronutriente
Concentrao na soluo final (em mg/L)

Referncia

FeCl3.6H2O

VIII
2a

IX
2

X
2

XI
4

XII
2

ZnCl2

0,05

0,05

0,05

0,212b
c

0,05

CuCl2.2H2O

0,03

0,03

0,03

0,076

0,038

MnCl2.4H2O

0,5

0,5

0,5

0,5

(NH4)6Mo7O24.4H2O

0,05

0,05

0,05

0,2

0,05

AlCl3.6H2O

0,05

0,05

0,05

0,09

CoCl2.6H2O

2,2

NiCl2.6H2O

0,05

0,1

0,142

H3BO3

0,01

0,1

0,05

Na2SeO3

0,2

0,164

EDTA

H3PO4

1 ml/L

HCl conc.d

1 ml/L

1 ml/L

1 ml/L

1 ml/L

1 ml/L

a) Sal usado foi FeCl2.4H2O; b) Sal usado foi ZnSO4.7H2O; c) Sal usado foi CuSO4.5H2O; d) Proporo a ser adicionada na soluo estoque.

Eng. sanit. ambient.

196

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

para a determinao da AME usando

o procedimento manomtrico (James
et al, 1990; Chernicharo & Campos,
1991; Cohen, 1991; Chernicharo
et al, 1997; Monteggia, 1991;
FDZ-Polanco et al, 2005; Louzada
et al, 2005).
O sistema mostrado na Figura 1
consistia de 8 frascos de reao de 1 L
submersos em um banho termostatizado, sendo a mistura do seu contedo
feita com agitadores magnticos. O
sistema de medio de gs era constitudo de uma vlvula solenide de
3 vias controlada por um medidor de
presso (manmetro ou transdutor de
presso), de tal forma que duas vias (vias
1 e 2 indicadas na Figura 1) ficavam
normalmente abertas permitindo a
comunicao do frasco de reao com
o reservatrio de gs. No decorrer do
ensaio de AME a presso no frasco de
reao e no reservatrio de gs aumentava e era registrada progressivamente
pelo manmetro at atingir um valor
limite. Quando a presso detectada no
manmetro atingia o limite estipulado,
o controlador emitia um sinal eltrico
para a vlvula solenide para fechar a via
de entrada para o reator (via 1) e abrir
a via de purga (via 3). Isso fazia com
que a presso do sistema fosse aliviada
devido liberao do gs acumulado
no reservatrio. Aps a despressurizao
o controlador enviava um novo sinal
para a vlvula para fechar a via 3 e
abrir novamente as vias 1 e 2, iniciando
assim um novo ciclo (Ince et al, 1995).
Outros respirmetros utilizam sistemas
de medio semelhantes, substituindo o
manmetro por transdutores de presso
(Cohen, 1991; Chernicharo et al, 1997;
FDZ-Polanco et al, 2005).
importante ressaltar que os procedimentos manomtricos s dispensam o uso de cromatgrafo caso haja
a absoro do dixido de carbono em
etapa prvia medio de presso. Nos
respirmetros utilizados por James
et al (1990), Chernicharo & Campos
(1991), Monteggia (1991), Ince et al
(1995) e Chernicharo et al (1997), a
presso registrada correspondia s presses
parciais do gs carbnico e metano e, por
isso a determinao cromatogrfica dos
gases era necessria para quantificao do
metano produzido. Recentemente, FDZPolanco et al (2005) desenvolveram um
respirmetro acoplado a um sistema de
absoro de gs carbnico (Figura 2), de
forma que a presso medida pelo trasdutor devida apenas ao gs metano.
Eng. sanit. ambient.

Um outro sistema respiromtrico

que pode ser utilizado e, que tambm
utiliza a concepo de absoro do
gs carbnico previamente medio
de presso, uma adaptao do kit
comercial Oxitop disponvel no
mercado e usualmente empregado nas
determinaes da demanda bioqumica
de oxignio (DBO).
A determinao da DBO com o
sistema Oxitop (Figura 3) se baseia no
fato de que durante a respirao aerbia
haver consumo de oxignio dissolvido
na fase lquida, com conseqente reposio pelo oxignio molecular presente
na fase gasosa. Desta forma a presso
parcial do oxignio no headspace tende
a diminuir devido reposio do oxignio consumido pela atividade microbiana. Como h, durante a degradao
aerbia, produo de gs carbnico,
preciso que se tenha um dispositivo
para sua absoro antes que a presso
seja medida, de forma que a queda de
presso devido ao consumo de oxignio
seja percebida e quantificada corretamente. Nos equipamentos Oxitop,
a absoro de gs carbnico feita por

pastilhas de NaOH colocadas em uma

cestinha suspensa, atravs da qual os
gases so obrigados a passar antes de
atingirem o trasdutor de presso.
Com base no exposto possvel
adaptar o equipamento Oxitop para
sua utilizao nas determinaes de
AME, s que nesse caso o equipamento
registraria acrscimos de presso, devido produo de metano, ao invs da
reduo de presso devido ao consumo
de oxignio.
No processo manomtrico preciso calibrar o equipamento e determinar
a constante do frasco (K, em unidade de
volume/unidade de presso), de forma
que o volume do biogs produzido
(V, em unidade de volume) possa ser
relacionado presso medida (P, em
unidade de presso) atravs da Equao
1 (Chernicharo, 1997):
(1)
7  ,1
A determinao experimental da
constante K pode ser feita atravs da
calibrao de frascos de reao contendo
um volume de gua correspondente ao
volume lquido utilizado no teste com
o lodo. Para minimizar, durante o teste

123456789101112-

Frascos de reao (V =1 L)
Septa para amostragem
Agitadores magnticos
Vlvula solenide de 3 vias
Reservatrio de gs (V = 80 ml)
Manmetro
Cabos eltricos
Termostato de imerso
Banho de gua
Motor do agitador magntico
Painel de controle da vlvula solenide
Computador par a aquisio de dados

Figura 1 Respirmetro, originalmente proposto por Monteggia

(1991), para realizao de testes de AME

12345678-

Frasco de reao (200 ml)

Soluo alcalina (15 gNaOH/L)
Headspace da cmara de lavagem do biogs
Tubo coletor
Porta de amostragem
Agulha de seringa
Transdutor de presso
Computador para aquisio de dados

Figura 2 Respirmetro desenvolvido por FDZ-Polanco et al (2005) para

remoo do CO2 previamente medio da presso
197

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ARTIGO TCNICO

Metodologias para determinao da atividade metanognica

de calibrao, a solubilizao de gases na

gua, principalmente do CO2, deve-se
utilizar gua previamente saturada com
NaCl. A simulao da produo de gs
seria feita injetando-se, a cada 30 minutos ou outra frequncia mais conveniente, quantidades conhecidas de uma
mistura padro contendo gs carbnico
e metano em concentraes conhecidas.
O acrscimo de presso registrado pode
ser ento relacionado com a quantidade
de metano adicionada, possibilitando a
determinao de K (Figura 4).

Mtodos volumtricos
Os mtodos volumtricos se baseiam na determinao do volume de
biogs ou metano produzido em um
frasco reacional que contm o lodo a
ser testado. A literatura reporta trs
metodologias comumente utilizadas
que empregam procedimentos volumtricos: i) medio do volume e composio do biogs, ii) medio apenas
da composio do biogs, iii) medio
direta do volume de metano.
Medio do volume e composio do
biogs
Nesse procedimento, frascos de
vidro (tipo antibitico por exemplo)
so inoculados com lodo a ser testado,
substrato e soluo de nutrientes, e
incubados 30 oC por um perodo que
varia de 7 a 20 dias. O teste deve ser
finalizado quando a produo acumulada de metano se estabilizar, ou seja,
fundamental que a taxa mxima de
produo de metano (ponto de mxima
inclinao na curva obtido em grfico
tipo volume acumulado de metano
versus tempo de incubao) seja obtida antes que o teste seja encerrado. O
monitoramento da produo de metano
pode ser feito diariamente com o auxlio
de uma seringa esmerilhada (que no
oferea resistncia ao deslocamento),
e a determinao da composio do
biogs amostrado pode ser feita por
cromatografia gasosa.
Nesse procedimento a produo
volumtrica de metano calculada diariamente, multiplicando-se o volume
de biogs pela porcentagem de metano
no biogs. A porcentagem de metano
no biogs pode ser encontrada a partir
de uma curva de calibrao construda
injetando-se volumes fixos de diferentes
gases padro que contenham metano
em diferentes porcentagens, ou injeEng. sanit. ambient.

Figura 3 Sistema Oxitop para medio da AME (Borges, 2004)

Presso mxima registrada pelo transdutor

(o headspace do frasco deve ser escolhido de
forma que o valor de presso mxima no
seja atingido durante o teste)

Presso medida (atm)

ARTIGO TCNICO

Aquino, S. F. et al.

dV/dP = K (ml/atm)

Metano adicionado (ml)

Figura 4 Exemplo da determinao grfica da
constante do frasco (K)
tando-se diferentes volumes de um
mesmo gs padro. A taxa mxima de
produo de metano pode ser obtida
ao se construir um grfico temporal
da produo acumulada de metano. A
AME pode ser ento determinada no
grfico volume acumulado de metano
versus tempo de incubao (Figura 5), pelo coeficiente angular no trecho
de maior inclinao. Deve-se assegurar
que a taxa mxima seja determinada
no trecho linear que corresponda ao
consumo mnimo de 50% do substrato
adicionado.
Como o resultado de AME geralmente expresso como gDQOCH4/gSSV.d,
preciso conhecer tambm a massa de
lodo inoculada (em gramas de SSV),
bem como converter a produo volumtrica de metano (Ex. ml CH4/d) em
DQO (gDQO/d). Isso pode ser feito
sabendo-se o coeficiente estequiomtrico
de oxidao do metano (Equao 2).
$)  0  $0  )0

(2)

A Equao 2 mostra que 1 mol

de metano equivale a 2 moles de O2 ou
64 g de DQO. Como 1 mol de qual-

198

quer gs, na CNTP (O oC e 1 atm),

ocupa um volume de 22,7 L, pode-se
dizer que 1 g de DQO destruda equivale, na CNTP, a 0,354 L de metano
formado. Como as condies do teste
de AME no se encontram na CNTP,
preciso usar a Equao 3 para ajustar
a relao terica:
E

17
17
 
O
 E  O
5 $/51
5 -"#

(3)

Supondo que o teste de AME seja

feito em um laboratrio localizado em
uma regio onde a presso atmosfrica
de 1 atm, e sendo a temperatura de
incubao de 30 oC (303 K), tem-se:
BUN  7 N
D BUN   - N

D
,
, -"#
$/51
 7   (4)

Ou seja, nas condies em que a

produo de metano foi determinada,
1 mol de metano ocupar um volume
de 25,19 L. Desta forma possvel
dizer que a 30 oC e 1 atm, 394 ml de
metano produzido equivalem a 1 g de
DQO destruda. Atravs dessa correlao possvel expressar a taxa mxima
de produo de metano determinada
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

De forma similar ao procedimento descrito anteriormente, frascos de

vidro (tipo antibitico por exemplo)
so inoculados em triplicata com lodo
anaerbio, substrato e soluo de nutrientes, e incubados at que a produo
acumulada de metano se estabilize.
A diferena principal para o mtodo
descrito anteriormente est relacionada
forma de medio do metano produzido. Nesse caso o monitoramento da
produo de metano feito diariamente
amostrando-se um volume fixo de biogs (Ex. 0,5 ml) de dentro do frasco de
reao e deteminando-se a quantidade
de metano (massa ou nmero de moles)
produzida, por cromatografia gasosa
(Steil et al, 2004).
A grande vantagem dessa metodologia que ela dispensa a medio do
volume de biogs e o uso de seringas
de vidro. Por outro lado sua grande
desvantagem reside no fato de que o
frasco de reao trabalha sob presses
muito maiores, aumentando o risco de
perda de biogs, principalmente durante
o procedimento de amostragem do volume fixo. Alm do mais, para evitar erros
na construo da curva de calibrao,
preciso que o volume de biogs amostrado seja exato (Ex. 1 ml), uma vez que
esse volume determinar a quantidade de
metano injetada no cromatgrafo.
Por ser um gs pouco solvel, a
quantidade de metano presente na fase
lquida desprezada na metodologia
de AME descrita na seo anterior,
uma vez que a presso no interior do
frasco zerada (igualada atmosfrica) periodicamente. Entretanto, no
procedimento em que se mede apenas
a composio do biogs, um pequeno
volume de gs amostrado periodicamente, causando a elevao contnua da
presso no interior do frasco de reao.
Nesse caso a solubilizao do metano
no pode ser desprezada, e necessita
ser calculada.
A solubilidade de metano em
gua pode ser facilmente calculada pela
Lei de Henry, conforme a Equao 5
(Manahan, 1994).
9M  ,1H
(5)
Onde:
Xl = concentrao metano dissolvida
(mol.L-1)
Eng. sanit. ambient.

matografia gasosa (Figura 6). Conforme

discutido anteriormente, isso pode ser
feito injetando-se diferentes quantidades de um gs contendo porcentagem
fixa de metano, ou volumes fixos de gases contendo diferentes porcentagens de
metano. Por sua vez, o nmero de moles
de metano que injetada no cromatgrafo durante a construo da curva de
calibrao obtido conhecendo-se o
volume de metano injetado bem como
a temperatura e presso local.
A curva de calibrao permite
ento que o nmero de moles de metano produzido diariamente no frasco
de reao seja determinado a partir da
injeo de um volume fixo de amostra
(Ex. 1 ml). Uma vez conhecido o nmero de moles de metano produzido
diariamente, pode-se obter a produo
diria em termos de ml CH4/d, bem
como a produo acumulada em termos de gDQOCH4 conforme raciocnio desenvolvido anteriormente. De
forma similar, o valor da AME, em
gDQOCH4/gSSV.d, pode ser calculado conhecendo-se a quantidade de
lodo usada como inculo (g SSV) e a
taxa mxima de produo de metano
(gDQO CH4/d) obtida no trecho de
maior inclinao.

Taxa mxima produo CH4 = dV/dt

Tempo incubao (d)

Figura 5 Determinao grfica da taxa mxima

de produo de metano

Nmero de moles CH4

Medio apenas da composio do

biogs

K = Constante da Lei de Henry (Para CH4

a 25oC, K = 1,34.10-3 mol.L-1.atm-1)
Pg = presso parcial do metano (atm),
funo da presso total e da % de metano no headspace (PCH4 = Ptotal %CH4)
Conhecendo-se os volumes da fase lquida e gasosa, pode-se encontrar ento
a quantidade de metano produzida a
partir da Equao 6.
O  9H7H  9M7M
(6)
Onde:
n = quantidade de metano dentro do
frasco (em moles)
Xg = concentrao de metano determinada na fase gasosa (em mol.L-1)
Vg = volume (em L) da fase gasosa
(headspace)
Xl = concentrao de metano calculada
na fase lquida (em mol.L-1)
Vl = volume da fase lquida
O inconveniente do procedimento descrito acima a necessidade de se
saber a presso dentro do frasco para se
determinar de forma exata a quantidade
de metano dissolvida.
Para se determinar a produo
diria de metano preciso construir
uma curva de calibrao que relacione nmero de moles de metano no
headspace com a rea sob o pico de
metano separado e detectado por cro-

Volume acumulado
de CH4(ml)

graficamente em equivalentes de DQO

(gDQOCH4/d).

rea
Figura 6 Curva de calibrao para
quantificao do metano

199

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ARTIGO TCNICO

Metodologias para determinao da atividade metanognica

ARTIGO TCNICO

Aquino, S. F. et al.

Medio direta do volume de metano

A nica diferena entre o mtodo
de medio do volume e composio
descrito anteriormente e o mtodo da
medio direta de metano que, para
se medir o volume de apenas metano,
deve-se lavar o biogs com uma soluo
de soda (Ex. NaOH 15%) para que haja
a absoro do CO2 de acordo com as
seguintes reaes:
)0  $0  )$0

Aparato II (Frasco de Mariotte)

(8)
$0  /B0)  /B$0  )0 (9)
Esse procedimento assume que o
CO2 e o CH4 so os principais constituntes do biogs formado durante o teste
de AME. Essa considerao vlida
uma vez que em pH neutro a maior
parte da amnia (NH3) e metade do
sulfeto de hidrognio (H2S), se presentes, estaro ionizados e dissolvidos na
fase lquida como NH4+ e HS-.
Diferentes grupos de pesquisa
brasileiros usam esta metodologia
(Rocha et al, 2001; Alves et al, 2005),
e o monitoramento da produo de
metano tambm feito diariamente,
com o auxlio de uma seringa conectada
a um recipiente para absoro do CO2.
A grande vantagem dessa metodologia
que ele dispensa o cromatgrafo
para determinao da composio do
biogs. Por isso essa tcnica tem baixo
custo e pode ser implementada em,
literalmente, qualquer laboratrio de
monitoramento, e mesmo em ETEs
pequenas sem grande capacidade de
infra-estrutura. A medio de metano
do biogs pode ser realizada como
ilustrado na Figura 7.
A Figura 7 mostra que o volume
de metano produzido pode ser aferido
medindo-se o volume do biogs lavado
(Aparato I), ou o volume de soluo de
hidrxido deslocado pelo gs lavado
(Aparato II). No Aparato I pode-se,
no momento da leitura, conectar o frasco de incubao ao frasco de NaOH por
meio de um sistema agulha-mangueira
latex-agulha, de forma que a introduo da agulha da seringa esmerilhada no
septo do frasco de NaOH cause a automtica despressurizao do frasco de
incubao. Como o gs entra no frasco
de NaOH abaixo do nvel da soluo,
garante-se que o gs medido na seringa
esmerilhada seja predominantemente
metano. No caso do Aparato II, o sistema agulha-mangueira latex-agulha

Gs livre
de CO 2

Gs livre de CO2
(medio volume com
seringa esmerilhada)

Frasco
NaOH 15%

Frasco
incubao

Frasco
NaOH 15%
Vreao

(7)

)$0  /B0)  /B$0  )0

Eng. sanit. ambient.

Aparato I

Medio do volume
deslocado com proveta

Figura 7 Esquema de dois aparatos experimentais para lavagem do

biogs e medio do volume de metano produzido
tambm seria usado para conectar o
frasco de incubao ao frasco de NaOH,
entretanto a despressurizao do frasco
de incubao ser seguida da expulso
de soluo de soda, que corresponde
ao volume deslocado pelo metano. O
volume de metano produzido pode ser
conhecido atravs da medio do volume ou peso da soda expulsa do frasco.
Caso se opte pela pesagem do liquido
tambm deve ser conhecida a densidade
da soluo alcalina. A grande vantagem
do Aparato I a sua simplicidade e a
dispensa da necessidade de recomposio peridica do volume da soluo
de NaOH, enquanto que a vantagem
do Aparato II a dispensa do uso das
seringas esmerilhadas. Salienta-se que
para o correto funcionamento dos aparatos I e II, as mangueiras utilizadas nas
conexes agulha-mangueira-agulha
devem ser impermeveis a gases (Ex.:
mangueiras tipo cristal ou de ltex,
impermeveis a gases).
Uma vez conhecido o volume
de metano produzido diariamente,
pode-se obter a produo acumulada
em termos de gDQOCH4/d conforme
raciocnio desenvolvido anteriormente.
De forma similar, o valor da AME, em
gDQOCH4/gSSV.d, pode ser calculado conhecendo-se a quantidade de
lodo usada como inculo (g SSV) e a
taxa mxima de produo de metano
(gDQO CH4/d) obtida no trecho de
maior inclinao e que corresponda a
uma utilizao de, pelo menos, 50%
do substrato adicionado.

esforo de alguns pesquisdores, no h,

na literatura nacional e internacional,
consenso sobre as melhores condies de
incubao do lodo (concentrao de biomassa, tipo e concentrao de substrato,
relao alimento/microrganismo, tipo e
concentrao de nutrientes, tempo de
incubao), bem como procedimentos
de medio de metano (manomtricos,
volumtricos) para a execuo do teste.
A no existncia de um procedimento padro para a determinao da
AME, dificulta a comparao dos resultados obtidos por diferentes estudos, e
limita a aplicabilidade e disseminao
do teste de AME como ferramenta
de controle dos processos anaerbios.
Dessa forma importante que novas
pesquisas investiguem a possiblidade
de harmonizao do teste de AME,
tanto pela adoo de procedimentos
comuns de incubao do lodo, como
pela avaliao da confiabilidade dos
diferentes mtodos de medio do
metano durante o teste.

REFERNCIAS
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CONCLUSES

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Esse artigo apresentou uma reviso

sobre os diferentes testes normalmente
utilizados para a determinao da
atividade metanognica especfica
(AME) de lodos anaerbios. Apesar do

CHERNICHARO C. A. L., CAMPOS, C. M. M. A

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200

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

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Endereo para correspondncia:

Srgio F. Aquino
Departamento de Qumica
Universidade Federal de Ouro
Preto - UFOP
Campus Morro do Cruzeiro
35400-000 Ouro Preto Minas
Gerais - Brasil
E-mail: sergio@iceb.ufop.br

Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ARTIGO TCNICO

Metodologias para determinao da atividade metanognica