RESUMEN GENERAL DE CLASES DE BIOQUMICA

TEMA 1: AMINOCIDOS Y PROTENAS

Las protenas tienen una serie de funciones:

Funcin cataltica: Enzimas. Recurdese que no todas las enzimas son

protenas (como el RNA) o que no todas las protenas son enzimas.
Inmunoglobulinas: Anticuerpos, sistema inmune (funcin de defensa).
Transporte: Para movimiento de material (por ejemplo: el transporte de
oxgeno realizado por la hemoglobina).
Regulatoria: Hormonas, control del metabolismo.
Estructural: Soporte, piel, pelo, uas, protenas contrctiles.
Movimiento: Msculo.
Recepcin: Ligan o reciben sustancias especficas (por ejemplo la unin
entre una molcula y su receptor protenico para que suceda alguna
reaccin qumica).

Algunos ejemplos de integracin de las funciones protenicas son los

siguientes:

Cuando la glucosa necesita ingresar a la clula, requiere un receptor

(funcin receptora) para atravesar la membrana celular (que es de carcter
hidrofbico), por medio de un canal protenico (funcin de transporte) que
es hidroflico (puesto que la glucosa igualmente lo es). Luego de ello, la
glucosa ingresa al citosol para iniciar sus procesos metablicos que son
llevados a cabo por enzimas (funcin cataltica).
La insulina requiere un receptor membranal (funcin de recepcin) para as
iniciar una serie de reacciones bioqumicas que disparan un conjunto de
seales (funcin de sealizacin o marcadores).
La lucirnaga, gracias a la enzima luciferasa es capaz de producir luz en
caso de que tenga energa en abundancia.
El cuerno de rinoceronte, de amplio uso en la industria de colgeno, se
hidroliza en el cuerpo gracias a la presencia de enzimas.

Aminocidos:
Los aminocidos son las unidades monomricas ms simples de las protenas.
Las protenas estn conformadas por uniones lineales covalentes de
aminocidos. Los grupos radicales de los aminocidos son los encargados de
conferir propiedades especficas a las protenas.
Cuando un aminocido se une a otro, se denomina residuo, porque pierde
parte de sus caractersticas en la unin (por medio del enlace peptdico). La
estructura bsica de un aminocido es la que se encuentra a continuacin:

Figura 1. Estructura bsica de un aminocido. El carbono central se denomina carbono alfa ()

mientras que el carboxilo (COO-) unido al carbono alfa se denomina alfa carboxilo, as como el
grupo amino (NH3+) o alfa amino. La excepcin es la prolina, que es el nico aminocido cclico.
La glicina es el nico aminocido cuyo radical es el hidrgeno. El carbono central se denomina
quiral porque tiene 4 sustituyentes diferentes (exceptuando la glicina). Fuente: Adaptado de
Nelson & Cox (2006)

(a)

(b)

Figura 2. En este resumen, se utilizar ste esquema para efectos prcticos (es decir,
colocando el radical en la parte inferior). Para las estructuras, se utilizar la forma (a). Para el
enlace peptdico y ejercicios de pK a, se utilizar la forma (b). El que el grupo amino o el carboxilo
tengan o no hidrgenos depender de si el aminocido se encuentra en su forma disociada o no.
Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Como los aminocidos son pticamente activos, se clasifican bajo el sistema de

Fisher D y L, que tradicionalmente se llamaron dextrgiros (que se mueven en
sentido horario) y levgiros (que se mueven en sentido antihorario). Sin
embargo, en la actualidad, se han designado como D los que tienen el -amino
a la derecha y L los que tienen el -amino a la izquierda. Todos los residuos de
aminocidos de las protenas son de configuracin L (slo en paredes celulares
o algunos antibiticos se han encontrado las formas D). Cuando en una mezcla
de aminocidos hay igual cantidad de formas D y L del aminocido, se
denomina mezcla racmica, que no rotan la luz en un plano polarizado.
Los aminocidos absorben, en general, luz UV de 190 a 220 nm, y en dicha
absorcin el responsable es el grupo carboxilo. Sin embargo, generalmente la
concentracin de aminocidos en las protenas se mide a 210 o 280 nm (ste
ltimo slo se aplica a soluciones puras de protenas, no a mezclas; si se tiene
una mezcla, debe separarse). Entre mayor sea la absorbancia, mayor es la
concentracin de protenas y debe medirse constantemente en tcnicas de
purificacin para verificar que se est obteniendo la protena de inters.
Clasificacin de Aminocidos:
Debido a que los grupos R confieren propiedades especficas a los aminocidos,
stos se han clasificado de acuerdo a dichas propiedades en los siguientes
grupos (la ornitina y la citrulina, dos aminocidos intermediarios del clico de la
urea, no se encuentran en las protenas):

Grupos R apolares alifticos (apolares): Se caracterizan por ser

apolares e hidrofbicos. Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile) y Alanina
(Ala) se agrupan entre s en las protenas, formando interacciones
hidrofbicas. La glicina es el aminocido ms simple del grupo, y su
pequea cadena no contribuye mayormente a interacciones hidrofbicas. La
metionina tiene un grupo apolar tioter en su estructura (aminocido
azufrado).
La prolina tiene una cadena lateral aliftica con estructura apolar cclica y
su grupo amino secundario (imino) forma estructuras rgidas que le restan
flexibilidad a los residuos polipeptdicos que la contienen. Asimismo, no
puede formar puentes de hidrgeno y desestabiliza las estructuras
proteicas.

Figura 3. Estructura qumica de los 7 aminocidos alifticos con carga (apolares).

Obsrvese que la glicina es la estructura ms simple, la prolina forma un ciclo con un grupo
amino secundario y la metionina es un aminocido azufrado con un grupo tioter apolar.
Leucina e Isoleucina se diferencian por la configuracin iso de la segunda. Fuente: Adaptado
de Nelson & Cox (2006).

Grupos R aromticos (aromticos): Forman aminocidos relativamente

apolares (por sus cadenas aromticas) y todos participan en interacciones
hidrofbicas. La tirosina (Tyr) y el Triptfano (Trp) son ms hidroflicos que la
Fenilalanina (Phe) por el grupo hidroxilo del primero y el anillo indlico del
segundo (que contiene un grupo NH), por lo que stos dos ltimos pueden
formar puentes de hidrgeno. Estos aminocidos absorben la luz
ultravioleta de 265 a 285 nm (por lo general, a 280 nm), propiedad utilizada
para caracterizar protenas (en su orden: Triptfano y Tirosina, y en menor
medida, Fenilalanina).

Figura 4. Aminocidos aromticos. En orden de hidrofobicidad (del mayor al menor) estn

Fenilalanina, Triptfano y Tirosina. Obsrvese que el hidroxilo de la Tirosina (Tyr) y el anillo
indlico del triptfano (Trp) ayudan a que sean ms hidroflicos (o menos hidrofbicos) que la
fenilalanina (Phe), puesto que stas estructuras les ayudan a formar posibles puentes de
hidrgeno. Todos absorben luz UV (en menor medida Phe) de 265 a 285 nm (generalmente
280 nm). Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006).

Grupos R polares sin carga (polares): Son

capaces de formar puentes de hidrgeno gracias
(para Serina y Treonina), sulfhidrilo (Cistena) o
Glutamina). Tanto Asparagina como Glutamina se
bases a Aspartato y Glutamato (sales).

aminocidos que son

a sus grupos hidroxilo
amidas (Asparagina y
hidrolizan por cidos o

Figura 5. Aminocidos polares sin carga. Obsrvense los grupos OH de Serina (Ser) y
Treonina (Thr), el grupo sulhidrilo de la Cistena (Cys) y los grupos amida de Asparagina (Asn)
y Glutamina (Gln), los que les confieren el carcter hidroflico a stos aminocidos. Fuente:
Adaptado de Nelson & Cox (2006)

La cistena se oxida hacia un aminocido dimrico unido covalentemente

llamado Cistina, que es la responsable del puente o enlace disulfuro, que
forman uniones fuertemente hidrofbicas entre dos polipptidos o dos
secciones de una protena.

Figura 6. Oxidacin de dos molculas de Cistena (Cys) a Cistina, conformando as una

unin hidrofbica dimrica conocida como puente disulfuro. Fuente: Adaptado de Nelson &
Cox (2006)

Grupos R cargados positivamente (bsicos): Son los ms hidroflicos

entre todos los aminocidos. Lisina se caracteriza por tener un grupo amino
primario en su carbono , Arginina por tener un grupo guanidino cargado
positivamente y la Histidina por tener un anillo imidazol. La Histidina tiene
un pKa del anillo cercano a la neutralidad (6,0) , lo que le da capacidad para
actuar como dador o aceptor de protones en reacciones catalizadas por
enzimas.

Figura 7. Aminocidos con grupos R cargados (bsicos). Se observa el grupo guanidino

positivamente cargado de la Arginina y el anillo de Imidazol de la Histidina. Estos
aminocidos tienen carga neta positiva significativa a pH 7. Fuente: Adaptado de Nelson &
Cox (2006).

Aminocidos con grupos R cargados negativamente (cidos): Tienen

carga neta negativa a pH 7. Est conformados por el Aspartato (cido
asprtico o Asp) y el Glutamato (cido glutmico o Glu), que tienen un
segundo grupo carboxilo.

Figura 8. Aminocidos cidos o con grupo radical cargado negativamente (a pH 7). Ambos
tienen un grupo carboxilo adicional en su radical. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Concluyendo, de todos los grupos de aminocidos se pueden extraer las

siguientes particularidades:
CARACTERSTICA GENERAL
Aminocidos Azufrados
Aminocidos con grupo OH

Aminocidos que pueden formar puentes de

hidrgeno (que tengan OH, SH o NH)

Aminocido que forma parte de una cadena

cclica
Aminocido ms simple
Aminocidos que absorben luz a 280 nm

AMINOCIDOS
Metionina (Aliftico apolar) Met
Cistena (Polar, sin carga) Cys
Tirosina (Aromtico) - Tyr
Serina (Polar, sin carga) - Ser
Treonina (Polar, sin carga) - Thr
Tirosina (Aromtico) Tyr (por su
OH)
Triptfano (Aromtico) Trp (por
si NH del anillo indlico)
Cistena (Polar, sin carga) - Cys
(por SH)
Serina (Polar, sin carga) Ser
(por OH)
Treonina (Polar, sin carga) Thr
(por OH)
Asparragina (Polar, sin carga)
Asn (COO)
Glutamina (Polar, sin carga)
Gln (COO)
Lisina (Polar, con carga) Lys
(NH3)
Arginina (Polar, con carga) Arg
(NH2)
Histidina (Polar, con carga) Hys
(NH)
Prolina (Aliftico, apolar) Pro

Glicina (Aliftico, Apolar) - Gly

Aromticos (Trp, Phe, Tyr)

Propiedades cido-Base de los aminocidos:

Cuando los aminocidos se introducen en agua, estn en forma de in dipolar o

zwitterin (in hbrido en alemn), por lo que estando as puede actuar como
dador de protones (cido) o aceptor de protones (base):

(a)

(b)

Figura 9. Aminocido en su forma de zwitterin, como dador de protones o cido (a) o

como aceptor de protones o base (b). Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Cuando una sustancia de comporta de forma dual como cido o base es una
sustancia anftera (conocida como anfolito o electrolito anftero).

Figura 10. Grfico del comportamiento de un aminocido en su forma de zwitterin en relacin

a las concentraciones de las formas protonadas y desprotonadas de sus grupos ionizables.
Fuente: Adaptado de Nelson & Cox (2006)

Dependiendo de ste comportamiento, es posible calcular el pK a de un

aminocido, es decir, el valor de pH al cual el 50% se encuentra en la forma
disociada y el otro 50% en la forma no disociada (equilibrio entre ambas
formas). Asimismo, los clculos de pK a ayudan a determinar el punto
isoelctrico (pI), que se refiere al pH al cual la carga neta del aminocido es
cero (0). En general, se puede establecer que cuando el pH es alto (hacia la
alcalinidad), el grupo amino tiene una carga de cero mientras que el hidroxilo
una carga neta de -1. Los aminocidos Lisina (Lys), Arginina (Arg) e Histidina
(Hys) pueden ser desprotonados.
Como ejemplo, se ilustrar el clculo del pI para el cido asprtico (Asp), cuyos
pKa se encuentran registrados en tablas:

Tabla 1. Valores de pKa para diferentes aminocidos. Algunos de ellos tienen 3 como
consecuencia de la cadena lateral. En la realizacin de los ejercicios, los valores se ordenan del
menor al mayor.

Y la solucin del ejercicio, con la curva de titulacin, es la siguiente:

Obsrvese en el ejercicio anterior que el cido Asprtico tiene 3 pK a. Asimismo,

que la curva de titulacin se grafica primero en 0,5; luego 1,5; 2,5 y as
sucesivamente, para cada pKa. Y el valor del punto isoelctrico, en el grfico,
se ubica entre el pK a de la carga neta -1 y el pK a de la carga +1 (puesto que en
el punto Isoelctrico la carga neta es 0). Del mismo modo, en cada pK a siempre
hay 50% de la forma disociada y 50% de la forma no disociada (como se
explic anteriormente en el concepto). Con esos porcentajes, se pide
solucionar las siguientes preguntas:

Indique el pH al cual hay 75% de la forma 3:

Como se observa en el grfico, en el pK 3 (10) y pK2 (3.9), hay 50% de la
forma 3. Asimismo, se sabe que a medida que sube la grfica, la forma 3 se
va formando. Por lo tanto:

p H (100 3)=3.9+

103.9
=6.95
2
pH (75 3caso 1)=3.9+

6.953.9
=5.425
2

pH (75 3caso 2)=6.95+

106.95
=8,475
2

Indique el pH al cual hay 25% de la forma 4: Ya se sabe que al 75% de 3, en

el caso 2, se forma el 25% de la forma 4, por lo que 8.475 es la nica
respuesta (no hay ms casos del 25% de 4).

Pptidos:
Los pptidos son secuencias de dos hasta 99 (dependiendo de la bibliografa,
se encuentra que hasta 20 o 50 aminocidos) mediante una unin conocida
como enlace peptdico. Cuando se unen dos aminocidos se llama dipptido,
tres es un tripptido y ms de 3 se considera un oligopptido (cuando son
pocos aminocidos) y polipptido (cuando son muchos aminocidos). El enlace
peptdico es la unin covalente del grupo carboxilo terminal de un aminocido
con el grupo amino inicial de otro aminocido, en un proceso de deshidratacin
que libera 1 molcula de agua (reaccin de condensacin). Se considera
protenas a las masas de ms de 10.000 daltons (10 KD).

Figura 11. Esquema de un enlace peptdico (una reaccin de deshidratacin). La rotura del
enlace peptdico se denomina hidrlisis e implica un rompimiento con participacin de molculas
de agua. Cuando no hay un rompimiento, se denomina hidratacin. Fuente: Adaptado de Nelson
& Cox (2006).

Al final, se dice que el pptido resultante tiene un extremo amino terminal (Nterminal) y un extremo carboxilo terminal (C-terminal), como se observa en el
siguiente grfico:

Figura 12. Esquema de un seril-glicil-tirosil-alanil-leucina o Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu. Fuente:

Adaptado de Nelson & Cox (2006).

El enlace peptdico tiene unas propiedades:

Es rgido y planar: Tiene un comportamiento parcial de doble enlace (40%),

presenta equilibrio en sus formas resonantes y generalmente se encuentra
en la configuracin trans.

Figura 13. Resumen de las estructuras resonantes del polipptido. Fuente: Adaptado de Nelson
& Cox (2006).

Participa en la formacin de puentes de hidrgeno: Los grupos de doble

enlace C-O y enlace sencillo N-H son polares.

As como se realizaron anteriormente ejercicios de pK a de aminocidos,

igualmente pueden hacerse para protenas. Para ello, se ilustrar el siguiente
ejercicio:

Estructura de las Protenas:

La conformacin de los diferentes niveles de las protenas exige del
conocimiento del comportamiento qumico de diferentes tipos de enlaces que
se dan entre las mismas:

Enlaces covalentes: Se presenta cuando un par de tomos comparte

electrones.
Enlaces de Hidrgeno: Es la atraccin electrosttica entre un tomo de
hidrgeno de una molcula de agua con un tomo de oxgeno de otra

molcula de agua. O, en el caso de los pptidos, entre el oxgeno del

carboxilo y el hidrgeno del amino, ambos de un enlace peptdico.
Interacciones van der Waals: Son interacciones electrostticas dbiles
que se dan cuando dos dipolos se atraen entre s.
Enlaces disulfuro: Es un enlace covalente entre dos grupos tiol de dos
cistenas. Es la clave para la conformacin de la estructura terciaria y su
rompimiento se denomina desnaturalizacin.
Interacciones Inicas: Es aquella interaccin en el que uno de los tomos
capta los electrones del otro, por una diferencia grande de
electronegatividad.
Interacciones Hidrofbicas: Son fuerzas que mantienen juntas las
regiones hidrfobas de las molculas, sin interactuar con el agua.

Los niveles de estructura proteica son los siguientes:

Estructura Primaria: Es la secuencia lineal de aminocidos, caracterizada

por el enlace peptdico, un tipo de unin covalente entre dos aminocidos.
Dentro del enlace peptdico se origina un pequeo dipolo elctrico porque
se reparte la carga en parcialmente positiva para el nitrgeno y
parcialmente negativa para el oxgeno. Casi todos los enlaces peptdicos se
encuentran en configuracin trans, aunque hay muy pocas excepciones en
configuracin cis. Los ngulos de giro del enlace peptdico se denominan
phi () para el enlace N-C y psi () para el enlace entre el carbono alfa y
otro carbono (los valores permitidos de ngulos de este tipo se expresan
mediante las grficas de Ramachandran). Los enlaces covalentes necesitan
mucha energa para separarse (200-460 KJ/mol). La rotura de un enlace
peptdico se realiza a un pH>2 y con cidos (HF a 6.0 M o 6.0 N), en un
proceso que se denomina hidrlisis.

Estructura Secundaria: Corresponde a la segunda estructura proteica que

se produce cuando las cadenas primarias se juntan gracias a que se unen
sus aminocidos ms cercanos (vecinos) por medio de enlaces puente de
hidrgeno. Dependiendo de la forma como se unan, se conocen dos tipos de
estructura secundaria:
o

Hlice alfa (): El esqueleto polipeptdico se encuentra totalmente

enrollado alrededor de un eje imaginario longitudinal de la molcula,
sobresaliendo los residuos R de los aminocidos que la conforman. En
la hlice, cada 3.6 aminocidos se produce un giro. En la hlice se
unen el hidrgeno del grupo nitrgeno de un aminocido del enlace
peptdico con el oxgeno electronegativo del grupo carbonilo del
cuarto aminocido siguiente (o entre dos amidas). Cuando hay
muchos grupos carboxlicos cargados negativamente se desestabiliza
la hlice (como sucedera con los grupos Lisina y Arginina cargados
positivamente a pH 7). En cambio, los residuos de Asparagina, Serina,

Treonina y Cistena contribuyen a estabilizar la hlice. La restriccin a

la formacin de la hlice es la presencia de residuos de prolina
(porque existe un tomo de nitrgeno unido al carbono alfa, por lo
que el giro C-N no es posible y dicho N no tiene hidrgenos libres
para formar puentes de hidrgeno con otro aminocido) y la glicina
(es rara su presencia en alfa hlices puesto que tiene mucha
flexibilidad conformacional).
Los cinco tipos de restricciones que afectan una hlice son:

Repulsin o atraccin electrosttica entre los grupos R

cargados de los aminocidos presentes.
Volumen de los grupos R adyacentes.
Interacciones entre cadenas separadas 3 o 4 residuos.
Presencia de residuos de Glicina y Prolina.
Interaccin entre residuos de aminocidos de la hlice y el
dipolo elctrico formado.

Lmina beta (): Conformacin simple formada por dos o ms

cadenas
polipeptdicas
paralelas
o
antiparalelas,
unidas
estrechamente por puentes de hidrgeno.

Paralelas: Reaccionan dos hebras del mismo sentido (cadenas

1-3)
Antiparalelas: Reaccionan dos hebras de sentidos opuestos
(cadenas 1-2 2-3).

Figura 14. Lminas beta paralelas y antiparalelas. Fuente: Adaptado de Nelson & Cox
(2006).

Algunas protenas globulares, en su empaquetamiento, constan de

unos giros en los que la estructura de lmina beta cambia de sentido,
denominados giros beta, y conectan los extremos de dos segmentos
de hojas antiparalelas. La estructura forma un giro cerrado de 180
implicando cuatro residuos de aminocidos que pueden formar un
puente de hidrgeno. Glicina (por su pequeo tamao) y prolina (por
la facilidad con que su nitrgeno imino forma configuraciones cis) se
encuentran involucradas en los giros. Los giros hacen conexiones ,
, o .
o

Superestructuras Secundarias: Se refiere a los motivos, que es la

combinacin estructural de varias estructuras secundarias. Cuando
estos motivos son repetitivos en una misma protena, pero no
necesariamente con la misma funcin, reciben el nombre de
dominios.

Estructura Terciaria: Es un nivel superior de conformacin proteica

(estructura) en la que se forman los puentes disulfuro entre cadenas
secundarias, por medio de la oxidacin de residuos de cistena. Las
interacciones presentes en la estructura terciaria pueden ser los puentes
salinos (interacciones carga-carga o +/- entre cadenas laterales), enlaces

puente de hidrgeno internos (contribuyen a estabilizar, son dbiles),

interacciones van der Waals (interacciones intramoleculares que dan buena
estabilidad), interacciones hidrofbicas (entre los grupos hidrfobos por el
plegado) e interacciones covalentes (por el puente disulfuro cuando hay dos
Cys cercanas).
Los aminocidos hidrofbicos van hacia el interior y los hidroflicos hacia el
exterior. De acuerdo a la forma como se establezcan los puentes disulfuro,
ste tipo de estructura puede ser (estas dos clases de protenas se
denominan holoprotenas o protenas simples, que slo estn formadas por
aminocidos):
o

Fibrosa: Sus cadenas polipeptdicas se encuentran en forma de

hebras u hojas (un nico tipo de estructura secundaria).
Generalmente forman estructuras en los seres vivos como la quitina,
queratina, pelo y uas (colgeno, queratinas, elastinas y fibronas)
Globular: Sus cadenas polipeptdicas se encuentran en forma de
glbulos o esferas. Pueden ser prolaminas (zena del maz), glutelinas
(gluten del trigo), albminas (lactoalbmina y ovoalbmina),
hormonas (insulina, prolactina) y enzimas (hidrolasas, liasas, ligasas,
transferasas, etc.).

Hay otra clase de protenas, las heteroprotenas (protenas conjugadas) que

pueden ser las glicoprotenas (anticuerpos), lipoprotenas (HDL, LDL),
nucleoprotenas (ribosomas) y cromoprotenas (citocromos, hemoglobina).

Estructura Cuaternaria: Son conformaciones estructurales proteicas de

ms de 1 monmero (o ms de una cadena polipeptdica en forma
simtrica). Los monmeros se unen por puentes salinos, interacciones
hidrofbicas, enlaces van der Waals, enlaces puente de hidrgeno y enlaces
covalentes (puentes disulfuros) (stos ltimos no son muy comunes; se
presentan generalmente en las inmunoglobulinas y la insulina). En la
desnaturalizacin, se pierde la estructura cuaternaria, terciaria, secundaria
pero no la primaria y puede ser total o parcial dependiendo del agente al
que se exponga la protena.
En la reversible, se agregan agentes (urea y -mercaptoetanol) y si luego se
retiran, se produce un plegamiento de la protena (por la nueva formacin
de puentes disulfuro, en un proceso conocido como renaturalizacin, donde
se reestablecen los puentes disulfuro de forma correcta y la protena vuelve
a su anterior plegamiento o conformacin). En la irreversible, se utilizan
agentes como el calor (que rompe todas las interacciones dbiles) o los pH
extremos (que cambian la carga de los aminocidos ionizables, alterando
los enlaces en los que participan).

TEMA 2: PURIFICACIN DE PROTENAS

La purificacin de protenas va ligada a tres conceptos importantes:

Actividad Especfica (AE): Es la seccin de protenas del total que tienen

determinada actividad.

AE=

Rendimiento (R): Es la cantidad de protena realmente extrada de la

seccin previamente seleccionada:

R=

Unidades totales en la fraccin i

Total de protenas en la fraccini

Unidades totales enla fraccin i

Unidades totales en la fraccin original

Porcentaje de Purificacin (P): Es la relacin que hay entre la actividad

especfica de una protena frente a la actividad especfica total de la
fraccin.

P=

AE en la fraccin i
AE en la fraccin original

En la purificacin no se hace identificacin de protenas sino extraccin de las

mismas. Los pasos para hacer una purificacin son (en cada paso debe hacerse
un seguimiento para determinar si lleva las protenas de inters):

Obtener el extracto crudo: Por medio de mtodos fsicos o mecnicos.

Pueden usarse mtodos abrasivos (no recomendados porque puede liberar
a protena y dejarla ir), homogeneizacin o extrusin a alta presin.
En los mtodos qumicos pueden usarse sustancias como lcalis, solventes,
detergentes (slo con membranas) o sustancias caotrpicas. Para
extraccin de organelos por diferencia de densidad se puede utilizar la
centrifugacin diferencial. A veces se utilizan enzimas que degradan a las
clulas.

Fraccionamiento de la protena por precipitacin (precipitacin con

sulfato amnico y dilisis): Se puede usar:
o

Desnaturalizacin de protenas (uso de diferentes temperaturas

para precipitarlas o uso de pH extremos, teniendo en cuenta los pI
proteicos).

Uso de solventes orgnicos: Se modifica la constante dielctrica

de las protenas, estimulando formacin de puentes de hidrgeno y la
posterior precipitacin.
Adicin de sales (salting out): Se pueden usar sales como sulfato
de amonio [(NH4)2SO4] para precipitar las protenas. Las sales se
eliminan por centrifugacin. La protena de inters queda en el
sobrenadante al centrifugarse (o en el precipitado). Las sales actan
evitando las interacciones agua-protena (son secuestrantes de
agua), obligando a las protenas a interactuar entre s y precipitarse.

Posteriormente, se puede utilizar la dilisis, que es el uso de membranas de

dilisis de tamaos de poros variados para separar las protenas de los
disolventes. Primero se hidrata la membrana (hasta que alcance la textura
elstica) y luego se llena con el contenido (debe quedar ajustado) y
posteriormente se sumerge en agua destilada (al menos 1L). La membrana
se suspende sin tocar las paredes del recipiente. La dilisis se hace a
temperaturas de refrigeracin.

Hacer cromatografa en columna: Se basa en el principio de

cromatografa, donde una fase mvil fluye sobre una estacionaria,
permitiendo la separacin de una mezcla. Puede ser de tres tipos:
o

Cromatografa de intercambio inico (separa por cargas):

Hace separacin de acuerdo a la carga elctrica de las protenas
donde la fase estacionaria es un soporte insoluble que contiene
grupos cargados (carboximetilos si es carga negativa; dietilaminoetil
si es positivo) y la fase mvil es un gradiente de sal o pH (a bajas
concentraciones de sal salen las protenas menos electronegativas y
a altas concentraciones de sal salen las ms electronegativas). Las
perlas estn cargadas positivamente, y van diluyendo la muestra
hasta dejar eluir las protenas ms negativas (o las ms positivas;
primero salen las menos afines). La extraccin se puede ayudar de
una bomba peristltica. Las protenas pueden medirse a 280 nm y la
concentracin debe ir aumentando. Al final, la columna se lava.

Cromatografa de exclusin molecular (separa por masas): Las

protenas de mayor tamao emergen antes que las pequeas. Se
tienen unas perlas que no dejan pasar las protenas ms grandes, por
lo que estas toman el camino ms corto y rodean a las partculas por
el exterior, mientras que las ms pequeas s pasan por todas las
cavidades y se demoran ms. No se considera un mtodo muy
efectivo porque su separacin no es tan precisa (es muy gruesa).

Cromatografa de afinidad (separa por sus propiedades

biolgicas): Es un mtodo de alta pureza donde las protenas tienen

un grupo qumico unido covalentemente, por lo que las ms afines a

las partculas de la columna saldrn ms tardamente. Por ello, las
protenas no deseadas son las que saldrn al principio, y las de
inters (atrapadas en la columna) sern eludas al lavar la columna
con una solucin de ligando (solucin competitiva).
o

HPLC (Cromatografa Lquida de Alta Resolucin): Utiliza

bombas de alta presin que aceleran el movimiento de las molculas
protenicas en la columna.

Hacer electroforesis (para separar e identificar, posteriormente): Realiza

una separacin de protenas por peso molecular. Utiliza geles de acrilamida
(redes o estructuras lineales) o biacrilamida (estructuras transversales).
Generalmente se utilizan dos geles:
o

Gel separador: Se prepara y gelifica primero. Se forma una estructura

de peine (en caso de dejar residuos, se limpia con buffer) y se coloca
muestra en cada pozo (en el caso de que un pozo quede
contaminado por otro, se puede adicionar buffer y succionar los poros
ensuciados).
Gel concentrador: organiza las muestras, permitiendo que corran al
mismo tiempo.

EL gel es poroso, y va atrapando en las capas superiores las protenas de

mayor peso molecular, y en las capas ms inferiores las de menor peso
molecular. Se recomienda hacer el ensayo hacia el centro del gel (puesto
que en los extremos se distorsionan las protenas) y se hace pasar una
carga elctrica para estimular el movimiento proteico a travs del gel. Si el
gel debe guardarse, para evitar su deshidratacin se coloca en una bolsa
con agua en el fondo, se cierra la bolsa y se refrigera.
o

Electroforesis en poliacrilamida SDS: Se utiliza el detergente

dodecil sulfato sdico (SDS), puesto que se une a las protenas en
forma proporcional a la masa de las mismas, aportando una alta
carga negativa y hace que los polipptidos pequeos se desplacen
ms rpidamente. Luego de la separacin, se aade Azul de
Coomassie para visualizar las protenas (el colorante se adhiere a las
protenas ms no al gel).
Enfoque isoelctrico: Determina el punto isoelctrico de una
protena. Un conjunto de cidos y bases se distribuye a lo largo del
gel (gracias a una corriente elctrica) y luego se adiciona la mezcla
de protenas, que se desplazan hasta que su pH alcanza el punto
isoelctrico.

Electroforesis bidimensional: Es la combinacin de los dos

mtodos anteriores y es el mtodo ms sensible que hay. Separa
protenas de diferentes masas moleculares pero pI similares o de
diferentes pI pero masas moleculares similares. Entonces, se forman
columnas con el mismo pI (pero sus pesos moleculares son
diferente).

TEMA 3: INMUNODETECCIN DE PROTENAS

Es la utilizacin de anticuerpos que se unen a determinas protenas y luego,
mediante la identificacin de dichos anticuerpos, se identifican las protenas
enlazadas. Los anticuerpos pueden ser de dos tipos:

Anticuerpos primarios: El anticuerpo slo lleva consigo una enzima. Cada

protena lleva 1 anticuerpo primario.
Anticuerpos secundarios: El anticuerpo lleva consigo un sistema de
deteccin (pero no lleva la enzima). Cada mtodo lleva 1 anticuerpo
secundario (por lo tanto, si se corren todas las protenas con un anticuerpo
primario por cada una, con el mismo secundario por mtodo, hay un ahorro
de anticuerpos).

Como ejemplo, por ejemplo se introduce determinada protena en un animal,

por lo que ste reacciona formando un anticuerpo de dicha protena (llmese
Anticuerpo X, al reconocer el antgeno extrao o la fraccin de la protena que
es extraa). Esos anticuerpos X se introducen en otro animal, por lo que el
animal forma nuevos anticuerpos (llmese anticuerpos Y, o anti anticuerpos X).
Se busca que los anticuerpos utilizados reconozcan secciones proteicas
especficas (eptopes); los anticuerpos ms caros son los mononucleales
(reconocen un nico eptope) mientras que los polinucleales (reconocen varios
eptopes) son ms baratos.
Las formas de deteccin de protenas son:

Mtodos colorimtricos: Genera una seal en forma de color. Por

ejemplo, en la unin de peroxidasa con un sustrato (DH 2) para generar agua
y un color. El Test de Elisa se basa en un principio colorimtrico.
Mtodos fluorimtricos: Utiliza fluorescencia para la identificacin.
Mtodos quimioluminiscentes: Utiliza reacciones qumicas que emiten
luz.
Mtodos electroqumicos: Puede ser potenciomtrico, voltamtrico o
amperomtrico.

Las tcnicas ms usadas de Inmunodeteccin de protenas son:

Test de ELISA (mtodo colorimtrico) (Enzyme Linked Inmuno

Sorbent Assay): Es un mtodo que slo cuantifica mediante la apertura de

clulas o tejidos. Se basa en utilizar un pocillo que tiene un anticuerpo, el

cual se une a la protena (primer sustrato). Se hace un lavado (para eliminar
el exceso de sustancias, con buffer o mezclas buffer-detergente) y luego se
adiciona un segundo anticuerpo a la unin anticuerpo-protena que ha
quedado en el pocillo. Posteriormente, se adiciona un segundo sustrato que
provoca el cambio de color, el cual se mide por espectrofotometra. A veces
se mide la actividad del anticuerpo o la actividad del antgeno (en este
caso, se llama Indirecto).
Utiliza peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Mtodo Western-Blot: A diferencia de Elisa, se hace sobre medio slido y

requiere de una electroforesis inicial. No es un mtodo de cuantificacin
sino de deteccin (tcnica cualitativa, pero con posibilidad de
cuantificacin). Utiliza luminol y perxido de hidrgeno. Los pasos son:
o
o

Primero se hace una electroforesis en gel SDS.

Posteriormente, las protenas se pasan a una membrana (por el uso
de corriente) y se tie la membrana con Rojo de Ponceau (si se desea
saber si tiene protena).
Se incuba con anticuerpos. Se agrega un anticuerpo primario que
reconoce a la protena y se une a ella. Luego, un anticuerpo
secundario que reconoce al primario (el secundario lleva un
indicador, la Hot Raddish Peroxidase o HDR).
Se adiciona un sustrato que produzca luz y se detecta la luz con placa
de rayos X.

Al final slo debe salir 1 mancha negra que indica la protena de inters; si
salen varias indicara que la protena se degrad en secciones o que sufri
reacciones inespecficas.

Inmunoprecipitacin: Es una tcnica utilizada para estimular

precipitaciones de protenas. No se utiliza para cuantificar o detectar, sino
para reducir la cantidad de protenas de la muestra. En primer lugar, se
adiciona un anticuerpo que reconoce la protena. Luego, se estimula la
formacin de complejos agregando ms protenas (A o G) u otros
anticuerpos, se centrifuga y se retira el sobrenadante; el precipitado se
mide con Western o Elisa.

Pruebas inmunohistoqumicas: Se utilizan especficamente

localizar en tejidos o clulas a las protenas. Los pasos son:
o
o

para

Se coloca el tejido en un medio de conservacin (formalina o

formaldehdo) y se congela en un criostato.
Se pasan los tejidos a parafina y se hacen rebanadas celulares con
micrtomos.

o
o

Se recuperan las rebanas en portaobjetos.

Se incuba la muestra con un anticuerpo primario que identifica a la
protena de inters (lleva una enzima), emitiendo una seal (cambio
de color o fluorescencia).

TEMA 4: SECUENCIACIN DE PROTENAS

La secuenciacin de protenas se utiliza para determina la secuencia especfica
de cidos (su orden) dentro de un polipptido o protena. Los pasos para
realizarla son:

Determinar composicin de aminocidos: Por hidrlisis cida (completa

o parcial) y luego cromatografa.
Identificar grupos terminales:
o

Amino N terminal: Con otra muestra distinta, se marca el

aminocido N-terminal utilizando:
Mtodo de Sanger: 1-F-2,4-dinitrobenceno (color amarillo)
Mtodo del cloruro de dansilo (ClDNS): Sustancia
fluorescente, por lo que se debe tener un detector de
fluorescencia).
Degradacin de EDMAN: Se utiliza hasta 50 aminocidos y
slo hidroliza el grupo amino terminal.
Marca amino terminal con fenil tiocianato.
Va liberando poco a poco los aminocidos, permitiendo
ver el orden.

Identificar Carboxilo terminal: Por medio de estndares, se

detecta
el
aminocido
utilizando
Hidrazina
(NH 2-NH2),
carboxipeptidasas o borohidruro de litio.

Reduccin (ditioeritriol o -mercaptoetanol) u oxidacin (cido perfrmico)

de puentes disulfuro:
Hidrlisis parcial.
Secuenciacin de pptidos.
Establecimiento de secuencia.
Localizacin de puentes disulfuro.

TEMA 5: ENZIMAS: