Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Per (DECANA DE AMRICA)

Facultad de Farmacia y Bioqumica

Escuela Acadmico Profesional de Farmacia y Bioqumica
DEPARTAMENTO ACADMICO DE FARMACOLOGA, BROMATOLOGA Y
TOXICOLOGA

PRCTIC
A N 2

DETECCIN DE SALMONELLA EN
ALIMENTOS

DOCENTE:

DRA. TERESA GALLARDO

GRUPO:

C3

ALUMNOS:

CICLO: DCIMO

AO: 2013

COLONIA OCHOA, BRUNO

CUYA LPEZ, EDILBERTO
DIAZ MARTINEZ, HEYDEE
GIURFA TUTAYA, LILIANA
OBLITAS BARBOZA, JEAN PIERRE

DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS

I.

INTRODUCCIN

Las bacterias pertenecientes al gnero Salmonella, familia

Enterobacteriaceae, se caracterizan por ser bacilos gram negativos,
anaerobios facultativos, utilizan citrato como nica fuente de carbono
y poseen metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo. Dentro de su
clasificacin taxonmica, actualmente se describen dos especies: S.
enterica y S. bongori, donde la primera a su vez se subdivide en seis
subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonea, houtenae e
indica; Salmonella enterica subespecie enterica representa 99% de los
serotipos aislados, siendo
estos ltimos determinados por los
antgenos somticos (O), flagelares (H) y capsulares o de superficie
(Vi). Es as como se describen mas de 2500 serotipos o serovares de
este gnero (Ejemplo: Salmonella enterica subespecie enterica
serotipo enteritidis o su abreviatura cientficamente aceptada,
Salmonella enteritidis). La salmonelosis se presenta en trminos
generales, dentro de dos espectros clnicos: el primero, la fiebre
entrica ms conocida como fiebre tifoidea, caracterizada por ser un
cuadro febril sistmico cuyos agentes etiolgicos son S. typhi y S.
paratyphi, donde el hombre se comporta como nico husped; y el
segundo, la gastroenteritis, caracterizada por sntomas como dolor
abdominal, malestar general, vmito, diarrea y en algunos casos
fiebre, frecuentemente relacionado a previo consumo de alimentos
contaminados de origen animal, es importante tener en cuenta que en
los pacientes adultos inmunocomprometidos con infeccin por
Salmonella no tifoidea, existe mayor mortalidad relacionada con
bacteriemia recurrente4,5 Los serotipos de Salmonella ms
representativos a nivel mundial son S. enteritidis y S.typhimurium
(24,1% y 6,6% de los brotes atribuidos a estos serovares
respectivamente); ubicndose as como el principal microorganismo
bacteriano implicado (46,9%)
dentro del espectro de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), seguido del
Staphylococcus aureus, gracias a su extraordinaria capacidad de
colonizacin y adaptacin a diversos hospederos animales, donde las
aves cumplen un papel protagnico.

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II.

MARCO TERICO

SALMONELOSIS
Es una enfermedad cuyos sntomas ms
comunes son: dolor abdominal sbito,
diarrea, nuseas, vmitos y fiebre. En
ancianos y lactantes
provoca una
deshidratacin que puede ser mortal. En el
Per esta enfermedad se viene notificando
en diferentes partes del pas, llamando la
atencin los brotes de infeccin en grandes
grupos de personas que acuden a servicios de alimentacin, sobre
todo en el norte del pas. En el ao 1977, ocurri un serio brote en la
Universidad de Trujillo que afect a cerca de 600 estudiantes y en la
que se aisl Salmonella agona, de los huevos de gallinas infectadas
que se utilizaron en la preparacin de la
mayonesa. El agente etiolgico es una
bacteria denominada Salmonella, de la que
se reconocen alrededor de 2,200 serotipos,
distribuidos en todo el mundo, siendo
alrededor de 200 los prevalentes en
lugares y pocas diferentes. Esta bacteria se desarrolla a
temperaturas de 8 C a 45 C, es sensible al calor y muere sobre la
temperatura de los 60 C.
Deteccin de Salmonella
La deteccin rutinaria de salmonelas supone una secuencia de pre
enriquecimiento, enriquecimiento, siembra en placas de medios
selectivos, aislamiento e identificacin.
El pre - enriquecimiento se
puede llevar a cabo o no,
dependiendo
del
grado
de
probabilidad de que en el alimento
existan clulas daadas. Se utiliza
cuando se analizan alimentos que
han sido calentados, congelados y
desecados y en aquellos alimentos

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en los que he de esperar que se encuentren clulas de salmonelas en
escaso nmero.

El enriquecimiento selectivo tiene por finalidad inhibir el

crecimiento de otros microorganismos a la vez que permite que las
salmonelas crezcan. Se consigue mediante el empleo de compuestos
qumicos inhibidores, de una temperatura y una duracin de la
incubacin determinadas, que permiten que la proporcin de
salmonelas con respecto a los dems microorganismos aumente. Los
caldos selectivos que se utilizan habitualmente son el caldo de
tetrationato con verde brillante, el caldo selenita con cistina y el caldo
con cloruro de magnesio verde malaquita de Rappaport Vassiliadis.
La presencia de salmonellas se determina sembrando muestras de los
caldos de enriquecimiento en placas de medios selectivos. Los
medios para siembra en placa que se emplean habitualmente son el
verde brillante con o sin sulfadiazina, el desoxicolato xilosa lisina, el
sulfito de bismuto, el agar entrico de Hektoen.
III.

PARTE EXPERIMENTAL

PROCEDIMIENTO:
MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
Transferir 25g o 25ml del matraz con 225ml
incubar a 37 C durante 24 h.

de agua peptonada,

AGUA PEPTONADA TAMPONADA

Asegura a mantener el pH durante 24horas, lo que sumado al
perodo de incubacin permite el incremento de clulas que son
sensibles a la disminucin del pH.
A stos medios se les puede adicionar sustancias que
contrarresten las sustancias inhibidoras que estn presentes en
algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un
factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

AGUA PEPTONADA TAMPONADA

Temperatura
37C
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Tiempo
incubacin

de

24 horas

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Usamos dos caldos el cual contiene sustancias inhibidoras que estimulan
la multiplicacin de salmonellas y reducen el crecimiento de dems
microorganismos competitivos
Llevamos 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo selenito
cistina
Llevamos 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo tetrationato
verde brillante
IV.

RESULTADOS

AISLAMIENTO SELECTIVO
Medio de cultivo Agar Hektoen Entrico
La morfologa y color de las colonias en agar Hektoen entrico son las
siguientes:

Colonias verdes con centro negro: microorganismos no

fermentadores de lactosa con produccin de H2S.
Colonias verdes: microorganismos no fermentadores de lactosa.
Colonias anaranjadas: microorganismos fermentadores de lactosa.

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AGAR SULFITO BISMUTO

Colonias tpicas
Las colonias tpicas de la Salmonella typhi son marrones o negras,
algunas veces con brillo metlico alrededor de las colonias. Algunas
cepas producen colonias verdes con poco o ningn oscurecimiento.

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AGAR
VERDE BRILLANTE

Es un medio altamente selectivo utilizado para el aislamiento de

microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella con excepcin de
la Salmonella typhi.
Colonias tpicas
Las colonias tpicas del gnero Salmonella son pequeas, incoloras,
rosadas o fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de
rosado a rojo.

IDENTIFICACIN BIOQUMICA
a) TSI (Triple azcar hierro)
Pico: Alcalino (lactosa y sacarosa negativo)
Fondo: Presencia de FeS (coloracin negra), produccin de H2S.

b) LIA (Agar Lisina Hierro)

Reaccin alcalina (prpura, descarboxila lisina)

Produccin de coloracin negruzca (produccin de H2S)

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Observaciones: La presencia de gran cantidad de FeS es debido

al tiempo de incubacin antes de la lectura. Para evitar esta
interferencia el mtodo seala que se debe dar lectura a las 24
horas. Por motivos de la prctica se realiz la lectura a las 48
horas.

V.

DISCUSIN

Los resultados obtenidos en la presente prctica demuestran la

presencia de Salmonella sp. el cual puede ser contaminante de
diversas muestras de alimentos. El hallazgo de Salmonella y otras
enterobacterias en alimentos son un serio riesgo para la salud por
la asociacin durante la infeccin con estas bacterias a
gastroenteritis en sujetos inmunocompetentes, cuadros clnicos
invasivos
severos
en
sujetos
inmunosuprimidos
y
con
1
complicaciones focales en menor frecuencia .
El aislamiento e identificacin de Salmonella sp. se realiz segn los
mtodos estandarizados de anlisis microbiolgicos en alimentos.
Este proceso se recomienda hacerlo en seis pasos: desde el
enriquecimiento de la cepa y su aislamiento hasta su identificacin
por pruebas bioqumicas y serolgicas 5,6.
Los resultados del aislamiento de colonias de Salmonella en agar
selectivo fueron positivos. En el agar bismuto sulfito las colonias
mostraron un centro negro rodeado de un borde claro y con brillo
metlico por la reduccin de iones de bismuto que se transforman
en bismuto metlico 5. En el agar verde brillante las colonias fueron
de color rosado, transparentes lo que indica que no fermentaron la
lactosa presente en el agar. En el agar Hektoen las colonias fueron

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verde azuladas con centro negro, esta coloracin oscura indica que
las colonias son productoras de SH2.
En la identificacin final de Salmonella sp. las colonias sospechosas
observadas en el medio de cultivo diferencial se someten a pruebas
de reaccin bioqumica con el fin de confirmar la presencia de la
bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un conjunto de
pruebas que incluyen la produccin de indol, rojo de metilo, Voges
Proskauer, citrato, TSI, hidrlisis de urea, deaminacin de la
fenilalanina, descarboxilacin de la lisina, arginina y ornitina,
motilidad, hidrlisis de gelatina, utilizacin de malonato,
fermentacin de glucosa con produccin de cido y gas,
fermentacin de lactosa y sacarosa, lipasa, ADNasa, transformacin
nitrato nitrito y fermentacin de manosa 7,8. Sin embargo, para el
objetivo de la presente prctica, solo se realizaron algunas de ellas
(TSI y LIA) porque son las ms recomendadas en los diferentes
mtodos de identificacin de dicha bacteria.
El resultado obtenido en la prueba de TSI (A/K con formacin de SH 2
y produccin de CO2) y el obtenido en la prueba de LIA (alcalina y
formacin de SH2) nos confirma que se trata de una especie de
Salmonella; sin embargo, debemos descartar la presencia de
Salmonella typhi y Salmonella paratyphi porque ninguna de ellas
produce SH2 9.

VI.

CONCLUSIN

El microorganismo analizado corresponde a la enterobacteria del

gnero Salmonella sp.
VII.

CUESTIONARIO

1. Qu otras pruebas bioqumicas adicionales recomienda la FDA

en la deteccin de la salmonella en alimentos adems del TSI y
LIA?
Otras pruebas adicionales que recomienda la FDA cuando la salmonella
no da reacciones tpicas son:
CALDO DE
PRPURA

LACTOSA

ROJO

FENOL O CALDO

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DE

LACTOSA

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Del TSI, inocular el caldo con una pequea cantidad de cultivo. Incubar
10 2 h en 35C, examinar despus de 24 h.
48
Positivo - produccin cida (amarillo) y produccin de gas en tubo de
fermentacin interior. Considerar la sola produccin de cido como
reaccin positiva. La mayor parte de cultivos de Salmonella dan
resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formacin de gas en
el interior del tubo de fermentacin y rojo (cuando el rojo fenol es el
indicador) o prpura (con prpura bromocresol como indicador) en todas
partes del medio.
CALDO DE SACAROSA ROJO FENOL O CALDO DE SACAROSA
PRPURA
Descartar como no Salmonella,los cultivos que dan pruebas de sacarosa
positivas, excepto aquellos que dan cido en la inclinacin del TSI y
reacciones positivas en el LIA
MR-VP caldo
Inocular el medio con la pequea cantidad de crecimiento de cada
inclinacin de TSI clasificada sospechosa de Salmonella. Incube 48 2 h
en 35C.
Vogues-Proskauer (VP) Realizar a temperatura ambiente de la
siguiente manera: Transfiera 1 mL de 48 h de cultivo un tubo de ensayo
limpio e incube el resto del
caldo un tiempo adicional de 48 h en 35C. Agregar 0,6 mL alfa-naftol y
agitar bien. Agregue 0,2 mL de solucin KOH al 40 % y agitar bien. Para
intensificar y apresurar la reaccin, agregue unos cristales de creatina.
Resultados ledos despus de 4 h; el desarrollo de color rosado- rojo en
todas partes
del medio es la prueba positiva. La mayor parte cultivos de Salmonella
son VP Negativas, indicadas por la ausencia de desarrollo de color
rosado-rojo en todas partes del caldo.
Rojo metilo: A 5 mL de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6
gotas del indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da
la prueba positiva, indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color
distinto, como el amarillo es la
prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan
positivo.
Agar Citrato Simmon: Inocular este agar usando aguja de inoculacin
con cultivo proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la
inclinacin y picando el extremo. Incubar 96 2 h en 35C. Lectura:
Positivo - presencia de crecimiento, por lo general acompaado por
cambio en color de verde a azul. La mayor parte cultivos de Salmonella
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son citrato - positivas. Negativo - ningn crecimiento o muy poco
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crecimiento
y ningn cambio en color.
2. Cmo observo las colonias de salmonella en el agar hektoen.
Explique el fundamento bioqumico.
La morfologa y color de las colonias en agar Hektoen entrico son las
siguientes:

Colonias verdes con centro negro: microorganismos no

fermentadores de lactosa con produccin de H2S.
Colonias verdes: microorganismos no fermentadores de lactosa.
Colonias anaranjadas: microorganismos fermentadores de lactosa.

Fundamento: En el medio de cultivo la proteosa peptona y el extracto de

levadura aportan los nutrientes para el desarrollo microbiano. La lactosa,
sacarosa y salicina son los hidratos de carbono fermentables. Las sales
biliares inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, de algunos
coliformes y de la mayora de las cepas de Pseudomonas spp. El azul de
bromotimol y la fucsina cida son los indicadores de la fermentacin de
hidratos de carbono, mientras que el citrato de hierro acta como
indicador de la formacin de SH2ma partir del tiosulfato debido a que se
forma sulfuro de hierro, compuesto de color negro.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente
solidificante.
3. Explique el fundamento del crecimiento de Salmonella en el
caldo tetrationato.
La Base de Caldo Tetrationato es utilizada como un medio de
enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella que pueden estar
presentes en pequeas cantidades y que compiten con otras bacterias
de la flora intestinal.En este medio la peptona provee la fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y aminocidos. La selectividad del medio
est dada por la combinacin del tiosulfato de sodio y tetrationato (el
tetrationato es formado en el medio con la adicin de yodo y yoduro de
potasio en solucin). Los organismos que tienen la enzima tetrationato
reductasa proliferan en el medio. Las sales biliares suprimen el
desarrollo de coliformes e inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas. El carbonato de calcio neutraliza y absorbe los metabolitos
txicos.
4. Cul es el fundamento del sistema API? Usos.

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Fundamento: Son medios, deshidratados o no, que se encuentran
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contenidos
en microtubos los cuales se rehidratan o siembran mediante
una suspensin bacteriana y luego se cultivan. Luego se incuban y en
este proceso el metabolismo del microorganismo genera cambios en el
medio de cultivo que se aprecian por un cambio de color de ste o al
aadir reactivos. Los cambios ocurridos se interpretan mediante tablas
de lectura o mediante un programa de ordenador.
Cada prueba de cada microtubo tiene un fundamento propio que es el
mismo que se usa para las pruebas tradicionales que son realizadas
individualmente.
Usos:
Identificacin de microorganismos gram positivos, gram negativos y
levaduras. Diagnstico de enfermedades infecciosas (laboratorio clnico),
bancos de sangre.
Uso industrial: control de calidad de productos cosmticos,
nutracuticos, agro, comida y biomedicametos.
5. Cmo se realiza la identificacin serolgica de Salmonella?
La deteccin de la presencia de los antgenos O, Vi Y H de Salmonella se
realiza por aglutinacin en placa con los sueros apropiados a partir de
colonias puras y despus de eliminar las cepas autoaglutinables.
a) Eliminacin de cepas autoaglutinables: colocar una gota de
solucin salina en una placa de vidrio. Con un ansa dispersar parte
de la colonia para obtener una suspensin turbia y homognea.
Mover la placa de vidrio en crculos por 30 a 60 segundos. Observar
el resultado contra un fondo oscuro preferiblemente con ayuda de
una lupa. Si la cepa aglutina es considerada autoaglutinable y no
debe someterse a la determinacin serolgica, ya que los resultados
no son confiables.
b) Determinacin del antgeno somtico O:
Antisuero polivalente (O): emulsionar una ansada de cultivo de 24 h 48 h tomado a partir del pico de flauta del TSI o preferiblemente del
triptosa agar sangre base (sin sangre) con 2 ml de solucin salina
0.85% y colocar una gota sobre la placa de vidrio. Agregar una gota
del antisuero polivalente O y mezclar con un aguja o ansa limpia y
estril. Inclinar con movimientos una y otra vez durante un minuto.
Observar el resultado contra un fondo oscuro y con buena luz.
Considerar cualquier grado de aglutinacin como positivo.
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13Antisuero (O) de grupo: utilizar antisueros de grupo, incluyendo el Vi

y realizar el mismo procedimiento que para el antisuero polivante

(O).
c) Determinacin del antgeno flagelar (H): A partir del pico de
flauta del TSI inocular un caldo BHI e incubar 4h - 6 h a 35C hasta
crecimiento visible (para realizar el test el mismo da) o caldo
tripticasa soja-triptona e incubar 24 h 2 h a 35 C (para realizar el
test al da siguiente). Agregar 2.5 ml de solucin salina fisiolgica
formolada a 5 ml de cualquiera de los caldos arriba mencionados.
Colocar 0.5 ml de una dilucin apropiada del antisuero polivalente
flagelar (H) en un tubo para serologa y agregar 0.5 ml del antgeno.
Realizar un control de autoaglutinacin mezclando 0.5 ml de solucin
salina fisiolgica formulada con 0.5 ml del antgeno. Incubar la
mezcla en bao de agua 48C - 50C. Observar a intervalos de 15
minutos y leer el resultado final en 1 h.
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