Universidade de vora

Escola de Cincias e Tecnologias

BIOQUMICA DOS CIDOS NUCLEICOS

5SEMESTRE

Licenciatura em Bioqumica
2013/2014

............................................................................................................................. 3
................................................................................................................................. 4
.......................................................................................................................... 6
3.1.

........................................................................................................................ 6

3.1.1.

....................................................................................................... 6

3.1.2.

.................................................................... 6

3.1.3

.............................................................................. 7

3.1.4.

............................................................................... 7

3.1.5.

............................................................................................................ 7

3.2.

....................................................................................... 9

1.

Obteno do Material Biolgico .................................................................................. 9

2.

Produo de Maas Transgnicas ................................................................................ 9

3.

Preparao das Amostras de Mas .......................................................................... 12

4.

Extrao dos compostos fenlicos das mas transgnicas ..................................... 13

5.

Identificao dos Compostos Fenlicos por LC-MS ................................................... 13

6.

Quantificao dos Compostos Fenlicos pelo Mtodo de HPLC .............................. 14

7.

Atividade Antioxidante dos Extratos de Maas......................................................... 14

8.

Experincias Nutricionais em Ratos de Laboratrio ................................................. 15

9.

Parmetros Hematolgicos, Bioqumicos e Imunolgicos do Sangue dos Ratos ..... 15

3.3.

................................................................................................. 16

3.3.1.

........................................................................................................... 16

3.3.2.

................................................................................................................... 16

3.3.3.

..................................................................... 17
.................................................................................... 18
............................................................................................................. 19
......................................................................... 19
......................................................................................... 20
................................................................................................... 21

1|Pgina

............................................................................................. 21
............................................................................................................................ 21
............................................................................................... 22
........................................................................................... 22
..................................................................................................................... 23
............................................................................................ 24
.............................................................................................. 24
............................................................................. 24
................................................................................................... 25
......................................................................................................................... 25
............................................................................. 26
.................................................................................... 27

Figura 1-Reao do DNA polimerase em PCR, quando na presena de DNA, primers e

nucletidos. ................................................................................................................................. 19
Figura 2-Desnaturao trmica, correspondendo primeira etapa do ciclo ao qual ocorre
separao da dupla cadeia de DNA. ............................................................................................ 22
Figura 3-Hibridao ou Annealing, correspondendo segunda etapa do ciclo, qual ocorre,
por complementaridade a definio do segmento a amplificar. ................................................ 22
Figura 4-Extenso, correspondendo terceira etapa do ciclo ao qual se verifica o
prolongamento das cadeias pela DNA polimerase de acordo com a complementaridade das
bases............................................................................................................................................ 23
Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA idnticas original, resultado da
amplificao. ............................................................................................................................... 23
Figura 6-Termociclo, equipamento capaz de amplificar de forma automatizada sequncias de
DNA. ............................................................................................................................................ 24

Tabela 1-Caracterizao dos reagentes qumicos envolvidos. .................................................... 7

Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo. ................................................................ 12
Tabela 3-Lista de reagentes e oramento correspondente, com e sem o IVA aplicado taxa
atual............................................................................................................................................. 18

2|Pgina

Os antioxidantes so molculas que podem reagir em segurana com os radicais

livres, de modo a neutralizar ou terminar as reaces em cadeia que levam danificao
de molculas essenciais para o ser humano. Os radicais livres so responsveis por
inmeras doenas, sendo que se encontra comprovado que os antioxidantes ajudam a
prevenir e at a combater estas doenas. Dentro das doenas que os antioxidantes
ajudam a prevenir de destacar o cancro (de vrios tipos), a arteriosclerose, doenas
cardacas, a doena de Alzheimer, diabetes, artrite reumatide, entre muitas outras. Os
antioxidantes podem encontrar-se em vrios alimentos, como as mas, batatas,
tomates, entre muitos outros. Dentro dos antioxidantes que se encontram presentes nos
alimentos, encontram-se os compostos fenlicos antioxidantes, como os cidos
fenlicos e os flavonides, que, nas plantas, so produzidas pela via metablica
fenilpropanoide. A biossntese dos compostos fenlicos depende essencialmente de trs
enzimas: chalcona sintase (CHS), chalcona isomerase (CHI) e dihidroflavonol redutase
(DFR). Estudos comprovam que altos nveis de antioxidantes na dieta podem proteger
contra danos oxidativos ao organismo, sendo que os compostos fenlicos tambm so
de grande importncia na proteco das plantas contras ameaas biticas e abiticas,
aumentando a produtividade das plantas.
As mas (Malus domestica) so frutos comuns, que fazem parte da dieta de
grande parte da populao do planeta, estando comprovado que so alimentos ricos em
antioxidantes. Devido ao seu elevado teor em antioxidantes, as mas podem ser muito
vantajosas para a sade humana, sendo que h um ditado antigo, an apple a day keeps
the doctor away - uma ma por dia mantm o doutor afastado. Embora as mas j
apresentem elevados teores em antioxidantes, a manipulao gentica das mesmas, de
modo a se tentar sobreexpressar as enzimas acima referidas, pode levar a um aumento
da sua capacidade antioxidante, fazendo com as mas sejam uma fonte nutritiva mais
eficiente, e ainda ajudar a proteger as prprias macieiras contra ameaas, garantindo
uma melhor produtividade das rvores. Existem vrias variedades de mas, sendo que
cada uma delas apresenta diferentes nveis de compostos fenlicos e, por sua vez, de
antioxidantes, sendo que com este estudo se pode transformar mas com mais baixos
3|Pgina

teores fenlicos, em alimentos mais ricos em antioxidantes e, assim, mais benficos

para a sade.

Gerais: Produo de mas transgnicas, para sobreexpresso de antioxidantes,

e avaliao da sua eficcia como fontes nutritivas mais eficientes.

Especficos:
o Conhecer:

Os Termos: promotores, terminadores, genes, enzimas de

restrio, plantas transgnicas,

O Enunciado: Etapas envolvidas no PCR,

Os

Conceitos:

Desnaturao,

Hibridao,

Transgnese,

organismos geneticamente modificados, transgnicos;

Os Compostos: que no interferem com as propriedades fsicas

dos nossos frutos e podem ser utilizados durante o procedimento
para a produo das plantas transgnicas, sem alterar as
propriedades antioxidantes;

O Procedimento Experimental: que leva montagem dos

mtodos necessrios realizao do objetivo: produo de mas
transgnicas, para sobreexpresso de antioxidantes; e avaliao
da actividade antioxidante de modo s mas serem fontes
nutritivas mais eficientes.

o Compreender:

Processo de produo envolvida na transformao das mas;

O funcionamento de um termociclo;

o Aplicar:

Conhecimentos adquiridos em segurana de laboratrio;

Uso correcto de material de laboratrio.

4|Pgina

o Executar:

A produo dos cinco tipos de mas transgnicas, com recurso

aos promotores e vectores adequados;

O PCR e o Northern Blot, para seleccionar as plantas

transgnicas, nas condies adequadas;

A extraco, identificao e quantificao dos compostos

fenlicos, nas condies adequadas;

As experincias nutricionais em ratos de laboratrio e s

respectivas anlises resultantes;

o Dar Valor:

Agrobacterium como meio simples de criao de plantas

transgnicas;

Ao PCR como tcnica de amplificao;

Ao uso de controlos, negativos e positivos, na realizao do PCR;

Aos ciclos de temperatura utilizados durante a realizao do

PCR;

electroforese como tcnica suplementar de anlise dos

resultados obtidos;

Aos

mtodos

utilizados

na

extraco,

identificao

quantificao dos compostos fenlicos;

Aos resultados obtidos pelas experincias nutricionais em ratos

de laboratrios;

5|Pgina

3.1.

Produo de mas transgnicas para sobreexpresso de CHI, CHS e DFR,

responsveis pela sobreexpresso de antioxidantes.

Avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas produzidas.

Verificao do uso das mas transgnicas, com uma maior sobrexpresso de

antioxidantes, como fonte nutritiva mais eficiente, em ratos de laboratrio.

3.1.1.

Mas de trs variedades diferentes: Fuji (as que possuem maior quantidade de
antioxidantes); Gala (das mas mais comuns, encontrando-se no meio da
tabela de teores em antioxidantes); e as Empire (mas produzidas inicialmente
a partir de clonagem, sendo as que apresentam menor quantidade de
antioxidantes).

3.1.2.

Tipo CHS, com sobreexpresso de chalcona sintase (base de dados

EMBL/GenBank, nmero de acesso X58339);

Tipo CHI, com sobreexpresso de cDNA de Petunia hybrida, codificando

chalcona isomerase (base de dados EMBL/GenBank, nmero de acesso
X14589);

Tipo DFR, com sobreexpresso de cDNA de P. hybrida, codificando

dihidroflavonol 4-redutase (base de dados EMBL/GenBank, nmero de acesso
X15537);

Tipo W95, com sobreexpresso de CHI e DFR;

Tipo W92, com sobreexpresso dos trs cDNA de cevada e petnia.

6|Pgina

3.1.3
Aqui apresentam-se os reagentes qumicos que apresentam mais cuidado no seu
manuseamento e quais os cuidados a ter no mesmo.
Reagente
Brometo de
etdeo

Azoto
lquido

Catamina

Caracterizao/Observao
Usado como agente intercalante usado como marcador de cidos
nucleicos. Deve ser usado luvas no seu manuseamento, pois
mutagnico.
Cuidado para o lquido no entrar em contacto directo com a pele, pois
pode levar ao seu congelamento. O vapor libertado no tem qualquer
efeito na pele.
Trata-se de um anestsico utilizado essencialmente em animais. Devese ter cuidado no seu manuseamento, evitando a sua inalao.

Tabela 1-Caracterizao dos reagentes qumicos envolvidos.

3.1.4.
Este trabalho cientfico encontra-se dividido em duas partes: a produo das
mas transgnicas; e a avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas.
A produo das mas transgnicas deve ser realizado num laboratrio onde se
tenha acesso ao material necessrio, sendo que este deve encontrar-se num clima
temperado, com os terrenos adequados para a plantao das macieiras transgnicas. A
plantao das mas pode ser feito fora do mbito do laboratrio, caso no estejam
disponveis os terrenos precisos para este efeito, sendo que neste caso preciso fazer
um seguimento detalhado da maturao e crescimento das macieiras transgnicas.
A avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas deve ser
realizado num laboratrio com as devidas condies de segurana, onde esteja
disponvel ou se tenha acesso a tudo o equipamento e material necessrio. O laboratrio
onde se procede ao estudo da avaliao da capacidade antioxidante das mas
transgnicas, pode ser o mesmo onde se procede produo das mas transgnicas,
desde que apresente as devidas condies.

3.1.5.
Este projecto um trabalho que consiste em duas partes: a produo de plantas
transgnicas e a avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas em ratos
7|Pgina

de laboratrio. A primeira parte tem meses estipulados, pois as macieiras tm pocas

para plantao e colheita.
Primeiro apresenta-se o calendrio que necessrio respeitar para a produo
das maceiras transgnicas.

Jan

Fev

Mar

Abril

Maio

Jun

Julho

Agosto

Setem

Out

Novem

Dezem

Pesquisa bibliogrfica
Produo das plantas transgnicas em laboratrio
Plantao das macieiras transgnicas

As macieiras devem crescer durante 2 anos antes da colheita das primeiras

amostras. Aps passado esse tempo, pode-se proceder colheita das amostras de mas
transgnicas das vrias variedades, cada uma na sua poca apropriada (apresentada na
calendarizao seguinte), que se encontrem em estados de maturao semelhantes.
De seguida, encontra-se uma possvel calendarizao para a segunda parte do
trabalho, avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas em ratos de
laboratrio.

Agosto

Setem

Out

Novem

Dezem

Jan

Fev

Mar

Abril

Maio

Junho

Julho

Pesquisa bibliogrfica
Colher e preparar amostras de mas Gala.
Colher e preparar amostras de mas Fuji e Empire.
Extrao dos componentes fenlicos das mas
Identificao dos compostos fenlicos pro LC-MS
Quantificao dos compostos fenlicos por
HPLC
Atividade antioxidante dos extractos
de mas
Experincias nutricionais em ratos de laboratrio
Parmetros hematolgico, bioqumicos e imunolgicos do sangue do rato
Realizao do artigo
Durante o perodo de investigao iro ser entregues relatrios mensais entidade reguladora da
investigao.

8|Pgina

3.2.
Nota I: Vo ser avaliadas a sobreexpresso de antioxidantes de trs variedades de
mas diferentes, Fuji, Gala e Empire, que apresentam caractersticas semelhantes, no
entanto, as suas conhecidas propriedades fenlicas so diferentes.

1. Obteno do Material Biolgico

1.1. Obter amostras dos trs tipos de mas a estudar, Fuji, Gala e Empire, que se
encontrem em estados de maturao semelhantes e ainda possuam folhas, sendo
que umas vo ser usadas como controlo e outras vo ser transformadas em
plantas transgnicas (procedimento apresentado no ponto 2.
1.2. Crescer as mas de controlo (que no so transgnicas) e as mas
transgnicas, num clima temperado, onde as maas estejam expostas a, pelo
menos, 6 horas de luz solar por dia, num local com bom escoamento de gua.
1.3. Deixar as maceiras crescerem pelo menos dois anos, antes de comear o estudo.
1.4. Quando as mas se encontrarem em estado de maturaes semelhantes,
recolher pelo menos 10 amostras de cada um dos trs tipos de mas a estudar,
de vrias rvores diferentes, sem misturar as amostras obtidas de rvores
diferentes.

2. Produo de Maas Transgnicas

Nota II: Neste estudo, so utilizados cinco tipos de plantas transgnicas, produzidas do
mesmo modo, mas com genes diferentes: tipo CHS, sobreexpresso de cDNA de cevada
codificando chalcona sintase (base de dados EMBL/GenBank, nmero de acesso
X58339); tipo CHI, sobreexpresso de cDNA de Petunia hybrida codificando chalcona
isomerase (base de dados EMBL/GenBank, nmero de acesso X14589); tipo DFR,
sobreexpresso de cDNA de P. hybrida codificando dihidroflavonol 4-redutase (base de
dados EMBL/GenBank, nmero de acesso X15537); tipo W95, sobreexpresso de CHI
e DFR; e, por ltimo, tipo W92, sobreexpresso dos trs cDNAs de cevada e petnia.
2.1. Construir os vetores construtores (plasmdeo), usando um vetor pBin, contendo
o respectivo cDNA, e orientado no sentido, sobre o controlo do promotor 35S e

9|Pgina

do terminador OCS, como apresentado na figura 1. Para as plantas controlo

utilizar um vetor vazio.
Figura 1. Representao esquemtica dos vectores utilizados para a preparao de mas
transgnicas. (a) CHS; (b) CHI; (c) DFR; (d) W95, construtor de dois genes (CHI e DFR); (e) W92,
construtor de trs genes (CHS, CHI, DFR).

2.2. Inserir o vetor na Agrobacterium tumefaciens, estirpe C58C1:pGV2260, para

cada um dos cinco tipos de planta transgnica, do seguinte modo:
2.2.1. Colocar o plasmdeo (vetor criado no passo anterior) em contacto com as
clulas de Agrobacterium.
2.2.2. Acoplar a gene resistente ao antibitico canamicina, para promover a
insero do plasmdeo nas clulas de Agrobacterium.
2.2.3. Verificar a integridade do plasmdeo por anlise com enzimas de
restrio.
2.3. Danificar as folhas da ma, por exemplo, procedendo ao seu corte, e colocar
em contacto com as clulas de Agrobacterium, agora j contendo o plasmdeo
desejado.
2.4. Aguardar cerca de 10 minutos.
Nota III: 10 minutos deve ser suficiente para a Agrobacterium integrar o seu DNA nas
clulas expostas das folhas de ma. Caso ache necessrio, pode esperar mais um
pouco.
2.5. Retirar as folhas e cresce-las num meio indutor de callus (meio contendo
antibitico).
Nota IV: As nicas clulas que vo crescer no meio contendo antibitico so as clulas
transformadas que contem os genes resistentes ao antibitico e o gene de interesse.
2.6. Transferir para um meio de regenerao, de modo a regenerar as folhas
danificadas anteriormente.

10 | P g i n a

Nota V: Caso a variedade de ma a estudar no seja susceptvel integrao do DNA

por Agrobacterium, pode-se utilizar um mtodo alternativo, Biobalstica, que dispara
pequenas partculas douradas, que esto cobertas de DNA, para a planta, podendo levar
a obteno de clulas integradas.
2.7. As clulas indiferenciadas, comeam-se a diferenciar e obtm-se folhas e at
haste.
Nota VI: Pode ajudar-se diferenciao mais rpida das folhas e das hastes, por adio
de hormonas, como, por exemplo, citoquina, que ajuda a planta a crescer e as folhagens
a alongar, e auxina, que ajuda as razes a crescer.
2.8. Enxertar as folhas ou hastes transgnicas obtidas num porta-enxerto de
macieira.
Nota VII: Proceder de modo semelhantes para os cinco tipos de plantas de mas
transgnicas, referidas na nota II, com os respectivos genes, e para as trs variedades de
mas estudadas.
2.9. Proceder a anlise por PCR de modo a pr-seleccionar as plantas transgnicas,
usando gene neomicina fosfotransferase (npt II) como marcador e usando
primers especficos para o gene resistente canamicina, do seguinte modo:
2.9.1. Extrair o DNA genmico de folhas in vitro usando DNeasy Plant Mini
Kit (Qiagen, Hiden, Germany), de acordo com as recomendaes do
fabricante.
2.9.2. Preparar uma mistura de reaco com um volume final de 25 l, com os
seguintes constituintes: Tampo de PCR (contendo MgCl2) 10x, com uma
concentrao de 1x; dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) numa
concentrao

final

de

200

mol/L;

CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3)

Primer
Primer

Forward

(5-

Reverse

(5-

CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3), ambos com uma concentrao

final de 0,40 mol/L; AmpliTaq Gold DNA Polymerase, numa
concentrao final de 2,0 UI; e 5 L DNA Template.
2.9.3. Preparar, pelo menos, um controlo negativo, que no possua o gene que
se deseja detectar, e dois controlos positivos, que possuam o gene que se
deseja detectar, de modo a garantir que no ocorreu nenhum erro.
2.9.4. Seguir os ciclos de temperatura, de acordo com a seguinte tabela:

11 | P g i n a

Fase

Temperatura

Tempo

N de ciclos

Ativao/Desnaturao inicial

95C

1 minuto

Desnaturao

95C

25 segundos

Anelao

60C

30 segundos

Extenso

72C

45 segundos

Extenso Final

72C

4,20 minutos

35

Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo.

Nota VIII: Se necessrio guardar o produto final do PCR a 4C.

2.9.5. Visualizar os fragmentos obtidos por PCR em gel de agarose 1% (p/v),
preparado com TBE e brometo de etdeo. Iniciar a electroforese a uma
diferena de potencial constante de 80 V, durante 2-2,5h. Visualizar num
transluminador de UV.
2.10.

Finalmente seleccionar as plantas transgnicas por anlise Northern blot,

do seguinte modo:
2.10.1. Preparar o RNA total a partir das folhas de rvores novas, usando o
mtodo de hidroclorato de guanidina.
2.10.2. Submeter os fragmentos de RNA obtido anteriormente, a electroforese
em gel de agarose (1,5% (p/v) agarose, 15% (v/v) formaldedo).
2.10.3. Transferir o RNA para membranas de nylon.
2.10.4. Remover os filtros e lava-los com trs vezes com 0,1x SSC e 0,1% SDS,
durante 30 minutos a 65C.
2.10.5. Hibridizar as membranas de nylon durante a noite, a 42C, com sondas de
cDNA marcadas radioactivamente.
2.10.6. Proceder a autoradiografia, de modo a verificar os resultados obtidos.
2.11. Deixar crescer as macieiras transgnicas seleccionadas, pelo menos, dois anos,
antes de proceder colheita das mas para se comear o estudo (como foi
indicado no ponto 1).

3. Preparao das Amostras de Mas

Nota IX: Este procedimento deve ser feito para as mas de controlo e as transgnicas.
3.1. Pelar 10 mas, de cada tipo, com um pelador prprio, obtendo-se peles com 12 mm de espessura.
3.2. Guardar as peles e a polpa separadamente, aps pesagem.
12 | P g i n a

3.3. Moer, desfazendo completamente, as peles e a polpa das mas, separadamente,

num almofariz, com recurso a azoto lquido.
3.4. Transferir as amostras modas para uma proveta com 70% de metanol aquoso,
com um rcio de 1:1 (p/v).
3.5. Homogeneizar a mistura usando um misturador de Polytron.
3.6. Filtrar inicialmente atravs de um papel de filtro de Whatman n1, sob vcuo.
3.7. Filtrar novamente atravs de um filtro seringa Acrodisc 0,45m.
3.8. Guardar o filtrado final a -20C, at posterior uso.

4. Extrao dos compostos fenlicos das mas transgnicas

4.1. Pesar 1g de filtrado seco para um tubo de ensaio.
4.2. Adicional 20 mL de 80% de metanol aquoso e 1% de HCl e agitar a suspenso
com cuidado.
4.3. Proceder a ultra-sons, dos tubos duas vezes durante 15 minutos.
4.4. Deixar os tubos temperatura ambiente (20C), durante 24h, na escurido.
4.5. Centrifugar o extrato durante 10 minutos, a 20.878g.
4.6. Recolher os sobrenadantes e guardar a 4C, para ser utilizado dentro de 24
horas.

5. Identificao dos Compostos Fenlicos por LC-MS

Nota X: A identificao dos compostos fenlicos dos extractos de mas foi feita
usando um sistema LC-MS, consistindo em um mdulo de separao de um
cromatgrafo liquido de alta-eficincia (HPLC) Waters gradiente 2690, detector de
absorvncia ultravioleta-visvel (UV-Vis) com sistema de dodos 996, e um
espectrmetro de massa quadrupole, equipado com uma fonte de ionizao (ESI)
eletrospray ZQ-spray.
5.1. Proceder separao numa coluna Symmetry C18 de 5m a 20C.
Nota XI: A fase mvel composta pelo solvente A (10% de cido frmico) e pelo
solvente B (100% de metanol).
5.2. Eluir a coluna inicialmente isocraticamente com 85% de eluente A (0-1 min) e
depois eluir com um gradiente linear durante 41 minutos, baixando eluente A
at 0%.
5.3. Entre os 42 e 51 minutos, continuar a diminuir para 0% o eluente A.
13 | P g i n a

5.4. Utilizar uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, a temperatura do capilar a 300C, o
gs de revestimento e o gs de auxiliar a 50 e 5 unidades, respectivamente, e a
voltagem a 3 kV para ionizao negativa e 0,1 kV para ionizao positiva.
5.5. Proceder anlise usando um scan MS de m/z de 100 a 1000.

6. Quantificao dos Compostos Fenlicos pelo Mtodo de HPLC

Nota XII: A anlise foi realizada numa coluna cromatogrfica liquida Merck-Hitachi L7455, com um detector de dodo array (DAD) e uma bomba quaternria L-7100,
equipada com um sistema de libertao multisolvente D-7000 e amostrador L-7200.
6.1. Proceder separao numa coluna Phenomenex Synergi Fusion RP-80 150 x
4.6 mm (4 m), com uma fase mvel composta por solvente A (2,5% cido
actico) e solvente B (acetonitrilo), e o forno a uma temperatura de 30C.
6.2. Correr o programa inicialmente com um gradiente linear de 0% do eluente B,
at ao final de 36 minutos se ter 25% de eluente B, a uma taxa de fluxo de 1.0
mL/min.
6.3. Seguidamente lavar e recondicionar a coluna.
6.4. Seguir os seguintes comprimentos de onda: 280 nm para os flavonides e as
dihidrichalconas, 320 nm para as hidroxicinamates, 360 nm para os glicosdeos
flavonides e 520 nm para as antocianinas.
6.5. Obter curvas de calibrao, usando epicatequina, catequina, quarcetina-3-Orhamnoside, cido clorognico, floretina-2-O-glucsido e procianidina B2, C1
e B1 como padres.

7. Atividade Antioxidante dos Extratos de Maas

7.1. Extrair 150 mg da polpa e das peles, separadamente, das mas com 0,1% de
HCl em soluo de metanol.
7.2. Diluir o extrato numa gama de 25000 e 35000 vezes, com gua.
7.3. Analisar utilizando um mtodo quimiluminescente.
7.4. Realizar as experincias num volume final de 250 L, contendo Tris-HCl 0,1M
(pH 9.0) e dihidrocloreto 2,2-azobis (AAPH).
7.5. Injetar a soluo de luminol (100 M) e os extractos diludos.
7.6. Contar os protes produzidos na reaco com um luminmetro microplaca
EG&G Berthold LB96P, a 30C.
14 | P g i n a

Nota XIII: O potencial antioxidante definido como a quantidade de estrato de ma

que inibe quimiluminescncia luminal por 50% e expresso como o IC50.

8. Experincias Nutricionais em Ratos de Laboratrio

Nota XIV: Este estudo deve ser feito de modo a verificar se as mas transgnicas
apresentam uma maior eficincia como fonte nutritiva. Realizar com ratos machos com
peso mdio de 220g, mantidos em jaulas individuais (com controlo de comida ingerida),
numa sala com temperatura constante de 21C, humidade de 60% e em ciclos de 12h de
luz/escurido.
8.1. Alimentar os ratos ad libitum com uma dieta contendo 30% das mas
transgnicas cozidas e secas, cada grupo consumindo a sua variedade, e um
grupo controlo, suplementada com uma mistura de minerais de 3,5%.
8.2. Pesar e registar o peso dos animais uma vez por semana e verificar a sua
situao de sade todos os dias.
8.3. Aps terminar a experiencia de alimentao, manter os ratos em jejum durante
12 horas.
8.4. Pesar os ratos e sacrifica-los com uma overdose de cetamina (50 mg.kg-1 bw).
8.5. Recolher o sangue do corao para posterior anlise e preparar e pesar os
seguintes rgos: crebro, fgado, intestino delgado, rins e corao.
8.6. Congelar e guardar o fgado e o crebro a uma temperatura de -70C at
posterior anlise qumica.
8.7. Recolher as fezes durante os sete dias da experiencia de digestibilidade.
8.8. Congelar as fezes e secar a 60. Aps retirar o cabelo presente, triturar e analisar
quimicamente segundo o mtodo AOAC.

9. Parmetros Hematolgicos, Bioqumicos e Imunolgicos do Sangue

dos Ratos
9.1. Proceder a anlise morfolgica do sangue em tubos contendo anticoagulantes
(EDTA) e com mtodos padres de laboratrio usando um analisador
hematolgico ABACUS, Diatron.
9.2. Para proceder a anlise bioqumica e imunolgica, centrifugar o sangue a 4500
rpm, durante 10 minutos.
9.3. Congelar e guardar o soro a -70C.
15 | P g i n a

9.4. Analisar

os

parmetros

bioqumicos

no

soro

sanguneo

espectrofotometricamente usando um analisador Vitros, sistema Ektachem DT60-II com um mdulo DT, DTE e DTSC, com recurso coleco Johnson &
Johnson Clinical Diagnostics.
9.5. Determinar as concentraes de IgE, IgA, IgM e IgG no soro sanguneo, usando
um mtodo quimiluminescente, com um analisador Immulete 2000.
9.6. Analisar a concentrao de soro IL-4 com o mtodo de ELISA.
9.7. Analisar os resultados de modo a determinar os resultados obtidos.

3.3.
3.3.1.

Vortex;

Termociclo;

Tina de electroforese horizontal e respectivas fontes de energia;

Transluminador de UV;

Equipamento para Northern Blot;

Autoradiografia;

Misturador de Polytron;

Sistema de vcuo;

Ultra-sons;

Centrifugadora;

Equipamento de LC-MS;

Sistema de HPLC;

Espectrofotmetro;

Balana analtica;

Ultracongelador.

3.3.2.

Placas de Petri;

Erlenmeyers;
16 | P g i n a

Bisturi ou faca;

Micropipetas e respectivas pontas;

Eppendorfs;

Varetas;

Membranas de nylon;

Pinas;

Sondas de cDNA marcadas radioactivamente;

Filtros;

Pelador ou faca;

Almofariz;

Provetas;

Filtro de papel Whatman n1;

Filtro seringa Acrodisc 0,45m;

Tubos de ensaio;

Pipetas de Pasteur;

Cuvetes;

Materiais necessrios para proceder ao sacrifcio dos animais;

Seringas.

3.3.3.

1Kit
25ml
1 Set
1Set

Pureza
(%)
---------

Entidade
Fornecedora
Qiagen
Sigma
Sigma
Sigma

Preo
()
129,17
291,17
38,13
38,13

100ml

---

Greener

69,65

1 Kit
100g
500g
100g
250g
10 ml
2UMOL
100g

--------99,8
----98

TaqMan
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma

279,46
174,94
35,28
14,52
81,79
39,02
104,00
48,20

Quantidade
DNeasy Plant Mini Kit
Tampo de PCR
Primer Forward
Primer Reverse
AmpliTaq Gold DNA
Polymerase
DNA Template
Agarose 1%
cido brico
EDTA
Tris
Brometo de etdeo
dNTPs
MgCl2

17 | P g i n a

TBE
Formaldedo
SSC
SDS
Metanol
HCL
cido frmico
cido actico
Acetonitrilo
AAPH
Luminol
Cetamina

250g
25mL
1L
25g
1L
100mL
100mL
500mL
100mL
25g
5g
10mL

98
----98,5
99,9
36,5-38
95
99,7
99,8
97
97
---

Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma
Fluka
Sigma
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Aldrich
Sigma
Sigma
Total
(sem IVA)
Total
(com IVA)

33,30
26,30
68,80
37,40
57,80
50,70
34,20
51,30
54,00
35,00
69,10
85,90
1947,16
2395,00

Tabela 3-Lista de reagentes e oramento correspondente, com e sem o IVA aplicado taxa atual.

Prope-se financiamento deste projecto cientfico Fundao da Cincia e

Tecnologia (FCT), no mbito da rea Bioengenharia, Biotecnologia e Bioqumica.
Neste projecto desejado produzir plantas transgnicas, mais especificamente, mas de
trs variedades diferentes, de modo a provocar a sobreexpresso de antioxidantes. Os
antioxidantes so molculas que se ligam aos radicais livres presentes no organismo,
ajudando a prevenir e a combater vrias doenas, como o cancro, doenas cardacas,
osteoporose, entre muitas outras. Aqui proposto a manipulao gentica das mas, de
modo a se obter uma ma com um maior contedo em antioxidantes, com vista a estas
serem uma fonte nutritiva mais eficiente, sendo que a manipulao gentica tambm
ajuda a proteger as plantas contra ameaas externas. Este estudo pode ser usado para
transformar um fruto de consumo relativamente comum, numa fonte nutritiva mais
eficiente, para um melhor efeito para a sade humana.

18 | P g i n a

A reao da polimerase em cadeia corresponde

a um mtodo de amplificao e deteno de
sequncias de DNA, possibilitando a obteno de
mltiplas cpias, num processo rpido, simples e
automatizado, sem o recurso a um organismo vivo.
Este mtodo baseia-se na utilizao da capacidade do
DNA polimerase (figura 1) em formar polmeros de
nucletidos pela adio destes a uma extremidade 3OH iniciadora (primer), permitindo assim a sntese de
uma cadeia de DNA complementar a uma cadeia
molde. A possibilidade de delinear uma sequncia
iniciadora especifica (primer) complementar cadeia
molde permite definir uma regio a amplificar.
Apesar

da

necessidade

de

quantidades

mnimas de material gentico verifica-se uma

amplificao vivel, por inmeras vezes e em pouco
tempo, fazendo com que este mtodo permita uma
deteno fivel de marcadores genticos relacionados
com doenas infeciosas, cancerianas e genticas.
Figura 1-Reao do DNA polimerase em
PCR, quando na presena de DNA, primers
e nucletidos.

19 | P g i n a

Desenvolvimento de oligonucleotdos manufaturados por Kary Mullis da

empresa Cetus com vista pesquisa e desenvolvimento de projetos internos;
Avanos no desenvolvimento de prottipos de sintetizadores
automticos de oligonucletidos.

Kary Mullis prope a sntese de oligonucleotdos baseando se no mtodo

de sequenciamento de DNA de Sanger;

A dificuldade da aplicao do mtodo para um local especfico do genoma

levou Mullis a adicionar um segundo conjunto de primers;

Aplicaes repetidas de polimerases conduziu a uma reao em cadeia de

replicao para um segmento especfico do genoma (PCR);

Incluso de ciclos trmicos, direcionados para pequenos segmentos de um

gene clonado.

Divulgao das experincias de Mullis envolvendo a

sintese de oligonucleotdos.

Purificao da Taq polimerase de uma bactria termfila.

Remoo da interveno humana no processo, ao introduzir um

enzima resistente a altas temperaturas, contribuindo para simplificar e
encurtar o processo.

PerkimElmer, uma outra empresa biotecnolgica lana um termociclo,

instrumento capaz de regular a temperatura da reao de forma
programada

20 | P g i n a

Por forma a proceder amplificao de sequncias de DNA por PCR, devem

estar presentes os seguintes componentes:

Cadeia de DNA Molde: Amostra de DNA que contm a sequncia alvo.

No inicio da reao, a elevada temperatura aplicada faz com que as cadeias
da molcula original de DNA se separem;

DNA polimerase-Enzima responsvel pela sntese de novas cadeias de

DNA compleamentares com a sequncia alvo. O enzima mais usado o
Taq polimerase (da bactria Thermis aquaticus) e a Pfu DNA polimerase
(da bactria Pyrococcus furiosus). Embora estruturalmente diferentes,
estes enzimas possuem duas caractersticas que os tornam adequados sua
utilizao em PCR:
o Poder formar novas cadeias de DNA, a partir de uma cadeia
modelo e primers;
o Serem resistentes a elevadas temperaturas.

Primers-Fragmentos de oligonocletidos sintticos complementares

sequencia alvo. Correspondendo ao componente ao qual a DNA
polimerase inicia a extenso de uma nova cadeia a partir de uma das
extremidades;

Nucleotdos (dNTPS ou desoxinucletidos trifosfato)-Unidades

individuais de bases distintas que representam componentes essenciais
sntese de uma nova cadeia pela DNA polimerase.

O PCR processa-se em trs etapas, no qual, em conjunto definem um ciclo

que se repete um nmero especfico de vezes. Assim, um ciclo consiste nas
seguintes etapas:

21 | P g i n a

desnaturao

trmica

processa-se a uma temperatura elevada

(em geral para temperaturas superiores
a 90C), ao qual ocorre separao da
dupla cadeia de DNA em dois
filamentos. A separao dos dois
filamentos ou cadeias de DNA (figura
Figura 2-Desnaturao trmica, correspondendo primeira
etapa do ciclo ao qual ocorre separao da dupla cadeia de
DNA.

2) verificam-se uma vez estes so

mantidos por pontes de hidrognio,
foras relativamente fracas que sofrem

rutura a elevadas temperaturas, ao passo que as ligaes entre nucletidos, por serem
ligaes covalentes, mais fortes, permanecem intactas.

Com o objetivo de amplificar

um segmento de DNA de interesse, so
introduzidos primers que marcam as
extremidades da sequncia alvo. So
designados dois tipos de primers, um
para cada cadeia simples de DNA
produzida na etapa de desnaturao. Figura 3-Hibridao ou Annealing, correspondendo segunda
O inicio da sequncia de DNA alvo

etapa do ciclo, qual ocorre, por complementaridade a

definio do segmento a amplificar.

marcada pelos primers que se ligam

(hibridam) com a sequencia complementar, definindo uma regio (figura 3). A
temperatura de annealing ou hibridao encontra-se normalmente entre os 40C e 65C,
dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. A definio rigorosa da
temperatura permite que estas sequncias iniciadoras se liguem sequncia alvo com
elevada afinidade.

22 | P g i n a

Aps a ligao dos primers s

sequncias de DNA, a temperatura
aumenta para 72C ao qual o enzima Taq
polimerase replica a cadeia de DNA
(figura 4). O processo de sntese
iniciado numa zona com cadeia dupla,
onde os primers se encontram ligados, e
ao qual ocorre incorporao de

Figura 4-Extenso, correspondendo terceira etapa do ciclo

nucletidos complementares sequncia.

ao qual se verifica o prolongamento das cadeias pela DNA

polimerase de acordo com a complementaridade das bases.

Esta etapa inicia-se pela extremidade 3

do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples.

No final do primeiro ciclo de

PCR verifica-se a existncia de duas
novas cadeias e DNA idnticas
original (figura 5). Como a DNA
polimerase no reconhece o final da
sequncia,

as

novas

cadeias

sintetizadas tm o seu inicio definido

pelo primer, mas a sua extremidade

Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA

3 indefinida leva formao de

idnticas original, resultado da amplificao.

fragmentos de diferentes tamanhos. No ciclo que se segue esta cadeia vai servir de
molde sntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia.
A cadeia de DNA sintetizada a partir deste molde, ter ento o comprimento definido
pelos primer. Estas cadeias desigmam se de Amplicons.
Ao fim de alguns ciclos, as cadeias de DNA que correspondem ao tamanho da
sequncia alvo, encontram-se presentes em maior quantidade do que as sequencias de
tamanho varivel, isto , a sequncia flanqueada pelos primers corresponde quela que
se amplia.

23 | P g i n a

O conjunto das trs etapas referidas ocorre

num termociclo (figura 6), um equipamento que
controla e alterna de forma cclica as temperaturas
automaticamente, durante perodos programados de
tempo para um determinado nmero de ciclos.

Figura 6-Termociclo, equipamento

capaz de amplificar de forma
automatizada sequncias de DNA.

O PCR pode ser aplicado ao nvel da sequenciao de segmentos de DNA,

genotipagem, avaliao da expresso de genes, clonagem, entre muitas outras
aplicaes.
Apesar de poder ser aplicado de uma forma alargada a um grande nmero de
reas apresenta algumas limitaes, que fazem com que a quantificao dos produtos de
PCR no seja confivel, tais como:

Determinao da quantidade inicial da sequncia alvo s possivel para uma

fase exponencial da reao de PCR;

Esta fase exponencial pode ser dificultada pela presena de inibidores da

reao de polimerizao, verificar-se um reagente que limita essa reao,
ocorrer a acumulao de molculas de pirofosfato, o auto-anelamento.

Organismos transgnicos so aqueles que receberam material genticos de

outros organismos, mediante o emprego de tcnicas de engenharia gentica, como a
tecnologia de DNA recombinante. A gerao de transgnicos visa obter organismos
com caractersticas novas ou melhoradas relativamente ao organismo original. A
manipulao gentica combina caractersticas de um ou mais organismos de uma forma
que provavelmente no aconteceria na natureza. Assim podem ser combinados
os molculas de DNA de organismos que no se cruzariam por mtodos naturais.

24 | P g i n a

Frequentemente h uma certa confuso entre organismos transgnicos

e Organismos Geneticamente Modificados (OGM), e os dois conceitos so tomados, de
forma equivocada, como sinnimos. Ocorre que OGMs e transgnicos no so
sinnimos. Os transgnico correspondem a organismos geneticamente modificados, mas
nem todos os OGM so transgnicos. OGM um organismo que teve o
seu genoma modificado em laboratrio, sem todavia receber material gentico
(RNA/DNA) de outro organismo. Transgnico um organismo que foi submetido a
tcnicas especficas de insero de material gentico de outro organismo (que pode at
ser de espcie diferente).

Alimentos transgnicos so alimentos produzidos a partir de organismos

cujo embrio foi modificado em laboratrio, pela insero de pelo menos um gene de
outra espcie. Alguns dos motivos de modificao desses alimentos so para que as
plantas possam resistir s pragas (insetos, fungos, vrus, bactrias e outros) e
a herbicidas. O mau uso de pesticidas pode causar riscos ambientais, tais como o
aparecimento de plantas resistentes a herbicidas e a poluio dos terrenos e lenis de
gua.
O uso de herbicidas, inseticidas e outros agrotxicos pode diminuir com o uso
dos transgnicos, j que eles tornam possvel o uso de produtos qumicos corretos para o
problema.

A primeira aplicao dos organismos transgnicos e dos organismos

geneticamente modificados a prpria investigao cientfica. A expresso de um
determinado gene de um organismo em outro organismo pode facilitar a compreenso
da funo desse gene. Posteriormente, organismos transgnicos, como plantas e
animais, foram desenvolvidos para estudos, e tambm vrios produtos obtidos a partir
de transgnicos foram desenvolvidos e comercializados. O primeiro produto
comercializado

foi

a insulina,

produzida

partir

de

uma

modificao

da bactria Escherichia coli, o final dadcada de 1970). Atualmente, alimentos

transgnicos so utilizados para consumo animal e humano.

25 | P g i n a

AAPH: Dihidrocloreto-2,2-azobis
cDNA: cido desoxirribonucleico complementar
CHI: Chalcona isomerase
CHS: Chalcona sintase
DAD: Detector de dodo array
DFR: Dihidroflavonol redutase
DNA: cido desoxirribonucleico
EDTA: cido etilenodiamino tetra-actico
ESI: Fonte de ionizao electrospray
HCl: cido clordrico
HPLC: Cromatografia lquida de alta eficincia
LC: Cromatografia lquida
MS: Espectrometria de massa
MgCl2: Cloreto de magnsio
npt II: Gene neomicina fosfotransferase
PCR: Reao em cadeia da polimerase
RNA: cido ribonucleico
SDS: Dodecil sulfato de sdio
SSC: Tampo salino citrato de sdio
TBE: Tris-Borato-EDTA
UV: Ultravioleta
Vis: Visvel

26 | P g i n a

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