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DNA
pode
ento
LIGASES
complementares.
Figura 4: Reao de ligao promovida pela T4 DNA ligase. Em
negrito, os nucleotdeos que foram unidos por ligao fosfodister
promovida pela ligase.
VETORES
A obteno de vrias cpias idnticas de uma extenso definida
de DNA, pode ser feita de vrias formas. Uma maneira introduzir o
DNA a ser copiado em uma bactria que se divide rapidamente; cada
vez que a bactria replica o seu prprio DNA, ela tambm copia o
DNA introduzido.
Para manter o DNA estranho na clula bacteriana, um plasmdeo
bacteriano utilizado como carreador ou vetor. Os plasmdeos
normalmente utilizados para a clonagem de genes so molculas de
DNA circular que se encontram separadas do DNA cromossmico da
clula. Este DNA circular geralmente ocorre naturalmente em clulas
bacterianas e leveduras. Ele geralmente representa uma pequena
frao do DNA total da clula hospedeira, mas que pode ser
facilmente separado devido seu pequeno tamanho. Como o DNA
cromossomal, o plasmdeo tambm replicado durante a diviso
celular, mas de forma independente do cromossomo, garantindo a
propagao do mesmo atravs das geraes da clula. Alm disso, o
vetor plasmidial tambm possui stios de corte para a ao das
A
origem 2:
de Principais
replicaoantibiticos
autnoma utilizados
ou ori o
stio agentes
em queseletivos
se iniciae aa
Tabela
como
concentrao
final
utilizada.
replicao do DNA, podendo se replicar independentemente da
replicao bacteriana e produzir milhares de cpias do plasmdeo
dentro da clula hospedeira. A replicao dos plasmdeos pode ser
sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo nmero de
cpias, ou ser independente do ciclo da clula hospedeira, permitindo
a proliferao de centenas de cpias por clula. O stio mltiplo de
clonagem ou polylinker um stio de clivagem de endonucleases de
restrio no qual inserido um fragmento de DNA de interesse sem
interferir na funcionalidade do plasmdeo.
TRANSFORMAO CELULAR
O processo de transformao consiste na introduo de um DNA
exgeno em clulas hospedeiras, que podem ser: bactrias,
leveduras, fungos filamentosos, clulas vegetais e clulas de
mamferos. A clula mais comumente utilizada a clula bacteriana
de Escherichia coli. O processo de transformao bacteriana utilizada
na Biologia Molecular ocorre in vitro, e pode ser afetado pelo tamanho
e conformao da molcula de DNA a ser introduzida na clula.
Plasmdeos pequenos incorporam-se mais facilmente clula
bacteriana competente. A transformao bacteriana utilizada para a
preparao de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleo de
clones recombinantes. A atrao do DNA pelas clulas bacterianas,
em condies naturais, um evento muito raro, devido ocorrncia
da repulso eletrosttica entre as cargas negativas dos fosfolpideos