Tema 15.

Mtodos de estudio del polimorfismo

HLA. Estudio de los anticuerpos anti-HLA

Cristina Abad Molina

Servicio de Inmunologa. H.U.V.R. Sevilla

17 de noviembre de 2015

Estudio de Anticuerpos anti-HLA

Mtodos de deteccin de Anticuerpos anti-HLA

Mtodos de deteccin de Anticuerpos anti-HLA

Reaccin
de
citotoxicidad
dependiente de complemento (CDC)

ELISA

Citometra de flujo

Luminex. (Basada en la citometra de
flujo utiliza microesferas recubiertas de
antgenos HLA purificados)

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Reaccin antgeno-anticuerpo con fijacin de complemento que

visualizamos con un colorante.
Sueros (Anticuerpos)+ Linfocitos (Antgenos)

Sangre perifrica/
Bazo o ganglio

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Incubamos 30

Sembrar los sueros

+
Sembrar los linfocitos

Aadir
Complemento

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Unin Ag-Ac

Activacin del complemento

(Complejo Ataque a Membranan (CAM))

Unin Ag-Ac

Activacin del complemento

(Complejo Ataque a Membranan (CAM))

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Incubamos 30

Sembrar los sueros

+
Sembrar los linfocitos

Incubamos 30

Complemento

Naranja de acridina/
bromuro de etidio
(3 l/pocillo)

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

CDC POSITIVA

Formacin COMPLEJO ATAQUE A

MEMBRANA (CAM)

Clulas Muertas

CDC NEGATIVA

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Este suero es Negativo para esta clula y
no tiene Ac anti A2, A23, B27, B44

A2
B44
A23

Clulas vivas

B27

Clulas muertas

Reaccin de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

~40 Linfocitos HLA-I conocidos

1.

A1/A2

B7/B44

CN

2.

A1/A26

B8/B14

10

11

3.

A2/-

B13/B40

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

4.

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

A23/A29 B35/B18
.
.
.

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

CN

CP

Positivo o Negativo
PRA =

N clulas con reaccin

N clulas totales

(Panel Reactive Antibody)

En los positivos se determina a la

vez la especificidad de sus Ac

LUMINEX
Mtodo similar a la citometra convencional, utiliza
microesferas recubiertas de molculas HLA en lugar
de clulas.
El uso de la citometra de flujo permite el escrutinio
de anticuerpos sricos frente a antgenos HLA con
una sensibilidad y especificidad mayor que el
mtodo convencional de la CDC.

LUMINEX
Se basa en un doble lser, uno para identificar a las beads, y otro para
identificar reaccin en superficie

Ac (tipo IgG) anti-HLA I

Ac (tipo IgG) anti-HLA II

IgG1, IgG3 e IgG2, IgG4

No IgM

Tipificacin HLA
Estudio con el que determinamos cules de todas
las variantes conocidas del locus HLA estn
presentes en un individuo determinado.

HLA
Polignico

Polimrfico

HLA-I: A, B, C
HLA-II: DR, DQ, DP
Alelos: Cada una de las
variantes que puede
presentar un gen

A* 02

A* 23

A* 33

T C T AC C TGC GAT C A

?
AGATGGTC GC TAGT

Expresin
codominante

Tcnicas de Tipaje HLA

Identificacin de las
molculas HLA por
reconocimiento de las
mismas
sobre
la
superficie celular

Estudios SEROLGICOS
(Test de Microlinfocitotoxicidad)

Determinacin de la
secuencia
gnica
que
codifica
las
molculas de HLA

Estudios de BIOLOGA MOLECULAR

(SSP, SSOP y SBT)

Identificacin de las
molculas HLA por
reconocimiento de las
mismas
sobre
la
superficie celular

Estudios SEROLGICOS
(Test de Microlinfocitotoxicidad)

Consiste en una reaccin

antgeno-anticuerpo
con
fijacin de complemento y
visualizacin de la reaccin
con un colorante

1 Sembramos los pocillos con los LINFOCITOS y sueros con

especificidad conocida

2 Aadimos COMPLEMENTO
EOSINA

3 Aadimos colorante

NARANJA DE ACRIDINA / BROMURO

DE ETIDIO

ESTUDIOS SEROLGICOS

Determinacin de tipaje HLA clase I

(Test de Microlinfocitotoxicidad)
Ac anti HLA B38

Linfocitos con HLA-I desconocido

CN

A1

A1

A1+
A36

A1+
A36

A1+A36+
A80

CN

B16

B16

B38+
A10

B38

B39

A2

A2

A2+
A69

A2+
A28

A28

A28+A10+
A33

B39

B17

B17

B17

B18

B18

B21

B49

B50

B22

A3

A9

A9

A23

A23+A21

B18+
B70

B21

A3
A24+
A55

A24

A10

A10

A25

A25

B22

B7+
B22

B55

B56

B27

B27+
B13

A26

A26

A26+A66

A34

A11

A11

B37

B37

A29

A29

A29+A30
+A31

A30+A31

A30

A30

B7+
B27

B13+40
+47

B40+
B47

B7+
B40

B48+
B60

B60

B60

B21+
B41

B41

B41

A32

A32

A32

A33+B14

A33

A33

B5

B5+
B49

B51

B51

B52+
B49

B52+B49+
B51

B42

B42+
B55

B41+
B42

B50+57
+60+70

B46+62
+70+75

B45+50
+62+70

B5+B35+
B53

B5+
B35

B35+B53

B7

B7

B8

B73

B73

Bw4

Bw4

Bw4

Bw6

Bw6

Bw6

Cw1

Cw1

Cw2

Cw2

B8

B12

B12

B12+A11

B44

B45

Cw3

Cw3

Cw4

Cw4

Cw5

Cw5

B45

B13

B13

B14

B14

B65

CN

Cw4+6

Cw4+6

Cw7

Cw7

Cw8

B15

B15
+
B57

B15
+
B57

B62

B62

CP

Cw8

CP

Tipaje HLA mediante biologa molecular

SSP, SSOP y SBT

Baja resolucin: Slo se identifica la pertenencia del alelo como codificador de

protenas parecidas (primeros dos dgitos)
Alta resolucin: Resolucin a nivel de equivalente proteico (primeros cuatro
dgitos)

HLA de clase I
Polimorfismos en el exn 2 y el exn 3 son los
responsables de la especificidad de unin al
pptido de cada molcula de una clase.

HLA de clase II
El exn 2 codifica el dominio beta1 de unin al
pptido

Estudios PRE-TX: Tipaje HLA de los pacientes en lista de espera

SSP (Primers Specific Secuence)

PCR que utiliza primers especficos de secuencia

Paneles de parejas de primers de secuencias especficas, que

discriminan los diferentes alelos HLA de cada locus (HLA-A, B, C,
DR y DQ).

SSP (Primers Specific Secuence)

T

DNA del donante

A
5

ADN del donante

Buffer
Mix

Nucletidos (A,T,G,C)

5
A

Agua
Taq polimerasa

3
G

5
A

3
G

3
G

No

5
A

No

5
A

S se unir

No

Reaccin en cadena de la
Polimerasa (PCR)

DNA POLIMERASA

DNA POLIMERASA

La clave del experimento es el

Diseo de los Cebadores

HLA-I: Exn 2 y 3

HLA-II: Exn 2

SSP (Primers Specific Secuence)

PCR que utiliza cebadores especficos de secuencia

PCR

Preparar una mezcla que contiene:

DNA
Buffer
Mix
Nucletidos (A, T, G, C)
Agua
Taq polimerasa

HLA-A

A*23/24

HLA-B

B*07/14

HLA-C

C*07/08

HLA-DRDQ

DRB1*01/15
DQB1*05/06

SSOP (Probes Oligonucleotides Specific Secuence)

Sondas Oligonucleotdicas Especficas de Secuencia)

Amplificacin del locus HLA por medio de la reaccin en

cadena de la polimerasa (PCR). Posteriormente,
hibridacin del producto amplificado con sondas
oligonuclotidcas especficas de secuencia.

SSOP (Labtype SSO-Luminex)

Extraer el DNA

1) AMPLIFICACIN

DNA
Buffer
Mix
Nucletidos (A,T,G,C)
Agua
DNA polimerasa (Obtenida de T.
aquaticus)

Amplificamos el exn 2 y 3 para

determinar el polimorfismo HLA clase I,
y el exn 2 para el de HLA clase II

Primers para amplificar los exones

DNA POLIMERASA

DNA POLIMERASA
(Exn de inters)

SSOP (Labtype SSO-Luminex)

2) DESNATURALIZACIN

3) HIBRIDACIN

4) MARCAR CON FLUOROCROMO

SSOP (Labtype SSO-Luminex)

Fundamento: 100 beads pticamente distinguibles unidas a sondas
especficas que hibridarn con el alelo especfico en caso de estar
presente.

Laser Rojo: identifica las beads

Laser Verde: identifica el ADN que hibrida

SSOP (Labtype SSO-Luminex)

SBT (Sequence based typing)

El DNA se amplifica con una mezcla de didesoxinucletidos
(ddNTP) marcados con 4 fluorforos, junto a desoxinucletidos

Grupo
hidroxilo 3

El grupo hidroxilo en
5de un nucletido se
une al grupo
hidroxilo en 3del
siguiente

Al aadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el

cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucletido

SBT (Sequence based typing)

Los fragmentos resultantes se separan por

tamao mediante electroforesis obtenindose
la secuencia del ADN.

SBT (Sequence based typing)