Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

Departamento de Biotecnologa

Licenciatura
Ingeniera Bioqumica Industrial

MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE

INGENIERA ENZIMTICA

Dr. Sergio Huerta Ochoa

Depto. Biotecnologa

Prlogo del Manual

Introduccin:
El manual de prcticas del laboratorio es un apoyo didctico para la UEA Optativa
Ingeniera Enzimtica de la licenciatura de Ingeniera Bioqumica Industrial.
Objetivo:
El objetivo general del laboratorio es que el alumno aplique y asimile los fundamentos
cinticos de reacciones enzimticas mediante la determinacin de datos experimentales
obtenidos en laboratorios virtuales utilizando el software comercial Laboratorio de
Enzimas Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software), y el software EnzymeLab, este
ltimo de acceso gratuito para fines didcticos.

Nota: Las prcticas aqu mostradas han sido adaptadas del manual del software
Laboratorio de Enzimas Ver. 6.12S. (Newbyte Educational Software) a los
requerimientos de la UEA Ingeniera Enzimtica

PRCTICA No. 1

Determinacin de la curva de progreso y la velocidad inicial de una

reaccin enzimtica
Introduccin:
La pepsina y la tripsina son enzimas proteasas, lo que indica que descomponen las
molculas de las protenas como parte del proceso digestivo.
La pepsina se encuentra en el estmago. La tripsina es secretada del pncreas al duodeno.
Ambas se liberan en forma de cimgeno inactivo y entran en accin en el estmago y el
lumen del tracto intestinal.

Protena Proteasa
Pptidos
Objetivo:
Mediante la determinacin de la curva de progreso y la velocidad inicial de la reaccin de
dos proteasas, que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad inicial de
reaccin enzimtica y que adquiera un conocimiento cualitativo de cmo la concentracin
de enzima y la de substrato afectan a dichas velocidades.
Procedimiento:
La curva de progreso puede obtenerse detectando la cantidad de sustrato que reacciona
durante el tiempo de reaccin.
1. Escoja Laboratorio de investigacin, haga clic en Restablecer y borre toda la
grfica.
2. Asegrese de que los siguientes datos pre-establecidos estn correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidos
Temperatura
pH

Protena
Tripsina
Pptidos
Ninguno

100
100
0
0
37.0
8.0

Protena
Pepsina
Pptidos
Ninguno

100
50
0
0
37.0
2.0

3. Haga clic en el botn de inicio y preprese para activar el botn de pausa cuando el
experimento haya llegado a 12 minutos.
4. Registre las concentraciones de sustrato y producto en la Tabla
5. Empiece un nuevo experimento haciendo clic en Restablecer.
6. Repita los pasos 3-5 para la pepsina
7. Lleve los niveles de sustrato al Grfico 1 y los de producto al Grfico 2

Resultados:
Tabla 1
Tiempo
(Unidades)

Tripsina
Concentracin
Concentracin
de sustrato
de producto
(Unidades)
(Unidades)

Pepsina
Concentracin
Concentracin
de sustrato
de producto
(Unidades)
(Unidades)

0
1
3
5
10
15
20
30
Diagrame a continuacin los datos de sustrato (Grfico 1) y producto (Grfico 2) de la
Tabla 1 para cada una de las proteasas y calcule la velocidad inicial de la reaccin,
mediante la determinacin de la tangente a la curva de progreso al inicio de la reaccin.
Grfico 1. Curva de progreso
Substrato vs tiempo
100
80
60
40
20
0
0

10

15

20

25

30

Grfico 2. Curva de progreso

Producto vs tiempo
100
80
60
40
20
0
0

10

15

20

25

30

PRCTICA No. 2

Determinacin de parmetros cinticos (KM, Vmax, kcat) de una reaccin

enzimtica
Introduccin:
La catalasa est presente en todas las clulas y en mayor concentracin en el hgado y las
clulas de la sangre. Evita la acumulacin de ciertos perxidos txicos que se forman
durante la respiracin.

2H 2 O2 Catalasa
2 H 2 O + O2
La Catalasa acelera el proceso naturalmente por un factor de 1010.
Objetivo:
Investigar el efecto de la concentracin de perxido de hidrgeno en la velocidad de
reaccin de la enzima catalasa, mediante la determinacin de los parmetros cinticos para
que el alumno aplique y asimile los conceptos de velocidad mxima de reaccin (Vmax),
constante de Michaelis-Menten (KM), y constante cataltica de una reaccin enzimtica
(kcat).
Procedimiento:
La curva de velocidad de reaccin versus concentracin de sustrato puede obtenerse los
parmetros cinticos de la reaccin enzimtica.
1. Escoja Laboratorio de investigacin, haga clic en Restablecer y borre toda la
grfica.
2. Asegrese de que los siguientes datos pre-establecidos estn correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidor
Temperatura
pH

Perxido de hidrgeno
Catalasa
Oxgeno
Ninguno

10-100
15
0
0
37.0
7.0

3. Inicie con una concentracin de sustrato de 10 y haga clic en el botn de inicio y

preprese para activar el botn de pausa cuando el experimento haya llegado a 12
minutos.
4. Registre la velocidad inicial de reaccin en la Tabla 1 a esa concentracin de
sustrato

5. Empiece un nuevo experimento haciendo clic en Restablecer y aumente la

concentracin de sustrato en 10 unidades.
6. Repita los pasos 3-5 hasta llegar a una concentracin de sustrato de 100.
7. Elabore el Grfico 1.
Resultados:
Tabla 1.
Concentracin
de sustrato
(Unidades)

Velocidad
inicial de
reaccin
(Unidades)

0
10
20
30
50
60
80
100
Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 1 (Grfico 1), determine manera grfica y
con un mtodo de regresin lineal el valor de Vmax y KM.
Grafico 1.

Velocidad de reaccin vs concentracin de sustrato

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

PRCTICA No. 3

Determinacin de la constante de inhibicin (Ki) de una reaccin

enzimtica para inhibicin competitiva y no-competitiva
Introduccin:
Las lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.1.3) forman parte de la familia de las hidrolasas
que actan sobre los enlaces steres carboxlicos. El papel fisiolgico de las lipasas es
hidrolizar los triglicridos en diglicridos, monoglicricos, cidos grasos y glicerol. Las
aplicaciones que tienen las lipasas en la industria actual son: fabricacin de detergente, la
industria de la leche y los quesos, panaderas para mejoramiento de sabores, industria de
bebidas, produccin de productos qumicos de inters por medio de enlaces ster,
polimerizacin e incluso se hacen investigaciones para la produccin de biodiesel.
Lipasas
Trigicridos
cidos grasos

Objetivo:
Determinar los parmetros cinticos (KM y Vmax) en presencia y ausencia de un inhibidor
competitivo, para que el alumno aplique y asimile los conceptos de inhibicin de reaccin
enzimtica.
Procedimiento:
La cintica tipo Michaelis-Menten un ausencia y presencia de inhibidor puede obtenerse
determinando la velocidad de reaccin a diferentes concentraciones de sustrato.
1. Escoja Laboratorio de investigacin, haga clic en Restablecer y borre toda la
grfica.
2. Asegrese de que los siguientes datos pre-establecidos en ausencia de inhibidor
estn correctos (Primeras dos columnas)
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidor
Temperatura
pH

Triglicridos 10-100
Lipasa
15
cidos grasos 0
Ninguno
0
40
8.0

Triglicridos 10-100
Enzima
15
cidos grasos 0
Competitivo 20
40
8.0

3. Haga clic en el botn de inicio y preprese para activar el botn de pausa cuando el
experimento haya llegado a 12 minutos.
4. Registre las velocidades de reaccin a diferentes concentraciones de sustrato en la
Tabla
5. Empiece un nuevo experimento haciendo clic en Restablecer.

6. Repita los pasos 3-5 cuando hay inhibidor presente (Columnas 3 y 4)

7. Lleve los datos al Grfico y determine los parmetros cinticos mediante el mtodo
de Lineweaver-Burk (Doble recproca).
8. Determine la constante de Inhibicin (Ki).
Resultados:
Obtenga los datos cinticos de la velocidad de reaccin enzimtica a diferentes
concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de inhibidor.
Tabla 1.
Concentracin
de sustrato
(Unidades)

Velocidad de
reaccin
Sin inhibidor
(Unidades)

Velocidad de
reaccin
Con inhibidor
(Unidades)

0
10
20
30
50
60
80
100
Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 1 (Grfico 1), determine de manera grfica y
con un mtodo de regresin lineal el valor de Vmax y KM.
Grfico 1.

Velocidad de reaccin vs concentracin de

sustrato
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

Determine la constante de inhibicin

40

60

80

100

PRCTICA No. 4

Efecto del pH en una reaccin enzimtica

Introduccin:
La -amilasa (E.C. 3.2.1.1.) puede ser de origen fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano
(B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas. La enzima -amilasa se
encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms en aquel que ha sido parcialmente
germinado. Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena
recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos -1,4; en tanto que la
fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces
glucosdicos 1,6. La -amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la
ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para
formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla
de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de
maltosa. La enzima -amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es
sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0 C por 15
min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la -amilasa
bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70 C conserva un 70% de
su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados.
-amilasa
Almidn
Dextrinas

Objetivo:
Determinar el efecto del pH en la actividad enzimtica.
Procedimiento:
Primero, obtener una cintica tipo Michaelis-Menten para determinar la concentracin de
sustrato ([S] = 25 KM) donde la enzima est en condiciones de saturacin (v Vmax).
1. Escoja Laboratorio de investigacin, haga clic en Restablecer y borre toda la
grfica.
2. Asegrese de que los siguientes datos pre-establecidos estn correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidor
Temperatura
pH

Almidn
-amilasa
Dextrinas
Ninguno

10-100
15
0
0
37
6.5

3. Haga clic en el botn de inicio y deje llevar a cabo la reaccin durante 12 minutos.

4. Registre las velocidades iniciales a los 2 minutos de reaccin a diferentes

concentraciones de sustrato en la Tabla 1.
5. Lleve los datos al Grfico y determine los parmetros cinticos (KM y Vmax)
6. Calcule [S] = 25 KM.
7. Realice experimentos a una concentracin de sustrato de [S] = 25 KM a diferentes
pH iniciales.
8. Registre las velocidades de reaccin a diferentes pH en la Tabla 2
9. Lleve los datos al Grfico 2 y discuta los resultados observados.
Resultados:
Registre los datos cinticos de la velocidad de reaccin enzimtica a diferentes
concentraciones de sustrato.
Tabla 1.
Concentracin de sustrato
(Unidades)
0
10
20
30
50
60
80
100

Velocidad de reaccin
(Unidades)

Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 1 (Grfico 1) y determine el valor de Vmax y

KM.
Grfico 1.

Velocidad de reaccin vs concentracin de

sustrato
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80

100

Registre los datos velocidad de reaccin enzimtica a diferentes pH.

Tabla 2.
pH

Velocidad de reaccin
(Unidades)

3
4
5
6
7
8
9
Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 2 (Grfico 2)
Grfico 2.

Velocidad de reaccin vs pH
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
3

PRCTICA No. 5

Efecto de la temperatura en una reaccin enzimtica

Introduccin:
La maltasa (-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.20) es una enzima que convierte la
maltosa (disacrido) en las dos glucosas de las que est compuesta. Est presente en
intestino delgado, en el borde de cepillo de las vellosidades intestinales. Pertenece a la
familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan de romper los disacridos
en los monosacridos que los forman.

Maltosamaltasa
Glucosa
Objetivo:
Determinar el efecto de la Temperatura en la actividad enzimtica.
Procedimiento:
Primero, obtener una cintica tipo Michaelis-Menten para determinar la concentracin de
sustrato ([S] = 25 KM) donde la enzima est en condiciones de saturacin (v Vmax).
1. Escoja Laboratorio de investigacin, haga clic en Restablecer y borre toda la
grfica.
2. Asegrese de que los siguientes datos pre-establecidos estn correctos
Sustrato
Enzima
Producto
Inhibidor
Temperatura
pH

Maltosa
Maltasa
Glucosa
Ninguno

10-100
15
0
0
37
7.0

3. Haga clic en el botn de inicio y deje llevar a cabo la reaccin durante 12 minutos.
4. Registre las velocidades iniciales a los 2 minutos de reaccin a diferentes
concentraciones de sustrato en la Tabla 1.
5. Lleve los datos al Grfico y determine los parmetros cinticos (KM y Vmax)
6. Calcule [S] = 25 KM.
7. Realice experimentos a una concentracin de sustrato de [S] = 25 KM a diferentes
Temperaturas (20 a 70 C).
8. Registre las velocidades de reaccin a diferentes Temperaturas en la Tabla 2
9. Lleve los datos al Grfico 2 y discuta los resultados observados.
10. Determine la energa de activacin (Ea) de la enzima.

Resultados:
Registre los datos cinticos de la velocidad de reaccin enzimtica a diferentes
concentraciones de sustrato.
Tabla 1.
Concentracin de sustrato
(Unidades)
0
10
20
30
50
60
80
100

Velocidad de reaccin
(Unidades)

Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 1 (Grfico 1) y determine el valor de Vmax y

KM.

Grfico 1.

Velocidad de reaccin vs concentracin de

sustrato
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80

100

Registre los datos velocidad de reaccin enzimtica a diferentes Temperaturas.

Tabla 2.
Temperatura
(C)
20
25
30
35
40
45
50
60
70

Velocidad de reaccin
(Unidades)

Diagrame a continuacin los datos de la Tabla 2 (Grfico 2)

Grfico 2.

Velocidad de reaccin vs Temperatura

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
30

35

40

Determine la Energa de Activacin (Ea).

45

50

55

60