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MICOBACTRIAS
As micobactrias so microrganismos que apresentam forma bacilar
com dimenses que variam de 0,2m a 0,6m de largura e 1m a 10m de
comprimento. So bacilos delgados, retos ou ligeiramente curvos, pleomrficos,
aerbios ou microaerfilos, imveis e incapazes de formar esporos, condeos ou
cpsulas. O tempo de multiplicao geralmente lento e apresenta grande variao
dentro do gnero, o que permite dividi-las em micobactrias de crescimento rpido
(crescimento visvel em menos de sete dias) e em micobactrias de crescimento
lento (crescimento visvel em mais de sete dias) (Leo et al., 2004; Brasil, 2005;
Barrera, 2007). As espcies, em sua maioria, so saprfitas, vivem e replicam-se
em ambientes naturais, ao passo que uma pequena parcela adapta-se ao ambiente
intracelular, tornando-se patgenos preferencialmente de vertebrados superiores
(Barrera, 2007).
Embora classificadas como Gram-positivas, as micobactrias no so
coradas pela colorao de Gram, mas pelos mtodos de Ziehl-Neelsen e de Kinyoun
usualmente. Ambas as tcnicas utilizam a carbolfucsina que confere colorao
vermelha s micobactrias. Por resistirem ao descoramento subsequente com
soluo lcool-cido, receberam a designao de bacilos lcool-cido resistentes
(BAAR) (Gutierrez et al., 2001; Rosemberg & Tarantino, 2002).
Esta caracterstica tintorial deve-se ao alto teor de lipdios cerca
de 60% que integra a sua parede celular, composta basicamente por uma
membrana citoplasmtica recoberta por espessa camada de peptidoglicano (cido
N-glicolilmurmico), o qual se encontra covalentemente ligado s cadeias de
arabinogalactano (polissacardeo) que, por sua vez, esto esterificadas na sua
extremidade com cidos graxos de cadeia longa, os cidos miclicos. H tambm
protenas e lipdios livres que no esto ligados covalentemente a este esqueleto
basal (complexo arabinogalactano-peptideoglicano). Dentre estes, o cido miclico
o principal responsvel por conferir s micobactrias resistncia descolorao
por lcool-cido, assim como a resistncia ao de diversos agentes qumicos
e antibiticos e a capacidade de formar de biofilmes (Castro & Trabulsi, 1998;
Rosemberg & Tarantino, 2002; Gumber et al.,2007).
TAXONOMIA E CLASSIFICAO
Em 1896, Lehmann e Neumann propuseram a criao do gnero
Mycobacterium, visando incluso dos bacilos da tuberculose e da hansenase, at
ento classificados como Bacterium tuberculosis e Bacterium leprae (Goodfellow
& Magee, 1997). Este gnero tem sofrido atualizaes constantes e a ele pertencem
142 espcies e 11 subespcies. Faz parte da famlia Mycobacteriaceae juntamente
com o gnero Amycolicicoccus e est posicionado taxonomicamente na subordem
Corynebacterineae, que pertence ordem Actinomycetales, da subclasse
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Patognicas
M. tuberculosis
M. branderi
M. celatum
M. bovis
M. africanum
M. microti
Potencialmente patognicas
M. genavense
M. malmoense
M. simiae
M. haemophilum
M. marinum
M. szulgai
M. chelonae
M. fortuitum
M. intracellulare
M. peregrinum
M. ulcerans
M. kansasii
M. scrofulaceum
M. xenopi
Raramente patognicas
M. agri
M. cooki
M. gordonae
M. phlei
M. terrae
M. alchiense
M. diernhoferi
M. hassiacum
M. porcinum M. thermoresistible
M. alvei
M. duvalii
M. homossenze
M. pulveris
M. tokaiense
M. brumae
M. fallax
M. lepraemurium
M. rhodesiae
M. triviale
M. austroafricanum M. farcinogenes
M. mucogenicum
M senegalense
M. vaccae
M. chitae
M. flavescens M. nonchromogenicm M. shimoidei
M. gilvum
M. chubuense
M. gadium
M. neoaurum
M. smegmatis
M. aurum
M. confluentis
M. gastri
M. obuense
M. sphagni
Fonte: Brasil, 2008d.
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M. kansasii
M. leprae
M. malmoense
Pulmes
Complexo M. avium
M. genavense
M. haemophilum
M. marinum
Pele
M. scrofulaceum
M. ulcerans
Linfonodos (cervicais)
Pele
M. xenopi
Pulmes
MNT
(crescimento rpido)
M. chelonae
M. abscessus
M. fortuitum
Pele, cateter
M. massiliense
Pele, articulaes
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Kanufre, 2007; Brasil, 2008d). Nos meios slidos, a morfologia colonial varivel,
podendo ser lisa ou rugosa mesmo em isolados da mesma espcie , pigmentada
ou no pigmentada. Esse pigmento, usualmente no difusvel, pode variar do
amarelo ao alaranjado, sendo normalmente decorrncia da sntese de -carotenos
(Leo et. al, 2004). As leituras devem ser realizadas 48 horas aps a semeadura e a
incubao (para verificar se houve contaminao) e, posteriormente, de sete em sete
dias at completar oito semanas (Brasil, 2008d).
Como o tempo de crescimento bacilar varia de duas a seis semanas,
a cultura apresenta como desvantagem o tempo necessrio para a liberao
do resultado. Por isso, foram desenvolvidos sistemas semiautomticos e
automatizados que reduzem o tempo de emisso do resultado para uma a quatro
semanas. Esses sistemas utilizam ensaios radiomtricos e/ou colorimtricos para
a deteco de CO2 produzido e O2 consumido durante o crescimento bacilar
(Ganguly, 2002; Kanufre, 2007).
Identificao Fenotpica
A identificao fenotpica da espcie de micobactrias baseada em testes
bioqumicos e caractersticas de crescimento. Ela feita a partir do primo-cultivo,
que deve estar em crescimento ativo de trs a quatro semanas. , tambm, necessria
a verificao da ausncia de contaminao e um nmero de colnias superior a 20,
exceto em lquidos estreis, como lquor. A sequncia de mtodos para identificao
composta de testes para separao do CMTB das MNT, diferenciao das espcies
do CMTB e identificao das MNT (Brasil, 2008d).
A separao das espcies do CMTB das MNT feita pelos seguintes
testes: anlise microscpica e macroscpica da cultura, inibio do crescimento em
meio com cido p-nitrobenzico (PNB) e teste da niacina. A anlise microscpica
til na avaliao da pureza da cultura, da presena de BAAR e da formao de corda
(as espcies do CMTB apresentam a formao de corda, ao contrrio da maioria dos
MNT). Em relao anlise macroscpica, as colnias do CMTB so acromgenas,
geralmente de cor creme e rugosas; as colnias de MNT so pigmentadas ou
acromgenas, lisas ou rugosas. O teste de inibio de crescimento em meio
com PNB separa os membros do CMTB, que so sensveis, das MNT, que so
resistentes, excetuando-se algumas cepas de M. kansasii, M. gastri, M. gordonae e
M. marinum. O teste da niacina baseia-se na deteco visual da produo de niacina
pela bactria. Embora seja produzida por todas as micobactrias, somente algumas
espcies do CMTB, como o M. tuberculosis e M. africanum e raras espcies de
MNT, produzem quantidades detectveis por meio deste teste (Brasil, 2008d).
Para a diferenciao das espcies do CMTB, podem ser realizados os
seguintes testes: crescimento em meio LJ com glicerol e LJ com piruvato de sdio,
inibio de crescimento em meio com hidrazida do cido tiofeno 2-carboxlico
(TCH), estreptomicina e cicloserina, preferncia pelo oxignio, pirazinamidase,
teste de reduo de nitrato, urease e niacina (Brasil, 2008d).
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A identificao das espcies das MNT pode ser feita pelos testes de
produo de pigmento, crescimento a 45oC e a 25oC, determinao do tempo de
crescimento em LJ, meio Sauton com cido pcrico e em gar comum, inibio
de crescimento em meio com NaCl 5%, arilsulfatase, hidrlise do Tween 20,
-galactosidase, reduo do telurito de potssio (Brasil, 2008d).
As principais limitaes do mtodo fenotpico consistem na demora para
obteno de resultados, na dificuldade de diferenciao de diversas espcies e nos
resultados duvidosos que podem ser apresentados por alguns testes bioqumicos,
alm de serem trabalhosos. Considerando estes aspectos, os LACENs realizam
apenas os testes para diferenciao entre o CMTB e as MNT (PNB e niacina) e o
TCH para diferenciar M. tuberculosis (resistente) dos outros membros do CMTB
(sensveis). Quando os resultados diferem dos esperados para CMTB, a cultura
em LJ encaminhada, para identificao da espcie, ao Laboratrio de Referncia
Nacional, o Centro de Referncia Professor Hlio Fraga no Rio de Janeiro (Brasil,
2008d). No caso das MNT, deve-se ter cautela em atribuir-lhes a responsabilidade
pela etiologia da doena, visto que podem significar uma contaminao ambiental e
no uma infeco real. Assim, o Centro de Referncia Professor Hlio Fraga emitiu,
em 2009, uma nota tcnica regulamentando o envio de cepas para identificao,
com o propsito de confirmar os casos de micobacterioses. So consideradas
infeces por MNT casos que apresentarem uma amostra com cultura positiva
proveniente de stio estril ou duas ou mais amostras com cultura positiva, com mais
de dez colnias, proveniente de stio no estril (Brasil, 2009b).
Diagnstico molecular
A necessidade de um teste rpido para o diagnstico laboratorial das
micobactrias levou ao desenvolvimento dos mtodos moleculares para a deteco
e identificao das espcies, diretamente de amostras clnicas ou a partir das
colnias isoladas em cultivo (Mello et al., 2005). Entre as tcnicas utilizadas para
o diagnstico, encontram-se aquelas que promovem a amplificao do material
gentico, como a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR Polymerase Chain
Reaction) e suas variaes (Nested-PCR e Multiplex-PCR, por exemplo). E, para a
identificao das espcies, h as tcnicas que empregam sondas genticas (Sistema
AccuProbe, por exemplo), sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR,
anlises com enzima de restrio (como o PRA-hsp65) e o HMA (Heteroduplex
Mobility Assay Ensaio de mobilidade eletrofortica de fitas heteroduplas).
Reao em Cadeia da Polimerase ( PCR)
A tcnica da PCR baseia-se na amplificao enzimtica de uma sequncia
especfica de DNA. Esta reao ocorre em ciclos, que so compostos por trs
etapas: desnaturao, pareamento e extenso. A desnaturao do DNA requer uma
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225
23. Dantec L, Duguet JP, Montiel A, Dumoutier N, Dubrou S, Vicente V. Ocurrence of mycobacteria
in water treatment lines and in water distribuition system. Appl Environ Microbiol 68: 5318-5325,
2002.
24. Delwart EL, Sheppard HW, Walker BD, Goudsmit J, Mullins JI. Human Immunodeficiency Virus
Type 1 Evolution In Vivo Tracked by DNA Heteroduplex Mobility Assays. J Virol 8: 6672-6683,
1994.
25. Duarte RS, Loureno MC, Fonseca L de S, Leo SC, Amorim Ede L, Rocha IL, Coelho FS,
Viana-Niero C, Gomes KM, da Silva MG, Lorena NS, Pitombo MB, Ferreira RM, Garcia MH, de
Oliveira GP, Lupi O, Vilaa BR, Serradas LR, Chebabo A, Marques EA, Teixeira LM, Dalcolmo M,
Senna SG, Sampaio JL. Epidemic of postsurgical infections caused by Mycobacterium massiliense.
J Clin Microbiol 47: 2149-2155, 2009.
26. Euzeby JP. List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. Disponvel em: http://www.
bacterio.cict.fr. Acesso em: jul/2010.
27. Falkinham III JO. Epidemiology of Infection by Nontuberculous Mycobacteria. Clin Microbiol Rev
9: 77-215, 1996.
28. Field SK, Cowie RL. Lung Disease Due to the More Common Nontuberculous Mycobacteria. Chest
129: 1653-1672, 2006.
29. Fontana RS. As micobactrias de crescimento rpido e a infeco hospitalar: um problema de sade
pblica. Rev Bras Enferm 61: 371-376, 2008.
30. Ganguly NK. What is new in diagnosis of tuberculosis? Part I: techniques for diagnosis of
tuberculosis. ICMR Bulletin 32, 2002. Disponvel em: http://icmr.nic.in/buaug02.pdf. Acesso em:
ago/2009.
31. Garg SK, Tiwari RP, Tiwari D, Singh R, Malhotra D, Ramnani VK, Prasad GBKS, Chandra R,
Frazino M, Colizzi F, Bisen PS. Diagnosis of Tuberculosis: Available Technologies, Limitations,
and Possibilities. J Clin Lab Anal 17: 155-163, 2003.
32. Gentry CA. Atypical Mycobacteria. In: Schumockv GT, Brundage D, Chessman K, Dunsworth
T, Fagan S, Kelly W, Rathburn R, Richie D, Semla T, Vasquez E, Zarowitz B. Pharmacotherapy
Self-Assessment Program Infectious Diseases II. 5.ed. Kansas City: American College of Clinical
Pharmacy, 2005.
33. Goodfellow M, Magee JG. Taxonomy of Mycobacterium. In: Mycobacteria I Basic Aspects v. I.
New York: Chapman and Hall Medical Microbiology Series, v.1, 1997. p. 99-126.
34. Groote MA, Huitt G. Infections due to rapidly growing mycobacteria. Clin Infect Dis 42:
1.756-1.763, 2006.
35. Gumber S, Taylor DL, Whittington RJ. Protein extraction from Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis: Comparison of methods for analysis by sodium dodecyl sulphate polyacrilamide
gel eletrophoresis, native PAGE and surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass
spectrometry. J Microbiol Meth 68: 115-127, 2007.
36. Gutierrez RS, Santos BR, Espina CAA, Azambuja HCP, Silva LCC. Tuberculose. In: Silva LCC.
Condutas em pneumologia. Rio de Janeiro (RJ): Revinter 1: 2001. p. 412-444.
37. Haddad DJ, Ide J, Ferrazoli L, Seiscento M, Telles MAS, Maria Martins C, Leite OM, Ueki SYM.
Micobacterioses: Recomendaes para o diagnstico e tratamento. Secretaria Estadual de Sade
de So Paulo. Coordenadoria de Doenas Infecciosas, 2005. p.29.
38. Henry MT, Inamdar L, Oriordain D, Schweiger M, Watson JP. Nontuberculous mycobacteria in
non-HIV patients: epidemiology, treatment and response. Eur Respir J 23: 741-746, 2004.
39. Hermans PWM, Schuitema, ARJ, van Soolingen D, Versteynen CPHJ, Bik EM, Thole JER, Kolk
AHJ, van Embden JDA. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by
polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 28: 1.204-1.213, 1990.
40. Hughes MS, Skuce RA, Beck LA, Neill SD. Identification of mycobacteria from animals by
restriction enzyme analysis and direct DNA cycle sequencing of polymerase chain reactionamplified 16S rRNA gene sequences. J Clin Microbiol 31: 3.216-3.222, 1993.
41. Jarzembowski JA, Young MB. Nontuberculous Mycobacterial Infections. Arch Pathol Lab Med
132: 1.333-1.341, 2008.
Vol. 40 (3): 207-229. jul.-set. 2011
227
42. Kanufre KA. Tuberculose pulmonar: aumento da eficincia diagnstica pela associao de mtodos
microbiolgicos e imunolgicos para pesquisa de anticorpos IgG anti - Mycobacterium tuberculosis
por Western blotting e interferon-gama.141 f. [Tese Doutorado em Fisiopatologia Experimental]
Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2007.
43. Katoch VM. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM). Indian J Med Res 120:
290-304, 2004.
44. Koh WJ, Kwon OJ, Lee KS. Nontuberculous Mycobacterial Pulmonary Diseases in
Immunocompetent Patients. Korean J Radiol 3: 145-157, 2002.
45. Leo SC, Martin A, Meija GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MAS, Portaels F. Practical handbook
for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria. 1. ed. European Commision,
International Cooperation for Developing Countries, 2004. Disponvel em: http://www.
esmycobacteriology.eu/PDF%20files/foreword.pdf. Acesso em: out/2009.
46. Lopes ML, Lima KVB, Leo SC, Sousa MS, Santi LQ, Loureiro ECB. Micobacterioses associadas
a procedimentos mdicos invasivos em Belm (nota prvia). Rev Para Med 19: 87-89, 2005.
47. Lopes AJ, Capone D, Mogami R, Tessarolo B, Cunha DL, Capone RB, Siqueira HR, Jansen JM.
Tuberculose extrapulmonar: aspectos clnicos e de imagem. Pulmo 15: 253-261, 2006.
48. Macente S, Ribeiro FHM. Diagnstico molecular de M. tuberculosis. Saud Pesq 2: 225-231, 2009.
49. Marinho A, Fernandes G, Carvalho T, Pinheiro D, Gomes I. Micobactrias atpicas em doentes sem
sndroma de imunodeficincia adquirida. Rev Port Pneumol 14: 323-337, 2008.
50. Martin-Casabona N, Bahrmand AR, Bennedsen J, Ostergaard Thomsen V, Curcio M, FauvilleDufaux M, Feldman K, Havelkova M, Katila M-L, Kksalan K, Pereira MF, Rodrigues F, Pfyffer
GE, Portaels F, Rossell Urgell J, Rsch-Gerdes S, Tortoli E, Vincent V, Watt B. Non-tuberculous
mycobacteria: patterns of isolation. A multicountry retrospective survey. Int J Tubercul Lung Dis 8:
1.186-1.193, 2004.
51. Martinez S, Mcadams HP, Batchu CS. The many faces of pulmonary nontuberculous mycobacterial
infection. Am J Roentgenol 189: 177-186, 2007.
52. Mello FCQ. Modelos Preditivos para o diagnstico de Tuberculose Pulmonar Paucibaciliar. 2001.
186 f. [Tese Doutorado em Clnica Mdica] Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Rio de Janeiro, 2001.
53. Mello FCQ, Fonseca-Costa JA. Utilidade da biologia molecular no diagnstico da tuberculose. J
Bras Pneumol 31: 188-190, 2005.
54. Menon PK, Kapila K, Ohri VC. Recent advances in tuberculosis diagnostic techniques. MJAFI 56:
143-148, 2000.
55. Niemann S, Richter E, Rsch-Gerdes S. Differentiation among members of the Mycobacterium
tuberculosis complex by molecular and biochemical features: evidence for two pyrazinamidesusceptible subtypes of M. bovis. J Clin Microbiol 38: 152-157, 2000.
56. Pandolfi JR, Malaspina AC, Santos ACB, Suffys PN, Oellemann MAC, Valentini SR, Leite CQF.
Tuberculose e o estudo molecular da sua epidemiologia. Rev Cienc Farm Bsica Apl 28: 251-257,
2007.
57. Pedro HSP, Pereira MIF, Goloni MRA, Ueki SYM, Chimara E. Isolamento de micobactrias
no-tuberculosas em So Jos do Rio Preto entre 1996 e 2005. J Bras Pneumol 34: 950-955, 2008.
58. Pitombo MB, Lupi O, Duarte RS. Infeces por micobactrias de crescimento rpido resistentes a
desinfetantes: uma problemtica nacional? Rev Bras Ginecol Obstet 31: 529-533, 2009.
59. Primm TP, Lucero CA, Falkinhem JO. Health impacts of environmental mycobacteria. Clin
Microbiol Rev 17: 98-106, 2004.
60. Ramachadran R, Paramasivan CN. What is new in the diagnosis of tuberculosis? Indian Journal of
Tuberculosis 50: 133-141, 2003.
61. Reniss Rede Nacional de Investigao de Surtos e Eventos Adversos em Servios de Sade. Casos
de infeco por micobactrias no tuberculosas notificadas. Disponvel em: http://www.anvisa.gov.
br/hotsite/hotsite_micobacteria/notificados.pdf, 2009. Acesso em: ago/2009.
228
62. Rocha AS, Barreto AMW, Campos ED, Silva MVB, Fonseca L, Saad MH, Degrave WM, Suffys
PN. Novel allelic variants of Mycobacteria isolated in Brazil as determined by PCR-restriction
enzyme analysis of hsp65. J Clin Microbiol 40: 4.191-4.196, 2002.
63. Rosemberg J, Tarantino AB. Tuberculose. In: Tarantino AB. Doenas pulmonares. 5 ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. p.294-380.
64. Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratoty Manual. 3 ed. v.2. New York, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2001. p. 8.4-8.12.
65. Secretaria Estadual de Sade de So Paulo. Micobacterioses: recomendaes para o diagnstico
e tratamento. So Paulo, 2005. Disponvel em: http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/TB/mat_tec/
TB11_3MNTSB.pdf. Acesso em: out/2009.
66. Silva FCS, Ueki YM, Geiger DCP, Leo SC. hsp65 PCR-restriction enzyme analysis (PRA) for
identification of mycobacteri in the clinical laboratory. Rev Inst Med Trop So Paulo 43: 25-28,
2001.
67. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bttger BT. Rapid Identification of Mycobacteria to the
Species Level by Polymerase Chain Reaction and Restriction Enzyme Analysis. J Clin Microbiol
31: 175-178, 1993.
68. Ueki SYK, Martins MC, Telles MAS, Virgilio MC, Giampaglia CMS, Chimara E, Ferrazoli L.
Micobactrias no-tuberculosas: diversidade das espcies no estado de So Paulo. J Bras Patol
Med Lab 41: 1-8, 2004.
69. van Soolingen D, Hermans PWM, de Haas PEW, Sol DR, van Embden A. The ocurrence and
stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of IS
dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol 29:
2.578-2.586, 1991.
70. Wang YN, Chi CQ, Cai M, Lou ZY, Tang YQ, Zhi XY, Li WJ, Wu XL, Du X. Amycolicicoccus
subflavus gen. nov., sp. nov., an actinomycete isolated from a saline soil contaminated by crude oil.
Int J Syst Evol Microbiol 60: 638-643, 2010.
71. Walria-Aleixo A, Kroon EG, Campos MAS, Marguti-Pinto ME, Bonjardim CA, Ferreira PC.
Heteroduplex mobility assay for rapid, sensitive and specific detection of mycobacteria. Diagn Micr
Infec Dis 36: 225-235, 2000.
72. Who World Health Organization. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing,
Disponvel em: http://www.who.int/tb/publications/global_report, 2009. Acesso em: out/2009.
73. Wu TL, Chia JH, Kuo AJ, Su LH, Wu TS, Lai HC. Rapid identification of mycobacteria from
smear-positive sputum samples by nested PCR-restriction fragment length polymorphism analysis.
J Clin Microbiol 46: 3.591-3.594, 2008.
74. Yuen LK, Ross BC, Jackson KM, Dwyer B. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains
from Vietnamese patients by Southern blot hybridization. J Clin Microbiol 31: 1615-1618, 1993.
229