Food Science and Technology (Campinas)

Food Science and Technology (Campinas) - ESTUDY OF THE PARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS
Food Science and Technology (Campinas)

On-line version ISSN 1678-457X
Cinc. Tecnol. Aliment. vol. 18 n. 3 Campinas Aug./Oct. 1998
29/01/15 07:41
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http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611998000300011
ESTUDO DA PREPARAO DOS EXTRATOS DE

PRPOLIS E SUAS APLICAES1
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Yong Kun PARK2,*, Masaharu IKEGAKI2, Jos A. da

Silva ABREU3, Nvia M. Freire ALCICI3
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RESUMO
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A obteno dos extratos etanlicos de prpolis foi feita utilizando gua

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e diferentes concentraes de etanol como solventes. Esses extratos
foram analisados quanto ao seu espectro de absoro por
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espectrofotometria na regio ultravioleta ("U.V. scanning"), por
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cromatografia em camada delgada de alta performance e por
cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE). O pico de absoro
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mxima de todos os extratos foi a 290 nm sendo o extrato etanlico a
80% o que apresentou maior absoro. A maioria dos flavonides
foram extrados nas concentraes alcolica entre 60 a 80%. Foram
testados ainda o efeito anrirnicrobiano, antioxidante e anflinflamatrio desses extratos. Verificou-se
que os extratos etanlicos de prpolis entre 60 a 80% inibiu satisfatoriamente o crescimento
microbiano e os extratos etanlicos a 70 e 80% apresentaram grande atividade antioxidante, e ainda,
o extrato etanlico a 80% foi a que melhor resultado apresentou sobre a inibio da atividade da
enzima hialuronidase.
Palavras chaves: Prpolis, flavonides, Apis mellifera, extrato etanlico.
SUMMARY
ESTUDY OF THE PREPARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS Ethanolic
extracts from propolis were performed by using lhe water and vaflous coneentrations of etanol as
solvent. The extracts were investigated by measurement of absorption spectruin with Uvspectrophotometer ("UV-scanning"), reversed phase-high performance thin-layer chromatography,
Reversed phase-HPLC. Maximum absorption of ali extracts was 290 nm, resembling flavonoid
compounds and 80% ethanolic extract showed highest absorption at 290 nm. The most isosakuranetin,
quercefin, and kaempferol were extracted from mixtures of propolis and 60% etanol, whereas 70%
etanol extracted te most pinocembrin and sakuranetin, but 80% etanol extracted more kaempferide,
acacetin, and isorhamnetin from propolis. The 60 to 80% ethanolic extracts ofpropolis inhibited highly
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0101-20611998000300011&script=sci_arttext
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to microbial growth and 70 and 80% ethanolic extracts showed lhe greatest antioxidant activity and
80% ethanolic extract inhibited highly to hyaluronidase activity.
Keywords: Propolis, flavonoids, Apis mellftra, etanolic extract.
1- INTRODUO
A prpolis uma resina de colorao e consistncia variada coletada por abelhas da espcie Apis mellifera de
diversas partes das plantas como brotos, botes florais e exsudatos resinosos. Durante a coleta da prpolis, as
abelhas misturam a cera e a prpolis coletada juntamente com a enzima 13-glicosidase presente na sua saliva,
acarretando a hidrlise dos flavonides glicosilados em flavonides agliconas. A prpolis utilizado pelas abelhas
para selar eventuais aberturas na colmia e para eliminar possveis invasores [7,9].
Dentre os produtos apcolas tais como mel, gelia real, plen, entre outros, a prpolis vem se destacando tanto
pelas suas propriedades teraputicas, como atividade antimicrobiana, antinflamatria, cicatrizante, anestsica
[4,8] e anticariognica [18], quanto pela possibilidade de aplicao na indstria de farmacuticas e alimentcias, na
forma de alimentos funcionais. Atualmente existem diversos produtos contendo prpolis comercializados em todo
mundo, principalmente no Japo, tais como balas, chocolates, doces, xampus, cremes para pele, solues antispticas, pastas de dente, etc. [1].
Os efeitos teraputicos tm sido atribudos aos diversos compostos fenlicos que compe a prpolis. Destes, os
flavonides podem ser considerados os principais compostos, encontrando-se ainda, alguns cidos fenlicos e seus
steres, aldedos fenlicos, lcoois e cetonas [3,5]. Fatores como a ecologia vegetal da regio onde a prpolis foi
coletada [16,17] e at mesmo a variabilidade gentica das rainhas [12], tambm influenciam na composio
qumica da prpolis.
O objetivo deste trabalho foi verificar a concentrao de flavonides agliconas nos extratos etanlicos de prpolis
em relao a concentrao do etanol utilizado como solvente extrator, bem como a sua comparao com o extrato
aquoso de prpolis. E, finalmente, os extratos etanlicos e aquoso foram analisados quanto a sua atividade
antimicrobiana, antioxidante e antiinflamatria.
2 MATERIAL E MTODOS
2.1 Prpolis
Aproximadamente 100 gramas de prpolis, coletadas por abelhas da espcie Apis mellifera, foram obtidos no
estado de Minas Gerais, Brasil.
A prpolis foi ento acondicionada em dessecador com slica, temperatura ambiente, sendo posteriormente,
triturada e homogeneizada para realizao da extrao.
2.2 Preparo dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis
Amostras de 2 gramas da prpolis triturada e homogeneizada foram transferidas para tubos de ensaio
(25x180mm). Em seguida, foram adicionado 25 ml de etanol a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 95%,
respectivamente, e feita a extrao a 70oC em banho de gua termostatizada por 30 minutos, sob agitao
constante. Aps a extrao, as amostras foram centrifugadas a 8.800 x g por 10 minutos a 20oC. Os
sobrenadantes obtidos foram armazenados em tubos de ensaio (15x160mm) com tampa de rosca, em refrigerador.
Por outro lado, o extrato aquoso de prpolis foi preparado como descrito por MATSUSHIGE et al.[14] Em 2 gramas
da prpolis triturada e homogeneizada, foram adicionados 25 ml de gua deionizada, sendo a mistura incubada por
2 horas a 95oC. Aps a extrao, a mistura foi centrifugada e armazenada nas mesmas condies descritas
anteriormente.
2.3 Determinao do espectro de absoro dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis
Para a determinao do espectro de absoro dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis, alquotas de 25 ml de
cada extrato, obtido de acordo com o item 2.2, foram diludas em 30 ml de etanol 95% e o espectro de absoro
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na regio U.V. das amostras foi determinado na faixa de comprimento de onda entre 200 a 500 nm ("U.V.
scanning") utilizando espectrofotmetro Beckman DU-70.
2.4 Determinao da formao do complexo metal (alumnio)-flavonides nos extratos etanlicos e
aquoso de prpolis
O princpio desta reao baseia-se na formao de quelatos entre o metal (alumnio) e os flavonides,
principalmente os flavonols (3-hidroxiflavonas) como a quercetina, em solues alcolicas, levando a um efeito
batacrmico do espectro de absoro dos flavonides, com alterao da colorao. A mistura de reao consistiu
de 0,5 ml dos respectivos extratos, diludos 1:10, 4,3 ml de etanol 80%, 0,1 ml de nitrato de alumnio 10% e 0,1
ml de acetato de potssio 1 M. Aps 40 minuto de reao o espectro de absoro na regio U.V. das amostras foi
determinado na faixa de comprimento de onda entre 200 a 600 nm ("U.V. scanning") utilizando espectrofotmetro
Beckman DU-70.
2.5 Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa dos extratos etanlicos e
aquoso de prpolis
Para realizao da cromatografia em camada delgada de alta performance, alquotas de 5 ~l dos respectivos
extratos foram aplicados em cromatoplacas (10 x 10 em) RP-1 8 F254-S (Merck Co.). O tempo de desenvolvimento
do cromatograma foi de 100 minutos aproximadamente, utilizando como sistema de solvente etanol 95%:gua
destilada (55:45, v/v). As placas desenvolvidas foram observadas sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda
de 366 nm, utilizando iluminador U.V. Cole Parmer, modelo UVP-UVGL-58.
2.6 Cromatografia lquida de alta eficincia em fase reversa dos extratos etanlicos e aquoso de
prpolis
A anlise quantitativa dos flavonides foi realizada utilizando cromatgrafo lquido Shimadzu modelo LC-10
equipado com coluna de fase reversa YMC PACK ODS-A. A fase mvel utilizada foi metanol: gua deionizada: cido
actico (75:60:5, v/v), com fluxo de 1 mi/minuto e detetor de fotodiodo. A concentrao dos flavonides nos
extratos foi calculado utilizando padres autnticos fornecido pela Extrasynthese A.A. Co., Frana.
2.3 Teste de atividade antimicrobiana dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis em bactrias
patognicas
2.7.1 - Preparo dos discos com extratos de prpolis
Os discos de papel de filtro Whatman no 3 (5 x 1mm de dimetro) foram submersos nos respectivos extratos de
prpolis durante 15 minutos e ento colocados em dessecador com slica temperatura ambiente por 24 horas.
Posteriormente, foram mantidos na estufa a 60oC por 4 horas para eliminao de qualquer resduo etanlico.
2.7.2 - Anlise da atividade antimicrobiana dos extratos de prpolis
A anlise da atividade antimicrobiana dos extratos de prpolis na bactria Gram positiva Staphylococcus aureus
coagulase positiva foi realizada de acordo com o mtodo descrito por BLAIR et al. [6]. Culturas ativas de S. aureus
foram inoculadas por espalhamento com "swabs" estreis em placas de Petri contendo gar nutriente. Os discos
com os extratos foram colocados sobre as placas inoculadas e incubadas a 37oC por 24 horas. A atividade
antimicrobiana foi determinada pela formao de halo inibitrio ao redor dos discos.
2.8 Determinao da atividade antioxidante dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis
A atividade antioxidante foi determinada pela oxidao acoplada do b-caroteno e do cido linolico [10,20, 21]. Em
um balo de fundo redondo, foram adicionados 60 mg de cido linolico, 200 mg de Tween 40 e 5 mg de bcaroteno foram dissolvidos em 5 ml de clorofrmio que, posteriormente, foi retirado utilizando rota-evaporador a
50oC. Aps a remoo do clorofrmio, o resduo foi dissolvido com a adio de 50 ml de gua deionizada e
oxigenada sob vigorosa agitao. Alquotas de 5 ml desta emulso foram transferidas para tubos de ensaio
contendo 0,5 ml dos respectivos extratos de prpolis e a absorbncia foi medida imediatamente em
espectrofotmetro a 470 nm. Os tubos foram incubados a 40oC para a reao de oxidao e a leitura da
absorbncia foi medida em intervalos de 60 minutos.
2.9 Determinao da inibio da atividade da hialuronidase pelos extratos etanlicos e aquoso de
prpolis
A inibio da atividade de hialuronidase foi determinada conforme descrito nas referncias [2] e [22]. A mistura de
reao consistindo de 50 ml dos respectivos extratos de prpolis, 0,5 ml do sal de potssio do cido hialurnico em
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tampo acetato 0,1M, pH 3,6 contendo 0,15 M de NaCl e 50 ml (350 unidades) da enzima hialuronidase (Tipo IVS: obtido de testculo bovino, Sigma Co.), dissolvida no mesmo tampo, foi incubada a 37oC por 40 minutos. Aps
a incubao, 0,1 ml tetraborato de potssio 0,8 M foi adicionado na mistura de reao e novamente incubada em
banho de ebulio por 3 minutos. Em seguida, adicionou-se 3 ml de r -dimetilaminobenzaldeido e a mistura foi
incubada a 37oC por 20 minutos. Finalmente, a absorbncia da mistura foi medida em espectrofotmetro a 585 nm
usando gua como controle.
3 RESULTADOS E DISCUSSO
3.1 Extratos etanlicos e aquoso de prpolis
Os extratos de prpolis foram preparados conforme descrito no item 2.2. Observando os extratos de prpolis
obtidos, verificamos que o extrato aquoso e os extratos etanlicos de 10 a 50% apresentaram uma colorao
amarela, enquanto que o extrato etanlico a 60% aparentava uma colorao amarela-esverdeada. A medida que a
porcentagem de etanol foi aumentando, a colorao esverdeada foi se tomando cada vez mais intensa.
3.2 Espectro de absoro dos extratos de prpolis
Os espectros de absoro dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis esto apresentados na Figura 1. Todas as
amostras exibiram um perfil similar, com mxima absoro a 290 nm. Entretanto, o grau de absoro a 290 nm foi
varivel, dependendo da concentrao de etanol utilizado para extrao. O extrato aquoso de prpolis apresentou a
menor absoro e essa absoro foi aumentando a medida a concentrao de etanol foi elevada at 80%. Os
extratos com 90 e 95% de etanol apresentaram diminuio na absoro a 290 nm. Anteriormente, foi relatado que
o perfil de absoro entre os comprimentos de onda de 270 - 330 um eram atribudos aos flavonides e fenis
[11]. Entretanto, os resultados da Figura 1 indicam que altas concentraes de flavonides foram liberados pela
prpolis quando utilizou uma soluo 80% de etanol como solvente extrator. Por outro lado, a mistura dos extratos
etanlicos de prpolis com nitrato de alumnio e acetato de potssio, muda completamente o espectro de absoro,
com o deslocamento do pico com absoro mxima a 310 um, como apresentado na Figura 2. A mudana na
absoro mxima ocorreu devido a formao de um complexo entre o metal (alumnio) e os flavonides [19]. A
maioria dos flavonides que ocorrem naturalmente, so compostos fenlicos que contem um ou mais grupos odihidroxil e ceto-hidroxi que esto envolvidos na formao do complexo com os metais. A formao do complexo
metal-flavonide induz um deslocamento do pico de absoro mxima do espectro [13]. A Tabela 1 expressa os
valores de absorbncia obtidos a partir dos extratos aquoso e etanlicos de prpolis a 290 um e os mesmos
extratos na presena de nitrato de alumnio e acetato de potssio a 310 nm. Podemos observar que o extrato
etanlico obtido a partir de etanol 80% apresentou maior absorbncia tanto a 290 quanto a 310 nm. Com isso,
conclumos que o extrato etanlico a 80% apresenta maior quantidade de flavonides.
FIGURA 1. Espectro de absoro dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis na faixa entre 200-500 nm. A mistura de
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reao consistiu de 25m l dos respectivos extratos, diludos em 30 ml de etanol 95%.
_______ espectro de absoro do extrato etanlico de prpolis a 80%

- - - - - - - espectro de absoro da mistura do extrato etanlico de prpolis a 80% e AINO3
FIGURA 2. Espectro de absoro do extrato etanlico de prpolis.
TABELA 1. A absorbncia dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis a 290 e 310 nm.
Extrato de Prpolis
Absobncia do extrato de
prpolis a 290 nm
Absobncia do extrato
de prpolis a 310 nm
Exrato aquoso
0.4434
0.4341
10% etanol
0.5115
0.4782
20% etanol
0.5965
0.5471
30% etanol
0.7401
0.7002
40% etanol
1.0575
0.9290
50% etanol
1.7802
1.5637
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60% etanol
2.4668
2.1455
70% etanol
2.6931
2.2860
80% etanol
2.9844
2.7154
90% etanol
2.6334
2.2692
95% etanol
2.5298
2.1980
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TABELA 2. Atividade antimicrobiana dos extratos e etanlicos e aquoso de prpolis sobre Staphylococcus aureus.
Extrato de
Prpolis
Zona de inibio do crescimento microbiano

(mm)
Exrato aquoso
10% etanol
20% etanol
30% etanol
0.5
40% etanol
1.0
50% etanol
1.0
60% etanol
1.5
70% etanol
1.5
80% etanol
1.5
90% etanol
1.0
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95% etanol
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1.0
3.3 Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa

O cromatograma das amostras est apresentado na Figura 3. No extrato aquoso, no foi detectado nenhuma
frao quando a cromatoplaca foi irradiada com luz ultravioleta a 254 um. No entanto, o numero de fraes
aumentou a medida que a concentrao de etanol foi aumentada at 50%, mantendo-se constante mesmo com o
aumento na concentrao de etanol.
FIGURA 3. Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa dos extratos etanlicos e auosos de
prpolis irradiao com luzultra-violeta a 366 nm.
3.4- Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em fase reversa

As anlises em CLAE dos extratos etanlicos e aquoso fora realizadas de acordo como mtodo descrito no item 2.6,
e os resultados esto apresentados na Figura 4. De acordo com o resultado, observamos que no extrato aquoso
no foi detectado picos de flavonides, exceto em quantidades traos de quercetina e pinocembrina. Mas com o
aumento da concentrao do solvente extrator, houve um aumento da quantidade de picos formados. A Figura 5
ilustra a relao entre a concentrao dos flavonides no extrato de prpolis e a porcentagem etanlica dos
extratos. Verificamos que a maioria dos flavonides identificados foram extrados nas porcentagens etanlicas
entre 60 a 80%.
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FIGURA 4. Cromatografia lquada de alta eficincia em fase reversa dos extratos etanlicos e auosos de prpolis.
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FIGURA 5. Relao entre a contrao de flavonides nos extratos etanlicos de prpolis e a porcentagem de etanol
utilizado para extrao.
3.5 Determinao da atividade antimicrobiana

Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos etanlicos e aquoso demonstraram que o extrato aquoso e
os extratos etanlicos de prpolis a 10 e 20% no apresentaram atividade antimicrobiana. Porm, os extratos
etanlicos de prpolis de 30 a 50% apresentaram uma ligeira atividade (zona de inibio de 0,5 mm). Quando
utilizados extratos etanlicos de prpolis de 60 a 80%, a inibio do crescimento microbiano aumentou
consideravelmente (zona de inibio de 1,5 mm), seguido de um decrscimo na atividade antimicrobiana nas
porcentagens mais altas de etanol.
3.6 Determinao da atividade antioxidante
A determinao da atividade antioxidante dos extratos de prpolis foi realizada conforme descrito no item 2.4 e os
resultados esto apresentados na Figura 2. Observamos que todos os extratos apresentaram atividade
antioxidante, no entanto, os extratos de prpolis a 70 e 80% de etanol apresentaram a maior atividade
antioxidante, seguido pelos extratos etanlicos nas concentraes de 90, 60, 50 e 40%, respectivamente. Os
extratos que apresentaram menor atividade antioxidante foram o extrato etanlico a 20% e o extrato aquoso. De
acordo com a literatura, a atividade antioxidante dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis conferida aos
flavonides [10, 20, 21].
3.4 Inibio da atividade de hialuronidase

O efeito dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis sobre a inibio da atividade enzimtica e hialuronidase foi
verificado e os resultados esto apresentados na Figura 7. Foi constatado que o extrato etanlico de prpolis a
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80% apresentou maior inibio da atividade enzimtica quando comparado com os demais extratos. Essa inibio
na atividade foi decrescendo a medida que a concentrao etanlica do solvente extrator foi diminuindo. No extrato
etanlico de prpolis a 10% e no extrato aquoso no foi observado inibio da hialuronidase. Alguns autores
descreveram que a atividade da hialuronidase est relacionada com o processo inflamatrio nos tecidos animais
[15]. Dessa forma, a inibio dessa enzima caracteriza uma atividade antiinflamatria dos extratos de prpolis.
FIGURA 6. Atividade antioxidante dos extratos etanlicos e aquoso de prpolis. A mistura de reao contm 50 m l dos
respectivos extratos de prpolis, exceto no controle e gua e etanol nas diferentes concentraes foi utilizado controle.
FIGURA 7. Inibio da atividade de hialuronidase pelos extratos etanlicos e aquoso de prpolis.
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4 CONCLUSO
Verificamos atravs dos resultados obtidos que existe grande variao na concentrao de flavonides entre
extratos dependendo da concentrao etanlica utilizada para extrao e esse fato, est intimamente relacionado
com a sua atividade biolgica. Observamos que o extrato etanlico a 80% foi a que apresentou os melhores
resultados em todos os testes realizados o que nos leva a concluir que a melhor concentrao para a preparao
dos extratos.
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Recebido para publicao em 26/02/98. Aceito para publicao em 04/09/98.
Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos (UNICAMP), 13081-970, Caixa Postal 6177, Campinas, SP.
CONAP, Cooperativa Nacional de Apicultura, Belo Horizonte, MG.
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Food Science and Technology (Campinas) - ESTUDY OF THE PREPARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS PDF

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Food Science and Technology (Campinas) - ESTUDY OF THE PARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS

Cinc. Tecnol. Aliment. vol. 18 n. 3 Campinas Aug./Oct. 1998

ESTUDO DA PREPARAO DOS EXTRATOS DE

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Yong Kun PARK2,*, Masaharu IKEGAKI2, Jos A. da

A obteno dos extratos etanlicos de prpolis foi feita utilizando gua

reao consistiu de 25m l dos respectivos extratos, diludos em 30 ml de etanol 95%.

_______ espectro de absoro do extrato etanlico de prpolis a 80%

Zona de inibio do crescimento microbiano

3.3 Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa

3.4- Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em fase reversa

3.5 Determinao da atividade antimicrobiana

3.4 Inibio da atividade de hialuronidase

FIGURA 7. Inibio da atividade de hialuronidase pelos extratos etanlicos e aquoso de prpolis.

Recebido para publicao em 26/02/98. Aceito para publicao em 04/09/98.

CONAP, Cooperativa Nacional de Apicultura, Belo Horizonte, MG.

A quem a correspondncia deve ser endereada.

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