Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioqumica

Prtica: Propriedades Fsico-Qumicas de Protenas e Dosagem de Protenas pelo Mtodo do

Biureto
Alunos: Juliana Esteves
Patrcia Sbano
Renata Gudergues
Ryanna Soares
Turma: Fm 161
Professores: Rafael Mesquita e Renato Carvalho
Data da realizao da prtica: 25/08/2010
Data da entrega do relatrio: 08/09/2010
Avaliao:
Critrio:
Apresentao
Introduo
Objetivos
Mtodos
Resultados
Discusso
Bibliografia
Total:

Nota:

I. Introduo
i.i) Desnaturao de Protenas
As protenas so molculas grandes, presentes em todos os seres vivo e formadas por
sequncias de aminocidos ligados por ligaes peptdicas apresentando, portanto, uma estrutura
nica e tridimensional. Essa estrutura o que determinar sua funo no organismo dos seres vivos.
Quando a protena est em sua condio mais estvel termodinmicamente, exercendo uma funo
especfica biolgica, denominamo-la nativa.
Mas, as protenas podem sofrer um processo de desnaturao, ou seja, perder a sua
conformao, j que as ligaes fracas responsveis pelas estruturas secundria, terciria e
quaternria so rompidas (pontes dissulfeto e/ou ligaes de hidrognio e/ou interaes hidrofbicas
e/ou pontes salinas), levando precipitao da protena, perda de sua conformao mais estvel e,
consequentemente, a perda de sua funo biolgica. Agentes fsicos e qumicos podem levar a tal
situao, como: temperatura, solventes orgnicos, altas concentraes salinas, cidos fortes e agentes
caotrpicos.
O aumento da temperatura rompe interaes por conta da agitao das molculas, os
detergentes e a uria so capazes de romper interaes hidrofbicas, o pH influencia na carga lquida
da protena, a fora inica interfere na solubilidade da protena frente a adio de diferentes
quantidades de sal, aumentando ou diminuindo a camada de solvatao. A constante dieltrica
provoca a exposio de radicais hidrofbicos em soluo apolar, processos de oxidao e reduo so
responsveis pela quebra de pontes dissulfeto e o agente caotrpico responsvel por fazer pontes de
hidrognio uma vez que apresenta em sua composio tomos eletronegativos, desestruturando,
assim, a protena.
importante realar que na desnaturao de protenas somente so rompidas as interaes
fracas, e no as ligaes peptdicas, umas vez que essas tm carter de ligao dupla e s so
rompidas por aes enzimticas catalticas ou em meio extremamente cido (H2SO4 ou HCl
concentrados) associado a altas temperaturas.
i.ii) Dosagem de Protenas pelo Mtodo do Biureto.
O biureto uma substncia formada pela mistura de cobre, hidrxido de sdio e um complexo
que estabiliza essa mistura. Dessa forma, quando em soluo que contenha protenas, essas formam
um complexo prpura, em solues salina, uma vez que o on cuproso se liga ao nitrognio dos
aminocidos. Assim, podemos estimar a concentrao da soluo que contenha protenas, quando
colocamos a amostra em um espectrofotmetro, emitindo luz monocromtica de comprimento de
onda de 540 nm. No deve ser utilizado o comprimento de onda de 270 nm, uma vez que a
probabilidade de outros aminocidos ou substncias absorverem luz nesse comprimento e
interferirem negativamente no resultado alta.
Temos ainda que, pela lei de Lambert-Beer a absorbncia A diretamente proporcional
concentrao do soluto absorvente. Podemos, ento, calcular a concentrao de uma amostra de
protenas desconhecida fazendo uso da seguinte frmula;

Onde;

a absorbncia; o coeficiente de extino molar, o caminho ptico e C a

concentrao.
Para comparar as concentraes das amostras, utilizado um tubo branco, contendo somente
biureto. Dessa forma, o espectrofotmetro ajustado de modo que identifique absorbncia zero. Ao
final das medies, possvel montar o grfico da curva padro da protena.
2

II. Objetivos:
Propriedade Fsico-Qumicas das Protenas.
Analisar o comportamento das protenas ovoalbumina e casena sob o efeito de diversos
fatores: temperatura, solventes orgnicos, altas concentraes salinas, cidos fortes e agentes
caotrpicos.
Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto
Atravs do mtodo biureto, com as leituras das absorbncias obtidas pelo espectofotrmetro
construir um grfico da Curva Padro de Casena e com isso calcular a concentrao da soluo
desconhecida de casena.
III. Material e Mtodos.
III. A. Material:
Propriedade Fsico-Qumicas das Protenas.
Material por grupo:
12 Tubos de Ensaio de Centrfuga
2 Pipetas de 2 mL
3 Pipetas de 5 mL
1 Pipeta de 10 mL
2 Pr-Pipetes
Solues:
15 mL de Soluo de Uria 8M em um bquer
50 mL de Soluo Tampo Fosfato (PBS) pH 7,4 em um bquer
20 mL de Ovoalbumina (clara de ovo diluda em PBS 1:25 v/v) em um bquer
20 mL de Casena (diluda em PBS 1 mg/ml) em um bquer
Acetona (na capela) com 1 Pipeta de 5 mL e 1 Pr-Pipete
Soluo de cido Sulfrico com 1 Pipeta de 5 mL e 1 Pr-Pipete
Equipamentos:
1 Banho Maria ALPAX ISO 9.001 (2000) Water Bath Logen Scientific
Centrfuga Clnica TDL80-2B CENTRIBIO
Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto
Material por grupo:
7 Tubos de Ensaio
3 Pipetas de 2 mL
1 Pipeta de 5 mL
1 Pr-Pipete
1 Bquer de 50 mL
6 Cubetas
3

Solues:
Soluo Padro de Casena (5 mg/mL) em PBS pH 7,4
Amostra de Casena de Concentrao desconhecida em PBS pH 7,4
Reagente do Biureto:
CuSO4 . 5 H2O
0,15% p/V
Tartarato Duplo de Sdio e Potssio
0,60% p/V
KI
1,00% p/V
PBS pH 7,4 (Tampo Fosfato com Salina em pH 7,4)
KCl
2,680 mmol/L
KH2PO4
1,470 mmol/L
NaCl
0,137 mmol/L
Na2HPO4 . 7 H2O
8,060 mmol/L
Esquipamentos:
Espectrofotmetro UVmini 1240 UV-VIS SPECTOR PHOMETERS/120V (E)
SHIMADZU
Vortex Marca: Vertex, modelo: QL-901
III. B. Mtodos:
Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas:
Com o auxlio de pipeta e pr-pipete, foram transferidas alquotas das solues de protenas
para 10 tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:
Nmero do tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Ovoalbumina
4 mL
2 mL
1 mL
2 mL
2 mL
-

Casena
4 mL
2 mL
1 mL
2 mL
2 mL

Para a verificao do efeito da temperatura, os tubos 1 e 2 foram colocados em banho-maria

fervente durante 10 minutos. Observou-se o aspecto das amostras, e reservou-se.
Os tubos 3 e 4 foram levados para a capela, e l acrescentou-se 2 mL de acetona,
homogeneizando os mesmos. O aspecto das amostras foi observado, e os tubos de ensaio foram
reservados.
Para a observao do efeito das altas concentraes salinas, foram transferidos 4 mL da
soluo de (NH4)2SO4 para os tubos 5 e 6, homogeneizando-os. O aspecto das amostras foi
observado, e estas foram reservadas.
Para a visualizao do efeito de cidos fortes, foram transferidos, na capela, 2 mL de H2SO4
para os tubos 7 e 8, homogeneizando-os. Observou-se o aspecto das amostras, e reservou-se.
Para os tubos 9 e 10, foram transferidos 2 mL da soluo de uria, homogeneizando-os. Os
resultados foram observados e o material, reservado.
4

Feito isto, os tubos que sofreram alteraes foram separados. Com o auxlio de uma balana
ordinria, estes tubos foram tarados e aps, centrifugados a 3000 RPM por 5 minutos em uma
centrfuga clnica.
Os resultados obtidos foram verificados. Foi descartado o sobrenadante dos tubos onde houve
a formao de precipitado (pellet), com o devido cuidado, para que no houvesse a ressuspenso do
pellet. Posteriormente, foram adicionados 6mL da soluo de tampo fosfato (PBS) aos
precipitados e, com o auxlio do vortex, os mesmos foram homogeneizados, a fim de que houvesse a
ressolubilizao dos precipitados.
Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto
Foram adicionados, a um bquer, aproximadamente 7 mL da soluo de casena, este foi
levado para pipetar na bancada. Em outro bquer foram adicionados 10 mL da soluo de PBS,
levando-o para pipetar na bancada. Com o auxlio de uma pipeta e pr-pipete, foram transferidas
alquotas das solues de protena para tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:
Tubo

PBS (mL)

B
1
2
3
4
5

2,0
1,5
1,0
0,5
-

Soluo
Padro de
Casena (mL)
0,5
1,0
1,5
2,0
-

Soluo [?]
de Casena
(mL)
2,0

Biureto (mL)

5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

Feito isto, os tubos foram homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 15

minutos. Posteriormente, o contedo de cada tubo foi transferido para uma cubeta, enchendo-a acima
da metade. Esta cubeta foi levada para o espectofotmetro, para que fossem lidas as absorbncias,
contra o tubo branco, no comprimento de onda de 540 nm. Os valores obtidos foram anotados.
IV. Resultados:
Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas:
Obtivemos os seguintes resultados nos ensaios com a Ovoalbumina e a Casena:
Nmero do
Tubo

Ovoalbumina

Casena

4 mL

Colorao
Antes do
Ensaio
Incolor

4 mL

Incolor

2 mL

Incolor

2 mL

Incolor

Ensaio

Efeito da
temperatura
Efeito da
temperatura
Efeito de
solventes
orgnicos
Efeito de
solventes

Colorao
Aps o
Ensaio
Soluo
levemente
esbranquiada
Soluo
incolor
Soluo
branca
Soluo
incolor
5

orgnicos
Efeito de altas
concentraes
salinas
Efeito de altas
concentraes
salinas
Efeito de
cidos fortes

1 mL

Incolor

1 mL

Incolor

2 mL

Incolor

2 mL

Incolor

Efeito de
cidos fortes

2 mL

Incolor

10

2 mL

Incolor

Efeito de
agentes
caotrpicos
Efeito de
agentes
caotrpicos

Soluo
levemente
esbranquiada
Soluo com
poucos
precipitados
Soluo
esbranquiada
homognea
Soluo
contendo
muitos
precipitados
Soluo com
um nico
precipitado
Soluo
incolor

Aps a centrifugao e a pesagem dos tubos que sofreram alteraes, observamos que:
Tubo

Colorao antes da
centrifugao
Soluo levemente
esbranquiada
Soluo branca

1
3

Soluo levemente
esbranquiada
Soluo com poucos
precipitados

5
6

Soluo esbranquiada
homognea

Soluo contendo
muitos precipitados

Soluo com um nico

precipitado

Colorao aps da
centrifugao
Soluo incolor

Pesagem

Formao de
precipitados (pellet)
ao fundo do tubo
Formao de poucos
precipitados (pellet)
Formao de poucos
precipitados (pellet)
ao fundo do tubo
Formao de
precipitado (pellet)
ao fundo do tubo
Formao de
precipitado (pellet)
ao fundo do tubo
Soluo incolor

13,30 g

14,05 g

15,60 g
15,88 g

14,51 g

14,65 g

13,90 g

Considerando que o tubo de ensaio contendo gua pesava 14,40 g.

Por fim, aps adicionarmos o PBS aos tubos que continham precipitado, observamos:
Tubos
3

Colorao aps a
centrifugao
Formao de precipitados

Resultado aps adio de PBS

No houve modificaes no
6

(pellet) ao fundo do tubo

Formao de poucos
precipitados (pellet)
Formao de poucos
precipitados (pellet) ao fundo
do tubo
Formao de precipitado
(pellet) ao fundo do tubo
Formao de precipitado
(pellet) ao fundo do tubo

5
6

7
8

precipitado
Houve ressolubilizao do
precipitado
Houve ressolubilizao do
precipitado
No houve modificaes no
precipitado
So houve modificaes no
precipitado

Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto

A partir do preparo dos tubos de ensaio com casena, PBS e biureto e a utilizao do
espectrofotmetro, obtivemos os seguintes resultados:
Tubo

PBS (mL)

B
1
2
3
4
5

2,0
1,5
1,0
0,5
-

Soluo
Padro de
Casena (mL)
0,5
1,0
1,5
2,0
-

Soluo [?]
de Casena
(mL)
2,0

Biureto (mL)

Abs (540nm)

5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

0
0,101 Abs
0,161 Abs
0,241 Abs
0,323 Abs
0,135 Abs

A partir do valor da absorbncia e da concentrao de cada tubo, conseguimos desenhar uma

curva padro da casena e, assim, calcular o valor da concentrao de casena desconhecida.
- Clculos para obteno da quantidade de casena em cada tubo:
Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

- Pela lei de Lambert-Beer:

onde, no caso, o caminho ptico, que ser de 1cm,
o comprimento da cubeta; tendo ento:
. No caso, C a concentrao e A a absorbncia e
assumir o valor da constante de proporcionalidade, dada por:

- Clculo para achar a concentrao da amostra com concentrao desconhecida:

7

Obs: a curva padro da casena est em anexo.

V. Discusso:
Propriedades Fsico-Qumicas das Protenas:
A ovoalbumina e a casena so protenas encontradas no ovo e no leite, respectivamente. Nos
processos de desnaturao pudemos fazer algumas observaes e comparaes entre as duas. No
primeiro efeito, o de temperatura, observamos que somente a ovoalbumina formou precipitado.
Sabendo que o efeito da temperatura na desnaturao de protenas de provocar um aumento na
vibrao molecular, causando a ruptura de algumas interaes fracas. Desse modo, podemos concluir
que as interaes intra e intercadeias da cistena so mais difceis de serem quebradas, podemos
congitar, ento, a presena de pontes dissulfeto, cuja ruptura ocorre principalmente por oxidao. A
colorao levemente esbranquiada no tubo contendo ovoalbumina pode nos dar a concluso da
ruptura de interaes fracas.
Os resultados quando adicionados solventes orgnicos, permitiu-nos concluir que a
ovoalbumina uma protena ou apresenta partes hidrofbicas, pois o solvente orgnico apresenta
caractersticas hidrofbicas, dessa forma, possibilitaria interaes hidrofbicas com a protena,
resultando a mudana de sua conformao nativa e percipitando-a. A casena, por no ter apresentado
modificaes quando adicionado o solvente, podemos concluir que no ou no possui parte
hidrofbicas.
No efeito das altas concentraes salinas, percebemos precipitados nos dois tubos. Isso
porque o efeito do aumento excessivo da concentrao salina (tambm conhecido como salting out)
interfere nas cargas eletrostticas da protena alm de diminurem a camada de solvatao da mesma,
levando a sua precipitao. Foi possvel a ressolubilizao das amostras uma vez que foi adicionado
o PBS. Tornando o processo reversvel.
O efeito causado pela adio de cidos fortes explicado e visto nos dois tubos, pois um meio
altamente cido apresenta grande concentrao de ons positivos (H3O+) esse excesso de carga
influencia na carga lquida da protena, causando sua desnaturao.
Por fim, o efeito causado pela adio de agentes caotrpicos, no apresentou efeito,
praticamente, uma vez que o precipitado observado no tubo contendo ovoalbumina poderia ser uma
impureza. Algumas literaturas consideram a temperatura como agente caotrpico, mas consideremos
o agente caotrpico sendo a uria, um composto txico ao organismo e que apresenta amnia em sua
composio, a qual favorece o rompimento de interaes fracas, principalmente pela formao de
pontes de hidrognio entre amostra e agente, desnaturando a protena.
Ao observamos mudanas aps a prtica do vortex nos tubos que apresentavam precipitados
formados por cido forte e solvente orgnico porque o PBS no apresento resultados devido a
desnaturao irreversvel causada por tais efeitos.
Dosagem de Protenas Pelo Mtodo do Biureto
O mtodo do biureto bastante eficiente quando se deseja encontrar a concentrao de uma
amostra de protena. Com o auxlio de um espectrofotmetro e a aplicao da lei de Lambert-Beer,
observando a absorbncia, e tendo outras solues para ser possvel a produo da curva padro da
protena ou possuir o coeficiente de extino molar (tambm chamado de coeficiente de absoro
molar) que constante a um dado comprimento de onda.
8

Podemos afirmar, a partir da prtica, que, levando-se em conta o mesmo comprimento de

onda e o mesmo comprimento da cubeta, a absorbncia diretamente proporcional a concentrao.
No caso, a concentrao da soluo padro era constante, o que variava era a massa de casena
presente na amostra. Verificamos, ento, a veracidade da Lei de Lambert-Beer apresentada na
introduo do relatrio.
O tubo branco utilizado teve a funo de calibrar o espectrofotmetro para a medida das
solues a partir da soluo do tubo branco.
VI. Referncias bibliogrficas
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2004. 1125p.
ZAIA, D.A.M; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J.; Determinao de Protenas Totais Via
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Disponvel
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<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040421998000600020&script=sci_arttext&tlng=es>. Acesso em 6 de setembro de 2010.
QUINTINO, D.; SAMPAIO, F.; CHUCHA, A. Doseamento das Protenas pelo Mtodo do
Biureto. Instituto Politcnico de Santatm Escola Superior Agrria. Curso de Engenharia da
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http://www.anaseca.uac.pt/pdf_bioquimica/introd_espectrof.pdf. Acessado em 7 de setembro de
2010.
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Acessado em 7 de setembro de 2010.
DE SOUZA, R.C.S.; Separao da Lisozima, Conalbumina e Ovoalbumina Presentes na Clara
do Ovo: Aspectos Tecnolgicos e Termodinmicos. Viosa Minas Gerais Brasil. 2008.
Disponvel
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http://www.tede.ufv.br/tedesimplificado/tde_arquivos/39/TDE-2008-0826T063324Z-1284/Publico/texto%20completo.pdf . Acessado em 7 de setembro de 2010.