Microscopie

Multiphoton
Cours de biophotonique
Ecole Polytechnique de Montral

1

Multiphoton ?
Mul9photon
= Interac9on de plusieurs photons simultanment avec la ma9re
= Processus dop9que non-linaire

2PEF
3PEF
SHG
THG
CARS

FLUORESCENCE 2 PHOTONS

Absorption 2 photons
1931 : Dmonstra9on thorique de la
possibilit de labsorp9on 2 photon
(M. Goeppert Mayer)
NA2 [ photon / s] =

Absorp9on 1PEF
NA1[ photon / s] = 1p [cm 2 ].I[ photon / s / cm 2 ]

Maria Goeppert Mayer

(1906 - 1972)

Absorp9on 2PEF
NA2 [ photon / s] =

Absorption 2 photons
1931 : Dmonstra9on thorique de la
possibilit de labsorp9on 2 photon
(M. Goeppert Mayer)
Maria Goeppert Mayer
(1906 - 1972)

Absorp9on 2PEF
NA2 [ photon / s] = 2 p [cm 4 s / photon]( I[ photon / s / cm 2 ])

Absorption 2 photons
Spin de photon = 1
Conserva9on du moment
angulaire total
Pas les mmes rgles de
slec9on
Des spectres dabsorp9on
dirents

6
C. Xu et al. PNAS 93, 10763 (1996)

Fluorescence 2PEF

Peu importe le chemin pris pour exciter la molcule, le

retour ltat fondammental se fait de la mme manire

Spectres de uorescence iden9ques

Fluorescence 2PEF

8
Principles of uorescence spectroscopy , J.R. Lakowicz, 3rd edi9on

Comparaison 1PA - 2PA

1960 : First Ruby Laser (Maiman)

1961 : Dmonsta9on exprimentale (Kaiser & Garrek)

Calcul du nombre de photons dtects (Xu et Webb, JOSA B, 1996)

Augmenter lefHicacit 2PA

Impulsions brves

10
1986 : Titanium:Sapphire laser (P. Moulton)

Rsolution
Etude de cas par9r dun faisceau gaussien

Contribu9on dun plan z=z0

11

Rsolution
Etude de cas par9r dun faisceau gaussien

12
Zipfel et al., Nonlinear Magic, Nat. Biomed. (2003)

Rsolution

13
Volume focal
(Zipfel, Williams, Webb, Nonlinear Magic, Nature biotech. 2003)

Microscope 2PEF

Leica TCS MP5 multiphoton microscope

1990 : Two-photon laser scanning uorescence microscopy
(Denk W, Strickler J, Webb W)

14

Microscope 2PEF

2PEF

Excita9on
15

430 nm

860 nm

Microscopie 2PEF
2PEF : Fluorescence sous excita9on 2 photons

Excita9on conne au point focal
=> Rsolu9on pour NA=0.85 800 nm

~ radiale 0,4 m

~ axiale 1,6 m

Fluorophores endognes :
- NADH
- las9ne
- avoprotine
- kra9ne...

~ 10-4 - 10-1 GM

- Fluorophores organiques (uorescine, ...)

~ 10-1 - 103 GM

Fluorophores exognes :

- Protines uorescentes (GFP, CFP, )

- Points quan9ques

~ 10-1 - 102 GM
~ 103 - 105 GM

16

Microscopie 2PEF

Figure 1. "In vivo" two-photon microscopy. The superior 9ssue penetra9on

of our newly constructed "in vivo" two-photon microscopy can visualize
neural ac9vi9es in the living brain. EYFP uorescence can be detected from
layers deeper than 0.9 mm beneath the brain surface in an anaesthe9zed
mouse. 3D-reconstruc9on of individual neural cells spreading in the layers I-V
is available without any degrada9on of sub-micron spa9al resolu9on.
(Collabora9ve research with Prof. J. Nabekura.

17

Quels avantages ?
Dirences par rapport un microscope confocal
Longueur donde
Volume dexcita9on conn

18

Quels avantages ?
Profondeur de pntra9on

Fenetre thrapeuthique : 700 1300 nm

Diusion plus faible dans linfrarouge

19

Quels avantages
Profondeur de pntra9on

Detec9on de photons
aprs diusion mul9ples
(Helmchen et Denk, Nature Meth. 2005)

20

Multiphoton VS confocal

XZ proles through an acid-fucsin-stained monkey kidney pathology sample

imaged through a depth of 140 m
Confocal excita9on 532 nm CW
Mul9photon excita9on 1047 nm 120 fs
Scale bar, 20 m

Mul9photon Excita9on Provides Op9cal Sec9ons from Deeper within Scakering
Specimens than Confocal Imaging
Biophysical Journal, Volume 75, Issue 4, October 1998, Pages 20152024

21

Quels avantages ?
Profondeur de pntra9on de 50m quelques centaines de
micromtres avec une rsolu9on de lordre de 1m^3

Photo-dommages (idem photo-blanchiment)
Absorp9on 1P des molcules organiques + faible dans linfrarouge
Photo-dommages par absorp9on 2P seulement au volume focal
U9le pour faire de labla9on laser (vido)

Spectres dabsorp9on plus larges

Imagerie simultane de plusieurs uorophores

Modes de contraste addi9onnels

U9lisa9on dautre processus non-linaire en combinaison avec 2PEF

22

Dsavantages ?
Rsolu9on maximale limite par la longueur donde
Lasers femtosecondes dispendieux
Spectres dabsorp9on et spectre du laser plus larges
=> moins de slec9vit (uorescence endogne)

23

GNRATION DE SECOND
HARMONIQUE

24

Optique non linaire

25

Optique non linaire

Dcomposi9on en somme d'harmoniques

SHG : molcule non-centrosymtrie
26
1961 : Second harmonic genera9on was rst demonstra9on by P. A. Franken, A. E.
Hill, C. W. Peters, and G. Weinreich

Optique non linaire

Polarisa9on induite :

(2) ()2

a : polarisabilit linaire (tenseur dordre 2)

b : hyperpolarisabilit du premier ordre (tenseur dordre 3)
g : hyperpolarisabilit du second ordre (tenseur dordre 4)

E : champs lectromagn9que incident

Polarisa9on induite dordre 2 dans le domaine frquen9el

27

Diples proches (d << )

Pour des molcules dont la distance est trs pe9te devant la longueur d'onde

28

Diples proches (d << )

Pour des molcules dont la distance est trs pe9te devant la longueur d'onde
Intensit
I
4 x I
0

Pour des molcules alignes :

L'intensit crot avec le carr du nombre de molcules

29

Diples plus loigns (d ~ )

30

Diples plus loigns (d ~ )

31

Diples plus loigns (d ~ )

32

Diples plus loigns (d ~ )

33

Diples plus loigns (d ~ )

34

Rayonnement

Zipfel et al., Nonlinear Magic, Nat. Biomed. (2003)

35

SHG en bref
Processus de diusion non-linaire
Longueur donde SHG exactement la moi9 de ceke de londe
excitatrice
Processus instantan (de lordre de 10^-15 s)
Processus cohrent
Anisotropie de lmission
Signal fonc9on du carr du nombre de molcules produisant du
SHG pour une mme distribu9on spa9ale
Possibilit dinterfrence destruc9ve entre le signal de dirents
molcules :
Sonde lorganisa9on des molcules lchelle de la longueur donde
Dicile de relier intensit du signal et concentra9on de molcules

SHG seulement ecace dans les milieux organiss sans centre

de symtrie

36

Gnration de second
harmonique

Source de SHG exognes (peu u9liss):
- Nano-cristaux (BK7, LiO3, KDP )
- Quelques molcules synth9ses pour la biologie :
essen9ellement des marqueurs de poten9el membranaire

1961 : Premire dmonstra9on de SHG par P. A. Franken, A. E.

Hill, C. W. Peters, and G. Weinreich
1979 : Gnra9on de SHG dans le collagne Shmuel Roth et
Isaac Freund

37

SHG endogne
Collagne

Image dartriole dun rein de souris (Strupler)

38
1979 : Gnra9on de SHG dans le collagne
Shmuel Roth et Isaac Freund

SHG endogne
microtubule

Alex C. Kwan, Daniel A. Dombeck,* and Wak W. Webb

Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 August 12; 105(32): 1137011375.
Published online 2008 August 5. doi: 10.1073/pnas.0805199105.

39

SHG endogne
Myosin

Michael E. Llewellyn et al., Minimally invasive high-

speed imaging of sarcomere contrac9le dynamics in
mice and humans, Nature 454, n. 7205 (print 2008):
784-788.

40

Microscope 2PEF

2PEF

Excita9on
41

430 nm

860 nm

Microscope 2PEF/SHG

SHG

2PEF

Excita9on

42
430 nm

860 nm

GNRATION DE TROISIME
HARMONIQUE

43

THG
A priori possible dans tous les matriaux
Ne sannule pas dans des milieux centro-symtriques
U9lisa9on de laser ~1.2 m (Ti:Saphh + OPO)

3
44

THG
Mais :
rgles daccord de phase
faisceau fortement focalis (phase de Gouy)
Pas de signal dans des milieux homognes lordre du volume
focal
Sensible aux inhomognits de lordre de grandeur du volume
focal

45
Ji-Xin Cheng and X. Sunney Xie, "Green's func9on formula9on for
third-harmonic genera9on microscopy," J. Opt. Soc. Am. B 19,
1604-1610 (2002)

THG
Visualisa9on des lipides

46
1.Delphine Debarre et al., Imaging lipid bodies in cells and
9ssues using third-harmonic genera9on microscopy, Nat
Meth 3, n. 1 (Janvier 2006): 47-53.

CONCLUSION

47

Point fort de la microscopie

multiphoton
Permet dimager des 9ssus pais des profondeurs plus grandes
que la microscopie confocale mais avec une rsolu9on quivalente
(typiquement la pntra9on va de 50m 1 millimtre)
Permet de raliser des images mul9modales (2PEF + SHG + ) sans
marquage : trs u9le pour les cas o il nest pas possible de raliser
des marquages uorescents comme limagerie in vivo chez lhomme
Permet de raliser une excita9on localis (ac9va9on dun neurone
par9culier, abla9on en profondeur sans dtruire les couches
suprieures, photodomages et photoblanchiement localis,
relargage localis de mdicament encapsul)
Possibilit du9liser tous les marqueurs (protines uorescentes,
an9corps uorescents, quantums dots, ) et toutes les techniques
bases sur la uorescence (FLIM, FCS, ) dveloppes pour la
microscopie de uorescence linaire

48

Attention
Vriez que votre signal dpend bien de lintensit du laser au
carr pour tre sr que cest bien de la 2PEF ou de la SHG que
vous dtectez (intensit du laser au cube pour la THG)
Dans le cas de la gnra9on dharmonique, se mer des
images, car des eets cohrents peuvent vous induire en
erreur. De la mme faon quil ne faut pas prendre le speckle
des images OCT pour des structures rellement prsentent
dans lchan9llon.
Ce nest pas parce que vous navez des canaux que pour
dtecter la SHG et la 2PEF que dautres phnomnes (3PEF,
absorp9on linaire ) ne se produisent pas

49