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Licenciatura em Bioqumica
2013/2014
............................................................................................................................. 3
................................................................................................................................. 4
.......................................................................................................................... 6
3.1.
........................................................................................................................ 6
3.1.1.
....................................................................................................... 6
3.1.2.
.................................................................... 6
3.1.3
.............................................................................. 7
3.1.4.
............................................................................... 7
3.1.5.
............................................................................................................ 7
3.2.
....................................................................................... 9
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
3.3.
................................................................................................. 16
3.3.1.
........................................................................................................... 16
3.3.2.
................................................................................................................... 16
3.3.3.
..................................................................... 17
.................................................................................... 18
............................................................................................................. 19
......................................................................... 19
......................................................................................... 20
................................................................................................... 21
1|Pgina
............................................................................................. 21
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........................................................................................... 22
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......................................................................................................................... 25
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.................................................................................... 27
2|Pgina
Especficos:
o Conhecer:
Os
Conceitos:
Desnaturao,
Hibridao,
Transgnese,
o Compreender:
O funcionamento de um termociclo;
o Aplicar:
4|Pgina
o Executar:
o Dar Valor:
Aos
mtodos
utilizados
na
extraco,
identificao
5|Pgina
3.1.
3.1.1.
Mas de trs variedades diferentes: Fuji (as que possuem maior quantidade de
antioxidantes); Gala (das mas mais comuns, encontrando-se no meio da
tabela de teores em antioxidantes); e as Empire (mas produzidas inicialmente
a partir de clonagem, sendo as que apresentam menor quantidade de
antioxidantes).
3.1.2.
6|Pgina
3.1.3
Aqui apresentam-se os reagentes qumicos que apresentam mais cuidado no seu
manuseamento e quais os cuidados a ter no mesmo.
Reagente
Brometo de
etdeo
Azoto
lquido
Catamina
Caracterizao/Observao
Usado como agente intercalante usado como marcador de cidos
nucleicos. Deve ser usado luvas no seu manuseamento, pois
mutagnico.
Cuidado para o lquido no entrar em contacto directo com a pele, pois
pode levar ao seu congelamento. O vapor libertado no tem qualquer
efeito na pele.
Trata-se de um anestsico utilizado essencialmente em animais. Devese ter cuidado no seu manuseamento, evitando a sua inalao.
3.1.4.
Este trabalho cientfico encontra-se dividido em duas partes: a produo das
mas transgnicas; e a avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas.
A produo das mas transgnicas deve ser realizado num laboratrio onde se
tenha acesso ao material necessrio, sendo que este deve encontrar-se num clima
temperado, com os terrenos adequados para a plantao das macieiras transgnicas. A
plantao das mas pode ser feito fora do mbito do laboratrio, caso no estejam
disponveis os terrenos precisos para este efeito, sendo que neste caso preciso fazer
um seguimento detalhado da maturao e crescimento das macieiras transgnicas.
A avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas deve ser
realizado num laboratrio com as devidas condies de segurana, onde esteja
disponvel ou se tenha acesso a tudo o equipamento e material necessrio. O laboratrio
onde se procede ao estudo da avaliao da capacidade antioxidante das mas
transgnicas, pode ser o mesmo onde se procede produo das mas transgnicas,
desde que apresente as devidas condies.
3.1.5.
Este projecto um trabalho que consiste em duas partes: a produo de plantas
transgnicas e a avaliao da capacidade antioxidante das mas transgnicas em ratos
7|Pgina
Jan
Fev
Mar
Abril
Maio
Jun
Julho
Agosto
Setem
Out
Novem
Dezem
Pesquisa bibliogrfica
Produo das plantas transgnicas em laboratrio
Plantao das macieiras transgnicas
Agosto
Setem
Out
Novem
Dezem
Jan
Fev
Mar
Abril
Maio
Junho
Julho
Pesquisa bibliogrfica
Colher e preparar amostras de mas Gala.
Colher e preparar amostras de mas Fuji e Empire.
Extrao dos componentes fenlicos das mas
Identificao dos compostos fenlicos pro LC-MS
Quantificao dos compostos fenlicos por
HPLC
Atividade antioxidante dos extractos
de mas
Experincias nutricionais em ratos de laboratrio
Parmetros hematolgico, bioqumicos e imunolgicos do sangue do rato
Realizao do artigo
Durante o perodo de investigao iro ser entregues relatrios mensais entidade reguladora da
investigao.
8|Pgina
3.2.
Nota I: Vo ser avaliadas a sobreexpresso de antioxidantes de trs variedades de
mas diferentes, Fuji, Gala e Empire, que apresentam caractersticas semelhantes, no
entanto, as suas conhecidas propriedades fenlicas so diferentes.
9|Pgina
10 | P g i n a
final
de
200
mol/L;
CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3)
Primer
Primer
Forward
(5-
Reverse
(5-
11 | P g i n a
Fase
Temperatura
Tempo
N de ciclos
Ativao/Desnaturao inicial
95C
1 minuto
Desnaturao
95C
25 segundos
Anelao
60C
30 segundos
Extenso
72C
45 segundos
Extenso Final
72C
4,20 minutos
35
do seguinte modo:
2.10.1. Preparar o RNA total a partir das folhas de rvores novas, usando o
mtodo de hidroclorato de guanidina.
2.10.2. Submeter os fragmentos de RNA obtido anteriormente, a electroforese
em gel de agarose (1,5% (p/v) agarose, 15% (v/v) formaldedo).
2.10.3. Transferir o RNA para membranas de nylon.
2.10.4. Remover os filtros e lava-los com trs vezes com 0,1x SSC e 0,1% SDS,
durante 30 minutos a 65C.
2.10.5. Hibridizar as membranas de nylon durante a noite, a 42C, com sondas de
cDNA marcadas radioactivamente.
2.10.6. Proceder a autoradiografia, de modo a verificar os resultados obtidos.
2.11. Deixar crescer as macieiras transgnicas seleccionadas, pelo menos, dois anos,
antes de proceder colheita das mas para se comear o estudo (como foi
indicado no ponto 1).
5.4. Utilizar uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, a temperatura do capilar a 300C, o
gs de revestimento e o gs de auxiliar a 50 e 5 unidades, respectivamente, e a
voltagem a 3 kV para ionizao negativa e 0,1 kV para ionizao positiva.
5.5. Proceder anlise usando um scan MS de m/z de 100 a 1000.
9.4. Analisar
os
parmetros
bioqumicos
no
soro
sanguneo
espectrofotometricamente usando um analisador Vitros, sistema Ektachem DT60-II com um mdulo DT, DTE e DTSC, com recurso coleco Johnson &
Johnson Clinical Diagnostics.
9.5. Determinar as concentraes de IgE, IgA, IgM e IgG no soro sanguneo, usando
um mtodo quimiluminescente, com um analisador Immulete 2000.
9.6. Analisar a concentrao de soro IL-4 com o mtodo de ELISA.
9.7. Analisar os resultados de modo a determinar os resultados obtidos.
3.3.
3.3.1.
Vortex;
Termociclo;
Transluminador de UV;
Autoradiografia;
Misturador de Polytron;
Sistema de vcuo;
Ultra-sons;
Centrifugadora;
Equipamento de LC-MS;
Sistema de HPLC;
Espectrofotmetro;
Balana analtica;
Ultracongelador.
3.3.2.
Placas de Petri;
Erlenmeyers;
16 | P g i n a
Bisturi ou faca;
Eppendorfs;
Varetas;
Membranas de nylon;
Pinas;
Filtros;
Pelador ou faca;
Almofariz;
Provetas;
Tubos de ensaio;
Pipetas de Pasteur;
Cuvetes;
Seringas.
3.3.3.
1Kit
25ml
1 Set
1Set
Pureza
(%)
---------
Entidade
Fornecedora
Qiagen
Sigma
Sigma
Sigma
Preo
()
129,17
291,17
38,13
38,13
100ml
---
Greener
69,65
1 Kit
100g
500g
100g
250g
10 ml
2UMOL
100g
--------99,8
----98
TaqMan
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
279,46
174,94
35,28
14,52
81,79
39,02
104,00
48,20
Quantidade
DNeasy Plant Mini Kit
Tampo de PCR
Primer Forward
Primer Reverse
AmpliTaq Gold DNA
Polymerase
DNA Template
Agarose 1%
cido brico
EDTA
Tris
Brometo de etdeo
dNTPs
MgCl2
17 | P g i n a
TBE
Formaldedo
SSC
SDS
Metanol
HCL
cido frmico
cido actico
Acetonitrilo
AAPH
Luminol
Cetamina
250g
25mL
1L
25g
1L
100mL
100mL
500mL
100mL
25g
5g
10mL
98
----98,5
99,9
36,5-38
95
99,7
99,8
97
97
---
Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma
Sigma
Fluka
Sigma
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Aldrich
Sigma
Sigma
Total
(sem IVA)
Total
(com IVA)
33,30
26,30
68,80
37,40
57,80
50,70
34,20
51,30
54,00
35,00
69,10
85,90
1947,16
2395,00
Tabela 3-Lista de reagentes e oramento correspondente, com e sem o IVA aplicado taxa atual.
18 | P g i n a
da
necessidade
de
quantidades
19 | P g i n a
sintese de oligonucleotdos.
20 | P g i n a
21 | P g i n a
desnaturao
trmica
rutura a elevadas temperaturas, ao passo que as ligaes entre nucletidos, por serem
ligaes covalentes, mais fortes, permanecem intactas.
22 | P g i n a
as
novas
cadeias
fragmentos de diferentes tamanhos. No ciclo que se segue esta cadeia vai servir de
molde sntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia.
A cadeia de DNA sintetizada a partir deste molde, ter ento o comprimento definido
pelos primer. Estas cadeias desigmam se de Amplicons.
Ao fim de alguns ciclos, as cadeias de DNA que correspondem ao tamanho da
sequncia alvo, encontram-se presentes em maior quantidade do que as sequencias de
tamanho varivel, isto , a sequncia flanqueada pelos primers corresponde quela que
se amplia.
23 | P g i n a
24 | P g i n a
foi
a insulina,
produzida
partir
de
uma
modificao
25 | P g i n a
AAPH: Dihidrocloreto-2,2-azobis
cDNA: cido desoxirribonucleico complementar
CHI: Chalcona isomerase
CHS: Chalcona sintase
DAD: Detector de dodo array
DFR: Dihidroflavonol redutase
DNA: cido desoxirribonucleico
EDTA: cido etilenodiamino tetra-actico
ESI: Fonte de ionizao electrospray
HCl: cido clordrico
HPLC: Cromatografia lquida de alta eficincia
LC: Cromatografia lquida
MS: Espectrometria de massa
MgCl2: Cloreto de magnsio
npt II: Gene neomicina fosfotransferase
PCR: Reao em cadeia da polimerase
RNA: cido ribonucleico
SDS: Dodecil sulfato de sdio
SSC: Tampo salino citrato de sdio
TBE: Tris-Borato-EDTA
UV: Ultravioleta
Vis: Visvel
26 | P g i n a
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