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*530986438X
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer la ayuda directa o indirecta en el desarrollo de esta Tesis
Doctoral a una serie de personas cuya inestimable ayuda me ha hecho ms fcil y
grat~ficante mi trabajo durante estos aos:
En primer lugar, mi agradecimiento especial al Prof Felix Garca-Ochoa,
tanto por la aportacin cientWca como por su estmulo, y enorme paciencia. Deseo
agradecerle el gran esfuerzo realizado, especialmente en la ltima etapa de este
trabajo y por todo lo que he aprendido de l en estos ltimos meses.
A Vickv, por su enseanza y amistad, por los buenos y malos momentos.
Al Centro de Citometra de Flujo de la Facultad de Farmacia, especialmente a
Alberto Alvarez, quien siempre estuvo dispuesto a echarme una mano y a darme
consejo en lo que necesit.
Al Centro de Microscopia Electrnica Luis Bru, de la Universidad Complutense
de Madrid, especialmente a Agustn, por su ayuda buenos consejos para observar y
fotografiar a mis bichitos
Al Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, especialmente a la Dra.
Pilar Castilln y a la Dra. Carmen Acebal por poner a mi alcance la utilizacin del
espectrofluormetro, necesario para la realizacin de este trabajo.
Al Profesor D. Pedro Lus y Luis, por su categora cient{flea y humana, por sus
buenos consejos y nimos desde el princz~io de esta Tesis Doctoral.
A la Dra. Aurora Santos y al Dr. Jose Antonio Casas por estar siempre
dispuestos a echarme una mano yfacilitar mi trabajo.
A Jos Timn, siempre dispuesto a arreglar lo que dbamos por perdido y
supona perder o retrasar el trabajo.
A Inma, por su amabilidady ayuda prestada en todo momento
Quiero agradecer el apoyo, y siempre prcticos consejos, de mi compaero
Miguel Ladero, con quien he compartido durante los aos de realizacin de esta Tesis
trabajo y amistad
A mi compaero Emilio Gmez, por su inestimable ayuda profesional y apoyo
personal durante la realizacin de este trabajo.
A Jose Carlos y a David, con quienes he compartido estos dos ltimos aos de
tesis, gracias por su sincera amistad y la ayuda que me han brindado. Gracias por el
buen humor y las risas de cada da.
Al resto de compaeros de laboratorio Virginia, David, Alex y Pedro por su
inters y aportacin directa o indirecta en este trabajo.
A mis amigas del otro lado del Atlntico Liliana, Vernicay Miriam, con las
que compart trabajo, consejos, y sin duda, amistad.
,
INDICE
Pgina
1.- INTRODUCCIN
1.1.- OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO
10
12
12
13
18
Productos.
t.2.1.3.- Influencia de las Variables en los Parmetros
/9
24
30
30
35
38
39
43
47
56
59
67
74
78
85
85
101
2.2.1.-Microorganismo
101
103
/06
/07
Pgina
2.3.- REALIZACIN DE UN EXPERIMENTO
/08
110
2.4.1.-Anlisis de Biomasa
lO
/1/
/13
114
lId
/18
/18
/21
/25
135
135
137
141
153
159
161
4.3.- DISCUSIN
181
181
181
189
191
193
/97
199
201
Pizina
5.- MODELO CINTICO METABLICO
203
2/2
2/6
5.3.- DISCUSIN
231
231
231
237
239
241
244
246
249
251
254
261
261
281
306
350
350
353
366
377
381
383
iii
393
P2ina
404
41/
8.1.- RESUMEN
4/1
8.2.-CONCLUSIONES
419
9.- NOMENCLATURA
431
10.- BIBLIOGRAFA
437
iv
1.- INTRODUCCIN
Introduccin
1.- INTRODUCCIN
Los procesos llevados a cabo con microorganismos han llegado a ser una fuente
importante
en la industria
Jntroduccwn
En el cambio de escala de este tipo de procesos, la importancia relativa de los
diferentes fenmenos involucrados va cambiando. As, se deben considerar varios
fenmenos que hay que estudiar de forma aislada para, una vez que el conocimiento de los
mismos es suficiente, ser acoplados con vistas a la descripcin del proceso global. Durante
el proceso de cambio de escala lo que va variando es la velocidad relativa de los diferentes
fenmenos y, quizs, la etapa controlante de la velocidad global del proceso. Debido a la
complejidad de estos sistemas microbianos, el cambio de escala no se realiza en un solo
paso desde la escala de laboratorio a la escala de produccin. En el laboratorio generalmente
se opera con Erlenmeyers, donde se buscan nuevos productos, mecanismos de control,
medios de produccin y se mejoran las cepas. Despus se pasa a un biorreactor, de 1 a 2
litros de volumen, donde el contacto gas-lquido es muy distinto de la etapa anterior,
despus a un tamao mayor, entre 10 y 20 litros. A esta escala, que de forma general se
llama Planta Piloto, se estudian o se comprueban los efectos de diferentes variables, tales
como la velocidad de agitacin, el caudal de aire, la temperatura, el control del pH, etc.,
buscndose la simplificacin de los problemas. En la primera etapa, a escala de laboratorio,
tambin se aborda el estudio de los diferentes fenmenos y variables de forma aislada, para
facilitar tanto el estudio como la comprensin. Cuando todos estos fenmenos sean
suficientemente conocidos deben ser acoplados, y el conjunto debe describir el proceso
global. As, se puede proceder al diseo del biorreactor donde llevar a cabo la produccin,
para Jo que se deben conjugar todos los factores de modo que la productividad sea la
mxima alcanzable. Por tanto, es necesario realizar un cambio de escala teniendo en cuenta
que el comportamiento del microorganismo, en cada nivel de produccin, puede no ser el
mismo; las diferencias pueden ser debidas a que las cantidades de energa y materia
involucradas son distintas para producir la transformacin. La complejidad de los sistemas
que usan microorganismos lleva, en la prctica, a utilizar varias etapas de comprobacin en
el cambio de escala, y no solo una -de planta piloto- como ya es habitual en la Industria
Qumica.
Introduccin
Transferencia de materia entre fases
Transporte de nutrientes o productos desde el seno del gas hasta la interfase gaslquido.
Este sistema puede generalizarse a otros donde la fase continua no sea un lquido
sino un gas, e incluso, en casos especiales, puede ser un slido (fermentaciones en
estado slido, de compostaje, por ejemplo) y la fase dispersa una o ms de las
siguientes:
Slidos, tales como clulas, partculas con enzimas soportadas y sustratos slidos.
Introduccin
Introduccin
El mantenimiento de las condiciones hidrodinmicas necesarias para el correcto
aporte de nutrientes a los microorganismos puede resultar perjudicial para el
proceso, sometiendo a los microorganismos al denominado stress hidrodinmico o
dao celular. Este efecto lo pueden sufrir las clulas cuando se someten a unas
condiciones que favorecen el transporte de oxigeno o de nutrientes en general-,
pero que sus estructuras, tanto internas como externas, no son capaces de soportar,
afectando a su metabolismo, y por tanto a su comportamiento general. Sin embargo,
este fenmeno no ha sido todava sistemticamente estudiado ni descrito para poder
ser incorporado en la descripcin global de un sistema microbiano (Meijer. 1989;
Merchuk, 1991).
Po2
tG
Interfase Gas-Lquido
Membrana
lA8
ni
o:
o
o:
Gr
o
Gfl
Resistencias
Co2
o
o
4:
Gr
4:
o:
en el
ni
Transpone de Materia
Figura 1.1.- Esquema de las resistencias en el transporte de oxgeno desde el gas hasta el
microorganismo, o la fase slida con enzima o clulas inmovilizadas.
5
Introduccin
intervienen
Introduccin
ANABOLISMO
DNA
RNA
ANABOLISMO
CA TABOLISMO
A TP
Nucletidos
hexosa
A
Nudetidos
Desoxinucletidos
41
Pentosa
Triosa
Glicerol
Glicsidos
Triglicridos
U,iidos membrana
MX
NADA
Purinas
Pirbnidinas
Histidina
Tirosina
Triptofano
Tetrosa
P-Gticerato
Serbia
p-aminobenwato
p-hidroxibenzoato
Piruvato
cidos grasos, Lpidos,
Poliqutidos
Quit,J respiratoria
Acetil-CeA
Purinas
Treonina
so/encina
1! etionina
Lisina
Aspartato
Porfirinas, etc.
Cisteina
Glutamina
Fosfoenolpiruvate
A cido Flico
fr01cina
Oxalacetato
.~.
Meya/enato, Esteroides,
Carotenoides, Terpenos
Citrato
Arginina
Pretina
Succinato
sI!
Porjirinas
<
2-Oxoglutarato
Giutamato
1fr Glutamina
Transferencia
NH t
4
Figura 1.2.- Esquema general de las rutas anablicas y del catabolismo central
-7
Introduccin
Nelsen
..
la correlacin verbal o
condiciones de operacion
Introduccin
una poblacin est formada por microorganismos diferentes. En el caso de los
microorganismos presentes en un cultivo puro, en el que se presentan distribuciones
de alguna propiedad como edad, tamao, etc. Se pueden denominar tambin como
modelos morfolgicamente estructurados. En el caso de los cultivos mixtos, la
segregacin puede referirse nicamente a la consideracin de diferentes biomasas
empleando para la descripcin de cada una de ellas modelos no estructurados-no
segregados (Garca-Ochoa y col., 1999b).
Modelo Cintico
Concepto
NO ESTRUCTURADO-NO SEGREGADO
METABLICO
ESTRUCTURADO
(o de CLULA)
QUMICAMENTE
ESTRUCTURADO
SEGREGADO
Introduccin
1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO
ciertas
variables
en dicho
proceso
de
produccin, considerando
Los modelos que se van a proponer a lo largo de esta Tesis Doctoral son de diferente
grado de complejidad. El primer paso es comenzar por un modelo sencillo, de los conocidos
como no estructurados, pues desde un punto de vista tcnico tiene sentido iniciar un
estudio de este tipo con los modelos cinticos ms sencillos. Adems, el abordaje, tanto
experimental como matemtico, es relativamente asequible, lo que hace que el primer
planteamiento al comenzar a modelizar un sistema sea con modelos de este tipo. Se
determinar si este modelo es suficiente para la descripcin del sistema, para lo cual se
estudiar la influencia de dos variables sobre la evolucin de los parmetros del modelo
(temperatura y concentracin de nitrgeno inicial). En caso de que no exista una relacin de
parmetros con las variables a estudiar, se modificar el modelo planteado de modo que
sea capaz de tener en cuenta la evolucin de los parmetros con la variable, y as poder
obtener una relacin en funcin de la variable estudiada. En caso de no ser suficiente este
modelo se ir complicando hasta [legar a
si bien ms
Introduccin
La progresiva complicacin en el planteamiento de modelos para la descripcin del
sistema microbiano debe llevar consigo una mejora en la consideracin de algn aspecto en
la propia descripcin del sistema, es decir, debe de ser capaz de subsanar deficiencias
encontradas en los modelos ms simples desarrollados y aplicados a los datos
experimentales en las primeras etapas dcl presente trabajo.
En definitiva, el objetivo final de esta Tesis Doctoral es llegar a aplicar un modelo
cintico de los denominados qumicamente estructurados, pues probablemente sean los
nicos capaces de tener en cuenta los cambios en la composicin del medio, especialmente
en lo referente al sustrato nitrogenado, tan ligado al crecimiento del microorganismo. Para
llevar a cabo la aplicacin de este tipo de modelos ser preciso un conocimiento profundo,
tanto bioqumico y microbiolgico, de la bacteria Xanthomonas campestris. Adems, se
hace necesario realizar un estudio exhaustivo y puesta a punto de mtodos rpidos y fiables
para el anlisis de compuestos intracelulares de forma cuantitativa. Para ello, se van a
comparar diferentes tipos de tcnicas de anlisis de estos componentes, desde las tcnicas
bioqumicas convencionales, pasando por tcnicas espectrofluorimtricas. hasta llegar a una
tcnica cada vez ms utilizada en microbiologa como es la citometria de flujo.
Finalmente ser necesario desarrollar una metodologa para hacer frente a la dificil
tarea de proponer y aplicar modelos cinticos estructurados. Hay que tener en cuenta que
apenas hay antecedentes en la literatura en cuanto a la propuesta de este tipo de modelos, y
no se encuentra ajuste de datos experimentales, y el consiguiente clculo del valor de los
parmetros, ni, desde luego, la relacin de los valores de los parmetros en diferentes
experimentos realizados en condiciones diversas.
11
introduccion
1.2.- MODELOS CINTICOS
A continuacin se realiza una breve revisin sobre los diferentes tipos de modelos
cinticos planteados en la literatura de acuerdo a la clasificacin comentada en la Tabla 1.1.
12
Introduccin
Lisis celular
Energia de Mantenimiento
CELULAS NO
VIABLES
Respiracin Endgena
PRODUCTOS
(ji),
/3
Introduccwn
La Ley de Maithus se emplea de forma amplia en estudios microbiolgicos sobre el
crecimiento, debido a la gran simplicidad del modelo, pues solo es necesario conocer la
evolucin experimentaJ de la biomasa con el tiempo. La citada expresin de Malthus viene
dada por la siguiente ecuacin:
dC~
dt
[1.1]
____
C~. 1
cx
[1.2]
C~.
ji
14
Introduccin
Las expresiones que hacen depender el crecimiento de microorganismos, tanto de la
concentracin de biomasa como del sustrato limitante, hacen que esta dependencia de la
concentracin del citado sustrato est incluida dentro de la velocidad especfica de
crecimiento (ji), siendo la ecuacin general:
dC~
dt
y(C5).Q~
[1.3]
4Cs)11m.iCs>It,nB
[1.4]
Cs
B
donde B es una constante. Este modelo plantea que hasta que la concentracin de sustrato
no haya llegado a cierto valor no influye en el crecimiento y se puede aplicar la ley de
Malthus.
proponiendo, por primera vez, una relacin estequiomtrica entre la velocidad de consumo
del sustrato y la de produccin de biomasa:
d?5
dt
1 dC~
Y~ ch
[1.6]
Cx0 expQu.t)
c
~i~A~- exp[u
.41
[1.7]
15
fu trod;tccwjj
siendo:
=
~t,,,
c~
YAS
C~
=C~
-4-C8j
(ci.
tI
\YS
[1.8]
[1.9]
Y~ C8
Lex~KE)j.c
dC1
[1.10]
dC~
di
El modelo propuesto por Monod est formado por las ecuaciones [1.7] y [1.11]. Este
modelo se simplifica en las siguientes condiciones particulares:
K5 C5
K
~.
dC~
____
d~i%
Mm
di
p 45
[1.12]
.cj
[1.13]
16
Introduccin
A partir de los diferentes modelos comentados hasta el momento, se observa que la
expresin fundamental de la cintica microbiana es el modelo propuesto por Monod (1949 y
1950) (ecuaciones [1.7] y [1.11]), ya que excepto la propuesta por Tiesser (1942) -que no
parece tener explicacin mecanstica- el resto de las expresiones comentadas pueden
entenderse como simplificaciones del citado modelo, segn la concentracin de riutriente
limitante presente en el medio; ya que la concentracin del citado nutriente varia durante la
fermentacin, el modelo propuesto por Monod se puede simplificar a unas u otras
expresiones durante el transcurso de la misma. Este hecho es corroborado de forma patente
en el trabajo de Esener y col. (1982) sobre modelos no estructurados, en el que se ajustan los
mismos datos experimentales con diferentes modelos, no siendo capaces de discriminar
entre ellos.
(p(q),ue).?x
[1.14]
dr
Inhibicin por sustrato, fue propuesto por Wayman y Tseng (1976); estos autores
consideran que existe una concentracin crtica de sustrato, por debajo de la cual no
se produce inhibicin del crecimiento.
Inhibicin por producto, propuesto por Hinshelwood (1946) plantea que la
inhibicin del crecimiento, por parte del producto, depende de la concentracin del
mismo.
introduccin
1.2.1.2.- Modelos dc Consumo de Sustratos y Formacin de Productos
.4-21-
[1.15]
r~ ir
Introdujo as el coeficiente de mantenimiento (ms), el cual trata de explicar el
consumo de sustrato para el mantenimiento de la biomasa en estado viable. Esto es
normalmente aplicable slo al sustrato empleado como frente energtica (generalmente
azcares). Sustituyendo la expresin [1.15] en la [1.7), se obtiene la siguiente ecuacion:
d?8
di
1
Y~
d?7 _ m8 dC~j
dt
y
di)
[1.16]
(Ypsmt,
incorporndose el
18
(__1
dC7
di
J$7
dc,.
di
m5
y
[1.17]
Introduccin
En cualquier caso, se hace necesario disponer de una expresin de la evolucin del
producto con el tiempo que se pudiera sustituir en la ecuacin anterior. El planteamiento de
las ecuaciones de la velocidad de formacin de productos depende del tipo de producto de
que se trate. As, segn Rleis y Kossen (1978), basndose en la terminologa propuesta por
Gaden (1959), clasifica los productos en las siguientes categoras:
di
d?~
di
19
lnroducc tau
iH
k0, exp( RT
AH2
+
exp( ----)
RT
[1.19]
[1.20]
Trnat))j}2
[1.21]
[1.22]
20
Introduccin
dC0
di
k~a~
(C0
?<>
?~
[1.23]
1
?~ =m<> ~?~<
+
%~
.dc~
[1.24]
di
[1.25]
[1.26]
K 0, ?
02
q7X
= K-i-?
OQ
[1.28]
Q
Introduccin
velocidades de produccin de cada uno de los compuestos que intervienen. En el caso de que
la expresin de velocidad de produccin del sustrato limitante del crecimiento se vea afectada
por la produccin, se tendrn que repasar las suposiciones realizadas para el planteamiento de
la expresin para describir el crecimiento. Esto es particularmente importante en el caso de
adoptar la ecuacin logstica, ya que esta ecuacin parte de la suposicin de que el crecimiento
y el consumo del sustrato limitante estn relacionados nicamente por un rendimiento
macroscpico o coeficiente estequiomtrico constante a lo largo de la transformacion.
Los modelos descritos hasta ahora, esto es, los modelos no estructurados sern
buenos cuando los microorganismos
est
no
sean
capaces
de
reflejar
la
influencia
de
ciertas
variables,
fundamentalmente la composicin del medio. Para estos casos se han propuesto un tipo de
modelos que tienen en cuenta cambios en la estructura interna del microorganismo y, en
casos muy complejos, nicamente modelos de este tipo sern
capaces de explicar la
22
Introduccin
Modelos metablicos, son modelos que podran englobarse dentro de tos no
estructurados, pero emplean un esquema simplificado de reaccin para describir las
rutas metablicas de consumo de sustrato y formacin de productos como una red de
reacciones. Describen el crecimiento como en los modelos no estructurados.
Modelos de clula,
Introduccin
justificacin mecanstica (ecuacin de Malthus, por ejemplo), y en la reciente propuesta de
modelos de clula con cientos de reacciones y decenas de especies qumicas participando
en el esquema (simplificado) del metabolismo celular (Jeong y col., 1990). El camino
adecuado parece ser intermedio, con la utilizacin de esquemas de reaccin simplificados,
pero realistas, utilizando iumping o una asociacin de especies qumicas para simplificarlo,
y una metodologa para la discriminacin entre modelos posibles pasando por el clculo de
parmetros (Sundaram y Froment, 1977; Garca-Ochoa y col., 1990b). En los sistemas
biolgicos, esta metodologa se corresponde con la propuesta de modelos estructurados en
Compartimentos, capaces de describir las transformaciones de forma simplificada, pero
mucho ms cercana a la realidad que los modelos sencillos, siempre que su grado de
complejidad no sea exagerado. Segn Shuler (1985), en su revisin sobre modelos cinticos
estructurados, para que un modelo cumpla esa situacin de compromiso
...
debe presentar
un mnimo de parmetros ajustab es, la mayora de los parmetros deben ser determinados
a partir de experimentos independientes o estimados por una serie objetiva de reglas. Debe
ser tratable matemticamente y debe tener alta fidelidad en los procesos biolgicos,
Este tipo de modelos plantea estructura slo para el metabolismo del o de los sustratos
carbonados, sin diferenciar panes en la biomasa, ya que la siguen considerando como en los
modelos no estructurados; es por ello que se pueden considerar como modelos no
estructurados-no segregados. Dentro de este tipo, existen modelos muy diferentes, muchas
veces propuestos para problemas muy especficos de forma terica (Van Dedem y MooYoung, 1973; Geraats y col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizando una simulacin a
partir de unos parmetros estimados de una manera que no siempre queda clara.
24
introduccin
Los modelos metablicos planteados en la literatura, estn todos realizados con la
levadura Saccharomyces cerevisie. Estos modelos responden, de forma general, al esquema
planteado en la Figura 1.4, donde el sustrato carbonado es introducido en la clula mediante un
sistema de transporte. La clula puede utilizar este sustrato como esqueleto para sintetizar
nuevas clulas (crecimiento), o bien transformar este sustrato carbonado en un intermediario
reducido (IR), el cual puede ser fermentado a etanol o bien ser introducido en la mitocondria
para, a travs del ciclo TCA y la respiracin obtener energa en forma de ATP.
Figura 1.4.- Esquema general de los modelos metablicos para la levadura Sacchoromyces
cerevisie, existentes en la literatura.
25
Introduccin
El modelo de Koga y col. (1969) plantea seis reacciones dentro del metabolismo de la
levadura Saccharomyces cerevisi, y que responderan al esquema planteado en la Figura 1 .4.:
Glicolisis (rj:
IR
[1.29]
[1.30]
+ Y/RO
N+yT,.
A TP
* YATP.
ADP
ADP
[1.31]
Pi
NADH
Ysrnx NAD
[1.32]
Respiracin (rR):
4 +r~i~,.>~ ATPr.up M
.
YYID.R
NADH
+ YITPR
ADP+
~2
[1.33]
>YVADR NAD
.
Fermentacin (rF):
IR> YP,F P
[1.341
Los autores proponen ecuaciones cinticas globales tipo Monod- para cada una de dichas
reacciones:
-
Glicolisis:
rrcma
cs
Cx
[1.35]
KATP + CATP
-
Metabolismo anablico:
r2rA~.,~
26
KvCx
+?\;
CTPCX
[1.36]
Introduccin
Metabolismo catablico:
rk0C
TP
Ciclo TCA:
C Pv
Cx
KNAD+CrvAn Ka +Cp
[1.38]
Respiracin~
rsrp~;
[1.37]
CNADHCX
[1.39]
Fermentacin:
u6 k FC ~
,~.
[1.40]
(yij),
[1.41]
4/
Koga y col. (1969), no estiman los parmetros del modelo por ajuste de datos
experimentales sino que toman estos parmetros de la bibliografia, realizando de esta forma
simulaciones con el modelo.
El esquema de reaccin que plantean viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones:
-
[1.43]
27
Introl,.ccon
((.44]
(O.
30,> JCO,+SH,0+(473+!)ATP
[1.45]
R +
J4TP
YA
[1.46]
-
2X
Las ecuaciones cinticas que proponen estos autores tambin son tipo Monod:
[1.47]
r~k
!K+C/
rskj
[1.48]
<y
Kw
Cm
[1.49]
r4C4
Cii
Km + Cii?
Cx
[1.50]
rs
La velocidad
r2,
kv Ci
Cx
dC5~ 0rl-r2-vs
It
rs
rri-v~rs
[1.51]
Por lo tanto el modelo final viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones
diferenciales (velocidades de produccin):
Sustrato carbonado:
dC5
___
:t-I,I
dt
[1.52]
Biomasa:
dC~
dt
28
[1.53]
Introduccin
ffitermediario reducido:
dC15 =r~ .r, r3 r4 ~y,
di
r5
[1.54]
Oxgeno disuelto:
dC<,
=3r,
[1.55]
It
-
ParaelATP:
dCTP
=(~>~
+1)r4
[1.56]
dt
Como puede observarse el planteamiento del modelo es muy similar al de Koga y col.
(1969), pero este modelo es ms sencillo pues el nmero de componentes clave se ha reducido
a cinco en lugar de tener once como en el caso anterior.
,
Los parmetros del modelo de Barford se estiman, en todos los casos, a partir de datos en
bibliografa o tomando en consideracin datos experimentales, pero por mtodos particulares,
no por regresion.
es
el propuesto por Montes y col. (t998), basado en el modelo de Bardford, el cual, a su vez,
est basado en el concepto de que el metabolismo aerobio de las levaduras es determinado
mediante el transporte de azcar al interior celular y la velocidad de transporte de piruvato
dentro de la mitocondria. Los parmetros de este modelo son obtenidos de forma experimental,
por ajuste de datos con el modelo propuesto.
De los modelos metablicos planteados en la literatura se puede concluir que este tipo de
modelos son abordables tanto desde el punto de vista matemtico como desde el punto de vista
experimental, pues, como se ha visto, el nmero de parmetros que presentan no es elevado y
los productos o componentes clave que son necesarios analizar no suelen precisar de mtodos
de anlisis complicados.
29
Introduccion
1.2.3.- Modelos Estructurados o de Clula
30
Introduccin
El modelo planteado por Ramkrisna y col. (1967), divide el citoplasma en dos
componentes estructurales, cuya interaccin entre s y con el ambiente que les rodea,
produce el crecimiento. Denominan masa O al gnipo formado por cidos nucleicos (DNA y
RNA) y masa D a las protenas; proponiendo el esquema simplificado formado por cuatro
reacciones en el que la formacin de un inhibidor del crecimiento puede dar lugar a formas
muertas de las masas G y D (N0 y ND).
[1.57]
C+75,<S *2G
O+
y>
0+ T
5> 0+ Dy,, T
.
(17,,)T
DT-4 ND
[1.58]
[1.59]
[1.60]
El citado modelo proporciona curvas de crecimiento con todas las fases observadas
experimentalmente, incluyendo la fase de latencia. La concentracin total de protoplasma
viable es la suma de las concentraciones de los dos compartimentos. El modelo predice
fenmenos observados en el crecimiento en discontinuo, ya que las curvas obtenidas
dependen de las siguientes variables (Tsuchiya y col., 1966):
i)
u)
Introduccin
S*K +G
[1.61]
(C~
= k,,
C5
C~
C0)
[1.62]
[1.63]
u)
1sI(
[1.64]
flCJCY
= fI
4-1
Estos autores calculan los parmetros del modelo por regresin no lineal y
reproducen datos experimentales.
Las ltimas modificaciones del modelo de Williams (1967) son las realizadas por
Nielsen y col. (1991a y 1991b); Nikolajsen y col. (1991). En estos modelos se incluyen los
dos compartimentos, aunque cambia la nomenclatura empleada, denominan compartimento
A o parte activa de la clula (protenas y RNA) y compartimento G o parte inactiva (DNA e
hidratos de carbono). El modelo desarrollado por el equipo de Villadsen (Nielsen y col.,
1990a y 1991b; Nikolajsen y col., 1991) incluye dos tipos de sustratos (carbonado y
nitrogenado) y la formacin de productos, suponiendo que el sustrato nitrogenado slo
32
Introduccin
interviene en la formacin de biomasa, mientras que el sustrato carbonado se emplea tanto
para el crecimiento como para la produccin. El esquema general se da en la Figura 1.5.
Este modelo debido a que incluye la formacin de dos productos
Estos autores (Nielsen y col., 199 la y 199 lb) calculan los valores de los parmetros
a partir de los experimentos realizados, pero no por regresin, y comprueban la
reproduccin de datos experimentales (Nielsen y col., 1991) donde aumentan el nmero de
sustratos carbonados a tres reproduciendo posteriormente a datos experimentales.
Figura 1.5.- Esquema general del Modelo de Nielsen y col. (1991a y 199 Ib).
33
Introduccin
Dentro de los modelos compartimentados hay modelos con ms de dos
compartimentos, como el propuesto por Harder y Rdels (1982), que est formado por tres
compartimentos segn el esquema de la Figura 1.6. El compartimento K representa el RNA,
el compartimento U las protenas y el compartimento R la biomasa restante, principalmente
hidratos de carbono y precursores. tales como cidos nucleicos y aminocidos. Se supone
que los tres compartimentos se sintetizan a partir de un sustrato interno y hay slo una
frente de carbono que se emplea tanto para la sntesis de ATP como para precursores. Se
supone que el sustrato limitante entra en la poblacin celular y se incorpora directamente al
compartimento R; los compartimentos K y G se forman a partir de precursores que hay en
R; K y U se pueden degradar dando lugar
R
4
34
Introduccin
Bacillus subtilis o
Introduccin
poblaciones: en 1985, fue ampliado (Shuler, 1985) para incluir situaciones de anaerobiosis,
alterando los mecanismos de generacin de energa en la clula; en 1986 fue modificado por
Peretti y Bailey (1986) examinando las interacciones huesped-plsmido.
Otro ejemplo de este tipo de modeJos es el propuesto por Jeong y col. (1990). Estos
autores desarrollan un modelo muy complejo para la descripcin del crecimiento y la
esporulacin de Bacillus subtilis. El esquema de reaccin considerado se recoge en la Figura
1.8. Este modelo tiene en cuenta 35 componentes intracelulares, en los que se incluyen
intermedios metablicos de la glicolisis, gluconeognesis, ciclo TCA, y una representacin
detallada del metabolismo de los nucletidos. En total est formado por
39 ecuacIones
Introduccin
frente a la simplicidad de los modelos no estructurados. En cualquier caso, aunque los modelos
de clula sean necesarios, es de suponer que sern modelos ms sencillos que los propuestos
hasta ahora, con menos componentes clave, y, por tanto, con necesidad de medir menos
compuestos, de tal forma que el clculo de parmetros por regresin sea abordable. Esto
implica hablar de modelos con no ms de 7 a 10 componentes clave, el mismo nmero de
etapas en el esquema de reaccin, y no ms de 20 parmetros.
37
Introduccin
co;
NH
Los modelos ms complejos empleados hasta ahora han sido los modelos de clula con
los cuales era posible realizar una buena descripcin del crecimiento teniendo en cuenta la
38
Introduccin
evolucin de componentes intracelulares durante el mismo. Estos modelos eran realizados
sobre sistemas de sobra conocidos como Ecol o Bacillus subtilis y no con microorganismos
empleados con un inters industrial. En consecuencia no es posible observar la aplicacin de
tales modelos desde este punto de vista, ni poder predecir el comportamiento del
microorganismo cuando se realiza un cambio de escala.
39
Introduccin
En la literatura inicial sobre modelos segregados se encuentra un grupo de modelos que
usa el tamao o masa celular como propiedad a considerar en la funcin de distribucin
(Eakman y col., 1966). Este tipo de modelos basados en el tamao o la masa celular han sido
los precursores de los modelos segregados que se desarrollan y emplean en la actualidad en la
descripcin de sistemas microbianos, en los que el microorganismo es de tipo filamentoso
(hongos, principalmente). Los hongos filamentosos forman parte de un subgrupo de hongos
muy importante a nivel industrial, ya que se emplean en la sntesis de metabolitos, tanto
primarios como secundarios.
Modelos de crecimiento
Las clulas de los hongos filamentosos estn unidas en estructuras denominadas hifas,
estos elementos hifales crecen slo en las clulas situadas en los extremos de las hifas,
denominadas puntas o yemas, producindose nuevas yemas en clulas intermedias de la hifa
por un mecanismo denominado ramificacion.
40
Introduccin
El crecimiento de las yemas o puntas se produce generalmente a cierta velocidad de
extensin constante, que est condicionada por la composicin intracelular y el entorno que la
rodea; por lo tanto, el crecimiento exponencial de un cultivo de hongos filamentosos se deber
slo a la existencia de una frecuencia de ramificacin de la hifa. As, mientras que el
crecimiento de un microorganismo unicelular se caracteriza por una velocidad especfica de
crecimiento, para caracterizar el crecimiento de hongos filamentosos se necesitan tanto la
frecuencia de ramificacin como la velocidad de extensin de la yema (Nielsen y Villadsen,
1992). Sin embargo, estas variables son dificiles de evaluar y, debido a la falta de mejores
medidas, la velocidad especfica de crecimiento se emplea tambin para caracterizar el
crecimiento de hongos filamentosos.
Nielsen y col. (Nielsen, 1992; Nielsen y Villadsen, 1992; Nielsen 1993) refieren el
ndice de crecimiento de la hifa que se emplea generalmente es la unidad de crecimiento hifal,
a la masa de la hifa (miigi3:
[1.56]
lbgu
[1.57]
n
Mb
[1.58]
[1.59]
Este autor (Nielsen, 1992) comprob que la unidad de crecimiento hifal referida a la
masa de la hifa es aproximadamente constante en diferentes condiciones y para diferentes
especies de hongos filamentosos; sin embargo, el dimetro de la hifa vara, lo que implica que
la unidad de crecimiento hifal referida a la longitud de la hifa tambin ser variable.
41
Introduccin
Segn Nielsen y Villadsen (1992), si la citada unidad de crecimiento hifal (ecuacin
[1.65]) es constante, tanto la velocidad de extensin de las yemas como la frecuencia de
ramificacin son proporcionales a la velocidad especfica de crecimiento de la biomasa, y para
ambas variables la constante de proporcionalidad es la unidad de crecimiento hifal.
Si
m~g
Si
m,gu
presenta un valor bajo: densa estructura hifal con muchos puntos de ramifcacion.
42
Introduccin
antibiticos, enzimas, etc.) desarrollan ligeramente el metabolismo del sustrato en el interior
del hongo. En el modelo de Matsumura y col. (1981), se consideran tres tipos de reacciones:
toma de sustratos, reacciones de metamorfosis y reacciones de los sustratos en el interior del
microorganismo, enfocadas a la produccin. Los citados autores plantean ecuaciones cinticas
para los dos ltimos tipos de reacciones, siendo, generalmente, expresiones tipo Monod o
potenciales.
Los modelos segregados estn especialmente indicados y quizs slo en esos casos,
para describir el crecimiento de microorganismos filamentosos de los que se obtienen
productos de gran inters.
43
lutroduccion
La necesidad de aumentar la complejidad de los modelos cinticos para describir
la evolucin de procesos microbianos es clara, sin embargo el propsito de los modelos
metablicos y, especialmente de los modelos qumicamente estructurados, entra dentro
del desarrollo de la denominada Ingeniera Metablica (Bailey, 1991: Stephanopoulos,
1991). La utilizacin de microorganismos como fbricas de productos sumamente
especficas ha llevado al desarrollo de herramientas para conseguir mejorar el
rendimiento del compuesto deseado. Durante bastante tiempo, la citada mejora se ha
realizado por mutagnesis al azar de cepas microbianas o por cambio en las condiciones
del cultivo. Este tipo de trabajo se llevaba a cabo porque muchos cambios genticos del
microorganismo potencialmente beneficiosos no eran evidentes, Incluso, los sistemas
enzimticos que gobiernan los cuellos de botella del metabolismo celular pueden estar
situados lejos del sistema enzimtico que finalmente sintetiza el compuesto bioquimico
deseado. En muchos casos, las reacciones energticas del metabolismo primario deben
ser reconducidas para aumentar la productividad (Vallino y Stephanopoulos, 1993).
Durante las dos ltimas dcadas, se ha ido desarrollando una tcnica ms racional
para conseguir la produccin ptima del producto deseado (Bailey
44
Introduccin
A principios de los aos 90 ya se encuentran revisiones completas sobre estos
estudios (Fel, 1992; Liao y Delgado, 1993); sin embargo, su aplicacin prctica no se
encuentra extendida.
La identificacin del sistema metablico, y su influencia en la produccin del
metabolito de inters, se ha abordado desde el punto de vista estequiomtrico (Hamer,
1989; Noorman y col., 1991; Goel y col., 1993; Vallino y Stephanopoulos, 1993); la razn
principal de este cambio de estrategia es el gran error que conleva la determinacin de los
coeficientes de control y elasticidad necesarios, as como la necesidad de conocer en
profundidad la cintica enzimtica de la red de reacciones que forman la ruta metablica
estudiada (Pons y col., 1996). En los antecedentes citados, se emplea un mtodo que
denominan de balance de materia, suponiendo para los metabolitos intermedios un estado
pseudoestacionario, aproximacin que evita la necesidad de su medida. Caben destacar tres
grupos de investigacin en la aplicacin de esta herramienta de la lingeniera Qumica a
procesos de produccin microbianos: el grupo de Delft (Holanda) (Noorman y
col.,
1991;De iong-Gubbles y col., 1995; Gulik y Heijnen, 1995; Vanrolleghem y col., 1996), el
grupo de Michigan (E.E.U.U.) (Varma y col., 1993; Varma y Palsson, 1994a y 1994b;
Varma y Palsson, 1995), y, por ltimo, el grupo de Lyngby (Dinamarca), que ya en su libro
sobre Ingeniera de la Biorreacin (Nielsen y Villadsen, 1994) incorporan este estudio en el
capitulo de anlisis estequiomtrico de reacciones, como paso previo al desarrollo de
modelos cinticos de este tipo de procesos (Nielsen y Villadsen, 1992; Jorgensen y col.,
1995; Noronha Pissara y col., 1996).
45
fY?tYOd celn
-/6
introduccin
1.3.- GOMA de XANTANO
El xantano es un biopolimero de origen microbiano. En el trmino biopolmero se
mcluyen un gran nmero de molculas de elevado peso molecular, tales como cidos
nucleicos, polisacridos y lpidos, producidos por una amplia variedad de sistemas biolgicos
(Higgins y col., 1985). Desde un punto de vista industrial han tenido importancia los
biopolmeros denominados gomas. En trminos prcticos o funcionales, las gomas son
compuestos de peso molecular elevado, con propiedades coloidales que, en un disolvente
adecuado o agente suspendedor, producen geles o suspensiones de elevada viscosidad. En la
industria, tcnicamente, se emplea el trmino goma referido a polisacridos obtenidos de
plantas o animales, as como a sus derivados, que son dispersables en agua fra o caliente para
producir geles o disoluciones viscosas.
47
IfltlO(hiCCiOfl
Finalmente, a nivel microbiano se puede realizar una manipulacin gentica que permita
obtener gomas con propiedades reolgicas fijadas, lo cual est lejos de conseguirse con las
especies vegetales.
48
Introduccin
La goma de xantano fue descubierta a fmales de los 50, como ya se ha indicado, por
los Nothem Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) del Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos, durante unos trabajos de investigacin sobre las aplicaciones industriales
de polisacridos microbiolgicos y la utilizacin de excedentes agrcolas. Los estudios
realizados mostraron que el polisacrido, producido por la bacteria Xanthomonas campestris
NRRL B-1459, posea propiedades muy interesantes. Propiedades que hicieron pensar que el
polisacrido podra suplir, por sus mejores caractersticas reolgicas, a otras gomas naturales y
sintticas solubles en agua (Kennedy y Bradshaw, 1984; Kang y Pettit, 1993).
Las soluciones de xantano tienen gran estabilidad y compatibilidad con sales, excepto
con iones polivalentes a valores elevados del PH (Margaritis y Zajic, 1978). Las soluciones,
especialmente en presencia de electrolito, tienen una estabilidad trmica excelente, y su
viscosidad, en presencia de cantidades moderadas de electrolito (0,1% NaC), es independiente
del pH en el intervalo de 5 a 9 (Margaritis y Zajic, 1978).
En general, las casas comerciales establecen dos calidades del producto: grado
alimentario y grado tcnico. Su presentacin es generalmente en forma de slido, aunque en
aplicaciones especficas en el campo de la recuperacin del petrleo utilizan caldos de
fermentacin clarificados. De cualquier forma, el xantano debe cumplir una serie de requisitos
referentes a sus caractersticas fisicas y qumicas.
49
Introduccin
TABLA 1.2.- Aplicaciones del xantano en los diferentes tipos de industrias.
INDUSTRIA
ALIMENTARIA
COSMETICA
APLICACION
GONG~TRAC[ON
PUNCIONES
0,1 - 0.5
0,1 - 0,4
Bebidas
0,05-0,2
Productos instantneos
0,05 - 0,2
~e a dar
cuerno
solubijidad
enfro
yen ca ente
Alinsentos enlatados
0,1 -0,3
Control de procesado
viscosidad durante el
0,05- 0,5
0.05 -0,2
Controla
la formacin
cristales;
contribuye
a la texturadecrenlosa
Confitera
0,1 -0,4
trmica, facilita
Proporciona estabilidad
el procesado
Productos lcteos
0,05 - 0,2
Productos dietticos
0.3 - 0,5
Mejora contenido
la textura, calrico
estabiliza. bajo
Productos crnicos
0,2- 0,5
Estabiliza; retiene
el agila; inhibe la
sinresis
Pastas dentfricas
0.7-1,0
Cremas y lociones
0,2 -0,5
Proporciona
fcil extraccin
los
titos
y buena permanencia
en edecepillo
Estabilza las emulsiones, proporciona
consistencia cremosa
Champes
0,2- 0,5
Controla la reologia
0,1- 0,5
Suspensiones y emulsiones
FARMACEUTIGA
TabletasALINIENTACION
ANIMAL.
o,s- ~o
Prolos~aefliempo
ingredientesdecontactodelos
activos
Sucedneos de leche
0,05-0,2
Establiza
la suspensin
de los
ingredientes
insolubles
0.1 -0,4
Productos agroquimcos
0,1 -0,3
Suspendela los
ingredientes
activos;
controla
adherencia
del escurrido
Limpiadores y pulimentos
0,2-0,7
Pinturas
0,1-0,3
Controla lareologia
Controla la migracin el color; mejora
VARIOS
EXTRACCION
DEL
PETROLEO
.50
0.2 -0,5
0,1 -0,3
el procesado
Controla la penetracin
Industria papelera
0,1 -0,2
Mineria
0,1-0,3
Tintas
0,05-0,1
Controla la reologia
Esmaltes cermicos
0,3 - 0,5
Proporciona
estabilidad de
slidosbuena
en stispensin
Perforacin
0,1-0,4
0,05-0,2
Introduccin
En cuanto al proceso de produccin y purificacin, el
xantano
se
obtiene
de la cepa, as como el
si
Introduccin
CONSERVACIN
BACTERIA
Xanlwmonas campestris
MANTENIMIENTO
CRECIMIENTO
Medio
Composicin
Temperatura
Transporte de 0~
r
MEDIO de PRODUCCIN
Sustratos (C,N)
Nutrientes:
Macro
NIlero
4
INCULO
Volumen
Fases en la preparacin
BIORREACTOR
Temperatura
PH, control
Oxgeno disuelto
Caudal
Agitacin
CALDO DE FERMENTACIN
PASTEURIZACIN
Fsica,Quimica y/o Enziintica
CLARIFICACIN
Filtracin, Centrifugacin
PRECIPITACIN
Alcoholes, Sales, Mezclas
FILTRACIN
VISCOSIDAD
XANTANO
PROPIEDADES
52
Introduccin
La estructura qumica de la molcula de xantano es bsicamente similar a la molcula
de celulosa. La goma de xantano contiene manosa, glucosa y cido glucurnico. Cada bloque
repetido contiene cinco unidades de azcar -dos unidades de glucosa, dos unidades de manosa
y una unidad de cido glucurnico- que forman una cadena principal y una cadena lateral (ver
Figura 1.10). La cadena principal est constituida sobre unidades de B-D-glucosa enlazadas a
travs de las posiciones 1 y 4, como sucede en el caso de la molcula de la celulosa. La cadena
lateral consiste en las dos unidades de manosa y la unidad de cido glucurnico. La unidad
terminal <3-D-manosa est unida glicosidicamente a la posicin 4 del cido glucurnico, que
vuelve a unirse glicosdicamente con la posicin 2 de la ct-D-manosa (Jansson y col., 1975;
Kennedy y Bradshaw. 1984). Esta cadena lateral de tres azcares se une a la posicin 3 de
cualquier otro residuo de glucosa de la cadena principal. La distribucin de las cadenas
laterales es desconocida. Alrededor de la mitad de los residuos de D-rnanosa terminales
contienen un residuo de cido pirvico, unido va grupo ceto a las posiciones 4 y 6 de la citada
molcula de azcar. La distribucin de estos grupos piruvato tambin es desconocida. La
unidad D-manosa tenninal contiene un grupo acetilo en la posicin 6 (Kennedy y Bradshaw,
1984). Debido a la presencia de las unidades de cido pirvico y cido glucurnico en la
molcula, el xantano es un polisacrido anionco.
La distribucin de pesos moleculares es amplia, el peso molecular del polmero vara
entre 2.106 y 20.106 Daltons. En disolucin acuosa, a baja temperatura, presenta un ficticio
mcremento en el peso molecular, como consecuencia de la tendencia que tienen estos
polimeros a formar estructuras ordenadas de las molculas en disolucin (estructura terciaria).
En el xantano se han detectado dos conformaciones -hlice y ovillo-, dependiendo de la
temperatura de disolucin (Horton y col., 1985; Garca-Ochoa y Casas, 1993).
53
Introduccin
CH2 OH
CH
2 OH
co~
:oo M
c
OH
CH3
.54
Introduccin
1.11.- Xantlwinonas campestris
La cpsula de este tipo de bacterias no presenta una estructura especial, por observacin
microscpica con tcnicas simples de tincin. Sin embargo, la tincin capsular con tinta Indio
ha llevado a observar cpsulas en muchos cultivos de Xanthomonas y especialmente de X
campestris (Bradbury, 1984). La produccin de gran cantidad de estos polisacridos capsulares
-o goma de xantano- se lleva a cabo cuando se emplean medios ricos en hidratos de carbono.
.56
Introducc,n
y Bradshaw, 1984; Sutherland, 1985). Hay que destacar la importancia de los lpidos
intennedios de la sntesis, que parecen ser los que transportan el monmero de xantano hasta la
membrana celular y gracias a ellos, se unen a diferentes monosacridos para la formacin del
esqueleto carbonado (Sutherland, 1975 y 1977). El residuo de piruvato proviene del
fosfoenolpiruvato (P.E.P) obtenido generalmente por va de Entner-Doudoroff, que es la ruta
-
por la que la bacteria lleva a cabo el metabolismo de la glucosa (Bradbury, 1984: Pons y col.,
1989)- unindose, finalmente, al esqueleto carbonado ya formado (lelpi y col., 1981a y 1981b).
LIPIDOP
UDP SIc
Sic GP .-*GIc1P
Sic
DF-
UDP-Ac SIc
Entier
GP*Man- GP*Man
Doudoroff
UMP
LIPIDOP-P-G(c
DF
LIPIDO-P-P-Gc-GIc
LIPIDO-P-P-GIc-GIcUD P
Man
PEP
Ac-Gk
Man
LIPIDO-P-P
y,
1r
Sic- Sic
Man
Ac Sic
Mcin= Pyr
MONOMERO DE XANTANO
55
Introduccin
En cuanto al metabolismo de carbohidratos, oxidan la glucosa, siendo la ruta de EntnerDoudoroff la predominante en el catabolismo de la glucosa, solo desvan de un 8 a un 16% de
la glucosa a la ruta de las pentosas fosfato. El ciclo de la hexosa no se emplea de forma
significativa. Tanto el ciclo del cido tricarboxilico como el ciclo del glioxilato estn presentes
en todo el gnero Xanthomonas (Bradbury, 1984).
Introduccin
partir del 4 al lOOo de azcar. Si se emplea Al phaseoli
de una goma de caractersticas similares, con una composicin similar, al xantano. pero con
diferente relacin molar entre los azcares que lo forman. Otras especies, como Xi
ma!vacearurn, Xi heredae, Xi papavericola y Xi vesicatoria, producen polisacridos formados
por las mismas unidades de azcar (Margaritis y Zadic, 1978; Bradbury, 1984). Es la goma
sintetizada por Xsrewartii la que presenta una clara diferencia con el resto, ya que las unidades
de azcar que la forman son D-glucosa, D-galactosa y cido glucurnico (Slodki y Cadmus,
978). La mayora de las bacterias del gnero Xanthomonas producen una familia de
polisacridos extracelulares, cuyo papel parece ser proteger a las clulas de la desecacin y
otras condiciones adversas, ya que es, en realidad, la cpsula bacteriana (Bradbury, 1984). En
la Tabla 1 .3 se resumen a composicin de diversos biopolmeros sintetizados por diferentes
especies del gnero Xanthomonas.
Tabla 1.3.- Composicin media (en porcentaje) de Los diferentes polisacridos sintetizados por
Las bacterias del gnero Xanthomonas (Kennedy y Bradshaw, 1984).
Especie
O-Glucosa
0-Manosa
Ac. D-Glucurnico
Piruvato
Acetato
36 campestrus
30.1
27,3
t4.9
7.1
6.5
36 olbilneans /739
30,2
27,5
13.9
53
5.8
25,2
26,1
14,2
5.8
5,1
X wconopodis 457
30,6
28,6
13,7
7,2
5,5
36 fregara 1469
32,5
28,5
15,1
7.0
3,9
XIfragarza 1822
24,6
26,1
14,0
4.9
5.5
36 gurnnsucians 2182
34,8
30,7
16,5
4,7
10,0
Xjug/andis 411
33.2
30,2
16,8
6,9
6,4
36 inanihotis 4459
33,3
28,7
16,7
7.6
6,8
36 phaseoli 556
29,1
34,2
17,8
7,7
1,8
36 phaseoli 1/28
30,9
28,6
15,3
1,8
6,4
36 vu.scuomm 702
34.9
30,2
17.9
6,6
6,3
36 vascularum 796
22.2
26,2
15,3
5,4
8,8
contiene O-Galactosa
58
Introduccin
Como ya se ha comentado, la especie ms ampliamente utilizada para La produccin
de xantano es Xanthomonas campestris. Aunque esta bacteria no es dificil de cultivar en
medios estndar de laboratorio, se han observado variaciones en las cepas, tanto en cultivo en
continuo (Silman y Rogovin, 1972), como en discontinuo (Cadmus y col., 1976), que afectan a
la calidad y al rendimiento del xantano producido.
Se han descrito tres tipos diferentes de cepas de esta bacteria (Slodki y Cadmus, 1978;
Cadmus y col., 1976 y 1978; Jeanes y col., 1976; Kidby y col., 1977):
59
In/toduccin
Peters y col.. 1989: Pons y col., 1989 y 1990; Santos, 1993). El tiempo necesario para la
preparacin del inculo est influido por la composicin del medio empleado para el desarrollo
del microorganismo- algunos autores varian la composicin de una etapa a otra (Rogovin y
col., 1961; Cadmus y col, 1978; Peters y col., 1989; Pons y col., 1989) y por la temperatura
empleada para el crecimiento de Xi campestris, existiendo un intervalo ptimo de 25 a 30 0C,
-
1985; Tait y col., 1986; Pinches y Pallent, 1986; Funahashi y col., 1987; De Vuyst y col.,
1987a y b; Lee y col., l989; Peters y col., 1989; Qadeer y Baig, 1989; Vashitz y Sheintuch,
60
Introduccin
1991; Zaidi y col., 1991; Suh y col.. 1992). Sin embargo, parece que es la sacarosa, en
concentracin entre 20 y 40 gIL, la que proporciona mejores resultados (Souw y Demain,
1979; Funahashi y col., 1987; De Vuyst y col., 1987a; Santos, 1993).
Respecto a! nutriente nitrogenado a emplear en la produccin, existe una gran
discrepancia en la literatura; mientras que hay autores que destacan el efecto beneficioso, sobre
la produccin del polisacrido, de fuentes nitrogenadas orgnicas o complejas (Souw y
Demain, 1979 y 1980; Kennedy y col., 1982; Qadeer y Baig, 1989), otros autores comentan
que es mejor, para el transporte en el caldo, cuanto menor y ms sencilla sea la molcula
empleada (Slodki y Cadmus, 1978). La idea general sobre el sustrato nitrogenado parece
indicar que se debe emplear un compuesto orgnico (urea, cido glutmico) o sustancias
complejas (CSL, DDS).No obstante, Santos (1993) realiz una comparacin de [aproduccin
obtenida cuando el nitrgeno se aade al medio de fomia inorgnica, como amonio y cuando
la frente nitrogenada es de naturaleza orgnica, observando que, para la misma cantidad de
nitrgeno, la cantidad de xantano producida con amonio era mayor que cuando se inclua una
fuente nitrogenada de naturaleza orgnica.
Introduccan
ha empleado sacarosa en una concentracin de 40 gIL, la cual es lo suficientemente elevada
para favorecer la sntesis del polisacrido, pero no para tener efecto negativo en la
produccin por inhibicin del crecimiento (Souw y Demain, 1979).
Tabla 1.4.- Condiciones de operacin empleadas por diferentes autores para llevar a cabo la
produccin de xantano en un tanque agitado.
N(r.p.m.)
0C)
T(
pH1
Autores
Cadinus y col. (1978)
V(L)
Q(L/L/min)
lO
1.5
225-300
20-30
6.8
(control)
Rogoviny col(1965)
227
2268
0.5
90-290
30-250
28
---
1000
28
500-1000
28
72.1
(control)
---
---
---
28
---
0.5
500
25
(control)
(
(control)
Pinchesy Pallent(1986)
10
2.5
0,4
600
1000
30
(
(control)
250-700
28
350-1200
30
---
0.3
200-800
28
(
(control)
ShuyYang(l990)
---
1.16
800
20-34
(
(control)
3.6
0,3, 0.6
500-900
29
6.9
(control)
3.5
0.5
400-600
30
SchweikartyQuinlan(1989)
1.2
300-1300
26
(
(control)
(
(control)
Santos(1993)
1,5
210-1300
28
Como puede apreciarse en la tabla, la temperatura que se debe emplear para llevar a
cabo la produccin se encuentra en el intervalo de 25 a 33 0C. La gran mayora de los autores
emplean la misma temperatura en la preparacin del inculo que en la produccin (Rogovin y
col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1966, 1971 y 1973; Suman y Rogovin, 1970 y 1972;
Davidson, 1978; Souw y Demain, 1979 y 1980; Kennedy y col., 1982; Trilsbach y col., 1984;
62
Introduccin
Pinches y Pallent, 1986; Tait y col., 1986; Funahashi y col., 1987, De Vuyst y col., 1987a y b;
Peters y col., 1989; Lee y col., 1989; Qadeer y Baig, 1989; Pons y col., 1989 y 1990; Zaidi y
col., 1991; Suh y col., 1992). Sin embargo, se ha propuesto el empleo de temperaturas
diferentes en ambas etapas del proceso (Thonart y col., 1985; Shu y Yang, 1990 y 1991).
310
C.
Aunque los valores del caudal de are empleados son dispares (de 0,3 a 1,5 L/L/min),
todos los autores mantienen constante la citada variable. Por tanto, la transferencia del oxgeno
en el caldo depende nicamente de la velocidad de agitacin. Sobre esta ltima variable
citada, hay dos tendencias: por una parte hay autores que la mantienen constante durante toda
la fermentacin (Souw y Demain, 1980; Pinches y Pallent, 1986; Shu y Yang, 1990 y 1991),
mientras que otros la van aumentando a medida que aumenta la viscosidad del caldo (Rogovin
y col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1971; Cadmus y col., 1978; Kennedy y col., 1982;
Funahashi y col., 1987; De Vuyst y col., 1987a y b; Schweickart y Quinlan, 1989; Pons y col.,
1990).
Introduccin
Finalmente, respecto a la ltima de las variables citadas anteriormente, el pH,
nicamente Thonart y col. (1985) proponen realizar la preparacin del inculo a un valor de 5,
el resto de los autores comienzan la fermentacin partiendo de un inculo crecido a pH cercano
al neutro y con el medio de produccin ajustado tambin a un valor cercano a 7. La diferencia
entre unos trabajos y otros radica en controlar o no esta variable durante la fermentacin, e
incluso se estudia la mejor base a emplear para realizar el citado control. Hay autores que
sealan, de forma especial, el beneficio del control del pH durante la fermentacin (Moraine y
Rogovin. 1971), mientras que otros autores nicamente trabajan empleando el citado control,
pero sin comentar si esta variable ha sido o no estudiada (Cadmus y col., 1978; Davidson,
1978; Souw y Demain, 1980; Patton y Dugar, 1981; Pinches y Pallent, 1986; Tait y col., 1986;
Robinson y Wang, 1988; Pons y col., 1989; Lee y col., 1989; Peters y col., 1989; Schweickart
y Quinlan, 1989; Shu y Yang, 1990 y 1991; Suh y col., 1992). Moraine y Rogovin (1971)
sealan la mejora que supone el empleo de hidrxido amnico como lcali para realizar el
control del pH.
En la literatura, sin embargo, existe tambin un gran nmero de trabajos en los que
se realiza la fermentacin sin llevar a cabo el control del pH (Rogovin y col., 1961 y 1965;
fvloraine y Rogovin, 1966; Suman y Rogovin; 1970 y 1972; Souw y Demain, 1979; De Vuyst
y col., 1987a y b; Funahashi y col., 1987). Santos (1993) y Garca-Ochoa y col. (1997)
proponen realizar la produccin sin control de pH pues no resulta beneficioso para la
produccin. Durante el periodo de crecimiento, el pH del medio prcticamente se mantiene
constante en este valor, pero al llegar a la fase estacionaria de crecimiento el pH disminuye,
si se controla esta variable la produccin se detiene.
Finalmente, en la Tabla 1.5 se muestra la comparacin entre la cantidad de xantano
producido, as como el rendimiento obtenido, en las condiciones empleadas por Santos (1993)
en comparacin con otros autores en tanque agitado y en discontinuo. Como puede observarse,
Shu y Yang (1990) obtienen mejor rendimiento en xantano que el obtenido en dicho trabajo,
pero la concentracin del polisacrido obtenida por estos autores es apenas la mitad que la
obtenida por Santos (1993), siendo un factor ms importante llegar a una concentracin de
xantano elevada. Slo Funahashi y col. (1987) han obtenido la misma concentracin de
xantano, pero han necesitado un da ms de tiempo de fermentacin.
64
Introduccin
Desde que se comenz a estudiar la sntesis del xantano, su produccin se ha
llevado a cabo en reactores tipo tanque agitado, realizndose la operacin de forma
discontinua. Existen, desde entonces, una gran cantidad de trabajos que, incluso en la
actualidad, siguen llevando a cabo la fermentacin en las mismas condiciones de
operacin y tipo de reactor (Rogovin y col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1966, 1971
y 1973; Cadmus y col., 1976 y 1978; Souw y Demain, 1979 y 1980; Kennedy y col., 1982;
Thonart y col., 1985; Dussap y Gros, 1985; Pinches y Pallent, 1986; De Vuyst y col.,
1987a y b; Funahashi y col., 1987; Peters y col., 1989; Shuy Yang, 1990 y 1991; Pons y
col., 1990). A partir de los aos 70 comenzaron a realizarse estudios para llevar a cabo el
proceso en continuo (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Davidson, 1978; Patton y Dugar,
1981; Trilsbach y col., 1984; Tait y col., 1986; Lee y col., 1989), aunque la produccin a
escala industrial se sigue realizando en operacin discontinua, ya que el problema es evitar
la contaminacin del cultivo con microorganismos indeseables (Kennedy y Bradshaw,
1984) y la degeneracin de las cepas. En los ltimos aos, han comenzado a realizarse
trabajos en reactores diferentes al tanque agitado, como son columnas de burbujeo y
airlifts (Pons y col., 1989 y 1990; Zaidi y col., 1991; Suh y col., 1992), los cuales, segn
estos autores, presentan ventajas en algunos aspectos respecto a los de tanque agitado
mecnicamente, como menor stress hidrodinmico, aumento en la velocidad de
transferencia de materia y calor, mejores condiciones de mezcla y menores limitaciones en
el cambio de escala. Incluso se han empleado reactores prototipo, como es el T.O.R.U.S.
(Krebser y col., 1988), llevndose a cabo el proceso, en todos los casos, de forma
discontinua. En trabajos previos
1997), se ha
65
!ntoduccon
Tabla 1.5.- Produccin de xantano y rendimientos obtenidos por los diferentes autores
trabajando en tanque agitado y aereado
Autores
t(h)
P(g/L)
46
67
72-96
96
14
15
70
96
15
73
75
40
96
14.6
29
50
60
10.5
76
45
DeVuystycol.(1987)
75
144
27.9
96
30
90
18.5
52
19
50
13
Ponsycol.. 989
Xp ~
t (h)
Cp (g/L)
Fermentador
=9
80
12
Colunna de Burbujeo
65
50
Tanque agitado
50
120
20
Columnadel3urbujeo
Plugging jet
Suhycol.. 1992
66
Introduccin
1.3.3.- Transpone de Ox2eno
en agua es muy
estas
circunstancias,
la
velocidad de
transporte de oxgeno controla, o influye notablemente, la velocidad del proceso global; por
lo que el parmetro caracterstico de este transporte, el coeficiente volumtrico de
transferencia de materia, kLav, debe ser conocido.
Por otra parte, teniendo en cuenta que, para efectuar cambios de escala en
fermentaciones aerobias, uno de los criterios ms ampliamente utilizado es el de mantener
valores similares de la concentracin de oxgeno disuelto o su velocidad de transferencia,
se
Introduccin
Como ya se ha comentado, en los procesos de fermentacin aerobios es necesario
proporcionar al microorganismo la cantidad de oxigeno suficiente para que ste satisfaga
sus requerimientos metablicos. La utilizacin de los nutrientes por parte de los
microorganismos, principalmente la oxidacin de la fuente de carbono y su posterior
transformacin en biomasa, productos y dixido de carbono slo es posible con el suficiente
aporte de oxgeno desde la fase gas. Cuando, en un biorreactor, un componente poco soluble
como el oxgeno, debe ser transferido desde el gas aire- al medio liquido, donde se
encuentran los microorganismos, el balance de oxgeno puede expresarse como (Moo-Young
y Blanch, 1987):
CL
dt
q02
C~
[1.60]
Las tcnicas de medida indirecta son aquellas que se llevan a cabo en sistemas donde
no se est produciendo una biotransformacion. Los valores de kLav obtenidos en medios
artificiales que simulan los caldos de fermentacin se emplean, generalmente, para realizar
comparaciones entre diferentes biorreactores que operan en condiciones similares o en la
obtencin de correlaciones empricas que permitan estimar el coeficiente de transporte y poder
describir la transferencia de materia gas-lquido (Dussap y col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990;
Yasukawa y col., 1991 a; Leckie y col., 1 991b; Garca-Ochoa y Gmez, 1988).
En estos casos, en ausencia de transformacin microbiana, el trmino correspondiente
al consumo de oxigeno, q0, C~, de la ecuacin [1.60]
es cero, resultando la siguiente
-
ecuacin:
dC0, =kLaV.(CO
dt
68
C0)
[1.61]
Introduccin
Los datos experimentales para la resolucin de esta ecuacin se pueden obtener
mediante diferentes tcnicas o mtodos, que pueden ser clasificados en qumicos y fisicos. Los
mtodos qumicos, se basan en la medida de la concentracin de oxgeno disuelto a travs de
una reaccin qumica tal como la oxidacin del sulfito (Yoshida y col., 1960; Dussap y col.,
1985; Yang y coL, 1992), la adsorcin de CO2 (Danckwerts y Gillham, 1966; Danckwerts,
1970) o la oxidacin de la hidracina (Onken y col., 1985). Los mtodos fisicos utilizan la
respuesta de un electrodo de oxgeno, a los cambios en la concentracin de este gas en el
medio, en condiciones no estacionarias o dinmicas. Este ltimo tipo de mtodo es el ms
ampliamente utilizado y se basa en la medida de la concentracin del oxgeno disuelto durante
la absorcin o desorcin de oxgeno de la disolucin (Dussap y col., 1985; Costa y col., 1982a
y 1982b; Merchuk y col., 1994; Arranz, 1993; Gmez, 1995, Garca-Ochoa y Gmez, 1998).
Su aplicacin presenta ciertas restricciones que es necesario tener en cuenta para la obtencin
de valores correctos, como son la adecuada disposicin en el reactor del electrodo de medida
del oxgeno disuelto, el tiempo de respuesta y la linealidad del mismo (Nocentini y col., 1993;
Merchuck y col., 1994).
Las tcnicas de medida directa son aquellas en las que se determina la velocidad de
transferencia de materia en presencia de microorganismos, es decir, en la fermentacin real por
lo que el valor obtenido es ms representativo del sistema en estudio. La medida de la
variacin de la concentracin de oxgeno en el biorreactor puede realizarse en condiciones
estacionadas o no estacionarias o dinmicas.
Introduccin
dc
0,
dt
C 02 ~
02 _
~~1o.
[1.62]
C\
k,a,
______
Co2 *
AIRE
Co2
ETENIDO
AIREACIN
dt
~c
)
q0,
1-.
FASE 11
Ccrit
FASE 1
t
Figura 1.13.- Esquema de la tcnica dinmica (rgimen no estacionario) para la medida del
coeficiente de transferencia de materia.
Antes de que la concentracin de oxgeno disuelto alcance un valor crtico, se reanuda
la aireacin del medio de cultivo y se registra la variacin de la concentracin de oxigeno
disuelto con el tiempo. En estas condiciones, la ecuacin [1.601se puede expresar como:
9, )dtq0 .9, dr
[1.63]
70
Introduccion
0,
C~
(t~lm)+(Co,
~Cm)
[1.64]
ecuacin, que una vez integrada, permite calcular el valor de kLav a partir de la variacin de
la concentracin de oxigeno con el tiempo, una vez conocido el valor del consumo del
microorganismo, q0 C,<, de la pendiente de la primera parte de la curva.
Este elevado nmero de variables hace que existan numerosas correlaciones empricas
para predecir el valor de kLaV que podemos clasificar en dos categoras. Unas tienen una
forma dimensional, correlacionando kLav con la velocidad de agitacin (o potencia por unidad
de volumen, la velocidad superficial del gas y, en caso de que el fluido sea no-Newtoniano,
con la viscosidad. Segn una expresin del tipo:
Pi?
=C,V~(-)
-p~
11.661
Sh
[1.67]
71
introduccin
Autores
2,2
NEWTONIANOS
NO NEWTONIANOS
INI
correlaciones
02
-0.4
0,6
08
.0
0,8
0.3
0,4
0.r
0,9
0.7
0,5
2,7
0.6
0,6
04
-2
0.5
0.4
0.5
0,7
0.4
2.0
0.5
2,4
0,8
0.3
-2.5
-0,5
2,0
0.4
2,5
-0,4
1,5
0.5~
-0,
0,9
0.4
0,5
0.5
0,1
-0.4
0,02
0,9
-0,6
1,1
0.4
2,7
0.6
2,0
0.67
-0,67
-1,0
0.6
0.67
-0,67
-1,0
72
Introduccin
[1.68]
y para uno de 2 litros:
kLaI, =c, y72 N1 u~E3
[1.69]
Los valores obtenidos son acordes con los propuestos en la bibliografia. En la Figura
1.14 se comparan los valores obtenidos a partir de la ecuacin [1.69] con las correlaciones
propuestas por otros autores para sistemas anlogos y en el mismo mtervalo de condiciones de
operacin. En la misma se observa, que los valores obtenidos por Ogut y Hatch (1988) son
significativamente superiores al resto de los trabajos, siendo las diferencias tanto ms
significativas cuanto menor es la velocidad de agitacin. La presencia de electrlitos y la
aplicacin de una tcnica poco adecuada (el mtodo qumico del sulfito) que proporciona
valores muy superiores, no comparables a los obtenidos mediante mtodos fisicos. Las
diferencias obtenidas por otros autores y las calculadas con la ecuacin [1.69]
se explican por
el efecto de los parmetros geomtricos sobre el coeficiente de transporte en el biorreactor
usado en el estudio (altura, tipo de agitador, tipo de difusor, etc.) y las propiedades fisicas del
fluido.
. N75
p39
[1.70]
73
Introduccin
0,1
0.01
~iz
.2
0.001
0,000 1
2
10
N (r.p.s.)
presencia de xantano, el medio es muy viscoso, unos 100 Kg/ms. Por todo ello, la
recuperacin del xantano del caldo de fermentacin no es sencilla, ya que se debe de
74
Introduccin
eliminar cerca del 95% del caldo. Para conseguir este fin se pueden emplear tanto mtodos
fisicos como qumicos (Kennedy y Bradshaw, 1984), dentro de los que se encuentran:
(y
IPA/v caldo).
Otros autores (Patton y Holman., 1968; Pace y Righelato, 1981; Albretch y col,
1964; Kenedy y col., 1981) han propuesto la adicin de cationes polivalentes a las
soluciones de xantano, realizndose la precipitacin del xantano debido al carcter
polelectrolitico del polisacrido. Se puede realizar la precipitacin por la adicin de sales
de calcio (Patton y Holman, 1968; Macneely y OConell, 1966) a pH bsico (entre 8,5 y 12)
o por sales de aluminio (Albretch y col., 1962 a pH cido (entre 4 y 4,5). De este modo se
obtiene una sal de xantano insoluble, que debe de ser transformado en un compuesto
soluble, en forma de sal sdica o potsica, para su empleo comercial.
75
Introduccin
Otra posibilidad es el empleo combinado de ambos efectos (debido al disolvente y a
la presencia de cationes en la disolucin). Smith (1983) seal la posibilidad de aadir al
caldo sales de calcio, magnesio y cinc- as como isopropanol, disminuyendo en gran
manera la cantidad de disolvente necesaria para llevar a cabo la precipitacin. El empleo de
sales polivalentes se debe a que, cuanto mayor es la carga del catin empleado, menor es el
volumen necesario de disolvente para conseguir la precipitacin de la misma cantidad de
xantano (ver Figura 1.15).
Las etapas finales empleadas dependen de las propiedades comerciales y los usos a
los que se vaya a dedicar el xantano purificado.
Introduccin
realizar el proceso, ya que evitan la etapa posterior de conseguir que la sal de xantano
insoluble, obtenida en el caso de emplear sales de cationes polivalentes sea transformada en
soluble por cambio del catin.
77
Introdccn
a>
(~0
a6
1,0
Introduccin
fermentacin.
Las
disoluciones
de
xantano
presentan
un
comportamiento
claramente
4fl0
Introduccin
MODELO
FUNCION
tYp
Ostwald- de Waele
y = k y
Casson
Horschel-Bulkley
~- =
0 = 1< yfl~I)
~ +k0 .~<2
+
2
roo
11
lo-;
lo2
lo
-2
lo
io~
102
4-y ls-)
102
80
Introduccin
<A
T0
60C
7.92r
0C
25
792s
lo
Key C,(><
a
o
o
o3
20
15
1
~C
601
80
TMUC)
20
26080
e
TM(C)
8]
Jniroduccz<vn
(Kg/ms>
SO
1,
rc
niveles
en
el
contenido de acetato y piruvato varan con las condiciones en las que crece la bacteria
(Souw y Demain, 1979; Cadmus y col., 1978; De Vuyst y col., 1987), con las condiciones
82
Introduccin
de operacin (Trilsbach y col., 1984; Peters y col., 1993) y con la especie de Xanthonionas
sp empleada (Cadmus y col., 1976; Kennedy y Bradshaw, 1984; Tait y col., 1986).
(K)
La
molecular del xantano. Este aspecto ha sido estudiado teniendo en cuenta varios nutrientes,
pero la mayora de los trabajos se centran en el estudio de la fuente de nitrgeno. Hay
autores que encuentran un mayor grado de piruvatizacin cuando la fuente de nitrgeno
empleada es de naturaleza orgnica (Qadeer y Baig, 1989; Kennedy y col., 1982), pero
Cadmus y col (1978) concluyen que la mejor frente de nitrgeno para conseguir un xantano
con alto
Introduccin
col. (1982) encontraron un incremento en el contenido en piruvato cuando la concentracin
de nitrgeno en el medio se aumentaba, pero Davidson y col. (1978) obtuvieron mayor
piruvatizacin y menor contenido en acetato cuando la fuente nitrogenada era el nutriente
limitante. Trilsbach y col. (1984) no encontraron relacin entre el contenido en piruvato de
la molcula y la composicin del medio. Posteriormente, Casas y col. (1999), tambin
estudiaron la influencia de esta variable sobre las propiedades de la molcula. As, en el
trabajo realizado se muestra que la concentracin de nitrgeno no afecta al contenido en
piruvato y acetato ni al peso molecular del polmero. Adems en su estudio se observ LLfl
84
2.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Procedimiento Experimental
2.1.- EQUIPOS
85
Procedirnieu/o Experimental
A continuacin se dan las caracteristicas principales de los equipos empleados:
FERMENTADOR COMERCIAL
en un
biorreactor BIOSTAT M de tipo tanque agitado, diseado y comercializado por BRAUN. Est
constituido por un tanque de cultivo de 2 L de capacidad y con los sistemas de medida, control
y regulacin de pH, oxgeno disuelto, temperatura y velocidad de agitacin, de acuerdo a un
diseo modular e insertados en una cabina metlica. En la Figura 2.1 se muestra un esquema
del biorreactor empleado, que consta de los siguientes elementos:
Procedimiento Experimental
La aireacin del caldo se consigue suministrando aire mediante un compresor,
filtrndose a travs de un filtro que posee una membrana de 0,2 ~m,para conseguir la
esterilizacin del aire que se introduce en el reactor. El aire se distribuye en el interior
mediante un difusor toroidal. El caudal de aire es ajustado mediante una vlvula y
medido por un rotmetro.
Sistema de medida y con trol de oH: El pH del medio de cultivo es analizado en lnea
mediante un electrodo esterilizable fabricado por INGOLD. Opera en un rango de
medida de 2 a 12 unidades de pH, disponiendo de una compensacin manual o
automtica de temperatura. La seal de medida, previamente amplificada, es
alimentada a un controlador de tipo PI. Una vez fijado el valor de pH al que se desea
trabajar es mantenido por la accin del controlador sobre sendas bombas de
alimentacin de lcali o cido, como se muestra en la Figura 2.5.
87
P-ocedinienw Experimental
Fermernador comercial de 2 1.
88
Procedimiento Experimental
89
Pocedniieno Experimental
SEAL
CONTROLADOR DE
CONSIGNA TENFERATURA
SALIDA DE AGIlA
90
Procedimiento Experimental
AMPLIFICADOR
DE SEAL
COUTROLADOR
F~LTRO
AIRE
RO! AMETRO
ELECTRODO
AIRE
DE Di
---e-
~.~J~jjjjjj--
SEAL
CONSIGNA
WQROLAOOR
OC VELOCIDAD
Procedimiento Evpcrirnental
92
Procedimiento Experimental
~--2
CONTROLADOR
DUR AO O N
DOS IP OAGIO N
TIEMPO GE
DOSIFICACION
SUSTANGIA
ANTIE SP UMA NTE
93
Procedimiento Experimental
INCUBADORA ORBITAL
ESTUFA DE CULTIVO
0,5
%,
5 0C hasta 600C.
CAMARA DE FLUJO
94
Procedimiento Experimental
BALANZA DE PRECISIN
0,1 mg.
CENTRIFUGAS
Para la centrifugacin de las muestras se han empleado dos tipos de centrfugas, una
de la firma HERMLE, modelo Z 230, con capacidad para ocho tubos de 10 ml cada uno;
alcanza un mximo de 5000 r.p.m.- lo que corresponde a 2000 g- durante un tiempo
controlado de hasta una hora.
Para la preparacin de las muestras para citometra de flujo, la centrfuga empleada fue
de la marca SELECTA, modelo Centrolit con una capacidad para 30 Eppendorf, alcanza una
velocidad fija de 10000 r.p.m. (18000 g) durante un tiempo que puede ser programado.
URMIETRO
VISCOSIMETRO
95
Procedimiento Experimental
ESPECTROFOTMETRO de ABSORCIN tJV/VIS
ESPECTROFOTMIETRO de FLUORESCENCIA
emisin.
AUTOCLAVE
ELECTRODO de AMONIO
96
Procedimiento Experimental
CROMATOGRAFA LIOUIDA de ALTA RESOLUCIN (HPLC
El equipo de cromatografia lquida de alta resolucin, HPLC, que se esquematiza en
la Figura 2.7, presenta las siguientes caracteristicas tcnicas:
Bomba: KONTRON JKSYRUMENTS (325 System), capaz de mantener un caudal
constante entre 0,1 y 5 mL/mm a una presin que puede variar entre 1 y 450 bar. Puede
trabajar tanto en rgimen isocrtico como en gradiente, tanto de caudal como de
composicin, ya que est dotada de un mezclador de tres canales.
97
Procedimiento Experimental
Filtro
u
Reserva de
disolvente
Precolumna
Bomba
Inyector automtico
Columna
CONTADOR de PARTCULAS
Para el contaje del nmero de clulas, necesario para el procesamiento de las muestras
por Citometra de Flujo, se emple un contador COULTER modelo ZM empleando un tubo
de 30 ~tmy un canalizador acoplado marca COULTER, modelo CHANNELIZER 256.
CITOMETRO DE FLUJO
se ha empleado un citmetro
98
Procedimiento Experimental
99
Procedimiento Experimental
r
Suspensin
celular
Agua
presurizadalE*
Q.$ij j6%%%
luz
Fuente d~~X
Rayo de luz
excitado
fluorescente
Detector
Coleccin de
lentes
N
Flujo
NS
Detectbr,~
de luz
disnersa
NS
NS
Mistogramas
4
1~
cg
100
Procedimiento Experimental
2.2.- MATERIALES EMPLEADOS
2.21.-
Nlicroor2anismo
El microorganismo empleado en el presente trabajo ha sido Xanthomonas campestris
crece y se reproduce). Se realiza en slants (tubos con medio slido), pero requiere una
renovacin del cultivo cada quince das (De Vuyst y col., 1 987a y b; Suman y Rogovin, 1970)
ya que si no se realizan transferencias del cultivo ms o menos frecuentes, la cepa puede
degenerar a Sm (Cadmus y col., 1976).
101
Procedimiento Experimental
-A
empleado medio YMagar. Los slants son incubados durante un periodo de 1 8 a 20 horas en
estufa de incubacin a 250 C y manteniendo posteriormente el slant a
40
C durante un
periodo de 14 das como mximo. Tras ese tiempo se renueva el cultivo traspasndolo a otro
slant con medio YM-agar.
Figura 2.9.- Fotografla de las colonias formadas por Xantho,nonas campestris sobre YMagar.
102
Procedimiento Experimental
En la Tablas 2.1 a 2.6 aparecen los reactivos empleados, tanto para la preparacin de
los medios de cultivo como aquellos que se han ido utilizando en el anlisis de los diferentes
componentes del sistema.
Compuesto
Marca
Cdigo
Agar-Agar
PROBUS
29210
PANREAC
141341
Extracto de Levadura
OXOUJ
L2 1
Extracto de Malta
OXOID
L39
Peptona Bacteriolgica
OXOID
L3 7
103
Procedimiento Experimental
Marca
Pureza
Cdigo
Qumica
Cloruro de Magnesio
PROBUS
PROBUS
cido Brico
PANREAC
cido Clorhdrico
PANREAC
Nitrato de Amonio
PROBUS
Carbonato Clcico
PROBUS
PROBUS
Oxido de Zinc
PANREAC
PANREAC
Hidrxido de sodio
PANREAC
Puro
Puro
Puro
35%
Puro
Puro
Puro
Puro
98%
120410
11510
23687
141019
21310
1092 1
91410
15682
141509
141687
970
Sacarosa
PANREAC
Puro
176820
Tabla 2.3.- Reactivos empleados para la precipitacin y extraccin del producto obtenido.
Compuesto
isopropanol
Marca
VIUDA e HIJOS de
MANUEL RIESGO
104
Pureza
Qumica
Puro
Cdigo
Procedimiento Experimental
Citometra de Flujo y en la
Marca
Pureza
Cdigo
Qumica
Tris (hidroximetil) aminometano
PANREAC
Puro
131940
Cloruro Sdico
PANREAC
Puro
141659
Glutaraldehdo
RIEDEL-DE HAEN
25%
62621
Deoxiribonucleasa 1
SIGMA
90 %
DN-25
Ribonucleasa A
SIGMA
85 %
R5503
loduro de Propidio
SIGMA
95-98%
P-4170
Isotiocianato de Fluorescena
SIGMA
90 %
F-7250
Rojo Nilo
SIGMA
N-3013
BOEHRINGER-MANNHEIN
10222
BOEHIRIINGER-MANNHEIN
109223
RNA de Levadura
BOEHRIINGER-MANNHEIN
104175
Marca
Cdigo
I3OEHRINGERMANNHEIM
Pureza
Qumica
Puro
Lisozima
Citrato de Sodio
SIGMA
99%
54641
SIGMA
>99%
L5901
Sulfato Cprico
PANREAC
Puro
141648
PANTREAC
Puro
141729
Reactivo de Folin
ANALEMA
Puro
PS
Fenol
PANREAC
Puro
141322
107255
los
Procedimiento Experimental
Marca
BOEI-IIRINGER-MANNHEIN
Acetonitrilo
RIEDEL-DE HAN
Pureza
Qumica
99,8 %
Cdigo
139041
34881
Extracto de Levadura
3 g/L
Extracto de Malta
3 g/L
Glucosa Anhidra
10 gIL
Acdo Brico
0,006 g/L
Acido Ctrico
2,100 g/L
Acido Clorhdrico
0,130 mL
Carbonato Clcico
0,020 g~L
0,0024 g/L
Oxido de Zinc
0,0060 g/L
MEDIO de PRODUCCIN
MEDIO A
0,507 gIL
Sulfato Sdico
0,089 gIL
Nitrato Amnico
1,1440 gIL
Sacarosa
40,00 gIL
106
Procedimiento Experimental
0,1M
Cloruro Sdico
0,IM
TAMPN B
Dodecil Sulfato Sdico
Tris Hidroxim. Amino Met.
1 ,5%(w/v)
10 mM
Citrato Sdico
lmM
Cloruro Sdico
10 mM
LOWRY A
Carbonato de Sodio
2 % (w/v)
Hidrxido Sdico
0,1 N
Sulfato de Cobre
0,5%(w/v)
1 ,O%(w/v)
LOWRY B
LOWRYC
LOWRY A: LOWRY B
50:1
107
Procedituienbo Experimental
2.3.-REALIZACIN de un EXPERIMENTO
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin del inculo, se lleva ste a la cmara de flujo
realizar diluciones y
antes de ser introducido en el citado autoclave, se prepara, de modo que se conecte al cuerno
del fermentador lo ms rpidamente posible. Se deben colocar filtros, tanto para la entrada de
aire como a la salida del refrigerante, que se cubren cuidadosamente con papel de aluminio y
se sellan con cinta adhesiva. Mi mismo, se colocan los electrodos de oxigeno disuelto,
El
ferinentador se debe esterilizar con el medio a emplear dentro, por lo que se deben
pinzar todas las gomas de salida y entrada para evitar prdidas. Cuando el medio que se va a
emplear en el experimento no se puede esterilizar todo junto -por contener la mente carbonada
y
sales inorgnicas-, se introduce en el reactor una parte del mismo, conteniendo todos los
aparte -de los preparados para control del pH, con salida al fermentador- y se esteriliza unido al
mismo, tomando la precaucin de pinzar la goma que los une, para evitar que haya paso de
liquido de uno a otro.
/08
Procedimiento Experimental
Una vez introducido todo en el autoclave, se esteriliza a 1200C durante 30 minutos. Despus
de la esterilizacin, se quita la cinta adhesiva y el papel de aluminio y se conecta el
ferinentador al cuerpo del mismo;
camisa y se abre la vlvula de llenado. Se conectan el agitador, los tres electrodos la bomba
y
Para llevar a cabo el seguimiento de la evolucin de este sistema durante el proceso, sc realiza
la toma de las muestras a distintos tiempos, as como el anlisis de las mismas. En el
fermentador, la toma de muestras se realiza por la salida superior. Una vez tomada la muestra
se pinza la goma y se introduce alcohol por el extremo inferior, hasta la siguiente muestra, para
evitar contaminaciones.
Las muestras deben ser tomadas en condiciones lo ms aspticas posibles, por lo que los tubos
donde van a ser almacenadas deben ser esterilizados previamente. Una vez tomada la muestra,
es centrifugada a 4000 rpm. <2860 g> durante 30 mlii. con el fin de separar el caldo de las
clulas, y de esta forma parar el crecimiento y la evolucin de sustratos y productos. Una vez
centrifugadas son almacenadas a C para el posterior anlisis de cada compuesto.
40
109
P,-ocedmicn/o Experimental
mtodo
turbidimtrico, es decir un mtodo ptico basado en la absorbancia que presentan las bacterias
en longitudes de onda del espectro visible. Consiste en medir la absorbancia de la muestra a
una cierta
trabajo, para este anlisis, fije de 540 nm y el blanco utilizado, agua destilada.
El calibrado del mtodo se realiz en un trabajo previo (Santos, 1993). El ajuste de los
datos experimentales por regresin lineal a la expresin de Lambert -Beer aparece en la
ecuacin [2.1].
c~~j (g L)
0.285
.
<540 nm)
[2.1]
110-
Procedimiento Experimental
.4
Q5
1,0
1,5
Abs(S~ mi)
Figura
20
inicialmente, pero cuando se dispuso del equipo de cromatografia lquida de alta resolucin se
emple esta tcnica en lugar de la tcnica enzimtica.
4=
7 fl$>
~1
la hidrlisis enzimtica de la sacarosa. Una vez preparada la muestra como se ha indicado, los
pasos a seguir son los siguientes:
/3 Fructosidadasa
glucosa
i~
fructosa
[2.2]
La
glucosa-E-fosfato
formada
(G-6-P)
es
oxidada
a gluconato6-fosfato,
formndose,
la vez,
<Pu c~ a
<36-- 1
El
-IT?
Ffexoqunasa
NADP~
(Y/u casaE
(36PDfcf.
P + <ID?
G/uconuto6p
NADPfI w 1<
[2.3]
[2.4]
AA9- AM
[2.5]
/000
[2.6]
separacin de las clulas del caldo de fermentacin. Esta separacin puede realizarse tanto por
centrifUgacin a
1/2
Procedimiento Experimental
filtro Millipore de 0,2 ~tm. Como ya se ha comentado, para este anlisis se ha utilizado un
cromatgrafo marca KONTRON, modelo SEDEX 45, con detector de dispersin de luz. Las
condiciones utilizadas han sido las siguientes: la columna empleada ha sido tipo Nucleosil
NH2 de Sgm, con unas dimensiones de 250 x 4,6 mm. Se ha empleado como eluyente una
mezcla Acetonitrilo/agua Mili Q en proporcin 75:25, con un caudal de 1 L/min. En cuanto al
detector, es de dispersin de luz, trabajando con una ganancia de 6, una presin de aire de 1,9
atm. y a 280
C de temperatura.
= 0,00863A
[2.7]
.4
~oo
A
Figura 2.11
2.4.3.-
113
Procedimiento Experimental
Sc toma una muestra de 10 mL
y~
El anlisis del xantano se llev a cabo estableciendo una relacin entre la viscosidad
del caldo y la concentracin de xantano en una muestra dada. La viscosidad se mide
generalmente a 30 r.p.m. entre 25 y 300C (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Cadmus y col.,
1976 y 1978: Souw y Demain, 1979; Tait y col., 1986; De Vuyst y col., 1987a y 1987b). En el
presente trabajo, el anlisis
1989); en consecuencia, para calibrar este mtodo de anlisis se emple el propio xantano
obtenido en cada experimento para realizar el calibrado. El procedimiento seguido fue el
siguiente:
Se toma un caldo resultante de la fennentacin y se aade un volumen conocido de alcohol
isoproplico (IPA), precipitando el xantano y quedndose en suspensin las bacterias. La
relacin caldo:IPA es normalmente superior a 1:2,3, debido a que no se emple ninguna sal
para no falsear la medida por pesada. Despus de filtrar, lavar y secar, se mantiene en una
estufa a temperatura de 50
114
Procedimiento Experimental
de calibrado se recogen en cada experimento, es decir, cambian los valores de a y de b en la
ecuacin siguiente:
[2.8]
La relacin entre la viscosidad aparente del xantano (g~) con su concentracin (gIL)
de acuerdo con la Ecuacin [2.8]
para cada experimento, se muestra en la Tabla 2.7.
Tabla 2.7- Valores de los parmetros a y b de la ecuacin [2.8]
para los diferentes
experimentos realizados en los que se varian las condiciones que se indican
en la primera columna.
Experimento
0,12
0,97
0,34
0.70
310C,257p.p.mNH
0,43
0,51
2,05
0,34
0,77
0,32
0,77
0,31
0,23
0,71
115
Procedimiento Experimental
2.5.- ANLISIS de COMPONENTES INTRACELULARES
La Citometra de Flujo (CMF) parece ser la mejor tcnica para poder realizar un
seguimiento del proceso, teniendo en cuenta los cambios producidos intracelularmente
cuando el microorganismo se encuentra bajo diferentes condiciones ambientales.
La CMF presenta importantes ventajas con respecto a otras tcnicas analticas, por
ejemplo permite la caracterizacin de clulas individuales en trminos de distribucin de sus
componentes, tales como DNA, RNA, y proteinas, o bien de sus propiedades tales como
viabilidad, tamao, variacin morfolgica (complejidad), etc.; adems, permite anlisis
multiparamtricos con alto grado de precisin. En la Tabla 2.8 se muestran algunos de los
principales parmetros biolgicos ana]izables por CMIF, tanto mediante el uso de
fluorocromos como sin ellos, siendo posible tambin el anlisis simultneo de varios de
estos parmetros.
116
Procedimiento Experimental
SIN
FL UOROCROMO
CON
FLUOROCROMO
PARMETROS
ESTRUCTURALES
Volumen Celular
Complejidad Celular
Pigmentos
PARMETROS
FUNCIONALES
Potencial REDOX
Viabilidad celular
Macromolculas
Orgnulos Subcelulares
Receptores
Metaboltos de Bajo Peso molecular
Etegridad de membrana
Movimientos inicos
Potencial de Membrana
Viabilidad Celular
Sntesis de DNA
Transporte Celular
Esta tcnica ha sido habitualmente utilizada para analizar clulas eucariotas (Hullet y
col., 1969; Criasman y col. 1975), especialmente clulas sanguneas. Su aplicacin para el
anlisis de clulas procariotas es menor, debido a que el contenido en constituyentes objeto
de anlisis (componentes intracelulares), en dichas clulas procariotas, es de dos a cuatro
rdenes de magnitud inferior que en eucariotas, lo cual hace que se requieran equipos
mucho ms sensibles (Steen y Boye, 1980; Steen y col., 1982).
A. pesar de las enormes ventajas de la CMIF frente a otras tcnicas, como las
microbiolgicas o bioqumicas convencionales, esta tcnica presenta inconvenientes a la
hora de emplear los datos necesarios para la formulacin de Modelos Cinticos, debido a
117
Basados en el trabajo llevado a cabo por Agar y Bailey (1982), se abord el estudio
para establecer una correlacin entre los datos obtenidos mediante CMF con otras tcnicas
de anlisis.
Procedimiento Experimental
un mtodo colorimtrico basado en el hecho de que los grupos fenlicos de las tirosinas
presentes en las protenas reducen el reactivo de Folin, dando un complejo de color azulado
cuya intensidad es proporcional
complejo azulado es necesario que las tirosinas estn accesibles al reactivo de Folin, para lo
cual se aaden iones calcio que se unen a las protenas dando complejos protena calcio.
-
precipitado en tampn Tris. Esta operacin se debe realizar al menos cinco veces, con el
fin de eliminar todo el polisacrido que pudiera estar pegado a las clulas, lo cual
introducira un error enorme en este ensayo en concreto, debido a la interferencia entre el
vantano con el reactivo de Folin.
Se vuelve a centrifugar a 4000 r.p.m (2860 g) durante 15 minutos y el precipitado se
resuspende en 2 mL de una disolucin de lisozima (10 mg/mL
y sonica durante 1
blanco agua destilada a la que se le haya efectuado el mismo tratamiento que a las dems
muestras desde la etapa de adicin de la lisozima, la cual ser cuantificada tambin como
protena y cuya concentracin debe ser restada en todas las muestras.
Los valores de absorbancia obtenidos son extrapolados en la curva patrn previamente
realizada con patrones de Albmina de suero de bovino (BSA) con concentraciones
entre 10 y 100 pg/mL.
119
Procedimiento Experimental
La Ecuacin [2.9] es la obtenida mediante ajuste por regresin lineal de los valores de la
cAPR
=4/~,674>
[2.9]
0,16
A(500nm)
120
0.6
0,4
0,2
0
O
lO
20
30
40
50
60
t(h)
El anlisis requiere de la digestin enzimtica con RNAasa para la medida del DNA
y con DNAasa para el anlisis de RNA, pues ambos componentes interfieren en el anlisis
debido a que la tcnica se basa en la absorbancia a 260 nm que es la longitud de onda
caracterstica de los cromforos de los cidos nucleicos, esto es, de las bases nitrogenadas.
121
Procedimiento Experimental
El protocolo de preparacin de las muestras para el anlisis de cidos Nucleicos
mediante el mtodo de Sambrook Modificado se detalla a continuacin:
En primer lugar debe realizarse el lavado de las clulas mediante centrifligacion a 4000
r.p.m. (2860 g) durante 30 minutos y resuspensin del precipitado en el tampn Tris. Esta
operacin se repite 5 veces para eliminar el xantano adherido a las clulas. A
continuacin se procede al fijado de las clulas, con ello se pretende abrir poros en la
pared de la bacteria para permeabilizarla a las enzimas que se van a emplear. Para ello,
una vez lavadas las clulas se centrifugan a 4000 r.p.m. (2860 g) durante 15 minutos
se
M.
se agita y sonica durante 1 minuto para disgregar los agregados de clulas, que se
g)
cuando se quiera analizar RNA y en una disolucin de RJNAasa 1 mg/mL cuando lo que
se quiere analizar es DNA. Se incuba, en ambos casos a 370C. durante 30 minutos.
Pasado el tiempo de incubacin, las clulas son tratadas para conseguir su rotura. Para
y,
y
alcohol
aaden 2 mL de etanol al 90 % (a 40C) dejndolo resbalar por las paredes para que
queden dos fases. Se deja precipitar de 1 a 4 horas a -700C.
Procedimiento Experimental
Luego se preparan diluciones a partir del cido nucleico resuspendido empleando el
mismo tampn.
Se lee la absorbancia a 260 nm. Tambin es necesario medir la absorbancia a 280 nm
para conocer si el cido nucleico extrado esta impurificado con protenas. Si el cociente
entre la lectura de absorbancia a 260 nm y el de 280 nm es aproximadamente 1,8 el DNA
est puro; en cuanto al RNA este cociente debe ser prximo a 2, para poder considerar
Los resultados experimentales del anlisis de las muestras tomadas del fermentador
se muestran en la Figura 2.14 para el DNA y en la Figura 2.15 para el RNA. Como se
puede observar, los valores obtenidos en cada ensayo son bastante diferentes y, por tanto, el
mtodo no permite obtener resultados repetitivos. La dispersin obtenida en los resultados
proporcionados por el anlisis descrito hace que este mtodo no sea aplicable para conseguir
datos utilizables en el desarrollo de modelos cinticos, ya que en ocasiones el error llega al
70%. No obstante, hay que comentar que desde un punto de vista cualitativo los resultados
son buenos, debido a la buena purificacin del cido nucleico.
0,4
0,2
Q
0.0
0
20
30
40
50
60
t (h)
223
Procedimiento Experimental
.4
0
30
(h)
124
Procedimiento Experimental
2.5.2.- Tcnicas de Fluorescencia
Debido a que no se obtuvieron buenos resultados con las tcnicas basadas en la
espectrofotometra de absorcin para la cuantificacin de componentes intracelulares y su
posterior relacin con los datos obtenidos mediante CMI, fue necesario buscar otra tcnica
que permitiese solventar los inconvenientes observados, bsicamente relacionados con la
rotura y extraccin del componente intracelular.
Por ello, la tcnica que se emple fUe la Espectrofluorimetra (EFM), que se basa, al
igual que la CMI, en la medida de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos
unidos de forma especfica al componente objeto de anlisis. La gran ventaja ofrecida por
esta tcnica es que la preparacin de las muestras es idntica a la seguida para Citometria de
Flujo, es decir no implica rotura celular ni extraccin del componente. Adems permite
obtener curvas patrn para la correlacin entre la intensidad de fluorescencia con la
concentracin del componente.
125
Procedimiento Experimental
MUESTRA
Cenrijugacon :000 r.p.m.
10 mnuut
SOBRENADANTE
PELLET
(Clulas)
LAVADO
110
mm
CELULAS LAVADAS
Cenrrifugacin 5000 r.p.m., 10 muz
Resuspensin Re/le Glutaraldehido 300
FIJADO
4/r
40(
~NAS
TINCIN con Tel (0.1 ng/mL)
Incubar 4 C
40 mm
LAVAR
DICESTION RNA asa
(1 mg/LI, 37 C, 4Omin)
Figura
126
2.16.-
para
anlisis
por
Procedimiento Experimental
Para la tincin con ITCE se centrifuga a 10000 r.p.m. (18000 g) durante 10 minutos. El
precipitado es resuspendido en una disolucin de ITCF de 0,1 mg/mL se agita e incuba a
durante 1 hora, posteriormente se lavan las clulas tres veces en Tampn Tris, para
0C
250
de fondo. Para ello, se aplic una disolucin de 1 mg/mL a una columna de filtracin de
membrana (PO lO). Las primeras fracciones son las correspondientes a la proteina unida
al ITCE. Se realiz una valoracin de la concentracin proteica de esta fraccin, para lo
cual se emple el mtodo de Lowry (Lowry y col., t951). A partir de esta disolucin se
preparan muestras en un intervalo de concentracin entre 0,01 a 0,5 mg/mL. Los
resultados de la relacin intensidad de fluorescencia (IF) con la concentracin de
c;~(g/L)
= 1,931W3 .jJ7F
ED
[2.10]
acuerdo a la ecuacin [2.10]. Los resultados para los dos ensayos realizados son repetitivos
al igual que ocurra con el anlisis mediante el mtodo Lowry.
Aunque los resultados obtenidos para el anlisis de protenas mediante el mtodo
Lowry eran repetitivos, se decidi realizar la correlacin de los datos obtenidos mediante
127
Procedimiento Experimental
CrVIF con los obtenidos mediante espectrofluorimetra. La razn ftmndametnal es que la
preparacin de las clulas por ambas tcnicas de anlisis es idntica.
0,8
0.4
0.
(It
Para llevar a cabo el calibrado de los datos obtenidos por CMF con los obtenidos
por EFM se emplearon 50 muestras, las cuales se obtuvieron a lo largo de un proceso
fermentativo con el fin de obtener datos a lo largo de toda la fase de crecimiento del
microorganismo y as obtener todo el intervalo de concentracin posible de protenas. La
Figura 2.18 muestra la relacin entre el valor de Mean (intensidad media de fluorescencia
por clula) con el contenido por clula (g/clula) de protena obtenido al extrapolar los datos
de IFF en la Ecuacin [2.10]. La curva de calibrado se ha obtenido con muestras con un
nmero de clulas comprendido entre 200 a 2000 cel! gL. La Ecuacin [2.111 muestra la
correlacin obtenida de esta forma:
C(g/L)
128
= (0,25
IF5,9S) ED NC
[2.11]
Procedimiento Experimental
15,
20
30
40
60
60
70
80
IF (nnn)
Se pueden emplear tambin fluorforos especficos para cada tipo de cido nucleico,
por ejemplo naranja de acridina para RNA y DAPJ para DNA (Mafiah y col., 1993), pero,
en principio, se decidi realizar el estudio con IP, por ser uno de los fluorforos ms
habitualmente empleados.
El protocolo de preparacin de las muestras para el anlisis de cidos nucleicos
mediante ambas tcnicas fluorimtricas (CMF y EFM) se muestra tambin de forma
esquemtica en la Figura 2.16, presentada anteriormente, el protocolo de este anlisis se
detalla a continuacin:
129
Procedimiento Experimental
En primer lugar, debe de realizarse el lavado
contador de paniculas Conter Counter con un tubo de 30 ~m,y diluyendo las muestras
en tampn Tris para llevar un nmero de clulas en un intervalo entre 500-2000 cel4tL.
Debido a que cliP se une tanto a DNA como a RNA, debe hacerse un tratamiento previo
con DNAasa o RNAasa, segn el componente a analizar (Petit y col., 1993). Las etapas a
seguir, una vez fijadas las clulas, son las siguientes:
Digestin con enzimas. Se reparte 1 mL de cada muestra en tubos lBppendorf y se
en tina disolucin de RNAasa de 1 mg/mL en Tris 0,1 M-NaCI, (pH 7.4) para el
durante lO minutos.
Para la lectura fluorescencia de las muestras teidas con IP deben emplearse las
siguientes condiciones de anlisis en el Espectrofluorimetro: longitud de onda de
excitacin de 536 nin y una rendija de 19. Para la emisin se emple una longitud de
onda de 623 nm y una rendija de 5. La temperatura empleada durante el anlisis fue de
25~ C en todos los casos.
mg/mL. Tiendo con loduro de Propidio 0,02 mg/mL. ya que se comprob que sta era la
concentracin de saturacin de la disolucin de 0,1 mg/mL de DNA y RNA para el IP.
130
Procedimiento Experimental
Los resultados obtenidos del ajuste por regresin lineal de los datos de concentracin de
las disoluciones patrn con los valores de Intensidad de Fluorescencia (1pE), se muestran
en las ecuaciones [2.12] y [2.13]:
Cj(g
[2.12]
Lp 3,4610> lE
12.13]
ED
Para el anlisis de las muestras en el Citmetro de Flujo las condiciones empleadas son:
Filtro para la excitacin de 488 mn, mientras que para emisin el filtro empleado fue de
600 nm. La fuente de iluminacin fue una lmpara de xenon de 75 W.
Una vez preparadas las muestras procedentes del fermentador, siguiendo el protocolo
que se ha indicado ms arriba, se obtuvieron los resultados tanto de su anlisis mediante
EFM como por CMF.
En el caso del anlisis utilizando CMI, se obtiene un histograma por muestra, con
una serie de datos estadsticos, como son la media de la intensidad de fluorescencia por
clula (Mean) y el coeficiente de variacin (CV), adems de indicar el nmero de clulas
por unidad de volumen. Los histogramas obtenidos en el anlisis de muestras lo han sido de
forma monoparamtrica para cada componente. La abcisa representa la distribucin de la
seal de fluorescencia en canales y la ordenada el nmero relativo de clulas. En la Figura
2.19 se muestra un histograma tipo, de los obtenidos para una muestra analizada mediante
CMF. Se muestra en la citada figura un histograma correspondiente a la fluorescencia verde
(F LI) que es la fluorescencia emitida por las protenas teidas con isotiocianato de
fluorescena. El otro histograma muestra la fluorescencia roja (FL2) que es la fluorescencia
emitida por los cidos nucleicos (DNA y RNA> teidos con loduro de propidio. En ambos
casos la fluorescencia media por clula aporta el valor Mean, necesario para realizar la
cuantificacin del componente correspondiente.
Las Figuras 2.20 y 2.21 muestran la evolucin de DNA y RNA obtenidas mediante
espectrofluorimetria a lo largo de la fermentacin. Los datos son expresados en
concentracin por extrapolacin de la intensidad de fluorescencia de acuerdo a
las
131
Procedimiento Lrperimental
y [2.13], para DNA y RNA, respectivamente. Los resultados obtenidos
ecuaciones [2.12]
para los dos ensayos realizados son repetitivos y evitan los problemas encontrados con los
mtodos basados en la espectrofotometra de absorcion.
FL2
FLI
2170
4
~~1
4.
4,
c.
o.
0
(-y
0~
54;?
156
Figura 2.19.- Histograma tipo de una muestra obtenida mediante CMF. FI] es la
fluorescencia verde (protenas) y FL2 la fluorescencia roja (cidos
nucleicos).
0,4
10
7
0,0
Figuras
132
2.20.-
Evolucin de RNA
Espectrofluorimetra.
durante
la
fermentacin
analizado
por
Procedimiento Experimental
0,4
0.2
rj~
0,0
O
lO
20
30
40
50
60
t (h)
Figura
2.21.-
Evolucin de RNA
Espectrofluorimetria.
durante
la
fermentacin
analizado
por
133
Procedimiento Experimental
tiempo no superior a 5 horas, para evitar posibles errores como consecuencia de la prdida
de fluorescencia.
unidad de volumen muy similar, prcticamente igual, con el fin de que los histogramas
fuesen siempre comparables, por lo que las muestras analizadas tenan todas tina
concentracin celular comprendida entre 200 a 2000 eel/gL. Otro aspecto importante a tener
en cuenta, a la hora de realizar el caJibrado, es el intervalo de concentracin de cada tipo de
cido nucleico pues era absolutamente necesario cubrir todo el intervalo que permitiese
posteriores anlisis, durante todo el ciclo celular de la bacteria. Para ello, las 50 muestras
analizadas fueron tomadas durante las diferentes etapas de la fase de crecimiento de
Xanthomonas campestris y, de esta forma, se obtuvo todo el intervalo de concentracin
posible. En la Figura 2.22 aparece reflejada la relacin entre las medidas conseguidas por
CMF y EFM para cidos nucleicos. Como puede verse en dicha figura, las pendientes
obtenidas al representar concentracin por clula vs. mean son iguales para ambos tipos
de cidos nucleicos, por tanto, el ajuste por regresin lineal se realiz uniendo lo obtenido
para el DNA y lo obtenido para el RNA. El resultado de este ajuste aparece reflejado en la
ecuacin [2.13]., en la que es necesario conocer el nmero de clulas (NC); este dato, como
ya se ha comentado, es obtenido tambin mediante Citometra de Flujo. El coeficiente de
regresin obtenido en este ajuste es r0,996.
C~\V~\~(g XL)
= 0,11 JEwr
ED NC
50
60
[2.14]
y.,
20
30
40
70
IF(n~n)
Figura 2.22.- Relacin entre IF obtenida CMF y concentracin obtenida por EFM
234
Procedimiento Experimental
2.6.- MTODOS MATEMTICOS
Debido a que en la presente Memoria ha sido necesario la aplicacin de diferentes
tcnicas de clculo, se va a dedicar este apartado a realizar una breve descripcin de las
mismas.
Las tcnicas matemticas empleadas se pueden dividir en dos grandes grupos:
tcnicas de estimacin de parmetros a partir de datos experimentales (regresin) y tcnicas
de simulacin de la evolucin del sistema con las variables estudiadas. Todos los programas
de clculo empleados se han desarrollado para llevar a cabo este trabajo y han sido
realizados en FORTRAN 77. A continuacin se expone brevemente el fundamento y la
forma de aplicacin de estas tcnicas.
t=1 ~yexp
Yeor
-4
mnimo
[2.15]
En los casos en los que se ha empleado este tipo de regresin, para describir el grado
de ajuste se ha tenido en cuenta el coeficiente de regresin, r.
En el caso de la aplicacin de estas tcnicas de regresin a datos experimentales,
en todos los casos se han utilizado mtodos no lineales basados en el algoritmo de
Marquardt (1963). Dependiendo del modelo a aplicar, se ha llevado a cabo el ajuste en
135
Procedimiento Experimental
simple-respuesta o en mltiple-respuestaz es decir, se ha ajustado nicamente la evolucin
de un componente, generalmente debido a que en la expresin que representa su velocidad
de produccin no aparece ningn otro componente (simple-respuesta); o, por el contrario.
si las velocidades de produccin de varios o todos los componentes clave del sistema estan
tnterrelacionadas es necesario llevar a cabo la regresin simultnea de todos los
componentes (mltiple-respuesta). En este ltimo caso, se hace necesario igualar los
residuos de los diferentes componentes, en caso de que los valores de unos componentes
respecto a otros presenten diferencias significativas en rdenes de magnitud. es decir, se
hace necesario pesar los residuos para que todos los valores presenten la misma
significacin en el algoritmo de regresin, que de nuevo optimiza la suma de los cuadrados
de los residuos (ecuacin [2.15)).
En el caso de que el ajuste realizado con los modelos cinticos a los diferentes
experimentos llevados a cabo proporcione una evoLucin lgica de los parmetros que
136
Procedimiento Experimental
contienen,
950o
Las simulaciones o predicciones que se llevan a cabo con los diferentes modelos a
los que se han ajustado los datos experimentales sirven para comprobar qu influencias son
capaces de predecir en cada caso. Para ello, nicamente es necesario realizar la integracin
conjunta de todas las ecuaciones diferenciales que forman las velocidades de produccin del
modelo cintico del que se trate. Los programas desarrollados para realizar las simulaciones
necesitan nicamente el algoritmo de Runge-Kutta de cuarto orden para la integracin del
modelo y proporcionar los valores de las concentraciones de los diferentes componentes
clave del sistema, una vez introducidos los valores de los parmetros a emplear en la
simulacin, as como los valores de las variables a emplear (temperatura, agitacin, caudal
de aire, etc.) y los valores de las concentraciones iniciales de los nutrientes y de la biomasa.
En la Figura 2.25 se recoge el diagrama de flujo general de los programas empleados para
realizar la simulacin con los modelos cinticos.
137
Procedimiento Experimental
NO
INVER
Clculo de inversa
RUNOE N
Ecuaciones
diferenciales
Figura 2.23.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en mltiple respuesta
empleado basado en el algoritmo de Marquardt (1963).
138
Procedimiento Experimental
Figura 2.24.- Diagrama de flujo del programa de regresin no lineal en simple respuesta
empleando el mtodo en velocidades de reaccin con el algoritmo de
Marquardt (1963).
139
Procedimiento Experimental
INICIO
DIMENSIN
RLTNOKN
Algoritmo
Runge-Kutta
RESULTADOS
RUNGFN
Ecuaciones
diferenciales
ARCHIVO
RESULTADOS
140
Resultados Experimentales
pH inicial
fermentacin.
141
Resultados Experimentales
340
C.
Resultados Experimentales
nmero de componentes a seguir y/o analizar aumente con el grado de complejidad del
modelo. En los modelos cinticos ms complejos aplicados, los denominados Estructurados
o de Clula, es necesario realizar el anlisis de componentes intracelulares.
Por ello, desde el principio se realiz el seguimiento y anlisis del mayor nmero de
componentes con el fin de aplicar los diferentes tipos de modelos propuestos para los
mismos experimentos. Adems, todos los experimentos fueron repetidos dos veces con el
fin de tener el mayor nmero de datos a lo largo del tiempo de fermentacin. Debido a que
el tiempo a que se tomaron algunas de las muestras en las dos fermentaciones realizadas en
las mismas condiciones coinciden, los valores obtenidos se presentan como la media entre
ambos en la tabla correspondiente. Los resultados de los distintos experimentos se
representan en las Tablas 3.2 a 3.8, una para cada experimento.
Medio A
Concentracin NH4~
(p.p.m.)
257
257
28
257
31
257
34
65
28
130
28
475
28
Experimento
25
43
Resultados E?vperimentales
Biomasa
(It)
(g/L)
O->
(0/
sat)
Agitacin
(rpm)
0,00
0.010
95,5
210
1,00
0,011
86.2
210
2.00
0,012
79,8
210
4,00
0,0 17
69,0
210
5,75
0,028
59,0
210
7,75
0,048
55,0
210
9,00
0,065
35,0
210
10,00
0,07 1
25.0
210
12.00
0,106
15,0
210
16,50
0,350
30,0
350
1 7,00
0,4 lO
15,0
350
20,00
0.62
8,0
350
24,00
0,780
50
350
24.50
0.862
25,0
400
25,00
0,901
18,0
400
25.75
0.930
14,0
400
28,00
0,93 8
7.0
400
29,00
0,989
20,0
550
29,50
1,222
16,0
550
32,75
1,400
18,0
550
34,75
1,530
13,0
650
35,00
1.560
8,0
650
3 8.00
1,590
12,0
650
50,00
1,618
11,0
750
50,50
1,620
15,0
750
52,25
1,680
12,0
750
55,00
1.680
16,0
860
56,75
1 ,680
13.0
860
44
NH
4
(g/L)
Sacarosa
Xanrano
DNA
(gIL)
(g/L)
(gIL)
RNA
(g/L)
Proteinas
(g/L)
0,3 10
40,0
0.33
0,0025
0,00 18
0,005
0,300
39,9
0,33
0,0027
0,0019
0.005
0.290
39,5
0,35
0,003
0,002 1
0.006
0,270
39,0
0,39
0,003 5
0,0031
0,009
0,250
38,0
0,40
0,0045
0,0055
0,011
0,2 10
37,8
0,44
0.0082
0,0078
0,020
0,190
37,2
0,48
0,011
0.0095
0.021
0,180
36,7
0,49
0,019
0,012
0,030
0,160
36,9
0,50
0,022
0,019
0,032
0,080
36,2
0,89
0,036
0,063
0.089
0,070
35,6
0,96
0,070
0,073
0,120
0,060
35,2
1,00
0,150
0,108
0,198
0,077
35,0
1,20
0,190
0,14
0,260
0,073
34,8
1,85
0,2 10
0.155
0,350
0,069
34,0
2,12
0,250
0,162
0,450
0,067
33,9
2,20
0,270
0,167
0.460
0,055
32,0
2.32
0,290
0,168
0,469
0,050
31,0
3,57
0,320
0,178
0,500
0,045
30.0
4,44
0,340
0,2 19
0,600
0,03 5
28,0
5,00
0,349
0,259
0,720
0,029
25,5
5,51
0.3 70
0,270
0,750
0,025
24,3
6,05
0,400
0,280
0,780
0,022
23,9
7,20
0,420
0,283
0,800
0,021
16,9
11,38
0,430
0,288
0,820
0,020
16,5
12,38
0,430
0,290
0,830
0,020
16,0
13,20
0,430
0,304
0,830
0.020
15,9
13,99
0.430
0,306
0,830
0,020
15,7
14,26
0,430
0,306
0,830
Resultados Experimentales
Biomasa
(%)
Agitacin
(rpm)
N1-bt
(gIL)
02
[ (g/L)
Sacarosa
~
Xantano DNA
J~fi~ ~
RNA
(gIL)
Protenas
(gIL)
0,00
0,070
100,0
210
0,309
36,5
2,19
0,017
0,0 12
0,035
2,00
0,084
73,0
210
0,300
36,4
2,19
0,03 1
0,020
0,039
4,00
0,099
59,0
210
0,298
36,0
2,19
0,037
0,021
0,044
7,00
0,130
34,0
210
0,287
36,0
2,19
0,042
0,030
0,050
9,00
0,156
24,0
210
0,280
35,9
2,23
0,049
0,035
0,05 8
12,00
0,209
16,5
210
0,275
35,7
2,29
0,065
0,042
0,069
13,00
0,229
10,5
210
0,269
35,0
2,33
0,085
0,048
0,089
14,50
0,2 88
8,0
210
0,266
2,39
0,120
0,054
0,092
16,00
0,300
5,0
210
0,254
34,7
34,0
2,59
0,137
0,081
0,115
16.50
0,350
35,0
310
0,247
33,8
2,62
0,165
0,088
0,129
19,50
0,480
25,0
310
0,220
33,5
2,99
0,199
0,110
0,135
23,50
0,620
15,0
310
0,190
32,9
3,90
0,235
0,149
0,210
24,00
0,663
5,0
310
0,166
32,0
5,82
0,240
0,160
0,250
24,50
0,790
28,0
380
0,140
31,8
6,21
0,250
0,170
0,3
28,00
0,910
19,0
380
0,100
28,7
7,30
0,290 0,199
0,480
32,00
1,220
15,4
380
0,082
26,0
7,59
0,330
0,215
0,600
33,50
1,252
10,2
380
0,073
25,0
7,78
0,33 5
0,229
0,7 10
34,00
1,350
24,5
550
0,05 5
24,0
8,10
0,3 50
0,230
0,720
38,00
1,400
18,5
550
0,045
23,0
8,40
0,3 70
0,255
0,760
38,50
1,450
10,0
550
0,025
21,0
8,90
0,3
75
0,260
0,765
39,50
1,500
5,0
550
0,0 13
20,2
10,48
0,3 80
0,265
0,772
41,50
1,548
17,0
650
0,00 1
18,0
11,20
0,3 90
0,269
0,775
42,00
1,560
28,0
650
0,000
17,2
12,00
0,395
0,270
0,780
43,75
1,580
21,8
650
0,000
12,0
13,28
0,395
0,270
0,780
48,00
1,580
20,3
750
0,000
10,6
14,90
0,395
0,270
0,780
48,50
1,580
30,0
850
0,000
10,6
15,13
0,3 95
0,270
0,780
52,00
1,580
28,0
890
0,000
10,6
15,22
0,3 95
0,270
0.780
59,00
1,580
21,0
890
0,000
10,6
15,20
0,395
0,270
0,780
20
14S
Resultados Experimentales
Tabla 3.4.- Resultados obtenidos en el Experimento n0 3. Condiciones experimentales:
310C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (210 r.p.m. inicial).
Tiempo
(h)
Biomasa
ftLL. 1
0,00
0.130
90.0
210
0,220
40,0
0,50
0,150
59,0
210
0,2 19
1,15
0,158
46.0
210
3,00
0,169
34,1
3.50
0,173
6,00
~2
Agitacin
(rpm) 1
NH
1 DNA
(gIL)
RNA
(g/L)
Proteinas
(gIL)
0,39
0.0 12
0,003
0,010
40,0
0.39
0,0 12
0,004
0.0 12
0,212
40,0
0,39
0,0 12
0,006
0,0 14
210
0.200
39,9
0.46
0,0 13
0,007
0,025
23,0
210
0,197
39,9
0,47
0,015
0,010
0,027
0,199
14,5
210
0,190
39,9
0,53
0,018
0,0 16
0,050
8.00
0,230
35.0
350
0.189
3 9.89
0,60
0,021
0.0 10
0,078
8,50
0,25 1
22.0
350
0,180
39,80
0,67
0,02 8
0,021
0,086
9,00
0,304
12,8
350
0.172
39.50
0,87
0,030
0,024
0,095
10,00
0,385
10.0
350
0,170
38,20
0,87
0,032
0,030
0.116
12,00
0,420
6,0
350
0,084
38,00
0,91
0,036
0,03 3
0.160
14.50
0,550
32,0
450
0,064
36,50
0,99
0.048
0,040
0,230
15,00
0,590
20,0
450
0,057
36,00
1,10
0,067
0,05 5
0.250
16.00
0,600
12,0
450
0,056
34,00
2,30
0,072
0,065
0,280
18,50
0,680
8,0
450
0,050
33,00
3,20
0,082
0,078
0,3 20
20,00
0.700
4,0
450
0,048
32,00
3,50
0,100
0,099
0,400
23,50
0,890
22,0
500
0.030
30,00
4,30
0,126
0,116
0.470
24,00
0.900
18,8
500
0,027
29,70
4,80
0,129
0,122
0.500
24,50
0,950
17,0
500
0,025
29,20
5,20
0,130
0,126
0.530
25,00
0,985
10,0
500
0.0 15
28,30
5,90
0,132
0,129
0,564
26.50
0.990
20,0
580
0,010
27,00
6,20
0,143
0.13 1
0,580
27,00
1,026
1 8,0
580
0,000
26,02
7,00
0.145
0,13 3
0,590
28,00
1.026
15,0
580
0,000
25,60
7,21
0,152
0,13 8
0.590
30.00
1,07 3
20,4
700
0,000
25,00
8,07
0,158
0,142
0,5 90
31,75
1,058
16,3
700
0,000
24,60
8,67
0,160
0,143
0,590
35,00
1,05 8
15,0
700
0,000
24,20
8,60
0,160
0,143
0,590
146
(% sat)
4
Sacarosa Xantano
...=L ~
(gIL)
Resultados Experimentales
Tabla 3.5.- Resultados obtenidos en el Experimento n0 4. Condiciones experimentales:
340C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (210 r.p.m. inicial).
Tiempo
(It)
Biomasa
(gIL)
02
(% sat)
DNA 7
~
RNA
0,00
0,045
97,70
210
0,202
40,0
3,00
0,087
81,00
210
0,175
6,00
0,104
70,00
210
9,00
0,122
60,00
12,00
0,135
14,00
Protenas
0,94
0,011
0,008
0,020
39.8
0,99
0,021
0,015
0,043
0,161
38,9
1,00
0,026
0.019
0,520
210
0,156
38,3
1,13
0,030
0,022
0,061
67,50
250
0,148
37,9
1,16
0,033
0,024
0,067
0,191
50,00
250
0,147
36,8
1,20
0,047
0,034
0,095
14,50
0,200
45,00
250
0,145
35,7
1,30
0,100
0,036
0,102
18,00
0,280
30,00
250
0,143
34,1
1,50
0,070
0,050
0,140
20,00
0,320
29,00
250
0,142
34,2
1,90
0,080
0,057
0,160
24,00
0,407
41,20
280
0,140
33,0
2,05
0,101
0,073
0,203
24,50
0,496
32,30
280
0,139
32,5
2,20
0,124
0,089
0,248
30,00
0,698
28,10
280
0,133
31,4
4,47
0,174
0,125
0,349
33,00
0,739
20,50
280
0,127
30,5
4,98
0,184
0,133
0,369
36,00
0,820
45,00
350
0,125
28,9
5,75
0,205
0,147
0,410
36,50
0,890
40,00
350
0,122
28,0
6,50
0,220
0,160
0,440
40,00
0,950
38,00
350
0,120
27,9
7,50
0,237
0,171
0,475
42,00
1,090
43,00
350
0,119
27,8
8,00
0,272
0,196
0,540
45,00
1,089
42,00
350
0,110
27,5
8,12
0,272
0,196
0,540
48,00
1,089
45,00
350
0,110
27,2
8,12
0,272
0,196
0,540
147
Resultados Experimentales
7~iacinNH
Tiempo
(h)
Biomasa
( IL)
O->
(%)
0,00
0.00853
99.80
210
0,0650
40,00
1,50
0,0093 8
93.90
210
0,0620
3,00
0,00980
92.82
210
4,50
0,0110
91,20
6,00
0,0 140
8,50
DNA
(g/L)
RNA
( L)
Protenas
( /L)
0,402
0,00 1
0.0008
0,003
39,86
0,402
0,002
0,0009
0,004
0,0600
39,68
0,402
0,003
0,00 1
0,004
210
0,05 50
39,42
0,5 12
0,005
0,00 1
0.006
87,30
210
0,0500
39,00
0.6 18
0,006
0,002
0,007
0,0330
82,50
210
0,0400
38,63
0,72 1
0,0 10
0.003
0,0 17
12,00
0,05 20
72.00
210
0,0330
37,50
0,980
0,0 12
0,004
0,029
16,00
0,1250
56.00
210
0.0220
36.25
1,230
0,030
0,004
0,073
20,00
0,290
35.00
210
0.0 180
35.00
2,700
0,041
0,010
0,142
23,50
0,640
22,10
210
0,0 120
34,18
3,520
0,054
0,0 18
0,258
24,50
0,660
19,10
210
0,0 lO
33,87
4,680
0,056
0,026
0,330
25.25
0,680
45,00
250
0,008
3 3,654
6,120
0,05 8
0.030
0,3 50
26,00
0,690
32,00
250
0,007
33,39
6,850
0,060
0,03 4
0,372
27.50
0,700
25,00
250
0,005
32,50
7,220
0.065
0,03 8
0,400
31,00
0,700
19,00
250
0,004
28,00
8,112
0,065
0,038
0,420
32,50
0,700
54,00
400
0,0009
27,55
9,850
0,065
0,03 8
0.420
33,00
0,700
43,00
400
0,0008
26,25
10,12
0,065
0,03 8
0,420
35,00
0,700
42.00
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0,03 8
0,420
40,00
0.700
40,00
400
0,0008
26,00
10,12
0.065
0,03 8
0.420
40.50
0,700
3 8.00
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0,03 8
0,420
43.00
0,700
38,50
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0.038
0,420
47,50
0.700
39,00
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0,03 8
0,420
50.50
0,700
40,00
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0.03 8
0,420
55,00
0,700
41,00
400
0,0008
26,00
10,12
0,065
0,03 8
0,420
148
4~
fL~~L1J~2
Sacarosa Xantano
(g/L) ~
Resultados Experimentales
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
O,
(% sat)
Agitacin
(rpm)
NH
0,00
0,011
100,0
210
0,130
39,7
0,521
0,001
0,00 1
0,006
2,50
0,0 15
98,0
210
0,129
39,5
0,52 1
0,002
0,00 1
0,008
3,50
0,017
93,0
210
0,129
39,3
0,52 1
0,002
0,002
0.010
5,50
7,50
0,026
86,0
210
0,128
0,54 1
0,004
0,003
0,0 14
0,027
78,0
210
0,128
39,0
38,7
0,56 1
0,005
0,003
0,015
8.50
0,034
70,0
210
0,127
38,5
0,58 1
0,006
0,004
0,0 19
9,25
0,055
67,0
210
0,127
38,0
0,623
0,008
0,006
0,027
10,50
0,07 5
55,0
210
0,126
37,7
0,792
0,012
0.009
0,03 2
16.00
0,098
35,0
210
0,120
36,7
1,480
0,0 15
0,020
0,056
20.00
0,300
26,0
210
0,110
35,9
1,980
0,045
0,036
0,174
24,25
0,5 80
18,0
210
0,063
2,3 50
0,079
0,069
0,336
25.00
0,654
45,0
310
0,044
34,9
34,6
0,082
0,07 8
0,379
26,50
0,69 1
33,0
310
0,020
33,3
3,297
0,103
0,083
0,400
28,50
0,703
32,0
310
0,012
32,5
4,016
0,105
0,084
0,405
30,50
0,706
29,0
310
0,009
31,0
5,105
0,105
0,084
0,409
31,50
0,708
25,0
310
0,007
30,2
5,920
0,106
0,085
0,4 10
32,00
0,709
23,0
310
0,004
29,0
7,080
0,106
0,085
0,4 13
33,50
0,710
20,0
310
0,003
27,5
8,939
0,106
0,085
0,413
38,00
0,712
19,0
310
0,002
26,0
10,300
0,106
0,085
0.415
45,00
0,712
30,0
450
0,002
24,0
11,200
0,106
0,085
0,4 15
49,00
0,7 12
21,0
450
0,002
23,5
11,500
0,106
0,085
0,4 15
50,00
0,712
19,0
450
0,002
21,7
12,000
0,106
0,085
0,4 15
51,00
0,712
18,0
450
0,002
21,0
12,900
0,106
0,085
0,4 15
4~
(g/L)
Sacarosa Xantano
DNA
RNA
(g/L)
j(~
..sIL... ~
2,297
Proteinas
(g/L)
149
J?esidtalos E.vperimenudes
Experimento n0 7. Condiciones experimentales
280 C, 475 p.p.m. de amonio inicial y agitacin variable (210 r.p.m. inicial).
Tiempo
(It)
Biomasa
O,
(g/L)
(%)
Agtacin
(rpm)
0,00
0.005
100,0
210
1,00
0,006
97,3
210
4,00
0,009
86.5
210
6,00
0,0 12
80,0
210
7.50
0,022
77.3
210
8,50
0,03 1
65,0
210
9,50
0,047
55.0
240
12,00
0,068
40,0
210
16,00
0,08 5
26.0
210
22,50
0,180
10,0
210
23,00
0,214
60,0
310
23,50
0,320
49,6
310
26.00
0,470
35,0
310
29,00
0,608
20,0
310
30,50
0,750
10,0
310
32.50
0,820
8,0
310
34,00
0.850
50,0
350
34,50
0,890
42.0
iSO
35,00
0,920
30.0
350
42,00
0,990
22,0
350
45,00
0,990
12,0
350
47,50
0,990
8,0
350
50.50
0.990
35,0
400
55,00
0.990
20,0
400
150
NH
4
(g/L)
Sacarosa Xantano
-j
DNA
RNA
Proteinas
(gIL)
(gIL)
(g/L)
(g/L)
0.475
40,00
0,86
0,001
0,001
0,003
0,4 75
38,90
0,86
0,002
0,001
0,004
0,475
39,80
0,866
0,003
0,002
0,006
0,468
39,70
0,866
0,004
0,003
0.0 II
0,453
39,50
0,86
0.006
0,003
0,0 15
0,445
38,40
0,86
0,009
0,008
0.023
0,440
37,90
0,93
0,013
0,011
0.034
0,429
37,00
1,02
0,040
0,032
0,065
0400
36.75
1,09
0,063
0,05 3
0,160
0,3 65
36,00
1,13
0,092
0.079
0,230
0,3 55
35,75
1,32
0,093
0,08 8
0,245
0,3 20
35,00
1,42
0,098
0,09 1
0,25 3
0,300
34,50
1,48
0,100
0,092
0,255
0.285
34,00
1,51
0.103
0.13 1
0,350
0,231
33,80
1,63
0,125
0,142
0,420
0,166
33,00
1,72
0,146
0,152
0,465
0,140
29,50
2,58
0,170
0,158
0,467
0,135
28,50
3,75
0,173
0.159
0.467
0,130
27,70
4,00
0,175
0,160
0.467
0,130
26,00
6,90
0.176
0,161
0.467
0,130
25,00
9,50
0.176
0,16 1
0.46 7
0,130
23,20
11,39
0,176
0,161
0,467
0,130
23,10
11,39
0.176
0,161
0,467
0,130
23,10
11.39
0,176
0,16!
0,467
Resultados Experimentales
Como ya se coment en el apanado anterior, Procedimiento Experimental, el
xantano se sigui por medida de la viscosidad del caldo, realizando el calibrado al final de
cada experimento, pues el xantano producido en las diferentes condiciones de operacin
empleadas no presenta siempre la misma relacin entre concentracin y viscosidad. Para
cada experimento, las ecuaciones finalmente utilizadas fueron las siguientes:
[3.1]
Para el Experimento n0 2:
0 70
(cp)
[3.2]
[3.3]
2,O5.,u 03~(cp)
0
[3.4]
Cp(g/LO,34p<
Para el Experimento n0 3:
Para el Experimento n0 4:
C~(g/L)
Para el Experimento n0 5:
C~(g/L)
= 0,77
y 03tcp)
0
[3.5]
C~(g/L)
= 0,77
,u 03(cp)
0
[3.6]
[3.7]
Para el Experimento n0 6:
Para el Experimento n0 7:
r.p.m.
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Al primer grupo citado pertenecen los modelos propuestos por Moraine y Rogovin
(1966 y 1971), y por Quinlan y colaboradores (Quinlan y col., 1986; Schweickart y Quintan,
155
Moraine y Rogovin (1966 y 1971) emplean ecuaciones tipo Monod (Ecuaciones (4.1]
y (4.3]). para describir la evolucin de xantano y biomasa, considerando el nitrgeno como
limitante del crecimiento, ecuacin (4.1] y la fuente de carbono limitante para la produccin
de xantano, ecuacin [4.3]. La evolucin de los dos sustratos con el tiempo vienen expresados
utilizando dos coeficientes estequiomtricos (ecuaciones [4.2) y [4.4)) denotados por Yp~5 e
YXN. Este modelo puede ser expresado por el siguiente sistema de ecuaciones:
dC~
dt
dE5
C~ C
K~+ (j
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dC~
dC1,
Y
_
[4.1]
[4.2]
di
<E5 .Cx
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K5-vQ
dC~
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[43)
[4.4]
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dC~
[4.5]
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dCYk
di
[4.7]
k
Y.
dr
dC~
dr
Cx
[4.8]
_ .cn.dQ
[4.9]
dt
a.c<~.dCx
di
[4.10]
aaden la ecuacin
CBdCV
[4.11)
di
Ninguno de estos autores emplea tcnicas de regresin para obtener el valor de los
parmetros que aparecen en las ecuaciones anteriores, por el contrario emplean tcnicas de
estimacin por simplificacin de ecuaciones en puntos singulares, obteniendo unos valores
de los parmetros que proporcionan un ajuste experimental de forma aceptable, aunque solo
para un experimento en cada caso.
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Los resultados experimentales, obtenidos en un trabajo previo (Santos, 1993, GarcaOchoa y col., 1997), muestran claramente que cuando la fuente de nitrgeno es el sustrato
limitante, el parmetro Cxm puede ser reemplazado por:
[4.12]
Cx +
dC\.
Ir
-~ C1C<j
YI%v>)
C~,
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1
+
[4.13]
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[4.14]
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kLaU
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[4.16)
Esta ecuacin [4.16] incluye un trmino para la transferencia de oxgeno desde el gas
y otro para el consumo de oxgeno tanto para mantenimiento como para crecimiento- tal y
-
como fue propuesto por Pinches y Pallent (1986). Para ello, es necesario emplear una
expresin para el coeficiente de transferencia de oxgeno, para lo cual se ha utilizado la
expresin dada en la ecuacin [4.17] (Gmez, 1995):
4V%43 N175
k1a~=3 ,08IcY
[4.17]
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(Z~ -k<C>~..m
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[4.18]
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<.C~ .(c~
Cx)
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Una vez calculados estos parmetros (kx e YxN), son sustituidos en la ecuacin
[4.13], emplendose,junto con las ecuaciones [4.14] y [4.16], para el clculo de los
parmetros
ni5,
Yxs
161
dE0
___ ___
di =kLa. (E0,
Coijy
dCx $..tn<jj>
E~
[4.19]
2,3~1O~ E0
(so)
[4.20]
En las Tablas 4.2 a la 4.8 se recogen los valores calculados de los parmetros fisicos
y estadsticos obtenidos de la aplicacin del Modelo Cintico No Estructurado a los datos de
los experimentos realizados (experimentos del 1 al 7). As mismo, las Figuras 4.2 a 4.8
muestran la reproduccin de los datos experimentales con el MCNE aplicado. En todas las
figuras, la lnea continua corresponde a los valores proporcionados por el modelo MCNE,
y los simbolos a los datos experimentales obtenidos del anlisis de los diferentes
componentes durante la fermentacin.
162
Y0j, y los
valores ms altos, a los obtenidos del ajuste de la concentracin de azcar ( ms, Yxs y kv).
En la Figura 4.2-a, se muestra el ajuste de la evolucin de la biomasa a la ecuacin logstica,
donde se observa la buena reproduccin de los datos experimentales a esta funcin; sin
embargo, en la misma grfica se muestran los resultados obtenidos en el ajuste de la
evolucin del nitrgeno, donde puede observarse que este modelo es incapaz de predecir un
buena evolucin de este componente. En cuanto a la evolucin del resto de componentes,
tanto la evolucin de la sacarosa y como la del xantano son buenos, mientras que para el
oxgeno no se consigue un buen ajuste (Figura 4.2-b).
Los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE del experimento n 2 realizado a 280
C y con 257 p.p.m de amonio inicial, son recogidos en la Tabla 4.3, donde se puede
observar que los intervalos de confianza de los parmetros obtenidos del ajuste al MCNE no
incluyen el cero y que, al igual que en el experimento anterior, se observan unos valores
muy bajos de la t de Student para los parmetros correspondientes a la evolucin de
oxgeno disuelto, quedando reflejado en la mala reproduccin de este componente, tal como
muestra la Figura 4.3-b; mientras que para las concentraciones de sacarosa y xantano los
resultados del ajuste son buenos. En la Figura 4.3-a se muestra la excelente reproduccin de
la concentracin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que la reproduccin de la
evolucin del amonio de nuevo es defectuosa, aunque es mejor que la obtenida en el
experimento anterior. Se reproduce bien el consumo de la fuente nitrogenada durante la fase
exponencial, no siendo bueno el ajuste en la fase estacionaria del crecimiento.
0~ e
163
340
C y con 257
p.p.m de amonio inicial se recogen en la Tabla 4.5-a. Se puede observar que al realizar el
ajuste de este experimento al MCNE el valor obtenido del parmetro m5 es negativo, lo que
indicara que a esta temperatura este parmetro no tiene influencia y, fisiolgicamente, que
el microorganismo no consume azcar para su mantenimiento. Para poder realizar el ajuste
posterior de la evolucin del oxgeno en simple respuesta, es necesario emplear los
parmetros ms, Yxs y k~
Y
0<
prcticamente en el lmite del valor terico, tabulado para un 95% de confianza. La Figura
4.6-a muestra la buena reproduccin de la biomasa con la ecuacin logstica, mientras que
la evolucin de nitrgeno, muestra un mal resultado en cuanto a la reproduccin de los
resultados experimentales. En la Figura 4.6-b aparece el ajuste de la evolucin de xantano y
de sacarosa, en los que el resultado es aceptable, mientras que para la concentracin de
oxgeno la reproduccin obtenida no es suficientemente buena.
164
Por ltimo, la Tabla 4.8 muestra los valores fisicos y estadsticos obtenidos por
0 6 realizado a 28 0C y con 475 p.p.m. de
ajuste a este modelo para el experimento n
amonio. Tanto los parmetros representativos de la biomasa, como los correspondientes a
la sacarosa y xantano cumplen tas restricciones estadsticas impuestas. El parmetro mox
proporciona un valor que incluye el cero, obtenindose un valor de la t de Student que est
por debajo del tabulado. En cuanto al parmetro Y
de Student
muy bajo, prcticamente en el lmite del valor tabulado al 95% de confianza. La evolucin
de oxigeno disuelto (Figura 4.8-b) obtenida de este ajuste, al igual que en todos los
experimentos anteriores, no es buena, sin embargo, tambin como en casos anteriores, la
reproduccin obtenida para evolucin de sacarosa y xantano es aceptable. La reproduccin
de la evolucin de la concentracin de biomasa (Figura 4.8-a) de este experimento, al igual
que en todos los anteriores, es muy buena. En cambio, para la evolucin del amonio, la
reproduccin obtenida no se corresponde bien con los valores experimentales, tal como se
ha ido viendo en el ajuste del resto de los experimentos.
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Figura 4.2- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 1 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 250 C, 257 p.p.m. de
amonio y programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.3- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 2 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 280 C, medio A (257 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.4- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 3 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 310 C, medio A (257
p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
71
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Figura 4.5- Ajuste de los datos experimentales del experimento u
temperatura
de
340 C, medio A (257
con Xanihomonas campesiris a la
p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
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Figura 4.6- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 5 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a la temperatura de 28 C, medio A (65 p.p.m.
de amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxgeno disuelto
176
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40
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60
Qi)
Figura 4.7- Ajuste de los datos experimentales del experimento n0 6 al MCNE, realizado
con Xanthomonas campestris a a temperatura de 280 U, medio A (136
p.p.ni. de amonio), programacton de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
(b) Evolucin de xantano, azcar y oxigeno disuelto
178
7.a.a
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30
(h)
Figura 4.8- Ajuste de los datos experimentales del experimento 7 al MCNE, realizado con
Xanthomonas campestris a la temperatura de 28~ C, medio A (475 pp.ni. de
amonio), programacin de agitacin (210 r.p.m. inicial).
(a) Evolucin de biomasa y amonio
180
En las Figuras 4.9 y 4.10 se muestran las evoluciones de los parmetros obtenidos del
ajuste al MCNE para los experimentos realizados a diferentes temperaturas.
-t
0.6
(a)
(b)
6
04
3
25
30
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35
25
30
35
Terq,emtura (C)
Figura 4.9.- Evolucin de los parmetros con la temperatura obtenidos por ajuste con la
ecuacin logstica.
181
YJ~-
tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable; m0 muestra una evolucin
ascendente, mientras que Y0~ presenta una evolucin descendente.
0
0.5
(b)
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0.3
~ 02
02
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0.
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35
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35
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50
30
20
lo
25
30
35
Tcflveratura (U)
Figura 4.10.- Evolucin de los parmetros del MCNE con la temperatura. La lnea discontinua
indica la tendencia terica de los parmetros y la continua el ajuste del modelo
en funcin de la temperatura (MCNE(T)).
(a) m~ (b) Yxs (c) k~ (d)m02 (e) Y01.
182
[4.21]
e Y
0.>..
parmetros tienen una tendencia ms o menos lineal con dicha variable. rn0, presenta una
-
2,
max
%, T
y C3:
m5(T)={ Cj(T-T).H-exp<>C,.<T-T
=
( C1
(T Tmrn) [1 exp(C% (T
-
Y (T)=C3
xs
[4.22]
[4.23]
[4.24]
La Tabla 4.9 muestra los parmetros obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a distintas temperaturas a este modelo en funcin de dicha temperatura. Como
puede observarse, los parmetros correspondientes al parmetro
m5 dan un resultado
estadstico aceptable al igual que sucede con el parmetro Yxs donde se observa el valor
elevado de la t de Student. En cuanto a los parmetros C y C,, correspondientes al ajuste del
83
ni
~,
(T)
/T T
[4.25]
a+fiT
[4.26]
13
{O,227 . ([16,6)
3554)42
m0 (T)
Yxs (T)=O,1445
3 + (2,6
=
0,X
39,23)42
[4.27]
14.281
[4.29]
[4.30]
(T)=5,6O,89T
[4.31]
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Figura 4.14.
A-A
A-A
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500
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300
400
nn,o (mm>
500
600
de la
189
En La
inicial de amonio, de los parmetros del MCNE relacionados con las velocidades de
produccin del azcar y dcl xantano: m5, Yxs y k?. La evolucin de los parmetros relacionados
con la evolucin del oxigeno, mo~eYox,
aparecen en la
Figura 4.ld
y 4.16e,
respecvarnente.
Ninguno de los parmetros del MCNE muestra una tendencia clara ni lgica en
funcin de la concentracin de amonio. Por ello, en este caso no es posible siquiera plantear
ecuaciones matemticas para proponer un modelo cintico en funcin de la variable
estudiada, tal como se intent en el caso de la temperatura. Adems, con este modelo no fue
posible obtener una buena reproduccin de la evolucin del amonio, tal como fue mostrado
en las Figuras 4.2a a 4.Ba. Por tanto, es lgico pensar que el modelo es incapaz de mostrar
una evolucin de parmetros en funcin de esta variable.
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Amoujo (m~<)
4.3.2.-
192
.-
Simulacin
Valores
Influencia de la concentracin de
biomasa inicial
C50
10g/L
Cso = 20 g/L
C50 = 40 g/L
Cso SOgfL
Influencia de la concentracin
azcar inicial
Influencia de la concentracin de
oxgeno disuelto
Agitacin constante
Perfil de agitacin
193
194
0,3
0,2
cf
(3<
o,
0.0
0
20
40
60
80
t(h)
Figura 4.17.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin de biomasa.
40
t(h)
Figura 4.18.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico no estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin de xantano y sacarosa.
195
25
2,5
20
2,0
~I,5
I5~
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x
1.0
0,5
5
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40
60
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(h)
Figura 419.- Simulacin realizada para la produccin de xantano en operacin en
discontinuo con el Modelo Cintico No Estructurado: influencia de la
concentracin inicial de biomasa sobre la evolucin del oxgeno disuelto y
el kay
196
En la Figura 4.21 puede verse como influyen las diferentes concentraciones de azcar
sobre la evolucin de la biomasa durante el proceso. El modelo predice que cuanto mayor es
la concentracin de sacarosa mayor es la concentracin de xantano, siendo capaz de predecir
que la produccin cese cuando la concentracin de azcar es cero, debido a que la ecuacin
correspondiente a la velocidad de produccin de xantano aparece la concentracin de azcar.
kLaV
mayor
0,3
1,
0,2
1,
cf
0,1
0,5
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60
80
(jo
t(h)
200
A lo largo de este apartado se han ido exponiendo los diferentes resultados obtenidos
con el MCNE propuesto, tanto en ajustes a datos experimentales como en las distintas
simulaciones. Se ha visto que se ha conseguido un buen resultado al aplicar el MCNE a los
diferentes experimentos realizados en este trabajo en las evoluciones de biomasa, xantano y
sacarosa; sin embargo, este modelo es incapaz de predecir una buena evolucin del oxigeno y
del amonio.
suficientemente buenas.
Las simulaciones fueron realizadas tomando como parmetros los obtenidos por ajuste
del experimento central aquel realizado con las condiciones ptimas (Santos,1993)-.Se han
realizado las simulaciones oportunas con el fin de observar la validez del modelo planteado.
Al comparar los resultados obtenidos a partir de las diferentes simulaciones con los
resultados experimentales, se ha podido llegar a las siguientes conclusiones respecto a lo que
el Modelo Cintico No Estructurado es capaz de predecir:
201
Por todo ello, se puede concluir que el modelo cintico no estructurado permite
predecir bien la influencia de azcar inicial en el medio, y la influencia de la biomasa inicial,
en cambio no permite obtener buenas predicciones de la evolucin de oxgeno disuelto,
variable se suma importancia en este proceso. As pues, el Modelo Cintico No Estructurado
no es suficiente para la descripcin de la produccin de xantano. Se hace, pues, necesario
mejorar el modelo de modo que se consiga una mejora en las predicciones de las
evoluciones de os componentes. Ello implica tener en cuenta en el modelo factores que
influyen en el proceso y, que no han sido considerados hasta el momento. En cl prximo
apanado se aplicar un modelo cintico ms complejo, esto es un Modelo Cintico
Metablico que, es de esperar, mejore significativamente la descripcin de la produccin de
xantano.
202
5.- MODELO
CIN
METABLICO
mo
Como ya se ha visto, los modelos cinticos no estructurados son buenos para describir
el sistema cuando la composicin celular est aproximadamente en estado estacionario o no es
necesario tener en cuenta la influencia de ciertas variables en los valores de los parmetros. Sin
embargo, en una situacin en la tienen lugar cambios en la composicin celular, los modelos
no estructurados proporcionan una pobre aproximacin a la realidad. Por otra parte, es lgico
pensar que los modelos no estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas
variables, fundamentalmente la composicin del medio, tal como ha quedado reflejado en el
apartado anterior. Para salvar estas debilidades en este tipo de casos, hay que recurrir a los
modelos estructurados.
Estos ltimos fueron clasificados por Nielsen y Villadsen (1992) en varios tipos, tal
como se detall en el primer captulo de esta Memoria. Dentro de esta clasificacin, se
encuentran los Modelos Cinticos Metablicos (MCM), los cuales no estructuran la biomasa,
pero plantean relaciones estequiomtricas definidas para el metabolismo del sustrato carbonado
(Kogaycol. 1969; HallyBarford 1981; Barfordy col. 1992).
203
20~
LIPIDO-P
.~1
14UMP
LIPIDO-P-P-G(c
UDP- GLc
GIc
/1
Gle SP .GIc1P
IDP-GIc
UDP-Ac Gle
IDP
LIP!DO-P-P-GIc-GIc
Ir
Ac-Glc
PE P
LIPIDO-P-P
y,
Man
LIPIDO-Gle-Gle-Man-Ac-GIc
PVR= Man
Gte Gle
Man
Ac Gte
Man= Pyr
MONOMERO DE XANTANO
Figura 5.1.- Rutas del catabolismo de glucosa y sntesis de xantano empleadas por
Xanthomonas campestris.
205
+ 1120) +
NaOH
2NADP
C30H47026Na + 1 ]<ADP
Pi)
(NADPH,FU)
5H20
[5.1]
[5.2]
+ 2CoASH
>
PEZ + ,4cetilCoA
NADPH W
,
[5.3]
Las ecuaciones [5.1] y [5.3] son multiplicadas por los coeficientes estequiomtricos
que estos autores han extrado de la literatura, y se muestran la siguiente ecuacin:
5,49C6 FJj:O + 10,S9ATP + 3,58(NADP~ NAD~) + ],3SNaOH
+ 0,6CoASH + 0,302 * C
3. 34His 58027 36NQ1,38 + bO,89(ADP + Pi)
4; NADE!, H~) + 0,6 CoA + 0,6C02
338(NADPH, H
[5.4]
3(ADP
Pi) + 2FAD~
10(NADH,H~ )+2FADH2
206<
10NAD~
6H20 * 6C02
3ATP
[5.5]
ADP + Pi
-*
[5.6]
NAD~ H2O
[5.7]
+ H20
ni,
expresarse como la relacin qp/ q?, siendo la relacin P/O o nmero de molculas de ATP
formadas durante la transferencia de un par de electrones a travs de la cadena respiratoria
hacia el oxigeno, que es el aceptor fmal de estos electrones en los organismos aerobios.
qx
[5.8]
q rn. = q c~
[5.9]
0=0,5q~
[5.10]
kLaV
[5.11]
CbMax(C*~Co,)
207
Modelo
Cintico
Metablico
qTP=]O,
[5.13]
[5.14]
1w,
qATP
glucosa para valores de P/O en un rango entre 3-0,5 respectivamente. Esto no parece apoyar los
resultados experimentales, los cuales no exceden de 0,7 g de xantanog de glucosa
q ~
89+ E
[5.16]
transferencia de oxigeno sobre las velocidades especficas. Esto debe ser expresado a
travs de la limitacin de oxigeno sobre la velocidad especifica opIada al consumo
de oxgeno, de acuerdo a:
[5.17]
qrMCO:
q
(Kc+ Co2)
qrM.
Cuando el
qrM
qr=
[5.18]
1,2 Co;
(Kc+Co;)
[5.19]
Cc.
4,6 .
10.6
molfL). El
YX.ATP
Por tanto, el modelo propuesto por Pons y col. (1989) se puede escribir, adaptndolo a]
mtodo utilizado en esta Memoria:
209
[5.20]
=/;
Evolucin de xantano:
dCx
[5.21]
Evolucin de glucosa:
dCg
[5.22]
It
Evolucin de oxgeno:
dC0
dt
kLaV(C * Co:)
ros
[5.231
dt
Las velocidades de reaccin planteadas para las reacciones del esquema, en el que
intervienen la biomasa, el sustrato carbonado, oxgeno y dixido de carbono son:
Para la biomasa:
rx
Ch
qr.
4. Y?
(3,58 + 4~ Yr (1 +
[5.25]
ArZ)
Para la glucosa:
(5,49 + 20,77 Y~ p +
-
Kg
= C8
qr
Yx
MP
(----)
________________
[5.26]
(3,58+4Yr-ATP)
Para el oxgeno:
r o~
0,5 Ch qr
[5.27]
CO: =
0,3 rx + Ch~
/2
[5.281
Yr
lCt
Ch,.
Coz)
Ch~. =6,35ACbCho
Pons y col.
(1989)
[5.29]
[5.301
[5.31]
[5.32]
cual emplean la ecuacin logstica. Para el resto de componentes realizan slo una simulacin.
Para la integracin de las ecuaciones diferenciales emplean el algoritmo de RungeKutta de
cuarto orden. Al comparar los resultados obtenidos de la simulacin del modelo con los
resultados experimentales confirman la validez del modelo propuesto.
Pons y col. (1989) plantean el modelo que se ha descrito para un reactor tipo columna
de burbujeo, por ello, no es posible la aplicacin directa de este modelo propuesto a los datos
experimentales obtenidos en el presente trabajo. unido a esto, tampoco realizaban un ajuste de
los datos experimentales para obtener los parmetros del modelo. Por esto, se ha formulado un
modelo cintico metablico para la produccin de xantano en un tanque agitado, teniendo en
cuenta para ello algunas de las consideraciones planteadas en el Modelo Metablico propuesto
por Pons y col. (1989).
21]
Por tanto, las velocidades de produccin de los componentes, suponiendo que toda la
sacarosa -sustrato carbonado empleado en este trabajo- es asumido en las ecuaciones como
glucosa, son:
dC
5,49 rir~
[5.34]
It
dC~
dt
=
ri
[5.35]
10,89ri+3re--r3 rs
[5.36]
It
dCCof
3,58 ri
12 r~
r4
[5.37]
(CC0)
[5.38]
It
212
+kLaV
Segn Pons y col (1989) la cintica de la reaccin dada por la ecuacin [5.7] es:
k4Co:
r4=
[5.39]
Cx
______
K4+ Co:)
= r4.[
[5.40]
3,58 +4Y,trp,p
O = 3,58 ri + 12 r~
[5.41]
It
Sustituyendo en esta ltima ecuacin las ecuaciones [5.39] y [5.40] y despejando r2, se
obtiene:
!1~3~58C
1+4. Yrp
[5.42)
3,584.YTrP)J
[5.43]
ri
r2
k4Co2
Cx
K4 + Cm
1
k4~Co
12 K4+Co,
_________
j358+4JflTPP
[5.44]
[5.451
CxI1
YA TPPjI
ji
Los valores de Y,~, y YATPP se han fijado en los propuestos porPons y col. (1989):
Yrp W,2~
Co
K4 +
YATPP
34
Co.
[5.46]
[5.47]
213
Para la biomasa:
kv.
It
(Cv
dOy
y0
C,i
Cx
Cx +Yxw Cx)
[5.48]
Para el azcar:
dCs
___ =180
5,94
923,2
It
dO
____ ___
ICx
Yxs
It
It
MCc,
-.
12 K4Co,
F(
LK
Cx.tl358d
1+4Yrp
Ml
[5.49]
Para el producto:
k4 Co, ( 14Y
1~
___ r:923,2. K4CO, K3,
It
58 + 4. YATPP
Cx
[5.50]
ICo,
It
0,3
dC~
923,2
It
k4Co, Ck(C*C)
K4Co
dCx
Yox
[5.51]
It
21~
215
Para la aplicacin del modelo cintico metablico planteado se han realizado los ajustes
de los experimentos del 1 al 7. Al efectuar el ajuste de los datos experimentales obtenidos, se
observ que el modelo era incapaz de ajustar los datos de ciertos experimentos debido a la falta
de convergencia del algoritmo. En la Tabla 5.1 se muestran los resultados de los parmetros
fisicos y estadsticos de los experimentos donde se pudo aplicar el MCM.
Todos los ajustes realizados han proporcionado niveles de confianza superiores al 950~,
hay que apuntar que los valores obtenidos para el parametro K4 son mucho ms altos que la
concentracin de oxgeno disuelto, por lo que las ecuaciones [5.39] y [5.46], pueden ser
simplificadas a orden 1 de la siguiente manera:
k4Co
Cx~kCo
KqCo
Yrp=L2
Co,
Cx
[5.52]
kCo,
K4Co,
[5.53]
respecto al anterior que aparecan con cinticas tipo Monod se denomin a este modelo como
Modelo Cintico Metablico Simplificado (MCMS).
En las Tablas 5.2 a 5.8 se recogen los valores de los parmetros fisicos y estadsticos
obtenidos de la aplicacin del MCMS a los experimentos del 1 al 7. Las Figuras 5.2 a 5.8
muestran las reproducciones del modelo correspondientes a cada experimento al realizar dicho
ajuste. En estas figuras, la lnea continua representa la reproduccin obtenida de la aplicacin
del modelo mientras que los smbolos indican los puntos experimentales.
En la Tabla 5.2 se muestran los parmetros obtenidos por ajuste del experimento no i,
0C y con 257 p.p.m. de amonio inicial, como puede observarse, todos los
realizado a 25
parmetros obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas, todos los parmetros
presentan intervalos de confianza estrechos, presentando valores tanto de la t de Student como
de la F de Fischer elevados. En cuanto a la reproduccin de Jos datos experimentales reflejada
en la Figura 5.2, se observa que para este experimento el modelo predice de forma adecuada
216
En la Tabla 5.6 aparecen los valores de todos los parmetros obtenidos al aplicar el
MCMS al experimento n~ 5, realizado a 28 0C con 65 p.p.m. de amonio. En dicha tabla
puede apreciarse que se cumplen las restricciones estadsticas, siendo el valor ms bajo de t de
Student el obtenido para el parmetro Yox. En cuanto a la reproduccin de la evolucin de los
los componentes con este modelo, se obtiene una evolucin de la concentracin de sacarosa
aceptable mientras que la evolucin de la concentracin de xantano y oxgeno disuelto
difieren bastante de las obtenidas experimentalmente, tal como muestra la Figura 5.6.
217
La Tabla 5.8 muestra los parmetros obtenidos del ajuste al modelo para el
experimento realizado a 28 0C con 514 p.p.m. de amonio (experimento n0 7). Hay que
destacar el valor significativamente alto del parmetro k, el cual es aproximadamente 2
rdenes de magnitud superior al obtenido en el resto de experimentos. Adems, el valor
obtenido para la
dentro del limite terico pero el valor es bajo en comparacin con los experimentos anteriores.
En cuanto a la reproduccin de los datos experimentales, en la Figura 5.8 se observa una
reproduccin aceptable para la evolucin de sacarosa, no siendo tan buena para la
concentracin de xantano ni para el oxgeno disuelto.
2/8
Tabla 5.1. -Valores fisicos y estadsticos de los parmetros obtenidos mediante el ajuste de los
datos de los experimentos 2,3, y 4 al MCM.
Valorn Parmetros
T
28
31
t Studeu,t
F Fiseber
5RC
Pa,.
Mx.
pt.
Mio.
Obtenido
0,552
0.535
0.5 19
68,77
Nt
6.229
6,073
5,918
80.26
3.670
3.183
2.696
13,07
It
5.97.10
5,95 [0<
5.94102
805,6
0.2 It)
0,177
0,145
0,87
Yox
[54,8
117,3
79.82
6,26
kx
0,472
0,446
0.421
36,71
St
4,652
4,325
3.998
27,29
6,912
6,030
5,148
13.67
It
6.66.10<
6,66.102
6.66.10.2
I.38.I0~
0,168
0.155
0.143
24,80
37.55
33.55
29,55
[6,77
1>.
0,439
0,423
0,408
57,76
YX
5,021
4.732
4,443
34,53
0.808
0.759
0,711
31,45
375.10<
3,74.10.2
9 lO
It
3 76 [0
Yxs
0 153
0 130
0,107
11,29
Yo~
3487
31,29
27,71
1754
Tabulado
Obtenido
Tabulado
2,080
66984
317
2.0610
199
2778
2.48
2,09
2,145
4(42
3.74
[.4110
2,262
4263
4,26
0.80:101
2010
2780
219
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Figura 5.2.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 1, realizado con Xant/zotnonas carnpestris a la temperatura
de 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
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Figura 5.5--
228
cf
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Figura 5.6.-
2,5
2,0
1
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cf
1,0
0,5
0,0
t (h)
Figura 5.7.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento
6, realizado con Xanthomonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (130 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin
(210 r.p.m. inicial).
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229
2.5
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1,0 ~
y-,
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Figura 5.8.- Reproduccin de los experimentales por ajuste por ajuste al MCMS del
experimento n0 7, realizado con Xantho,nonas campestris a la temperatura
de 280 C, medio A (475 p.p.m. de amonio), programacin de agitacin (210
r.p.m. inicial).
230
5.3.
DISCUSIN
5.3.1.-
c para k. Los
otros dos
parmetros del modelo -Y=~sy k- presentan una tendencia lineal con la temperatura. El
parmetro relativo a la velocidad de desaparicin del azcar, Y~<s , decrece, mientras que k,
parmetro relacionado con la velocidad de aparicin del producto, aumenta con el incremento
de dicha variable.
De acuerdo
ajustados
parmetros, as como el ajuste a las ecuaciones [5.54]a [5.57] se muestran en la Figura 5.9:
231
[5.54]
- Tmax))Jf
[5.55]
a /3-7
[5.561
kYT)=a/3-T
[5.57]
C2,
Ti,,a<,,
valores de los parmetros y sus estadsticas, obtenidos del ajuste de los cuatro experimentos
realizados a diferentes temperaturas, donde los parmetros relativos a la frente carbonada, al
xantano y al oxigeno disuelto han sido puestos en funcin de la temperatura de la forma
indicada. Como se observa, para todos los parmetros se cumplen las restricciones estadsticas
superando siempre el valor terico de t de Student y de F de Fischer.
Las tendencias obtenidas para estos cuatro parmetros cuando son ajustados
conjuntamente, se mostraron en la Figura 59, donde el resultado de este ajuste era el
representado por la lnea continua. Este ajuste es el resultado de sustituir los valores de
temperatura en las ecuaciones [5.54] a [5.57] con los valores de los parmetros obtenidos,
de la siguiente forma:
7,>
2,913 + 2,048 7
( 0,571 - (T -24,35)11
[5.58]
[5.59]
[5.60]
232
140
120-
120
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180
160
140
120
100
80
60
40
20
0,2
GO
,%
045
1~>
0,1
0,05
20
o
25
30
T (OC)
Figura 5.9-
35
20
25
30
35
Tc7C)
233
La
Os
4..>
4-O
4-
o-.>
400
4-
U.>
CM
[4
o
4-
o-.>
La
U.>
[4
0
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2[4O
La
0
4
4~4
La
[4
[4
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4-
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e
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~~0
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-t
e-
la
la
2,5
40
35
2,0
30
15~
25
(-5-
20-
1,0:
-4
cf
15
0,5
un
0,0
10
20
30
40
50
60
t (h)
2,5
2,0
1,5?
(-5-
ib-
1,0 ~
4$9
(y
0,5
0,0
t(h)
235
40
2,0
35
30
1.5
25
(-5$9
cf
-2
20
1~0
I5
(-y
I0~
0,5
0,0
20
40
t (h)
2,5
40
35
2,0
30
25
l,5~
ib-
20
$9
3[5
1,0
lo
5
0,5
o
t
(h)
Figura 5.13.- Reproduccin de los datos del experimento ~0 4 realizado a 340 C, medio
A (con 257 p.p.m. de amonio) y programacin de agitacin (210 r.p.m.) al
MCMS (T).
236
5.3.1.2.-
237
so
5)00
-1)00
x00
(a)
1,1111
(b)
60,,
-40-
~oo
-
~1~
20
-1-
1000 O
0
lOO
200
300
-:
400
500
100
200
300
400
Amonio (ppm)
Amonio (ppm)
500
600
600MX)
020
1(X)
1~
300
20<1
(d)
3$ ~
tOi5
11
It
-H
1)10
1)
[00
200
300
400
Amonio (ppm)
500
600
lOO
200
300
400
Amonio (ppm)
500
600
Figura 5.14.- Evolucin de los parmetros del MCMS con la concentracin de amonio inicia].
La lnea discontinua indica la tendencia de los parmetros obtenidos
experimento a experimento.
238
realizar
simulaciones, una vez comprobado que el modelo cintico objeto de estudio es vlido.
En este captulo se ha visto que el MCM ha podido ser obtenido en funcin de una
de las variables estudiadas, concretamente, de la temperatura. En cambio no se ha planteado
un modelo que tenga en cuenta la variacin de la concentracin inicial de amonio, lo cual es
lgico si se tiene en cuenta que la concentracin de amonio slo influye en el crecimiento
Las simulaciones realizadas en este captulo son las mismas que en el captulo
anterior. Se han realizado aquellas con las que, en principio, cabra esperar mayor influencia
en la evolucin de componentes, como biomasa inicial, concentracin de azcar inicial y
concentracin de oxigeno disuelto.
Simulacin
240
Valores
Cxo = 0,03 gIL
Cxo 0,07 g/L
= 0,50 g/L
Cxo = 1,00 gIL
Cso IOg/l
Cso = 20 gIl
40 gIl
CsoSOg/l
C02= 10%
Influencia de la agitacin
Agitacin constante
Perfil de agitacin
20%
5.17
se observa
241
0.30
025
020
0,1 5
0.10
0.05
0,00
t
<h)
(3-
cf
30
60
t (Fi)
242
25
2,5
20
2,0
15-y
6
(4,
1
>1
lo
(-3
0,5
o
0
20
40
60
t (h)
243
En la Figura 5.19 puede verse como influyen las diferentes concentraciones iniciales
de azcar sobre la velocidad de produccin de xantano durante el proceso. El modelo es
incapaz de predecir la influencia del azcar en la evolucin del producto, ya que la cantidad
de xantano obtenida es siempre igual, independientemente de la concentracin de azcar de
la que se parta.
La simulacin para poner de manifiesto la influencia de la concentracin inicial de
azcar en la evolucin de oxgeno disuelto y el valor de kLav aparece en la Figura 5.20. En
ella se observa que el MCMT no es capaz de predecir cambios en la evolucin de dichos
1
-I~ 1
al cambiar esta variable, lo cual es lgico, debido a que a
concenLraclon ue
xantano, directamente relacionada con la viscosidad, no se ve influida por lo que el valor de
componemes
kLaV
244
0,3
2,0
1,5
0,2
1,0
cf
cf
0,I
0,5
0,0
0,0
loo
t (h)
(-y(-y.>
10
20
30
40
t
50
60
70
(Ii)
2,5
25
2.0
20
-5
I5
,0
-t
O
0-i
(-3
0,5
0,0
0
t
Figura 5.20.-
246
(h>
En
la Figura 5.22
aparecen
concentraciones de oxgeno disuelto, con 10 y 20% del valor de saturacin. Cuanto mayor
es la concentracin de oxgeno disuelto, el modelo predice una mayor concentracin de
xantano, y por tanto un mayor consumo de sacarosa. Al igual que en el caso anterior, la
evolucin dc la concentracin de biomasa no se ve afectada por la concentracin de oxgeno
disuelto.
2,0
45
40
1,5
35
30
25~
10
s
u
0,5
lo
5
0,0
70
t (h)
247
2-
45
40
1,530
25~
~
(-5-
tO
202
(3<
0,5
10
5
0,0
0
t (h)
Figura 5.22-
248
No fue posible obtener una relacin de los parmetros cinticos calculados para
experimentos realizados con distintas concentraciones de amonio, debido a que los parmetros
obtenidos no presentaban una tendencia lgica respecto de la concentracin inicial de dicho
sustrato nitrogenado.
Por todo esto, el Modelo Cintico Metablico permite una buena reproduccin de
datos experimentales de la concentracin de xantano, sacarosa y oxigeno disuelto. Este
ltimo componente no pudo ser reproducido de forma adecuada por el MCNE.
frente
250
6.- MODELO
DE
CINE liCO
CLULA
Todos los modelos de este tipo existentes en la literatura explican slo el crecimiento
de microorganismos, y estn desarrollados para aquellos muy conocidos como la bacteria
Escherichia coli
caracterizan por tener un elevado nmero de parmetros (entre 74 y 200), los cuales son
obtenidos siempre de datos de la bibliografia. En ningn trabajo se presentan valores de los
parmetros
debido
fundamentalmente a dos razones: una con relacin al elevado nmero de parmetros que
presentan los modelos cinticos de clula, lo que implica una gran dificultad a la hora de
abordar matemticamente el problema; la otra, tiene relacin con el anlisis de los
componentes clave del sistema. El seguimiento de componentes intracelulares presenta una
especial dificultad para obtener datos fiables que puedan ser utilizados en el modelo cintico.
251
252
Ribosa-6P
Fosforihosilpirofosfato
,4TP
NAD~
Glucosa-6P
(iMP
IMP
Ac 6 Fosfoglucnico
IMP
4,
ATP
ir
14TP
Piruvato
GMP
4,
GTP
NAD~
ir
AMINOCIDOS
OXIDACIN-REDUCCIN
,4cet1 coA
Oxaacetato
Isocilrato
dATP
CO2
dGTP
dCTP
dUMP
dTTP
ATP
253
Estudiar una a una las reacciones del esquema, para reducir la complejidad del problema a
una suma de reacciones simples, si bien no siempre es posible aplicar este procedimiento.
Una vez conocidas las especies quimicas, se debe plantear un esquema simplificado de
reaccin. Para llegar a l, se debe realizar un anlisis exhaustivo de los datos experimentales.
Adems, se aplicar lumping de las especies qumicas que forman este sistema, llegando,
posteriormente, a la formulacin de las ecuaciones de filiacin (o relaciones estequiomtricas
defmidas) de los diferentes compuestos que intervienen en las reacciones.
Una vez calculados los parmetros, es necesario comprobar la reproducibilidad del modelo.
Para ello debe formularse el modelo cintico, mediante combinacin de las ecuaciones
cinticas para determinar las velocidades de reaccin. Si ste no es aceptable, es necesano
recurrir a otro modelo, siendo primordial el establecimiento de criterios para realizar la
discriminacin en esta etapa (Garca-Ochoa y Romero, 1993).
El estudio estequiomtrico del sistema objeto de estudio puede ser de notable ayuda en
los primeros pasos de la formulacin de la red de reaccin. La infonnacin que se debe obtener
es:
-
Cmo pueden calcularse los cambios en la composicin del sistema conociendo los cambios
Esta informacin es muy importante para la determinacin del mtodo analtico capaz
de seguir los cambios en la composicin. Adems, puede ser de gran utilidad para la propuesta
del esquema de reaccin debido a que el nmero mnimo de reacciones que deben incluirse en
el esquema debe coincidir con el nmero de variables independientes y con el nmero de
componentes clave. En este caso, en principio, se ha optado por asumir la biomasa por tres
especies intracelulares: protenas RNA y DNA. Esta hiptesis se contrastar ms adelante.
El nmero de reacciones y de especies implicadas varian segn los casos, desde cuatro
a cinco especies hasta cientos de ellas, aunque como se ver ms adelante es muy
conveniente que coincidan el nmero de componentes clave y el de reacciones del
esquema.
256
Al analizar una red compleja de reacciones, como debe ser el esquema simplificado
propuesto en el apartado anterior, las ecuaciones que ligan las magnitudes medibles
(velocidades de produccin o concentraciones) con las magnitudes que hay que determinar, en
funcin de las condiciones de operacin (velocidades de reaccin), son (Garca-Ochoa y
Romero, 1993):
NR
i1
CjC10
NR
=Zvi~
j<
o
r, .dtJj
]...NC)
[6.2]
R~=
dC
NR
~=Zv,1.k,.fi(Cx);(C1=1...NC)
[6.3]
257
[6.4]
Clculo de las velocidades de produccin Rj, para los NC componentes clave. Este clculo
se realiza por ajuste de los datos experimentales a una funcin del tiempo conocida y
posteriormente se deriva analticamente, obtenindose los valores discretos de las
velocidades citadas si, como es habitual, se trata de datos integrales, composicin ,s
tiempo.
Clculo de los parmetros cinticos del sistema; para ello, se pueden realizar diferentes tipos
de regresin lineal o no lineal y, adems se puede realizar empleando simple o mltiple
respuesta.
[6.5]
r5
[6.6]
donde r5 representa el producto de las integrales por las constantes de la ecuacin [6.5].
Clculo de las integrales de las velocidades de reaccin r5, para las NR reacciones que
tienen lugar. Este clculo se puede realizar mediante el ajuste de los datos a una funcin
conocida y posterior integracin analtica, obtenindose los valores discretos necesarios de
dichas integrales.
Clculo de los parmetros cinticos del modelo. Para ello, pueden ser aplicados tanto la
regresin lineal como la no lineal, como en el caso anterior.
258
y. R
[6.7]
es cuadrada, es decir, el
r5 =v -C
[6.8]
[6]
259
Una vez conocidas las cinticas aplicando mtodos como el de las velocidades de
reaccin, es necesario calcular los parmetros realizando un ajuste en mltiple respuesta, es
decir no obteniendo los parmetros de las reacciones individuales, sino de forma conjunta
mediante clculo por regresin de los datos experimentales.
Los modelos propuestos pueden obtenerse por combinaciones entre distintas cinticas
dentro del mismo esquema de reaccin propuesto al formular el modelo. Muchas veces ocurre
que varios modelos son capaces de describir el sistema, de forma que, en este punto, es
primordial el establecimiento de criterios de discriminacin.
Criterios
261
g componentel caldo
Figura 6.2.- Unidades de los datos obtenidos a partir del Citmetro de Flujo y su conversin
en otras para aplicar en el modelo cintico
Adems del seguimiento de los componentes intracelulares,
se ha analizado otro
Como ya se ha indicado, el nitrgeno (en forma de amonio) que ser consumido por el
microorganismo, ir a frmar los componentes intracelulares, pero adems parte de ste
nitrgeno puede ser empleado para sintetizar otras protenas que no quedarn en el interior
262
Para realizar dicho balance de nitrgeno, hay que calcular previamente la concentracin
de nitrgeno que hay en la molcula de amonio (que es como se mcorpora en el medio de
cultivo); se emple la siguiente ecuacin:
14
Para el clculo de la concentracin de nitrgeno que hay en las molculas medias de
[os componentes intracelulares (deducidas por aplicacin del lumping) se emplean las
siguientes ecuaciones:
Cvg~~(g/L) =C~4(g/L)~
3 75~ 14
491,16
[6.11]
/ L) = CJg XL)
,36 14
133,848
[6.13]
En las Tablas 6.1 a 6.7 se muestran las concentraciones de nitrgeno empleadas por
el microorganismo en la sntesis de los componentes intracelulares en los distintos
experimentos realizados en este trabajo. En las citadas tablas se muestran las evoluciones de
nitrgeno (por molcula de amonio) CNA, as como las cantidades de nitrgeno en DNA
(CN DNA),
RNA
(CN,RNA)
protenas intracelulares
(CN,PRJ).
Adems, se ha realizado la
suma de estos tres componentes (CNT), con el fin de compararlo con la concentracin inicial
263
=CN0
C~1,-
[6.14]
En la Tabla 6.1 se muestran los resultados del experimento realizado con 65 p.p.m.
05). Si comparamos la cantidad de nitrgeno total con la
de amonio inicial (experimento n
aadida inicialmente en el medio de cultivo (0,0506 g/L de nitrgeno), se observa que la
cantidad de nitrgeno encontrada como suma de DNA, RNA y protenas intracelulares es
mayor que la cantidad inicial de nitrgeno, llegndose a obtener 0,083 gIL de nitrgeno
rnmovilizado en componentes intracelulares. Este balance podra indicar que el
microorganismo puede sintetizar estos componentes empleando otra fuente de nitrgeno,
por ejemplo aminocidos procedentes de! medio YM, que es el medio empleado para
realizar el inculo en el biorreactor. O bien, podra ser que el microorganismo estuviera
empleando este amonio en fabricar componentes con una composicin diferente a la que
tiene cuando la concentracin de amonio es mayor, o lo que es lo mismo, con una
estequlometra diferente. Adems, se observa en la tabla que no hay sntesis de protena
extracetular, salvo la que aparece entre las 3 a 16 horas de la fermentacin, pero en la fase
estacionaria de crecimiento no parece que exista excrecin de este tipo de protenas.
Para el experimento realizado con 130 p.p.m. (experimento n0 6), que aparece en la
Tabla 62, el balance del nitrgeno indica que el nitrgeno inicial aadido 0,1011 g/L se
encuentra en los componentes intracelulares hasta una cantidad mxima 0,084 gIL
(observada en la fase estacionaria de crecimiento), teniendo en cuenta que se ha consumido
completamente el nitrgeno a lo largo de la fermentacin, el nitrgeno que falta estar
formando parte de la protena extracelular, como refleja la ltima colunma de la citada tabla.
se obtiene cierta
protena extracelular. como indica la ltima columna de la tabla. El hecho de que en este
experimento no haya consumo total de amonio indica que en este caso el sustrato
nitrogenado no est siendo el
demas.
Por ltimo, en la Tabla 6.7 aparece el balance para el experimento realizado a 340C y
con una concentracin de amonio inicial de 257 p.p.m (experimento n0 4). En este caso, no
llega a consumirse todo el nitrgeno aadido inicialmente (0,157 gIL) pues queda una
cantidad residual de 0,077 gIL. En este experimento, todo el nitrgeno consumido se
encuentra inmovilizado como componentes intracelulares, y un porcentaje de nitrgeno se
emplear para la sntesis de protenas extracelulares en la fase estacionaria de crecimiento,
como indica la ltima columna de la Tabla 6.7.
265
Tabla 6.1.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xandzoinonas canipestris durante la
fermentacin en el experimento n0 5, llevado a cabo con 65 p.p.m. de amonio y
280C.
Tiempo
(h)
0
1.5
3
4.5
6
CRNA
( IL)
0.000 16
0.00017
0.00018
0.00021
0.00027
0.00063
CDNA
( /L)
0.00023
0.00025
0.00026
0.0003
0.00038
0.00089
12
16
20
23.5
24.5
CN,x
( /L)
0.0505
0.0497
0.0482
0.0466
0.045 1
0.0435
0.0326
0.0256
0.0194
0.0132
0.0093
0.001
0.0014
0.0037
0.0024
0.0055
0.0123
0.0127
0.0033
0.0078
0.0172
0.0178
0.0090
0.0210
0.0463
0.0478
25.25
0.0062
0.0130
0.0183
0.0492
0.0806
26
27.5
31
0.0015
0.00078
0.00078
0.0132
0.0134
0.0134
0.0186
0.0188
0.0188
0.0499
0.0506
0.0818
0.0830
0
0
32
32.5
33
35
40
0.00078
0.00078
0.00078
0.00078
0.00078
0.0134
0.0134
0.0134
0.0134
0.0134
0.0188
0.0188
0.0188
0.0188
0.0188
0.0506
0.0506
0.0506
0.0506
0.0506
0.0506
0.0830
0.0830
0.0830
0.0830
0.0830
0.0830
0
0
0
0
0
0
8.5
266
CPR
(g/L)
SCDNA,RNN,PIU
0.00062
0.00068
0.00071
0.0008
0.0010
0.0023
0.00 10
0.0011
0.0011
0.0013
0.0016
0.0039
0.0061
0.0148
0.0344
0.0759
0.0783
IL
(IL)
0
0
0.0011
0.0025
0.0037
0.0030
0.0117
0.0100
0
0
0
Tabla 6.2.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 6, llevados a cabo con 130 p.p.m. de
amonio y 280C.
Tiempo
(h)
0
CN.A
( /L)
0.1011
2.5
0.1008
3.5
0.0972
5.5
Cp.~
(g/L)
C~
4
(g/L)
CPRI
ZCDNA.RNA,PRI
CPRE
(g/L)
<g/l)
(g/L)
0.0855
0.0746
0.00021
0.00025
0.00031
0.00035
0.00040
0.0003
0.00035
0.00043
0.00049
0.00057
0.0008
0.00094
0.00116
0.0013
0.00152
0.00131
0.00154
0.0019
0.00214
0.00249
0
0
0.00188
0.01331
0.02384
0.0661
0.00048
0.00067
0.00181
0.00297
0.03192
9.25
10.5
16
20
24.25
0.0591
0.0528
0.00092
0.00112
0.0013
0.00157
0.00348
0.00421
0.0057
0.0069
0.03619
0.04121
0.0248
0.0019
0.00267
0.0042
0.0051
0.0063
0.0080
0.0092
0.0121
0.0128
0.0132
0.0138
0.00592
0.00729
0.0089
0.01 133
0.01299
0.017
0.01808
0.01862
0.01943
0.00717
0.01588
0.01175
0.02602
0.06437
0.05554
26.5
28.5
30.5
31.5
32
33.5
0.0194
0.0085
0.0073
0.0058
0.0048
0.0031
0.0019
0.00078
0.00075
0.01955
0.0239
0.03041
0.03487
0.04562
0.04852
0.04997
0.05214
0.03203
0.03915
0.04982
0.05713
0.07474
0.07949
0.08186
0.08542
0.06041
0.05446
0.04535
0.03905
0.023 14
0.01957
0.01836
0.01483
38
0.00066
0.0138
0.01943
0.05214
0.08542
0.01492
25
47
0.00008
0.0140
0.0197
0.05287
0.08661
0.01431
47.5
0.00008
0.0140
0.0197
0.05287
0.08661
0.01431
49
0.00008
0.0140
0.0197
0.05287
0.08661
0.01431
50
51
53.5
0.00008
0.00008
0.00008
0.0140
0.0140
0.0140
0.0197
0.0197
0.0197
0.05287
0.05287
0.05287
0.08661
0.08661
0.08661
0.01431
0.01431
0.01431
267
Tabla 6.3.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 2, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio.y 28~ C
Tiempo [ CN
(h)
Wg2~L=.
CRN4
CDNA
CpRI
(g/L)
( /L)
(IL)
XCDNA,RNA,PR
J=~g~==
(gIL)
0
2
4
0.2403
0.2333
0.2317
0.0013
0.0016
0.0019
0.0018
0.0022
0.0026
0.0048
0.0058
0.0068
0.0097
0.0114
0
0
0
0.2232
0.2177
0.0025
0.0030
0.0035
0.0042
0.0090
0.0108
0.0150
0.0180
0.0061
12
13
14.5
0.2138
0.2092
0.2068
0.0040
0.0044
0.0055
0.0056
0.0061
0.0077
0.0145
0.0159
0.0200
0.0242
0.0265
0.0333
0.0039
0.0062
0.0017
16
16.5
0.1975
0.1921
0.0057
0.0067
0.0081
0.0094
0.0208
0.0243
0.0347
0.0405
0.0096
0.0093
19.5
23.5
24
24.5
28
32
33.5
34
0.1711
0.1477
0.1291
0.1088
0.0777
0.0637
0.0567
0.0427
0.0092
0.0119
0.0127
0.0152
0,0175
0.0234
0.0240
0.0259
0.0129
0.0167
0.0178
0.0213
0.0245
0.0329
0.0337
0.0364
0.0334
0.0431
0.0461
0.0550
0.0633
0.0849
0.0871
0.0940
0.0556
0.0718
0.0768
0.0915
0.1054
0.1413
0.1450
0.1564
0.0152
0.0223
0.0360
0.0415
0.0587
0.0368
0.0401
0.0428
38
38.5
0.0350
0.0269
0.0377
0.0974
0.1622
0.0448
39.5
0.0194
0.0101
0.0279
0.0288
0.0391
0.0404
0.1009
0.1044
0.1679
0.1737
41.5
0.00078
0.0297
0.0417
0.1077
0.1793
0.0545
0.0581
0.0618
0.0606
0.0081
42
0.00063
0.03001
0.0420
0.1086
0.1807
43.7
48
0.00040
0.00008
0.0304
0.0304
0.0426
0.0426
0 1100
01100
0.1830
48.5
52
0.00008
0.00008
0.0304
0.0304
0.0426
0.0426
0.1100
0.1100
268
0.1830
0.1830
0.1830
0.0037
0.0585
0.0588
0.0588
0
Tabla 6.4.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthononas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 7, llevados a cabo con 475 p.p.m. de
amonio y 280C.
Tiempo
(h)
0
2
4
0.0001
0.0001
0.00022
0.00043
0.00050
0.00067
CUNA
(gil)
0.00016
0.00026
0.00032
0.00059
0.0007
0.00094
CPRI
(g/L)
0.00041
0.00067
0.00084
0.0015
0.0018
0.0024
ECDN,LNA,pR,
(gil)
0.00068
0.0011
0.0014
0.0025
0.0030
0.0040
CPRE
(gil)
0
0
0
0.0009
0.0043
0.0087
0.00089
0.0011
0.0016
0.0017
0.0024
0.0061
0.0090
0.0117
0.0157
0.0177
0,0190
0.0190
0.0190
0.0190
0.0190
0.0012
0.0016
0.0022
0.0024
0.0034
0.0086
0.0126
0.0164
0.0221
0.0248
0.0267
0.0267
0.0267
0.0267
0.0267
0.0032
0.0041
0.0059
0.0062
0.0089
0.0222
0.0327
0.0423
0.0571
0.0640
0.0689
0.0689
0.0689
0.0689
0.0689
0.0053
0.0069
0.0098
0.0104
0.0149
0.0370
0.0544
0.0704
0.0950
0.1065
0.1147
0.1147
0.1147
0.1147
0.1147
0.0097
0.0198
0.0480
0.0824
0.1596
0.1919
0.1978
0.2052
0.1884
0.1963
0.1920
0.1920
0.1920
0.1920
0.1920
CN,
(gIL)
CRNA
9
12
0.3694
0.3686
0.3678
0.3655
0.3616
0.3562
13
14.5
16
16.5
19.5
23.5
24
24.5
28
32
33.5
34
0.3538
0.3422
0.3111
0.2761
0.1944
0.1400
0.1166
0.0933
0.0855
0.0661
0.0622
0.0622
38
0.0622
38.5
0.0622
0.0622
39.5
(g/L)
269
Tabla 6.5.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campestris durante la
fermentacin en el experimento n0 1, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 250 C.
Tiempo
(b)
0
5.7
7.7
9
10
12
16
17
20
24
25
28
29
32
34
35
38
50
270
CN,.%
CRNA
(g/L)
(g/L)
CDN..x
(g/L)
0
0.3012
0.2951
0.2922
0.2812
0.2761
0.2741
0.1813
0.0017
0.0061
0.0069
0.0111
0.0123
0.0182
0.0591
0.0641
0.1082
0.1323
0.1522
0.1711
0.1802
0.2301
0.2606
0.2707
0.2805
0.3002
0.0021
0.0031
0.0101
0.0161
0.0171
0.0261
0.0872
0.1093
0.1325
0.1922
0.2522
0.2712
0.2811
0.3511
0.3824
0.4225
0.4122
0.4300
[ 0.1241
0.0901
0.0851
0.0752
0.0414
0.0333
0.0112
0.0091
0.0006
0.0006
CPRI
(g/L)
0.0051
0.0085
0.0211
0.0321
0.0351
0.0473
0.1522
0.1831
0.2811
0.3503
0.3802 1
0.4411
0.4702
0.6502
0.7025
0.7201
0.7811
0.7811
JI..
CPRE
(gIL)
0.0087
0.0176
0.0369
0.0582
0.0642
0.0911
0.2961
0.3562
0.5183
0.6744
0.7855
0.8821
0.9332
1.232 1
1.3422
1.3933
1.4733
1.5121
0,0012
0.0024
0.0034
0.0043
0.0053
0.0079
0.0168
0.0203
0.0346
0.0679
0.0802
0.1271
0.1438
0,1764
0.1784
0.1785
0.1785
0.1785
ECDNA,RNA,PRI
Tabla 6.6.-
Tiempo
(b)
CNA
CRNA
CUNA
CPRI
ECDN,~,PRI
CPRE
(gIL)
(gIL)
(gIL)
(gIL)
J~j~[
(gIL)
0
0.5
1.15
3
3.5
0.1711
0.1697
0.0025
0.0035
0.0095
0.0156
0.00405
0.00426
0.00456
0.0108
0.0114
0.0122
0.0178
0.0187
0.0200
0
0
0
0.00467
0.0125
0.0205
6
8
0.1512
0.1445
0.0028
0.0030
0.0032
0.0033
0.0038
0.0044
0.00537
0.00621
0.0144
0.0166
0.0236
0.0272
0
0.0074
8.5
9
10
12
14.5
15
16
18.5
20
23.5
24
24.5
25
26.5
27
28
30
31.7
0.1329
0.1299
0.1221
0.1061
0.0846
0.0803
0.0718
0.0524
0.0423
0.0243
0.0224
0.0206
0.0189
0.0145
0.0133
0.0111
0.0077
0.0056
0.0048
0.0058
0.0074
0.0080
0.0105
0.0113
0.0115
0.0130
0.0134
0.0171
0.0173
0.0182
0.0189
0.0190
0.0197
0.0197
0.0206
0.0203
0.00677
0.0082
0.0103
0.0113
0.0148
0.0159
0.0161
0.0183
0.0188
0.0240
0.0242
0.0256
0.0265
0.0267
0.0276
0.0276
0.0289
0.0285
0.0181
0.0220
0.0278
0.0304
0.0398
0.0427
0.0434
0.0492
0.0506
0.0644
0.0651
0.0688
0.0713
0.0716
0.0743
0.0743
0.0777
0.0766
0.0297
0.0360
0.0456
0.0498
0.0652
0.0711
0.0711
0.0806
0.0830
0.1055
0.1067
0.1127
0.1168
0.1174
0.1217
0.1217
0.1273
0.1255
0.0082
0.0054
0.0031
0.0150
0.0211
0.0207
0.0279
0.0379
0.0456
0.0410
0.0418
0.0376
0.0352
0.0389
0.0359
0.0381
0.0359
0.0398
0.0030
0.0203
0.0285
0.0766
0. 1255
0.0424
0.1677
0.1655
0.1=95
271
Tabla 6.7.- Clculo del nitrgeno aprovechado por Xanthomonas campes/Rs durante la
fermentacin en el experimento n0 4, llevados a cabo con 257 p.p.m. de
amonio y 340 C.
Tiempo
(h)
0
3
6
9
12
14
14.5
18
20
24
24.5
30
33
36
36.5
40
272
CN,
(gIL)
0.1521
CRNA]
Cpftg
SCDNA~NA,rRI
CPRE1
(g/L)~
0.00019
DNAj
~tL....J
0.00022
0.0002
DeDil
0.1547
0.1462
0.1361
0.1151
0.1143
0.1104
0.1088
0.1052
0.1011
0.0972
0.0933
0.0855
0.0855
0.0777
0.0777
0.0777
0.0277
0.00029
0.00048
0.00022
0.0011
0.0013
0.0014
0.0023
0.0048
0.0067
0.0086
0.0134
0.0150
0.0173
0.0188
0.0269
0.0269
0.0269
0.0004
0.00067
0.0010
0.0014
0.0018
0.0019
0.0032
0.0067
0.0094
0.0121
0.0188
0.0210
0,0243
0.0264
0.0377
0.0377
0.0377
0.0010
0.0017
0.0028
0.0036
0.0047
0.0050
0.0083
0.0174
0.0243
0.0313
0.0487
0.0543
0.0627
0.0682
0.0975
0.0975
0.0975
0.0017
0.0029
0.0046
0.0060
0.0078
0.0083
0.0139
0.0289
0.0405
0.0521
0.0811
0.0903
0.1043
0.1135
0.1622
0.1622
0.1622
0.0013
0.0012
0.0015
0.0017
0.0022
0.0081
0.0025
0.0101
0.0110
0.0121
0.0152
0.0223
0.025]
0.0252
0,0252
0.0252
0.0777
0.0269
0.0377
0.0975
0.1622
0.0252
(g/L)
IL
(g/L)
0
0,0011
Figuras 6.3 a 6.9 se muestran las evoluciones de los componentes intracelulares (DNA, RNA
y protenas), as como la suma de estos tres componentes estructurales de la clula, con el fm
Se puede observar que las evoluciones de todos los componentes (en g/l..) en todos los
experimentos es similar. El contenido en protenas es siempre mayor que el contenido en
cidos nucleicos y, dentro de stos, la cantidad de DNA es siempre mayor que la de RNA. Por
otm lado, se observa la estrecha relacin entre la sntesis de estos componentes y e] consumo
de nitrgeno, es decir, cuando el sustrato nitrogenado se agota, el microorganismo no puede
seguir sintetizando nuevas molculas, por lo que la sntesis de aminocidos se detiene y, en
consecuencia, la sntesis de cidos nucleicos, lo que provoca que el microorganismo entre en la
fase estacionaria del crecimiento. Una excepcin a esta afirmacin es la correspondiente al
experimento realizado con una concentracin de amonio inicial de 0,475 gIL; en este caso,
cuando el microorganismo entra en la fase estacionaria del crecimiento, todava queda una
concentracin elevada del sustrato nitrogenado en el medio, por lo que la entrada en esta Ibse
se debe, probablemente, a otro nutriente que se ha agotado y no al nitrgeno. Adems, en todas
las grficas se ha representado la suma de los componentes intracelulares (DNA, RNA y
protenas), que se ha llamado biomasa terica (Cxr~), se aprecia que esta suma en todos los
casos es semejante al valor de la biomasa obtenida experimentalmente, existiendo una
diferencia -no muy significativa- en la fase estacionaria del crecimiento, debido a que no se han
considerado otros componentes, como lpidos o hidratos de carbono, que, aunque en mucha
menor cantidad, se encuentran en la biomasa, y pueden ser los responsables de esa pequea
diferencia entre la biomasa experimental y la terica (DNA, RNA y protenas intracelulares).
273
0,8
ex
# -s
V
A
- -
-u. ----3.
0Q~ O -
0,6~
~
%rot,, +CRNA+CDN
0,4-
2,
y. ~gt
(3
- -
4,
It,
0,2
7 .~o ~~v
~~v-
y.
>,1
1~
0
-
30
20
10
40
50
(h)
2.0
1.5
I,0
e!
u
0,5
o,
.F
0 0004
0.0
0
10
20
r
30
40
50
60
t(h)
Figura 6.4.- Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 6. Condiciones experimentales: CNO=130 p.p.ni., T 28 0C, N~=
variable (210 r.p.m. inicial)
274
2.0
CN
AC RNA
~
o
1,5
u
mi
o
I,0O
o000
1P~
di
g
0,5
ji
0,0 ~
Jo
20
tp
50
40
30
60
t(h)
Figura 6.5.- Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 2. Condiciones experimentales: CNO=25? p.p.m., fl 28 0C, N=
variable (210 r.p.m. inicial)
2,0
1,5
4~NA
o s
.cx
E,.,,
CXT~<,~
[0
Oc
0~
o
u
0,5,
.SS..
0,0
9s..
ollo
20
30
40
t(h)
Figura 6.6. Evolucin de componentes intracelulares, fuente de nitrgeno y biomasa del
experimento n0 7. Condiciones experimentales: CNO=475 p.p.m., T= 28 0C, N=
variable (210 r.p.m. inicial).
275
2,0
CRNA
1,5
u. uo
5
1,0
.0
TM
u... U
UD
o
u
u
0,5
~00
o-
o0
0,0
~1~
10
20
30
t
40
50
60
(Ii)
2,
1,5
CN
C~A
a
-4
Eo
u.....
o
1,0
n-o
0~ O-
u
u
0,5
~
0,04
O
I0
q50
20
~~AAA
WVV7
a-
----
30
40
t (h)
276
2.0
CN
A
C~
1.5
CYSi,ten
ocxT~
E
I,0
u ~
a.
O O
00
XX
Esa
ca
SO
0,5
~
0,0
lo
~x
e.
x~X X
O
.~~~-
20
30
40
t (h)
277
PROTEINA
INTRACELULAR
Aminocidos no
formadores de bases
PROTEINA
EXTRACELULAR
FI~7flEZZZZ4~NA
278
En la sntesis de las bases que forman RNA slo ceden tomos de carbono los que se han
- En la sntesis de bases del DNA, a partir de las bases del RNAm, se tiene en cuenta que
se produce el mismo consumo de nitrgeno que si se estuviese sintetizando RNA. Si bien,
se conoce que, en la formacin de DNA a partir de RNAm, se produce una transformacin
en la base nitrogenada, es decir, el uracilo que forma parte de los nucletidos del RNA, se
transforma en timina en el DNA, para lo que es necesario un aporte de carbono e
hidrgeno, que se supone que viene de la frente de carbono original empleada (sacarosa).
Adems, es necesaria la presencia de un intermedio reducido (IntRed) que realice la
reduccin para pasar la ribosa a desoxiribosa (ribonucictidos a desoxirribonucletidos).
Por tanto, el metabolismo del sustrato nitrogenado supone una estructuracin de este
componente en la biomasa, ya que es el citado compuesto nitrogenado el que produce
aminocidos y stos dan lugar a protenas y bases nitrogenadas, precursoras, de los cidos
nuccicos. Si se aplica lumping en el sistema, englobando aminocidos, bases del RNA y bases
del DNA en compuestos con frmulas moleculares medias del total de molculas que los
forman, las reaccIones globales, que tienen lugar en la ruta metablica del nitrgeno, se pueden
plantear las siguientes relaciones estequiomtrieas (ecuaciones de filiacin):
279
0,933C6U1~O6
1,4NH O,2l6NAD~0,ICoASH-t-ATP
7ZZ~
[6.15]
O,5C6H1,06
+ 2,2SNAD>
z~ C3 [-15503!V
2,25(NADH, H ~)
[6.16]
1.Or6HJ,06 qH5pNZ74NF~
3.5ATP3.5
WAP +0.2 EGT 3QHf~3N5P3
~
CqSLJI7PR7SNThP3 5.34k03.5(ADP+PP+3.5
IV>4D[-fl- Sp-
[6. 17]
L0W~H,O6 C3H5
503N+2,74N1-4 +3,5A TP3.5IN,4L1 +0,2 SGTI 3C101-112013N5P3zt
Q5J-I~ 75O~ ~75iV375P3
5,34H20+3,5(ADP+Pi) 3,5yN>4DHi- 5 ) +
[6.18]
O,2YGDPPO3C10H1=010N5P2
Sntesis de DNA (r5):
280
[6.19]
del sistema por aplicacin de una regresin lineal simple sin trmino independiente, de forma
individual.
dt
=0
[6.20]
R~A
puesto que
RRNAm
=r4r5
[6.21]
se obtiene:
[6.22]
dt
1?
[6.23]
aa~/ffi
281
puesto que
=r,r3 r4
[6.24]
se obtiene:
r,=
[6.25]
dcNR4>
r,
It
2,75r3 2,75 r4
[6.26]
dC VR
1,4
r1 3,75r3 3,75~
It
[6.27]
dC RNA =
[6.28]
It
dCD
[6.29]
It
=13~
It
282
dCPRE
dt
[6.30]
Se asume estado pseudoestacionario slo para RNAm (ecuaciones [6.201a [6.22], en este
caso no se supone esta simplificacin para los aminocidos no formadores de bases, por lo que
la velocidad de consumo de amonio vendr dada de forma diferente al modelo MCC- 1, mientras
que el resto de velocidades (para RNA, DNA y Protenas intracelulares) son las mismas que en el
caso anterior.
Para el amonio:
dC4+ =1,4r~
2,75r32,75r4 =1,4r,
~~2
2,75r3 2,75r5
[6.3 1]
It
Una vez propuestas las velocidades de produccin para cada componente clave es preciso
plantear estas ecuaciones en trminos de velocidades de reaccin, para ello se aplica la ecuacin
[6.8] para obtener de forma individual cada una de estas velocidades.
Simplificacin 1 (MCC-1):
[6.32]
frl.It#CppuCPRJ)+(CPE)
frs
It ~RNA
CRNO
[6.33]
fI
It .DNA CDO
[6.34]
283
Tanto rs corno r53 y rs5 vienen dadas de la misma forma que en MCC- 1, es decir por las
ecuaciones [6.32), [6.33] y [6.34], respectivamente.
La diferencia entre las dos simplificaciones la marca la ecuacin cintica r2. la cual viene
dada por la siguiente expresin obtenida al despejar de la ecuacin [6.31]:
S2
2,75.(CDNACDN#O
)+l,4( C~
1~
CItVO)+
C~I?I0))
[6.35]
La aplicacin de este mtodo a los datos experimentales obtenidos en este trabajo fUe
realizada en simple respuesta empleando el mtodo de integral, con una subrutina tipo
Simpson. Las funciones (f(Cj)) que se han probado para cada una de las velocidades de reaccin
han sido:
Para las ecuaciones r1, r3, y r5, (ecuaciones [6.32], [6.33] y [6.34], respectivamente),
vlidas tanto para MCC-l como para MCC-2, se han probado tres cinticas diferentes:
Potencial 1:
Potencial 2:
5 k, ~
C di = ~
[6.37]
Hiperblica:
5 k1 .Cj .
CN
CNK,
d=XV,1 (CjC1~
);p=
1 NR)
[6.38]
Para ri, calculada slo para la simplificacin 2 (MCC-2), como ya se ha indicado, se han
realizado ajustes con dos cinticas potenciales del tipo que indica la ecuacin [6.36] y la (6.37].
Debido a que todos los experimentos presentan resultados similares, se han elegido dos
experimentos como representativos para observar los resultados de la aplicacin de esta
metodologa, y para evitar alargar excesivamente el desarrollo de la exposicin de este capitulo.
284
probando las cinticas que se han indicado, se muestran en las Tablas 6.8 a 6.14, donde se
observan los valores obtenidos para los parmetros de cada una de las funciones probadas.
Todos los parmetros cumplen las restricciones estadsticas impuestas, se observa que el
valor de SRC (suma de residuos al cuadrado) es menor para las cinticas hiperblica y
potencial 2. Esto se corrobora observando que las formas de las curvas, tanto en forma integral
(Figuras 6.11 y 6.12), como derivadas (Figura 6.13 y 6.14) se asemejan mucho ms a la fUncin
que para el caso de la cintica potencial 1, cuya suma de residuos al cuadrado es mucho mayor.
Las Figuras 6.11 y 6.12 muestran los resultados, por tanto, para el valor de la integral de
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y el experimento n0 4 (340C y 257
r1 para el experimento n
p.p.m.), respectivamente. Las ecuaciones hiperblica y potencial 2 son las que permiten
obtener mejor resultado respecto al acercamiento de las curvas a la de la funcin.
En cuanto al valor de r
curva que corresponde a la ecuacin potencial 1 presenta una forma descendente, indicando
que no es posible considerar esta cintica en el modelo propuesto, mientras que las cinticas
hiperblica y potencial 2
principio, posible considerar cualquiera de las dos cinticas para el modelo cintico.
0 1.
Tabla 6.8.- Parmetros
cinticos
de
r1
calculados
por
ajuste
de
los
datos
del
experimento
n
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
experimentales: T=250 C, CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial) modelo de clula.
Valores de los paranietros
t Student
F Fischer
Cntica
SRC
Mix
k1 c
c~
pt
Ma
Obt.
Teor.
Obt.
flor.
k,=0,132
k=O.129
k,=O,126
4,3.l0~
2,086
925
4,35
0,92
k,=1,097
ko,977
k,=0.857
6,3.I0~
2,086
2432
4,35
0,23
2,093
3331
4,38
0,12
k1=0,035
K1=0,003
k,=O.028
K1~0,002
k1=0,021
K,=0,00i
8.1 i0
k
1 c
285
Tabla 6.9.- Parmetros cinticos de r1 calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
experimentales: T=280 C, CN257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los parametros
Cintica
Mx
c~
0< + k
Tabla 6.10.-
pt
0W.
k=0.150
I<~=0.148
i,iio~
2.074
1120
4,54
0,85
k,=0.44
k1=0.43
k1=0.45
8.3.10
2.074
1332
4.54
0.092
kft0.051
K1=0.O05
k1~0,050
K1=0.005
k1~0.049
K,=0,005
3.1102
2.080
2331
4,60
0,012
k ~
SRC
k0.152
Cintica
r Fiseber
t Student
Nlu
Xlx
pt
k,=0.315
o~
k,=0.704
1=0.195
k1=0.590
<jV
k, 0,450
K1 0,600
1=0.310
K1=0.390
K1
t Student
F Fiseher
SRC
Mm
Obt.
Teor.
Obt.
Teor.1
3
4,3.10~
6.3.
o
2.080
2,080
2432
4,35
k1=0,075
k1=0,470
925
435
15
2,086
3331
3.52
0,12
k,=O.170
K1=0,180
0.23
s..o
0
1 calculados
por
ajuste
de
los
datos
del
experimento
n
a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
4 en simple respuesta
0 C, Cre257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
experimentales:
T34
inicial) modelo de
clula.
Valores de los parmetros
Cintica
286
C..~ K
pt
F flscher
Mm
Obt.
Teor.
0W.
Teor.
SRC
k,=0.131
k,=0.O,11
4,310~
2,060
925
4.35
3.75
1=0,237
k1=0,150
k1=0,063
6.3.10~
2,060
2432
4,35
1.23
k=0.268
K1=0,093
k1=0.173
K,~0.063
k1=0.095
K,=0,033
8,1.10~
2.064
3331
3.52
0.82
kJO,143
c~
<~
Mx
t 5hdent
Tabla 6.12.- Parmetros cinticos de r calculados por ajuste de los datos del experimento n0
1 a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
2. en simple respuesta
0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
experimentales:
T=28
inicial), al modelo
de clula.
Mx
1 C\
~ c~
k1 <i~
(~ ~K,
pt
t Student
F Fiseher
Mm
0W.
Teor
DM
Teor.
5RC
k,=0.18
k,=0,131
k1=0.082
4.3.10~
211
925
4,38
2.95
k1=0.288
k~=O.lSO
k1=0.138
6.3.102
2 11
2432
4,38
0.55
k1=0.178
K1=0,066
k1=0.173
K1=0,063
k,=0.167
K,=0.060
8,lA0~
212
3,55
0,182
0
1 calculados por ajuste de los datos del experimento
n
Condiciones
2. en simple respuesta
0 C, a diferentes ecuaciones cinticas.
(210 r.p.m.
experimentales: T28
CNl3O p.p.ni de amonio, N= variable
inicial), a] modelo de clula.
Valores de los parametros
Mx
pt
Ma
Cintica
t Student
CM.
Teor.
F Fiseher
0W.
flor.
SRC
k1 c<
k1=0.900
k1=0.900
k1=0,900
2.102
2,069
925
3,68
1,3
k1 cj Ej
k1=5,830
k1~5.800
k,=5,770
410
2.069
1223
3,68
0.23
K1=0.010
k1=0,069
k=0.069
K,=0,010
k1=0,069
K1=0,010
3.102
2.074
1325
3,34
0.12
(i<+K
k1c~
Mix
pt
Ma
t Student
E Fiseher
CM.
flor.
CM.
flor.
SRC
=0.131
k1=0,131
k1=O,131
4,3.10~
2.080
955
4.30
0,72
=0.151
k1=0.l50
k~=0,149
6,3.10~
2,080
2432
4,30
0,11
k~=0.l73
ktO,173
k0J73
K,=0,063
K1=0,063
8,1.10~
2,086
3331
3,37
0,082
=0,063
287
0,30
1 IttEnc,a1 1
2 bn~c,ai 2
SI bpcrliolica
0.25-
--
--u-
3 -.
--
020u
0.15
/IP
0.10o
1
0,05
e
<u
,1
1-~-u- 4
0.00 u
lo
20
30
40
t(h)
50
60
Figura 6.11.- Evolucin mostrada por la integral de r1 con el tiempo para el experimento n0
2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes
cinticas y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0.8
20
30
40
50
(h)
Figura 6.12.- Evolucin mostrada por la integral r1 con el tiempo para el experimento n0 4,
realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
288
0014
0012
0010
oms
0036
0032
a,
lO
30
20
40
O,)
50
60
Figura 6.13.- Evolucin mostrada por rsi con el tiempo para el experimento n0 2,
realizado a 280C y 257 p.p.n. de amonio inicial probando diferentes cinticas
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
lO
20
30
40
50
t (h)
289
1 donde se observan los valores obtenidos para los parmetros dc cada una de las
fimoiones probadas. En todos los experimentos se superan los valores estadsticos tericos de lii
Student y de la E de Fischer, obtenindose valores significativamente bajos de SRC. La
cintica potencial 1 es la que muestra valores ms altos de la suma de residuos al cuadrado, lo
que indica que describe peor la forma de la funcin para r3, que las otras dos cinticas probadas.
Los resultados de la integral de r53 para cada uno de los experimentos tomados como
0 2 y n0 4), se muestran en las Figuras 6.15 y 6.16, mientras que
representativos (experimento n
la frmncin r
3. para dichos experimentos, aparecen en las Figuras 6.17 y 6.18. Donde se puede
observar algo similar a lo que ocurra con [a velocidad de reaccin r4 esto es, las cinticas que
-
t Student
E Fischer
5RC
Cintica
Mx
~<
k u, u ,~
A
290
~4i
pt
Mm
0W.
Teor.
0W.
Teor.
1.5.102
2.086
1120
4,35
0.28
1=0,223
7.3.10~
2.086
3332
4.35
0.08
k1=0.033
K1=0.033
4.1.10
2.093
4321
438
0.04
lq=O.O65
k,0.0348
k<0,004
k,=0.295
I<~=0.259
k0.035
K1=0.112
k1=0.0344
K1=0,0396
Tabla 6.16.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n0
2. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
experimentales: T280 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los parametros
t Student
E Fischer
Cintica
SRC
Mix
pt
Mm
Obt.
flor.
Obt.
flor.
1 c~
- Q
A1 ~
k=0,152
k1=0,045
k1=0,148
1,1.102
2,074
1120
4,54
1,8
k,=0,44
k1=0.129
k1=0,45
8,3.10
2.074
1332
4,54
0,92
k,=0,051
K1=0.005
k1=0,013
K1=0,080
k=0,049
K1=0,005
3,1.102
2,080
2331
4.60
0,012
t Student
E Fischer
Cintica
SRC
Mix
~>t
Ma
Oht.
flor.
Obt.
Teor.
1=0,052
k1=0,0408
k1=0,028
3,5.102
2,080
820
4,35
0,84
c~
k,=0.224
k1=0,124
k,=0,024
5.3.10~
2,080
1332
4.35
0.12
Cv4K,
k1=0,026
K1~0.076
k1=0.023
K1=0,074
k1=0,021
K1=0,073
7.l.I0~
2.086
5221
3,52
0.03
o
1
0
0
Tabla 6.18.- 4.
Parmetros
cinticos
de
r3
calculados
por
ajuste
de
los
datos
del
experimento
n
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas.
Condiciones
experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los paranietros
t Student
E Fiseher
Cintica
5RC
Mix
pt
Mm
Oht.
flor.
Obt.
Teor.
1 c~,
k1=0,039
k1=0,039
k1=0,039
1,2.10
2,060
725
4.35
2.5
k1 o, - (\,
k1=0,455
k1=0,454
k1=0,453
2.3.10
2,060
1536
4,35
022
k,=0,049
K1=0,057
k1=0,049
K1=0.057
k1=0,049
K[=0,057
4110
2,064
2325
3,52
0,43
(~ #1
29]
Mx
ti Q
pt
Obt
Teor.
Obt
Teor.
k,=O.039
k,=0.039
1,2.10
2,11
725
4.38
3.1
F,k1
Tabla 6.20.-
SRC
k1=O.454
k1=0,454
2.3.10
2,11
1536
4.38
0.22
kj0.049
k1=O.049
k1=0.049
4,1.10
2,12
2325
3,55
0.43
K~ 0,057
K~=0,057
K~=0.057
k
1=0.454
A, c~
E Fiseher
Mm
lc~=0,039
~<
t Studeut
Mix
k - c
k -o
pt
t Studeut
E Eischer
Mm
Obt.
Teor.
Oht.
Teor.
SRC
k~=O.O7l
k~=O.O7O
k,=0.070
3.10
2.069
725
3,68
0.98
-o
k~=O.l8O
k,=l.78
k~=l,76
i.io
2.069
1536
3.68
0,12
Lis
k=0.02I3
k~=0.0212
k=0,021
2.10
2.074
2325
3.34
0.03
(~ +K~
K1=O,0002
K1=0.0002
K1=0.0002
A
1 - ~--
Tabla 6.21.-
en
simple
respuesta
a diferentes
0 C, CN~475
p.p.m ecuaciones
de amonio, cinticas.
N variable Condicione~
(210 r.p.m
experimentales:
T28
inicial).
Cintica
Mix
t Studeat
014.
Teor.
E Fiseher
Oht.
Teor.
SRC
=-l
k -
k
1=0.0417
k - oY 0k. ~
292
k[ -
Y
-v
k1~0.0417
k,=0,0417
2.10
2.080
725
4,30
4,2
k,=O.395
k~=0,392
k1=0.289
3.10
2,080
1536
4,30
0.33
k,=0.019
K
1=O.002
k1=0,019
k1=0,019
410
2086
2325
3,37
0.11
K1=0.002
K~=0.O02
lO
20
30
t
Figura 6.15
40
60
50
(h)
para el experimento
Evolucin mostrada por la integral de r con el tiempo
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de 3amonio
inicial probando diferentes
ncinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
lO
20
30
40
50
(h)
Figura 6.16.- Evolucin mostrada por la integral de r
con el tiempo
el experimento
0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de 3amonio
inicial para
probando
diferentes
ncinticas y su comparacin con la funcin correspondiente.
t
293
0014
0012
0.01&
0.038
0.01>6
0.0)4
0032
lO
20
30
t(h)
40
50
60
Figura 6.17.- Evolucin mostrada por r53 con el tiempo para el experimento n0 2, realizado
a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente.
0.0116
0,004
0,092
O,cr~9
O
lO
20
30
ti
40
50
(h)
294
Las formas de las curvas para cada una de las cinticas, en comparacin con la
funcin se muestran en las Figuras 6.19 y 6.20 (para la integral de rs) y las Figuras 6.21 y
6.22 para r5 (derivada). Tal como ocurra en los dos casos anteriores se observa que las
cinticas que mejor describen la forma de la funcin (f(Cj)) son las correspondientes a la
ecuacin hiperblica y a la potencial 2.
Los resultados que se muestran, como en los casos anteriores, son los
0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y al experimento n0 4
correspondientes a 1 experimento n
(340C y 257 p.p.mj. Al igual que en las dos velocidades de reaccin anteriores los
resultados son similares para todos los experimentos, por lo que se muestran unos resultados
representativos.
t Student
E Fiseher
Cntica
SRC
Mix
k~=0,l52
k, ~,
pt
Mm
Oht.
Teor.
014.
Teor.
1=0,0922
k10,148
4.1.102
2,086
850
4,35
0.11
0~
k1=044
k~=0.348
k,=0.45
5.3.10
2086
2232
4.35
0,075
C1~K1
k1=0,060
1<~=0.058
k1=0,060
K1=0,058
k1-=0,060
K10,0
5,1.10
2,093
5241
4,38
0.03
295
t 5tudent
E Fischer
Ma
Obt.
Teor.
Obt.
Teor.
k,=O.0168
k,=0.148
i..104
2,074
1120
4.54
SRC
0,8
k,=0,175
k,=0,45
g.s.io
2,074
1332
4.54
0.19
k,=0.0214
K1=0.0075
k,=0,049
K1=0,005
3,1.10
2,080
2331
4.60
0.01
Cintica
ti
k,=0.152
Ej
0.44
k=o.oss
K1=0,005
~+K
1
Cintica
~
~
t Student
0W.
Teor.
E Fischer
Oht.
Teor.
SRC
=0.057
k,=0,057
k,=0,057
2,1.10
2.080
1750
4.35
0,23
=0.179
k,=0.178
k,=0,176
3.3.10
2.080
3232
4,35
0,08
kO.037
K=0,087
k~0.037
K,~0,087
k0,037
K
1=0,037
6.1.10
2.086
4241
3.52
0.025
A>
296
<.~
CV>KI
y Fischer
Mm
Obt.
Teor.
Obt.
Teor.
2,1.10
2.060
3078
4.35
SRC
1.4
1=0.629
3.3.10
2,060
3282
4.35
0.11
k,=0.078
K,=0.063
7.1.10
2.064
2241
3,52
0.12
pt
Cintica
c~
t Student
k=0.057
k,=0.054
k,=0,051
lt=O629
k,=0,629
k,=0,078
I<,=0,063
k=0.078
K,=0,063
Tabla 6.26.- Parmetros cinticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 5. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T280 C, CN65 p.p.m de amonio, N~ variable (210 r.p.m.
inicial).
Cintica
k=0.054
ti u
A1
u~
1 +K~
t Student
0W.
Teor.
F Fiseher
Oht.
Teor.
SRC
k
1=0.054
k1=0.054
2.1.10
2080
3078
4,30
3.4
k=0.629
k=0,629
k~0,629
3,3.I0~
toso
3282
4,43
0,8
k,=0,078
K,=O,063
k,=0,078
i(,=0,063
k1=0,078
K,=0,063
7,1.10
2,086
2241
32,37
0,5
297
3
-
1 Rflo~4 1
2 R,t~,&a1 2
-
3 H~,al~lica
-u
~1----
0,3-
1
gro
0.2
1
0. 1
1
1
<1.
<~
--a>.
0.0
O
lo
20
30
40
60
50
(h)
Figura 6.19.- Evolucin mostrada por la integral de r5 con el tiempo para el experimento
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
uy su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
035
Jr~
lO
20
30
40
50
(h)
Figura 6.20.- Evolucin mostrada por la integral de r
5 con elprobando
tiempo para
el experimento
0 2, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio
diferentes
cinticas
n
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
298
lO
20
30
ti
40
(h)
50
60
0,0100
1 Potenca 1
2Potendaj 2
3 H~potIca
0,0075
1-te
0,0050
0,0025
0,0030
lO
20
t(h)
30
40
50
Figura 6.22.- Evolucin mostrada por r55 con el tiempo para el experimento n0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
299
de reaccin para determinar las cinticas que pueden ser aplicadas en el modelo planteado, se
muestran en las Tablas 6.29 a 6.35, donde se pueden observar los valores obtenidos para los
parmetros de cada una de las funciones probadas, en este caso slo potenciales, as como los
valores estadsticos de dichos parmetros. Como puede apreciarse, la cintica que permite
obtener mejor resultado es la potencial 1, es decir, la que viene en funcin slo de la
concentracin de nitrgeno, pues como puede apreciarse en las tablas, en la cintica potencial
2, el valor del parmetro obtenido (k2) para muchos de los experimentos incluye cl cero en su
intervalo de confianza y la suma de residuos al cuadrado tiene valores significativamente mas
altos en todos los experimentos, que los obtenidos con la ecuacin cintica potencial 1.
Las Figuras 6.23 y 6.24 muestran las evoluciones de las curvas para la integral de la
0
ecuacin r2 para los experimentos que se han tomado a modo de ejemplo (experimentos n
2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y n0 4 (340C y 257 p.p.m.). Las Figuras 6.25 y 6.26,
muestran estos mismos resultados para la ecuacin correspondiente a r
2, para los
0 2 y n0 4, respectivamente. En estas ltimas figuras se puede apreciar la
experimentos u
clara diferencia entre las dos cinticas potenciales probadas para esta ecuacin, siendo
significativamente mejor la obtenida con la ecuacin potencial 1.
Cintica
1< u
<
300
Ej
u~
k=0.580
k>=0,091
k=0.250
t Student
014.
Teor.
Obt.
E Eischer
Teor.
SRC
1=0.088
1.1.102
2,086
1221
2.2
0.5
k=-0.080
42,1
2,086
825
3.25
1,7
Tabla 6.30.- Parmetros cinticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento
0 2 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinticas. Condiciones
nexperimentales: T~280 C, CN257 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los parmetros
Cintica
t,
~> u~- cj
Mix
k,~0,152
k,=0,440
t Studeot
E Fiseher
pt
Mm
Oht.
flor.
Obt. k
Teor.
SRC
1=0,0168
k,~0,148
3,1.102
2.074
1120
2.080
0.18
k1=0.175
k,=-0,090
2,074
83,5
2,086
1.95
62.5
t Student
E Eischer
Cintica
SRC
pt
Mm
Obt
flor
Oht
Teor.
1=0,055
k,=0,048
1110
2060
1225
4,35
0,5
k1~0,631
k,=0,259
352
2060
3251
4,35
2,3
Mix
t - y
o - y,
k~=0.061
k,=1.521
30]
t Student
Cintica
XIx
Mm
014.
k <y
k> =0.560
k>=0,350
k>=0,140
i,i.i03
2,11
552
4.38
0,2
3S0
8.3.102
2,11
875
4.38
7,2
k,=l,250
kL=O.
o,
o,
k
1=2.140
~Teor.
E Fischer
0W. jnor.
Nlx
=0,158
ko-o
k=1.47
t Stndent
E Eischer
pt
Mm
Obt.
Teor.
Oht. 1
Teor.
SRC
1=0,125
k,=0,092
ij.o~
2.069
878
3,68
0,23
k=0,69
k>=0.19
25,3
2.069
325
3.68
3,5
302
iO
20
40
30
t
50
60
(h)
Figura 6.23.- Evolucin mostrada por la integral de r2 con el tiempo para el experimento
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas
n
y su comparacin con la funcin correspondiente a protenas.
0,150
0,125
0, l03 -
r, ~
a~o
a(25
0,030
o
io
20
30
t
40
50
(h)
303
0,
(>035
0,030
0.025
0+
0,020
(9,015
0,0>0
0,C05
0(1190
lO
20
30
ti
40
(h)
Figura 6.25.- Evolucin mostrada por r52 con el tiempo para el experimento no 2, realizado
0C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinticas y su
acomparacin
28
con la funcin correspondiente a protenas.
016
0,14
0,12
0,10
0.08
0,06
0.04
0.02
0.09
O
lO
20
30
t
40
50
(h)
304
Se ha observado que las ecuaciones reacciones cinticas r1, r3 y r5 (vlidas tanto para
el modelo MCC-l como para el MCC-2), presentan mejores resultados con ecuaciones
cinticas de tipo hiperblico (ecuacin [6.38]) o tipo potencial 2 (ecuacin [6.37]), no
siendo posible discriminar mediante criterios estadsticos cul de las dos ecuaciones puede
ser la ms adecuada para el modelo planteado. Por este tipo de criterio se ha desechado la
ecuacin potencial 1 (ecuacin
[6.361)
r2
305
Las ecuaciones cinticas a probar en primer lugar sern las de tipo potencial 2, de
acuerdo a lo visto en el apartado anterior y vienen dadas por las siguientes expresiones:
A, C,- - CV
= A,
-
[6.39]
[6.40]
Los parmetros obtenidos, por ajuste al MCC-1 con cinticas dadas por las
0 1 realizado a 250C y 257 p.p.m.,
ecuaciones [6.39] a [6.41], para el experimento n
cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.36), si bien presentan un valor de
SRC (suma de residuos al cuadrado) relativamente alto, indicativo de que la reproduccin
de datos experimentales es poco aceptable, tal como puede comprobarse, a la vista de la
evolucin de componentes, en la Figura 6.27.
4). los valores fisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.39,
donde se aprecia que se cumplen las condiciones estadsticas tericas, y en la Figura 6.30
muestra, a diferencia de los experimentos anteriores una buena reproduccin
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-1 con cinticas potenciales para el
experimento n0 7 realizado a 28C y 475 p.p.m., tambin cumplen las restricciones
estadsticas impuestas (Tabla 6.42) pero no penniten una buena reproduccin de los datos
experimentales, tal como muestra la Figura 6.33.
307
Tabla 6.36.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T=250 C, CN~=25I p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Valores de los parametros
Parmetro
t Student
Mx
pt
Mm
0,129
0,129
0,129
l,i.i03
0,169
0,149
0,129
7,l.l0~
y
0,714
0,706
de Student (95% confianzar 2,080
E de Fischer (95% de confianzaft 2,49
0,697
2,3.102
.5
Anulo
A
7
O
RN
Iixx~a
F Fischer
377,2
SRC= 4.3
1,0
0000
~AAA
uO,Q~7
~
50
e.
-
10
20
30
1~~~
40
50
60
t (ti)
Figura 6.27.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (250C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
308
Tabla 6.37.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: Th280 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
t de
1~
t(h)
Figura 6.28.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
309
Tabla 6.38.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: Th310 U, CN=257 p.p.ni de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Valores de los parmetros
Parametro
t Student
Mx
pt
Mm
0,098
0,088
0,078
1,1.102
0,014
0,012
0,010
5,i.i03
0,317
0,315
de Student ( 95% confianzaft 2,080
E de Fischer ( 95% dc confianzat 2,49
0,313
l,3.10~
F Fscher
573,25
SRC= 1,05
(12
lO
20
30
40
1(h)
Figura 6.29.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (310C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
310
Tabla 6.39.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (216 r.p.m. inicial), al modelo MCCI.
t Student
Mix
pt
Mm
0,226
0,176
0.126
0,255
0,247
0,239
0,0759
0,0759
de Student (95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de con fianza)= 2,49
F Fiscber
3,1.l0~
~7,1.10
361,5
0,0759
2,3.10~SRC= 0,85
1,2
Lo
QS
Q4
-
00 O
lO
30
20
40
50
t(b)
Figura 6.30.- Evoluciones0 de
los ycomponente
delamonio
sistemainicial)
obtenidos
por MCC-1.
ajuste del
4 (340C
257 p.p.m. de
al modelo
experimento n
311
Tabla 6.40.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
Mm
0,580
0,577
0,574
3,1.10~
0,818
0,804
0,790
7,1.10~
1,375
1,375
Student ( 95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
1,375
2,3.102
de
F Fiseher
92,33
SRC= 4,11
0,8
Amiio
RN~
DN~
l1r~a
u
a
~.
04-
(12
<
A~A
A
-
-v
00
O
lo
20
30
40
50
60
t(li)
Figura 6.31.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-1.
312
Tabla 6.4 1.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: Th280 U, CN=l30 p.p.m de amonio,
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
Mo
0,286
0,23
0,174
8,1.10
0,326
0,324
0,322
2,l.10~
0,761
0,761
de Student (95% conflanzay 2,O&O
F de Eischer ( 95% de confianza 2,49
0,761
5,9.10~
F Fiseher
723,75
SRC= 0,92
10
20
30
t
40
50
60
(h)
Figura 6.32.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 oc y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
313
Tabla 6.42.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=475 p.p.ni de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
Valores de los parametros
Parmetro
1 Student
Mx
pt
Mm
0.052
0,0414
0,030
1,1.102
0,057
0,054
0,051
7,l.10~
0,294
0,294
0,294
1,9.l0~
F Fiseher
382,15
SRC= 0,62
25
1
O
lO
20
30
40
50
t (h)
Figura 6.33.- Evoluciones de los componente del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-!.
314
MCC-3
En este caso, el modelo MCC-3, se consideran 4 respuestas y 4 parmetros. El ajuste
es realizado empleando regresin no lineal en mltiple respuesta de la forma ya indicada.
Los resultados del ajuste a este modelo se muestran a continuacin.
316
El ajuste de los datos expernentales al MCC-3 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n0 5 realizado a 28C y 65 p.p.m., muestra que los parmetros
obtenidos cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.47) pero no se
consigue una buena reproduccin de los datos experimentales, tal como muestra la Figura
6.38, probablemente debido a que, en este experimento, la estequjometria supuesta no debe
ser cierta en este caso.
El ajuste del experimento n 6, realizado a 28C y 130 p.p.m., muestra que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas, como se muestra en la
Tabla 6.48, y reproduce de forma adecuada la evolucin de los componentes del sistema
con el MCC-3, tal como indica la Figura 6.39.
podra estar
produciendo un cierto efecto txico en las clulas, por lo que existira una cierta inhibicin
del crecimiento del microorganismo.
317
Tabla 6.43.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: Th250 C, Crc257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
t Siudent
Mix
pt
0,577
0,547
0,162
0,234
F Fiseher
Mm
0,517
2,2.l0~
0,151
0,140
i,i.03
0,225
0,216
1,2.l0~
0,040
0,035
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Fiseher ( 95% de confianza 2,49
0,030
3,2.10~
1823,1
SRC= 0,088
-o
-t
Q)
(h)
Figura 6.34.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (25 0C y257 p.p.ni. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
318
Tabla 6.44.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
t Stiident
Mx
pt
Ma
0,573
0,57
0,567
5,2.10~
0,155
0,152
0,149
4,l.10~
0,200
0,199
0,197
2,2.10~
0,040
0,038
de Student (95%confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
0,036
8,2.10~
F Fiseher
2725,1
SRC= 0,060
(5
60
t(h)
Figura 6.35.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
319
Tabla 6.45.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: Th310 C,
p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
C~~257
t Student
Mix
pt
Mm
0.378
0,375
0,371
3,2.10~
0,104
0,103
0,102
3.1.10~
0,148
0,147
0,146
1,2.l0~
0.054
0,052
de Student ( 95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
0,050
5,2.l0~
F Fiseher
3825,1
SRC= 0,008
1,25
1,00
0,75
0,50
o
025
0,00
20
t (Ii)
Figura 6.36.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
320
Tabla 6.46.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
0,229
0,221
0,213
2,2.l0~
0,083
0,082
0,081
s,i.io4
0,112
0,112
0,112
8,2.10~
0,024
0,022
de Student (95% confianza 2,080
F de Fiseher ( 95% de confianza 2,49
0,020
7,2.l0~
F Fiseher
Mm
3895,1
SRC= 0,03 1
nE
e
(h)
Figura 6.37.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
321
Tabla 6.47.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: Th280 C, C~65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
Parmetro
pt
0,614
0,610
0.606
2,2.l0~
0,185
0,182
0,178
5,1.10
0,206
0,066
0.202
0,065
0.198
0.064
3,2.l0~
7,2.l0~
F Fiseher
Mm
Mx
325,1
SRC= 1,89
2,49
5
u
30
t(h)
Figura 6.38.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
322
Tabla 6.48.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CNl3O p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
t Student -
Mx
Opt
Mm
0,591
0,571
0,551
2,2.l0~
0,141
0,141
0,141
,.o4
0,195
0,195
0,195
1,2.lO~
0,042
0,039
tde Student (95% confianza 2,080
F de Fischer ( 95% de confianza 2,49
0,035
3,2.102
F Fiseher
986,2
SRC= 0,75
1~
60
t
(h)
Figura 6.30.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
323
Tabla 6.49.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, Ge475 p.p.m de amonio, N=
variable <210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
t Student
Mx
pt
Mm
0,613
0,610
0,607
2,2.102
0,184
0,182
0,180
s,.o~
0,212
0,202
0,192
3,2.10~
0,067
0.065
0,062
7.2.l0~
F Fischer
295,1
SRC= 0,75
Ee
o
2)
(h)
Figura 6.40.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3.
324
MCC-4
En este caso, el modelo considera 4 respuestas y 7 parmetros, debido a las cinticas
supuestas en cada velocidad reaccin, es decir las reacciones r1,
it3
950o
componentes del sistema, tanto los valores tericos como los reproducidos por el MCC-4,
mostrndose el buen ajuste entre ambos.
Para el experimento realizado a 310C y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
n0 3), los valores fisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.52,
donde se aprecia que los valores tericos de t de Student y F de Fisclier son superados en
todos los casos, y la Figura 6.43 muestra la buena reproduccin de los datos
experimentales obtenidos para este experimento con el MCC-4.
325
Mo co Cintico de Clula
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-4 con las cinticas probadas en esta
caso para el experimento n0 5 realizado a 280C y 65 p.p.m., tambin cumplen las
restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.54) pero no permiten una buena reproduccin
de los datos experimentales, tal como ocurra con el modelo anterior a ste, y se muestra
en la Figura 6.45.
326
o
Tabla 6.50.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n 1.
Condiciones experimentales: T250 C, CN~2S7 p.p.nl de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
t Student
Mx
pt
0,11
3,1.1O~
0,005
0,045
0,005
0,044
0,005
0,043
7,8.l0~
7,1.10~
0,049
0,048
0,047
6,2.10~
0,076
2,3.10~
0,0802
0,0801
0,080
5.102
0,05
5,23.10~
F Fiseher
Mm
2225,3
SRC= 0,09 1
1,75
1,50
1,25
1,00
e
0,75
0,50
025
0,00
t (Ii)
Figura 6.41.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1(25 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
327
Tabla 6.51.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u0 2.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al MCC-4.
Valores de los parmetros
Parn etro
t Student
Mix
pt
0,10
9,2.10~
0,133
0,131
0,128
8,8.i03
0,203
0,203
0,203
l,i.i04
0,047
0,049
0,048
4,2.10~
0,039
1,12.102
0,12
0,112
0,10
2.119
0,054
de Student ( 95% confianza> 2,12
F de Fischer ( 95% de confianza> 2,66
F Fiseher
Mm
3825,3
2.23.102
SRC= 0,055
60
t (h)
Figura 6.42.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 2 (28 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
328
Tabla 6.52.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T310 C, C,~257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
F Fiseher
Mm
0,102
s,i.io~
0,069
0,069
0,069
6,8.10~
0,022
0,022
0,022
2,l.10~
0,475
0,0513
0,0511
7,2.10~
0,0411
1,5.l0~
0,11
0,11
0,11
6.2.10~
0,113
5,23.10~
14825,3
SRC= 0,0045
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
40
t (h)
Figura 6.43.- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del experimento
n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
329
Tabla 6.53.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
0,106
3,1.1O~
0.002
0,002
0,002
2,8.l0~
0,036
0,036
0,036
,i.o4
0,0503
0,0502
0,0501
2.2.10~
0,0542
0,0541
0,054
4,2.l0~
8.23.10~
F Fiseher
Mm
0,058
1131.3
SRC= 0,061
75
1,50
.25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
O
lO
20
30
40
t(h)
Figura 6.44.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
330
Tabla 6.54.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 5.
Condiciones experimentales: T2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
t Student
Mx
pt
Mm
0,133
0,131
0,129
3,1.102
0,112
0,11
0,11
2,8.10~
0,029
0,026
0,023
1,1.10~
0,037
2,2.102
0,0479
0,0478
0,0477
4,2. o3
0,099
0,099
0,099
5,1.10~
0,07
0,07
0,07
8,2.102
F Fiseher
135,3
SI4C= 2,18
fi
e!
30
t
(ti)
Figura 6.45.- Evolucin de los componentes del sistema obtenidos porajuste del experimento
n0 5 (28 0C y 65 p.p.n. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
33
Tabla 6.55.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento u0 6.
Condiciones experimentales: Th280 C, C\130 p. n.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), a] modelo MCC-4.
t Student
M
Mx
pt
0,152
0,150
0,148
3,1.10
0,090
0,089
0,088
7,gJ93
0,029
0,029
0,029
7,1.l0~
0,039
0,035
0,033
6,2.l0~
0,06
0,06
0,06
2,3.10~
0,083
0,080
0,077
3.102
0,05
5,23.10~
Fischer
Mm
1925,3
SRC= 0,52
30
60
t (ti)
Figura 6.46.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
332
Tabla 6.56.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, C,r475 p.p.m de amonio, N= variable
(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
Kl
t Student
Mx
pt
0,130
0,130
0,130
3,1.10~
0,112
0,11
0,10
2,8.10~
0,026
0,026
0,026
i,1.104
0,037
0,037
0,037
2,2.10~
0,0478
0,0478
0,0478
4,2.10~
0,100
0,099
0,07
0,098
4
5,i.i0
8,23.10~
F Fiseher
Mm
185,3
SRC= 0,95
1,75
1
t(h)
Figura 6.47.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7(28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
333
El modelo considera, al igual que en los dos casos anteriores, 4 respuestas, pero
consta de 5 parmetros. El ajuste es realizado empleando regresin no lineal en mltiple
respuesta. Los resultados del ajuste a este modelo (MCC-5) se muestran a continuacin.
0 5 (28C, 65 p.p.m. de
En este caso no se va a considerar el experimento n
amonio), pues como ya se ha visto no se obtienen buenas reproducciones de los datos
experimentales con ninguno de los modelos anteriores, debido, probablemente, a que la
estequiometra supuesta no es vlida para esta concentracin tan baja de amonio.
El ajuste del experimento n0 1 (250C y 257 p.p.nt) al MCC-5 permite la obtencin
de los parmetros que se indican en la Tabla 6.57. Los parmetros obtenidos por ajuste al
modelo superan los valores tericos de la t de Student y la F de Fischer obtenindose una
adecuada reproduccin de los datos experimentales (Figura 6.48), muy similar a los dos
modelos anteriores (MCC-3 y MCC-4).
4), los valores tisicos y estadsticos de los parmetros se muestran en la Tabla 6.60,
Para el experimento n0 6, realizado a 280C y 130 p.p.ni., se puede observar que los
parmetros obtenidos cumplen las condiciones estadsticas tericas (Tabla 6.61). El MCC5 permite, tambin para este experimento, la reproduccin de forma adecuada los datos de
este experimento, tal como indica la Figura 6.52.
Los parmetros obtenidos por ajuste al MCC-5 para el experimento n0 7 realizado a
280C y 475 p.p.m., cumplen las restricciones estadsticas impuestas (Tabla 6.62) la
reproduccin es aceptable (Figura 6.53), como ocurra en el caso anterior, pero peor si la
comparamos con el resto de experimentos, lo que parece confirmar el ya citado efecto
txico del amonio a elevadas concentraciones.
335
Tabla 6.57.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T250 C, CN=2S7 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-S.
t Student
Mx
pt
Mo
0,101
0,101
0,101
3,l.l0~
0,02
0,02
0,02
4,2.l0~
0,189
0,189
0,189
,.o5
0,200
0,200
0,048
0,200
l,12.l0~
5,23.l0~
1? Fiseher
1525.3
SRC= 0,15
1,75
1,50
1,25
-4
11)0
0,75
e
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.48.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
336
del experimento n0 2.
Tabla 6.58.- Parmetros calculados por ajuste de los datos
C,
C~=257
p.p.m
de amonio, N=
Condiciones experimentales: T=280
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
t Student
Mix
pt
Mm
0,102
0,102
0,102
0,183
0,182
0,181
0,080
0,080
0,080
3,1.l0~
0,119
0,119
0,119
2,12.l0~
0,0384
0,0382
0,0300
8,23.l0~
F Fiseher
2,2.10~
2325,3
SRC= 0,102
t (ti)
Figura 6.49.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (28 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5.
337
Tabla 6.59.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T=310 C, CN=257 p.pan de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
t Student
Mx
pt
Mm
0,080
0.080
0,080
9,l.1O~
0,0640
0,0639
0,0638
5,3.l0~
0,119
0,119
0,119
2,1.lO~
0,1702
0,1701
0,1700
3.I2.10~
0,0949
l,23.10~
SRC= 0,010
F Fiseher
3985,3
ffi
.4
20
40
t (ti)
Figura 6.50.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
338
Tabla 6.60.- Paranietros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: Th340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
t Student
Mx
pt
Mm
0,10
0,10
0,10
5,l.i05
0,0459
0,0458
0,0457
8,3.10~
0,113
0,113
0,113
9,1.10~
0,16
0,16
0,16
7,2.10~
0,0775
0,0773
0,0772
4,23.10~
1 Fiseher
2112,8
SRC= 0,12
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
0,75
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.51.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento no 4 (34 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
339
Tabla 6.61.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 C, CN=13O p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
Valores de los parmetros
Parmetro
Mx
pt
Mm
0,105
0,10
0,095
3,l.l0~
0,045
0,042
0,039
4,2.l0~
0,302
04302
0,302
i,i.o~
0,440
0,440
0,440
l.12.l0~
0,0553
0,0553
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Eischer ( 95% de confianza 2,49
0,0553
5,23.l0~
F Fischer
t Student
1125,3
SRC= 0,96
O.
0.50
025
O.
30
60
t (ti)
Figura 6.52.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-5..
340
Tabla 6.62.- Parmetros calculados por ajuste de los datos de] experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
Kl
t Student
Mx
pt
Mm
0,102
0,10
0,098
5,i.i03
0,063
0,062
0,061
5,3.l0~
0,199
0,199
0,199
2,1.10~
0,201
0,200
0,199
3,2.10~
0,059
F Fiseher
211,8
5,23.102
SRC=1,2
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
0,75
0,50
0,25
0,00
t (ti)
34
342
Para el experimento n0
por ajuste al MCC-6 son mostrados en la Tabla 6.67, donde se puede apreciar que superan
los valores tericos de la t de Student y de la F de Fischer. La reproduccin de los datos
experimentales con el MCC-6 es significativamente buena, tal como indica la Figura 6.58.
343
Tabla 6.63.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.
Condiciones experimentales: T250 (2, C~=257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-6.
Kl
Kl5
t Student
Mx
pt
Mo
0,673
0,67
0,667
2,2.l0~
0,0311
0,0311
0,0311
2,5.l0~
0,045
0,045
0,045
3,2.l0~
0,0575
0.0572
0.0569
2,1.l0~
0,085
0.085
0,085
9,3.l0~
0,044
7,23.102
F Fiseher
1921,3
SRC= 0,11
(ti)
60
344
Tabla 6.64.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T280 (2, (2NC57 p.p.ni de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial> al modelo M(2(2-6.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mix
pt
Mm
0,302
0,30
0,298
2,2.10~
0,018
0,018
0,018
7,50~
0.0502
0,05
0,05
l,2.10~
0,039
0,039
0,039
3,3.10~
0,11
0,11
0,11
5,3.l0~
0,078
0,076
0,074
5,3.102
F Fiseher
1989,3
SR(2= 0,095
175
1.50
125
-4
1,00
E
u
0,75
0,50
0,25
0,00
O
t
Figura
(ti)
6.55.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 2 (2S 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2(2-6.
345
Tabla 6.65.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 3.
Condiciones experimentales: T310 (2, CN=257 p.p.m de amonio, N=
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
t Student
Mx
pt
Mm
0,402
0,401
0.400
4,2.10~
0,018
0,018
0,018
,5.i04
0,051
0,051
0,051
5,2.10~
0,036
0,036
0,036
7.2.10~
0,11
0,11
0,11
6.3.10~
0,076
1,23.102
F Fiseher
3899,3
SRC= 0,005
1,75
1,50
1,25
1,00
E
u
0,75
0,50
0,25
0,00
t (ti)
Figura 6.56.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 3 (31 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MC(2-6..
346
Tabla 6.66.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.
Condiciones experimentales: T=340 (2, (2r~e2S7 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
t Student
Mx
pt
Mm
0,54
0,53
0,52
3,2.l0~
0,0173
0,0172
0,0171
2,7.10~
0,05
0,05
0,05
4,3.10~
0,0359
0,0359
0,0359
5,3.l0~
0,103
0,10
0,101
4,3.l0~
0,0604
9,23.l0~
F Fiseber
3911,2
SR(2= 0,011
1,25
u.
t(b)
Figura 6.57.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 4 (34 0(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo M(2C-6..
347
Tabla 6.67.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.
Condiciones experimentales: T280 (2, (2N=130 p.p.m de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo MC(2-6.
t Student
0,801
0,800
2,2.l0~
0.0271
0,0270
2,5.l0~
0,042
0,042
3,2.l0~
0,054
0.054
0,054
2,.10~
0.079
0.079
0,079
9,3.l0~
0,036
0,035
0,034
7,23.102
F Fiseher
1399,3
SRC= 0,894
1 flO
-4
0.75
0.50
u
025
ono
t (ti)
Figura 6.58.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
348
n o 7.
Tabla 6.68.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento
p.p.m de amonio,
Condiciones experimentales: T~280 (2, (2N475
variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
1(3
t Student
Mm
Opt
0,532
0,531
0,017
F Fischer
0,530
3,2.I0~
0,017
0,017
2,7.10~
0,055
0,05
0,05
4,3.1O~
0,03595
0,0359
0,3585
5,3.10~
0,10
0,10
0,10
4,3.10~
0,0604
9,23.10~
611.2
SR(2= 0,93
13
1,50
1,25
1,00
n
e
0,75
0,50
0,25
0,00
t(h)
Figura 6.59.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento
349
En el apanado anterior se han mostrado los ajustes de los datos experimentales a los
diferentes modelos propuestos para el crecimiento de la bacteria Xanthomonas campestris, a
continuacin se va a tratar de seleccionar el modelo de acuerdo a los criterios antes
comentados.
Entre los dos esquemas de reaccin simplificados propuestos, que corresponden a los
modelos MCC-l y MCC-2, se ha observado que el primero no permite obtener una
reproduccin de las velocidades de produccin de los diferentes componentes clave de los
distintos experimentos realizados, por lo cual el citado modelo ha sido descartado segn un
criterio estadstico, considerando que el valor de SRC es significativamente alto, lo que se
traduce en una mala reproduccin de los datos experimentales de todos los experimentos
ajustados con el MCC- 1Para MCC-2. se plantearon diferentes posibilidades en funcin de las ecuaciones
cinticas probadas en rl, r3 y r5. La velocidad r2, en todos los modelos ha sido potencial 1,
pues, como ya se vi, parece ser la nica cintica con la que se obtienen parmetros con
valores estadsticos aceptables.
As pues, se realiz el ajuste con distintas suposiciones en las cinticas de estas
reacciones, tal como se ha indicado en el apanado anterior. Se han propuesto as cuatro
modelos, cuyas velocidades de produccin corresponden a la indicada para la simplificacin
2 (MCC-2), pero variando las cinticas de las velocidades de reaccin y efectuando diversas
combinaciones entre ellas <MCC-3, MCC-4, MCC-5 y MCC). Como se ha podido
apreciar, estos cuatro modelos permiten, para todos los experimentos, obtener unos
parmetros con valores estadsticos significativamente buenos. En todos los casos, los
valores estadsticos de los parmetros obtenidos superan los valores tericos de F dc Fischer
y de t de Student, obtenindose en todos los casos unos
estrechos. Por otro lado, los valores de SRC (suma de residuos al cuadrado) parecen ser
3S0
Tabla 6. 69.- Valores de SRC (suma de residuos al cuadrado) obtenidos en los ajustes a
diferentes modelos de clula para cada uno de los experimentos realizados.
MCC-3
0,088
0,060
0,008
0,030
0,075
0,750
MCC-4
0,091
0,055
0,005
0,061
0,520
0,950
MCC-5
0,150
0,102
0,010
0,120
0,960
1,200
MCC-6
0,110
0,095
0,005
0,011
0,894
0,930
35
SRC significativamente inferiores a los obtenidos con MCC-3, a pasar de que sera de
esperar un mejor ajuste debido a que este modelo dispone de ms grados de libertad. Los
valores de la suma de residuos al cuadrado, presentados en la Tabla 6.69, son muy
semejantes entre ambos modelos, solo se obtiene un valor inferior de SRC respecto al
modelo MCC-3 para el experimento n06, en el resto, son superiores a los presentados por el
MCC-3.
En vista de esto, se podra discernir entre ambos modelos decantndonos por el
MCC-3, no obstante y dado la similitud en los valores de suma de residuos al cuadrado se
van a comparar los cuatro modelos mediante criterios fsicos, por si estos pudieran aportar
datos para llegar a una conclusin ms clara.
352
Como ya ha sido expuesto, este modelo consta de cuatro parmetros, debido a las
cinticas potenciales supuestas en este caso. En las Figura 6.60 se muestran las evoluciones
de los parmetros correspondientes a cada una de las velocidades de reaccin.
353
temperatura, mientras que el parmetro del denominador K1, presenta una tendencia
pasando por un mximo, como se indica en la Figura 6.61 a.
y5
presentan
tendencias similares con la variable en ambos casos, tal como indica la Figura 6.61b y
6.61c; se puede asumir que tanto los parmetros del numerador como del denominador de la
ecuacin cintica correspondiente no varan con [a temperatura.
354
aprecia en
similar a una hiprbola invertida. Funcin muy diferente a la obtenida en los modelos
anteriores y poco explicable
De nuevo puede afirmarse que los modelos MCC-5 y MCC-6 no aportan nada sobre
el MCC-3, ya que [a variacin dc parmetros con la temperatura es ms razonable en [os
modelos MCC-3 y MCC-4.
355
0 6
-i
:61
vi.
06
________________________
:4
26
II
60
TOTIVCntIta
1
~1
3 6161
-0
SO
II
60
[oir cntira
(03<
420-j
630.]
0101
O
6.
0.100440.
:6
SO
lo
1.011, criC
Ienhientllra
Figura 6.60.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-3 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad r~
ti) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad y5
d) parmetro para la velocidad r2
356
0,12
u
ojo
0,08
~1
0,08-
.--...
~~~>-
//Y
11,040.024
0.00-
26
28
30
32
34
Tenperatra
0.12
ti
0.10
O .08
o .i
.04
0.02
090
36
24
28
311
32
renperawa
34
020
0.1 11
0.10-
0,05
0.00-
Tenvedira
0.03
23
16
SO
30
32
34
TeripcriC ir a
Figura 6.61.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
Temperatura.
14.:J o
26
-A &
5
25
iJ
4.140.]
~
-a/0<
4>
<O
or\-g--r
- - -
0.456
0,454
.025
4.4>0
14>
54
4
54
CflpOriCiiriI
036
304=11-
44=4-
t
---
-~- -
:8
24
.
..-.-,4
34
42
34
>4.25
11
.4>
4-
2-8
si
4---
4.
44
28
cnt
u-a
62
64
-a--O
0-Ii
~-61
2
~0
0.015
u
1,
4.06 0-
2-..
44425-
24
28
14
44
Icnpert ura
Figura 6.62.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MC(2-5 con la
Temperatura.
a) parmetro para la velocidad ~L
ti) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5
358
-.
0
0.8
0?
0.6
.5
~ :731
>4.-sn
0.2-]
0.!
0.0
28
26
33
30
34
Tcnpetittra
006-
004
3 0
000
lenvenhira
0.00,
-A 4
--A
-.
0.04
0.02
4400 24
26
28
.--.
30
32
34
1cnpcitta
0. Co
44015A
4.050 -
0.025
24
28
28
30
32
34
Tenpera ira
Figura 6.63.- Variacin dc los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
Temperatura.
Como se aprecia en la Figura 6.67, la tendencia de todos los parmetros del modelo
es constante, es decir, el valor de los parmetros no cambia significativamente con la
concentracin inicial de amonio, al igual que en los casos anteriores.
360
4< 08.-
~..
.
L____
.--~
.4
.4 4
4.3 -
410.440
24>0
300
404
400
CM(P.P.m)
:1
6,
45.
II
0.2
4,1
4-4
=040
II O
300
400
44>0
C~(pp.m)
0.4
[r,7
4>..
4.6
0.4
0.4
0.3
_________
02 0.
0.400
=00
300
400
600
C<ppno)
0,
rn4
0.20
d
4.45
0-lo
0.05
0-., 10
=00
400
304>
500
no)
Figura 6.64.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-3 con la
concentracin inicial de amonio.
6 6
ti
Ajo
-
1
<i~1
i-~-
- -~
-~
.9-
:4444
44>44
4444
440
4>
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4444
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11
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444
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4,4)50
--4>
240
44
=00
-4>44>
6<44>
4? ~6.9pm>
-
Figura 6.65.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-4 con la
concentracin inicial de amonto.
a) parmetro para la velocidad r1
b) parmetro para la velocidad r3
c) parmetro para la velocidad r5
d) parmetro para la velocidad r2
362
0=4
<0
a
4>35
~
4.14>
e-
<0
4.140
404>
40
304>
400
4030
C>4ppm)
4.50
415
4>
4.3,
4434
4=44
0.35
0,44>
44.45
441.
440
200
44>0
4410
400,
9.03,
<--4
446
0.5
3--
4>-;
0.2
0.4
0.0
400
200
3110
400
500
C~<p.p.m)
-E 4>,
442
d
0.4
230
400
4303
500
4440
C%(P.P.J30)
Figura 6.66.- Variacin de tos parmetros del modelo cintico de clula M(2C-5 con la
concentracin inicial de amonio.
b) parmetro para la velocidad r3
a) parmetro para la velocidad r1
d) parmetro para la velocidad r2
c) parmetro para la velocidad r5
363
I-.k>
-
a
4-~~~~~24-
.7
114>4
44>>>
y
_ a-
ti
<5
~
A-
A
A
4444
4<>
=41<>
4444>
4=4
$4144
-.
Liii
4=41
c
--A-
40
.,--.4<
- A
0--~
--1
454-44
2450
44,1
lOO
-400
6<34=
4>2
.418
-c
41.410
.5
44.44=
240
46
300
400
444
p no~
Figura 6.67.- Variacin de los parmetros del modelo cintico de clula MCC-6 con la
concentracin inicial de amomo.
a) parmetro para [a velocidad rj
b) parmetros pata la velocidad r3
c) parmetros para la velocidad r5
364
A pesar de que todos los modelos presentan una tendencia aceptable de los
parmetros con las variables, hay que destacar que el MCC-6 presenta el parmetro
correspondiente a r2 con una tendencia con la temperatura que no parece muy clara. El
MCC-~5, en la variacin de parmetros con el amonio presenta mnimos para r3 y r5, lo cual
no parece ser muy lgico.
Hay que recordar que ambos modelos poseen un nmero ms elevado de parmetros
que el MCC-3, en cambio los valores de SRC eran mayores y, como se acaba de ver, la
evolucin de parmetros de estos modelos con las variables no es indicativa de que se
mejore el resultado obtenido con MCC-3 y MCC-4.
Por tanto, y debido a que se ha optado por el MCC-3, se pueden plantear ahora
parmetros como funciones de la temperatura para este modelo. Las funciones se pueden
obtener por observacin de la forma de las curvas de la Figura 6.62; tanto k3 como
presentaban una tendencia constante con la variable, mientras que r2 parece responder a una
funcin tipo Ratkowsky, y r1 una variacin lineal descendente, de la siguiente forma:
365
k1(T) = C1
[6.42]
~2 ~
k3(T) = C3
k3(T)
[6.43]
C5
[6.44]
[6.45]
T,ica))i)~
A lo largo del apartado anterior se han ido exponiendo los resultados obtenidos al
aplicar diferentes modelos para la descripcin del crecimiento de Xanthornonas can-ipestris.
Se ha decidido discriminar el MCC-3 frente al resto de los modelos planteados, los cuales
tambin permitan obtener buenos resultados en
la reproduccin de
los datos
366
(280
inicial, son
[6.46]
dC
de
18 (6
-
[6.47]
/70,5
/03,5
-
491/6
)2,75
486,4
368
Tabla 6.70.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: T=280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al MCC-3
Valores de los parmetros
t Student
0,59
0,58
7,1.102
0,158
0,155
7,1.10~
0,25
0,24
9,8.10~
0,05
0,049
7,3.10~
F Fischer
2430
SRC= 0,025
t(h)
Figura 6.68.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-3,
con cambio en la estequlometra de los componentes.
369
Tabla 6.71.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.
Condiciones experimentales: 1=280 C, CN=S p.p.m de amonio, N variable
(210 r.p.m. inicial), al MCC-4.
Valores de los parmetros
Parmetro
t Student
Mx
pt
0,089
0,088
0,088
y,i.io~
0,014
0,013
0.012
5,3.lO~
0,083
0,082
0,081
9,1.l0~
0,052
0,052
0,052
8,5.l0~
0,171
0,17
0,169
6,2.l0~
0,095
0,095
0,095
9,1.1 o~
0.013
0,013
de Student ( 95% confianzar 2,080
F de Fiseher ( 95%de confianza 2,49
0.013
6.23.10~
F Fiseber
Mm
4430
SRC~ 0,012
125
J
1,00 .4
-4
A
y
Anunio
RNA
DNA
Pruteina
non~a
0,75-~
.s u
1.
030-
OtO
0,25-
0,00
20
30
40
~~1
50
60
t (h)
Figura 6.69.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento it 5 (28 ~C y 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4
con cambio en la estequiometra de los componentes.
370
eMejora del ajuste del experimento n0 7 (28~ C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
Como ya ha sido expuesto anteriormente, para el experimento realizado con una
concentracin inicial de amonio de 475 p.p.m., se obtenan valores estadsticos
significativamente buenos de los parmetros y una aceptable reproduccin de los datos
experimentales con los modelos MCC-3 y MCC-4, esto es, los que parece que mejor
describen el crecimiento de la bacteria. No obstante, si comparamos las reproducciones
obtenidas por ajuste a los citados modelos con las obtenidas para el resto de experimentos,
se puede observar que la reproduccin de los datos experimentales de este experimento es
significativamente peor.
Una explicacin a lo observado, podra ser el efecto txico del amonio para el
crecimiento del microorganismo a partir de cierta concentracin. En la literatura aparecen
referencias sobre el efecto txico de este compuesto en el crecimiento de microorganismos
(Cid y col., 1996).
ch
14C5
dC~
Fji_.c
tt
LK-c?8
:.
[6.48]
678 =
1
k/ (C~
Csc))jCx
:.
C~ =C~
[6.49]
tt
La
(p
<ip~~~
)k1
67.-Vc
[6.50]
(CNG),
pero para comprobar este efecto inhibitorio se ha supuesto que este valor es de 350 p.p.m
de amonio.
1 que es la constante de
inhibicin por amonio. Los valores estadsticos de los parmetros superan los valores
tericos de t de Student y F de Fischer. En la Figura 6,70 se muestra la reproduccin de las
velocidades de los componentes del sistema. Si se compara con la Figura 6.40,
correspondiente al ajuste de este mismo experimento con el MCCI, se observa la clara
mejora obtenida al considerar el trmino de inhibicin.
Para el ajuste con el modelo MCC-4, los valores de los parmetros obtenidos se
muestran en la Tabla 6.73, Los valores estadsticos de los parmetros superan los tericos
de la t de Student y de la E de Fisclier. La Figura 6.71 muestra de nuevo la clara mejora en
la reproduccin de los datos experimentales al incluir el trmino de inhibicin por sustrato,
al comparar con la Figura 6.47 correspondiente al ajuste realizado con este mismo modelo
(MCC-4) sin considerar la inhibicin por sustrato. Adems se consigue un significativo
descenso del valor de SRC.
372
Tabla 6.72.- Parmetros calculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.
Condiciones experimentales: T280 C, C,e475 p.p.n de amonio, N
variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3 con trmino de Inhibicin.
t Student
Mix
pt
Mm
0,53
0,52
0,51
2,1.10~
0,154
0,15
0,147
8,2.10~
0,22
0,19
0,16
5,2.102
0,055
0,05
0,045
9,3.102
0,081
0,08
de Student ( 95% confianza 2,080
E de Fischer ( 95% de confianza 2,49
0,079
F Fiseher
4635,3
SRC= 0,05
1,75
1,50
1,25
1,00
1~
0,75
0,50
0,25
0,00
50
t (b)
Figura 6.70.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC4,
con trmino de inhibicin.
373
t Student
Mx
pt
Mm
0,122
0,121
0,12
5,.104
0,102
0,101
0,10
7,1.10~
0,022
0,020
0,018
3,1.l0~
0,045
0.045
0,045
5,2.l0~
0,08
0,08
0,08
9,2.10~
0,082
0,078
0,074
3,1.l0~
0,05
9,23.l0~
0,067
9,5 io~
K
1
0,067
0,067
de Student ( 95%conflanzat 2,93
E de Eischer ( 95% de confianza 2,54
F Fiseher
5635,3
SRC= 0,042
1.75
1,50
1,25
1,00
0,75
o
u
0.50
0,25
0,00
50
t(h)
Figura 6.71.- Evoluciones 0 de
los0Ccomponentes
7 (28
y 475 p.p.m.del
de sistema
amonio obtenidos por ajuste del
inicial) al modelo MCC4,
experimento
n inhibicin.
con trmino de
374
Es necesario ahora unir este modelo de clula -el cual permite predecir cambios en la
composicin del medio considerando el metabolismo del nitrgeno estructurado en la
biomasa (DNA, RNA y protenas)- con el modelo cintico metablico, el cual aport
resultados muy buenos para la parte correspondiente a produccin del polisacrido, tal como
se vi en el Captulo 5 de la presente Memoria.
375
rico
Los modelos ms complejos vistos hasta ahora han sido los modelos de clula, con los
que poda realizarse una buena descripcin del crecimiento del microorganismo teniendo en
cuenta la evolucin de una serie de componentes intracelulares que constituyen la biomasa del
mismo. En la literatura existe escasa informacin sobre este tipo de modelos, solo se han
realizado intentos por describir el crecimiento utilizando estos modelos sobre sistemas muy
conocidos como Escherichia
377
A pesar de las grandes ventajas que pueden ofrecer los modelos qumicamente
estructurados, no existe en la literatura ningn precedente en la lnea indicada. La modelizacin
ms compleja vista hasta ahora se ha quedado al nivel de modelos de clula, donde tampoco
existen muchos trabajos. y donde se realiza nicamente, como ya se ha comentado, la
estimacin de parmetros sin ajuste de datos experimentales.
378
Cx
[7.!]
4.
Para el azcar:
1
5,94 dCp
923,2 di
1C~
~180L
di
Velocidades
de
Produccin
<j
12 K4C0, Cx ji
dC~
Yv~
d~
3.5818
[7.2]
Para el producto:
dC1.
di
Para la evolucin de oxigeno disuelto:
923,2
dr
923,2
di
~y
+I<LCIV
C
Y
Co
Ecuaciones
Cinticas
1
12
.(cc0, )~
Cx
l~
k4C0,
K,, C0,
[731
L~
7A 7?!
1+4
$~ 8+4
dCx
di
>ox
[7.5]
1
NN
[7.6]
3~~8~447P)
l+4Y;p j
TPP
ji
Co,
yrp
Parmetros
con la
Temperatura
094-
(7
-19,45)11-
[7.7]
[7.8]
Li TPP~34
<(7)
[7.4]
exp<l,399
. IT
[7.9]
- 34,24))112
[7.10]
<(7) = 2,913+2,0487
[7.11]
[7.121
= L340+(6
,/ . 10)T
[7.13]
379
dCD4tA
<It
RNA
+
tt
[7.14]
tt
RNA
[7.15]
di
Velocidades
DNA
de
dc /~j4.\,.j
Produccin
y.
[7.16]
dr
Protenas intracelulares
dCPPJ=y1~ dC~~
tt
di
[7.17]
Para el amonio:
dC~~4. =1811,4
dt
1$
12
,..,
103,5
136,5
<3
478,6
275
[7.19]
C,~
[7.20]
1,490,0367
kg1)
Parmetros
con la
Temperatura
380
CN
=k2
k~(T)
0,150
k~(T)=0.198
k,(77)
[7.18]
C.C
r3 =Ic~ C~ C<
Ecuaciones
Cinticas
~)
491,;
[7.21]
[7.22]
[7.23]
[7.24]
[7.25]
[7.26]
Se realizar, por tanto, la unin de los dos modelos de este tipo que ya han sido
aplicados en el presente trabajo. Al unir ambos modelos, la parte correspondiente a biomasa del
modelo metablico (ecuacin [7.1]) queda ahora desglosada en las expresiones del modelo
cintico de clula (ecuaciones [7.14] a [7.17]). Adems, es necesario cambiar el trmino
correspondiente al rendimiento de azcar en biomasa(Yxs) de la ecuacin
[7.2],
dC8
5,94
dr 180< 923,2
0,933<
136,5
dCl,
dr
1
kjC0
(1
12 Ki + C0, Cx .[I~3.58j3s8+
,> 0,5<
)-.-
103,5
1,08<
491,87
J,12.(
~
~.
Y,~JJJ
486,7
[7.27]
de los dos
modelos citados, cuyos valores de parmetros ya haban sido obtenidos por ajuste de datos
experimentales. Por otro lado, el abordaje matemtico de un modelo de este tipo, con tan
elevado nmero de parmetros, sera muy complejo.
381
Tabla 7.3.- Valor de los parmetros en funcin de la temperatura empleados para el Modelo
Qumicamente Estructurado.
kIT,)
y0~ IYD
2,9 13 + 2,048 T
= 0,150
<(7)
0,198
k,(T)={0,041(T-21)fI-exp(0.352(T-3S,O8))]
382
[7.28]
[7.29]
[7.30]
[7.31]
[7.32]
[7.33]
[7.34]
[7.35]
Estructurado.
En las Figuras 7. 1 y 7.2 se muestran los resultados de las reproducciones con ambos
modelos para el experimento u0 1, llevado a cabo a 250 C y con 257 p.p.m. de amonio
inicial. En la Figura 7.1 se comparan estos resultados para la evolucin de la biomasa y de
amonio. Se puede apreciar que el MQE (lnea continua) predice una concentracin de
biomasa en la fase estacionaria algo inferior a la obtenida con el MMET. Adems, se
observa la clara mejoria que introduce el MQE en la reproduccin de la evolucin de
amonio. En la Figura 7.2 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de
formacin de xantano, de consumo de azcar y evolucin de oxgeno disuelto. En la citada
figura se puede ver que el MQE predice una concentracin de xantano inferior a la que
predice el MMET, con lo que se explica la menor velocidad de consumo de azcar y
oxgeno con este modelo en comparacin con el modelo metablico. Estas diferencias son
seguramente debidas a la inferior cantidad de biomasa que predice el MQE.
En las Figuras 7.3 y 7.4 se muestran estos mismos resultados para el experimento
u0 2, realizado a 280 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.3 se observa
que MQE (lnea continua), de nuevo, predice una concentracin de biomasa en la fase
estacionaria de crecimiento algo inferior a la obtenida con el MMET, no siendo as durante
la fase exponencial. Adems se observa la mejor reproduccin de la evolucin de amonio
introducida por el MQE. En la Figura 7.4 aparece la reproduccin con ambos modelos de la
velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la evolucin de oxgeno
disuelto. El MQE predice tambin en este caso una concentracin de xantano ms baja que
la que se obtiene con el MIPvIIET y, en consecuencia, una menor velocidad de consumo de
azcar y oxgeno.
383
En las Figuras 7.7 y 7.8 se muestran estos mismos resultados con el experimento n0
4, llevado a cabo a 340 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.7 se puede
ver que no hay diferencias significativas en la evolucin de biomasa que predicen ambos
modelos; sin embargo, hay cierta diferencia, como se ha ido viendo, en la reproduccin de
la evolucin de amonio introducida por el MQE. En la Figura 7.8 aparece La reproduccin
con ambos modelos de la velocidad de formacin de xantano, de consumo de azcar y la
evolucin de oxgeno disuelto. Se puede apreciar que apenas hay diferencias en la evolucin
de estos componentes en los dos modelos que se estn comparando.
En las Figuras 7.9 y 7.10 se muestran las reproducciones de los datos experimentales
para el experimento n0 5, realizado a 280 C y con 65 p.p.m. de amonio inicial. Hay que
destacar que, en este caso, se emplea el cambio de estcquiometra para el amonio (ecuacin
[6.47]), que ya fue visto en el capitulo anterior. En la Figura 7.9 se observa que la biomasa
obtenida con el MQE es significativamente menor que la obtenida con e] MMET. En la
Figura 7.10 aparece la reproduccin con ambos modelos de la velocidad de formacin de
xantano, de consumo de azcar yla evolucin de oxigeno disuelto, observndose que
tambin la produccin de xantano es menor en el caso del MQE que en el MMET, lo que de
nuevo parece relacionado con la infraestmacin de biomasa.
384
Si bien las diferencias en las reproducciones de los datos de cada uno de los
experimentos no son muy significativas, se observa que el modelo qumicamente
estructurado predice, salvo en el experimento
polisacrido. Esto parece ser debido a que la biomasa que predice el MQE es tambin
inferior a la que predice el MIEMy a la obtenida experimentalmente. Como ya se ha visto, la
curva de evolucin de biomasa obtenida con el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado es, en casi todos los experimentos, inferior a la obtenida con el Modelo
Cintico Metablico. Esta pequefla diferencia en la biomasa es la que provoca, por tanto, la
diferencia en la prediccin de algunos otros componentes (xantano y azcar) en la parte
correspondiente a la produccin.
385
2,0
1,0
0,5
Ox)
60
t(h)
Figura 7.1- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
25
40
2.0
15
.4
ti.
1.0 t
=9
5
05
0~O
O
lO
20
40
30
50
60
(h)
386
~0
1,2
1,0
.4
=9
uz
0,6
0,4
0,2
0,0
30
60
t(h)
Figura 7.3- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
2,5
2,0
(5.
lo ~
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
t (h)
387
=9
=9
u
t(b)
Figura 7.5- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio de]
experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado (lnea continua).
45
2,5
2,0
-4
(1
-4
1,0
=9
0,5
0,0
03
2,0
1,5
5
.4
=9
0,5
O. O
lO
20
30
40
t(h)
2,5
2,0
I,5~
t.
(5lo
0,5
0,0
t (h)
2.0
c~
.5
1.0
I~
0.5
0.0
tu
I0
20
30
t
40
50
60
(h)
2,5
z0
5;
(5-
t
toQ=
cts
QO
t (h)
390
2,0
1.5
1,0
=9
6<
0.5
0,0
60
t(h)
2,5
2,0
1,5
(5.
.4
=9
1,0
0,5
0,0
t(h)
391
2,0
5
.4
lO
20
30
40
t(h)
Figura 7.13- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.ni. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico ([inea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado <lnea continua).
2,5
40
24
35
30
E5
25
20
rs
I5
CF
lo.
cts
00
O
lO
20
30
40
50
L (h>
Puede ser que el microorganismo, segn las condiciones en las que se realice el
proceso. acumule otro compuesto intracelularmente, probablemente hidratos de carbono, los
cuales no han sido analizados experimentalmente. De esta forma, segn Las condiciones a
las que se haya realizado la fermentacin, la diferencia entre la biomasa terica (suma de
DNA, RNA y protenas intracelulares) y la experimental puede ser mayor o menor.
cIC~
dt
dt
dt
tt
Q%~.
[7.36]
+kHc
393
En la Tabla 7.4 se muestran los valores obtenidos del parmetro kHc por ajuste en
mltiple respuesta con el modelo MQE para cada uno de los experimentos realizados en este
trabajo.
Tabla 7.4.- Valor del parmetro kuc obtenido por ajuste del MQE a los datos de los
experimentos llevados a cabo en este trabajo.
Panmetro
t Student
________________
Experimento
Max.
4
4.2. 0
302.10
1.51.10
7717101
Opt.
To
3.0110
TIbio
Mm
Obt.
TTif5,1.i0~
Teor
2.9
2,92
Tbi0t5IO~
1,49.10~
4.2.1O~
2.73
l,52.Iff
?,51.lO~
6,1.10
3.25
2,7.I0~
2,71.10
2,71.10
5,1W
2,70
2,8.10~
2,8.10~
2,8.10~
7,2.10~
2,92
3.21.10 3.2.10
3,19.10
2.2.10~
2,9
Por tanto, se concluye que al incluir el trmino de hidratos de carbono como otro
componente ms de la biomasa se mejora significativamente la reproduccin de los datos
experimentales con el Modelo Qumicamente Estructurado.
394
2,0
1,5
1,0
-4
=9
6<
0,5
0,0
lO
20
30
40
50
60
t(h)
Figura 7.15- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 1 (25 C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
2.5
2.0
1.5;
(3.
t.
4.59
1.0
.s
u
0.5
0.0
lO
20
30
40
50
60
t (ti)
395
2.0
5 LO
.4
0,5
0.0
60
t(h)
2,5
2,0
1<
(5.
=9
IOy
cf
0,5
0,0
lO
20
30
40
50
60
tQ,)
396
5
.4
.59
.5
lO
20
30
40
t(h)
Figura 7.19- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
2,5
2,0
l,5
4.59
CF
0,5
10
-y-
20
0,0
30
40
t (ti)
2.5
2,0
5
.59
.4
0,5
0.0
t(l)
Figura 7.21- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea continua).
2.5
2,0
I,59
ci.
.4
1,0 ~
.59
u
0,5
0,0
(lii
2,5
2.0-
.5
1.0-
r~4f~.~
0.0
n9mp
.-
lo
mp
20
30
50
40
60
2,5
a;;
a;,
4Q4
2,0
30u.
LS;
20 J
u
4
AA
..
lO-,
e
0
a
A
nfl..-&
o
1>
.A........A--
10
20
30
40
50
60
ao
jo,)
Figura 7.24. - Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxgeno disuelto del experimento n0 5 (28 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
399
2,5
u
2.0
cf
tt
=9 1,0
6<
U.U
0.SJ
0,0
-<l
1~
lo
20
30
40
50
60
t(h)
Figura
7.25-
2,5
40
35
2,0
30
(Y
1,5
25
-4
=9
cf
20
5.
lo
0,5
5
0,0
10
20
30
40
50
60
400
2.5
5
=9
6<
lO
20
30
40
t(h)
Figura 7.27- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de biomasa y amonio del
experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) entre el Modelo
Cintico Metablico (lnea discontinua) y el Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con el tnnino de hidratos de carbono (lnea continua).
2,5
2,0
ti
(Y
u
A
0
A.
0
AA A
10
20
-r
30
40
50
QO
60
o,)
Figura 7.28.- Comparacin de la reproduccin de la evolucin de sacarosa, xantano y
oxigeno disuelto del experimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial)
entre el Modelo Cintico Metablico (lnea discontnua) y el Modelo Cintico
Qumicamente Estructurado con el trmino de hidratos de carbono (lnea
continua).
401
En la Figura 730 aparece representada la evolucin del parmetro kHc con respecto a
la concentracin inicial de amonio. Como se puede apreciar, se puede asumir, que la
tendencia es a un valor ms o menos constante, como indica la lnea discontinua.
Por tanto, el Modelo Qumicamente Estructurado viene dado por las ecuaciones
[7.15]
402
[7.36]
e--Kl.
24
26
28
30
32
34
Tenperaura
Figura 7.29.- Variacin del parmetro kHc del Modelo Cintico Qumicamente
Estructurado con la Temperatura.
u
e
co
1
z
It
-J
loo
200
300
400
500
S(Ppm)
Figura 7.30.- Variacin del parmetro kHc del Modelo Cintico
Estructurado con la concentracin inicial de amonio.
Qumicamente
403
Una vez planteado el modelo MQE definitivo, con los valores de los parmetros en
funcin de la temperatura, se puede emplear para realizar simulacin de distintas
operaciones. Como ya se ha comentado a lo largo de esta Memoria, las simulaciones
permiten
404
Aunque solo se muestra la evolucin de biomasa, no hay que olvidar que sta es, en
realidad, la suma de componentes intracelulares: DNA, RNA, protenas intracelulares e
hidratos de carbono, cuyas evoluciones con el tiempo de fermentacin pueden ser predichas
con este modelo.
405
2.5
2,
1,5
4
=9
4
o
0,5
o.,
t
(h)
45
40
35
30
Clave
Ce..,
1~
C.c 70 pprfl
ZC,.c200ppm
3 C,.
0.250ppm
~25c~J,.
220-
C,
Cp
00
cf 5lo
3
5
2.
o
20
40
80
t(h)
60
406
2,5
25
20
Y
5
o
lOO
t (h)
Por tanto, se puede concluir que el modelo qumicamente estructurado permite una
adecuada prediccin del proceso de produccin de xantano. De la misma manera que ya
fue vista para el modelo cintico metablico, el MQE permite una adecuada reproduccin
de la evolucin del consumo de azcar, produccin de xantano y de la evolucin del
oxgeno disuelto Se obtiene una significativa mejora en la prediccin de la evolucin del
sustrato nitrogenado, gracias a la estructuracin de este compuesto en el crecimiento del
microorganismo.
Parece necesario, por tanto, estructurar el metabolismo, tanto del sustrato carbonado
(en el modelo cintico metablico) y como del sustrato nitrogenado (modelo cintico de
clula), tanto en la parte correspondiente al crecimiento como en la produccin del
producto de inters industrial, con el fin de predecir la influencia de cienos cambios que,
de otra forma, no seria posible llevar a cabo.
407
408
16
14
12
lo-.
ti
6
4
&at&WT paaTnoSpartCWfl
2 Siwu]aoT
o-
t*n~s ga1eI~
50
lOO
150
200
250
300
350
400
450
500
C~
4 (p.p.nv)
409
Resumen y Conclusiones
8.1- RESUMEN
En el presente trabajo de investigacin se ha llevado a cabo el desarrollo de modelos
cinticos de diferente grado de complejidad para observar su capacidad de describir la
influencia
por la Ingeniera Quimica en el campo del desarrollo y aplicacin de los modelos cinticos
de redes complejas de reacciones.
Resumen y Conclusiones
disoluciones, una elevada viscosidad en un amplio intervalo de condiciones, incluso con
una baja concentracin de polisacrido.
agitacin, etc.), as como la composicin del medio a emplear en el proceso (Santos, 1993).
Asimismo, se ha observado la influencia de las citadas condiciones de operacin en las
propiedades del producto obtenido (reologa de sus disoluciones, peso molecular y
contenidos en acetato y piruvato) (Casas y Col.. 1999).
Resumen y Conclusiones
pseudoestacionario para componentes como el ATP y los cofactores. Se proponen
relaciones estequiomtricas simplificadas considerando que el sustrato carbonado se emplea
para la sntesis de xantano y para el mantenimiento del microorganismo en estado viable,
principalmente
Las reacciones que tienen lugar dentro de los microorganismos para que se produzca
el crecimiento o reproduccin de los mismos, se han considerado aisladamente, proponiendo
un Modelo Cintico de Clula; es decir, se ha desarrollado un modelo en el que no se tiene
en cuenta la parte correspondiente a la produccin de xantano, sino nicamente la parte
correspondiente al crecimiento, considerando la biomasa microbiana constituida por
componentes intracelulares como son protenas y cidos nucleicos (RNA y DNA),
proponiendo un esquema de reaccin simplificado. Se considera adems que parte de las
protenas que produce el microorganismo van a ser secretadas al medio, esto es son
protenas extracelulares.
Resumen y Conclusiones
sido las optimadas previamente, como ya se ha comentado: un caudal de aire de 1 L/Lmin:
un pH inicial de 7, no siendo controlado durante la fermentacin; perfil de agitacin con una
velocidad dc 210 r.p.m., variable a lo largo del tiempo (Santos 1993, Garca-Ochoa y col.,
1997). Como fuente de carbono se ha empleado sacarosa en concentracin de 40 g/L y el
medio de produccin usado ha sido el propuesto por Garca-Ochoa y col. (1992) como
ptimo para La produccin de xantano. Las variables estudiadas en el trabajo experimental
han sido la temperatura (25. 28, 31 y 34 oc) y la concentracin del nutriente
nitrogenado (amonio: 65, 130, 257 y 475 p.p.m.) en el medio de produccin, ya que en
estudios previos se ha observado que ambas variables influyen en la evolucin del sistema,
incluso con la presencia de un mximo en la produccin de xantano.
Se llev a cabo el ajuste de Los datos experimento a experimento con este modelo,
obtenindose valores de los parmetros para cada uno de dichos experimentos. Los citados
valores son capaces de describir de forma satisfactoria la evolucin de la biomasa, el
sustrato carbonado y el producto en todos los casos, pero la descripcin de la evolucin de
oxigeno disuelto y la prediccin del consumo del sustrato nitrogenado obtenidos no son
aceptables. La simplicidad de este modelo hace que presente varias deficiencias, ya que con
l no es posible tener en cuenta las influencias en la produccin de xantano ni del oxigeno
disuelto, ni de la cantidad de sustrato nitrogenado suministrado al sistema y, adems, los
parmetros obtenidos mediante este modelo no son relacionables con la temperatura. Por
tanto, este modelo sencillo parece til nicamente para la descripcin de experimentos
aislados.
las rutas metablicas por las que transcurre el proceso. Es decir, en este modelo se realiza la
estructuracin del metabolismo del sustrato carbonado en una serie de reacciones, el sustrato
nitrogenado no se estructura y, al igual que en el modelo anterior, no es considerado como
respuesta en el esquema de reaccin. El modelo consta de relaciones estequiomtricas
414
Resumen y Conclusiones
definidas que consideran la produccin de xantano (ecuacin [5.1]), el catabolismo total de
la glucosa (ecuacin [5.5]), la fosforilacin oxidativa (ecuacin [5.6]) y la energa necesaria
para el mantenimiento del microorganismo en estado viable (ecuacin [5.7]). Para
compuestos como ATP y Cofactores se realiza la suposicin de estado pseudoestacionario,
ya que no han sido medidos.
El modelo metablico es capaz de describir la evolucin de todos los componentes
ajustados (biomasa, sustrato carbonado, xantano y oxgeno disuelto) de forma satisfactoria;
sin embargo, la prediccin de la evolucin del sustrato nitrogenado no es buena, debido a
que se emplean las mismas ecuaciones para la descripcin del crecimiento que en el modelo
anterior, como ya se ha comentado. En cuanto a la influencia de las variables en los
parmetros, con este modelo ha sido posible proponer expresiones en funcin de la
temperatura de los parmetros presentes en la parte que se haba desarrollado. Asimismo,
este modelo es capaz de predecir la influencia en la produccin y en el consumo del sustrato
carbonado de cambios en la transferencia de oxgeno (variaciones en la agitacin o en el
caudal de aire suministrado) en el sistema, ya que en las citadas relaciones estequiomtricas
aparece el oxgeno como un reactante ms y ste est incluido en las ecuaciones cinticas
propuestas. ya que se considera como nutriente limitante del proceso. La influencia de la
concentracin inicial de sustrato nitrogenado en la produccin no se puede tener en cuenta
con este modelo ya que describe el crecimiento de forma muy simplificada.
Para el planteamiento del Modelo Cintico de Clula fue necesario el desarrollo de
metodologa debido a que en la literatura no se encontraron antecedentes de modelos de este
tipo para el sistema de produccin de xantano; y aunque existen para otros sistemas, los
parmetros no se calculan por ajuste de datos experimentales.
Resumen
Conclusiones
con una elevada precisin y rapidez. En este sentido, es necesario realizar un especial
esfuerzo para la conversin de los datos obtenidos por esta tcnica (datos cualitativos o
semicuantitativos) en datos cuantitativos (necesarios para la aplicacin de los modelos
cinticos), obteniendo curvas patrn, empleando otra tcnica de fluorescencia para el
calibrado: Espectrofluorimetria. En el presente trabajo se ha desarrollado un procedimiento
para el anlisis cuantitativo de protenas intracelulares, RNA y DNA, mediante tincin con
fluorforos especficos (Isotiocianato de Fluorescena e loduro de Propidio) y su posterior
anlisis en el citmetro de flujo.
de los componentes
Una vez planteados los posibles esquemas de reaccin, es necesario conocer qu tipo
de ecuaciones cinticas son las ms apropiadas en cada caso. El mtodo empleado para
determinar qu expresiones cinticas pueden ser utilizadas ha sido el mtodo de las
velocidades de reaccin (Garca-Ochoa y Romero, 1993), en el que se pueden aislar las
citadas expresiones cinticas siempre que el nmero de componentes clave del sistema
coincida con el nmero de relaciones independientes, es decir, que la matriz de los
coeficientes estequiomtricos sea cuadrada. En todos los casos, se probaron ecuaciones
tanto tipo potencial de primer y segundo orden como tipo hiperblico o Monod. Los
resultados de aplicar el mtodo de velocidades de reaccin sobre las dos simplificaciones
416
Resumen y Conclusiones
propuestas llevaron a plantear una cintica de primer orden para la velocidad de reaccin de
aminocidos formadores de bases, y cinticas de segundo orden e hiperblicas para el resto
de las velocidades de reaccin.
microorganismo
con otra
composicin en
Resumen y Conclusiones
Este modelo cintico de clula presenta una evolucin coherente de los parmetros
con las variables estudiadas. Con la concentracin de nitrgeno, la tendencia de todos los
parmetros es a un valor constante, con la temperatura pueden ser ajustados a diferentes
funciones, por tanto se puede obtener un modelo de clula en funcin de la temperatura.
Con ello, es posible tener un modelo cintico que explique la influencia, tanto en
crecimiento como en produccin, de variables como la temperatura o cambios en la
composicin del medio, sobre la evolucin de los principales componentes del sistema, algo
sin precedentes en la literatura.
4/8
Resumen y Conclusiones
8.2.- CONCLUSIONES
dCx
di
cw,[ Cx
0435
FCo+607Ci
6,073
dCN
It
dC
6,07
dcx
di
It
J(7y
0,139
di
dCP=
0o147.c
di
dCo2
1.1
.-
k(C~
Co~~
.c
~
ji 2,02.1<
c~
1.2-
1.3.-
419
Resumen
2.-
Conclusiones
El Modelo Cintico Metablico es capaz de predecir razonablemente bien la
evolucin de los componentes del sistema y est formado por el siguiente
conjunto de ecuaciones diferenciales:
dC~
k,<
CNjJ.CX 1
dC
5,94 dC~
r180.{~
di
923,2 It
k4 C~>,
1
12
CY.[1358Q358t47
dC~
y Us dr
dC~ 923,2
It
K4 +C<2,,
j}]}
dC0,
It
0,3 dC~
0,5
923,2 de
3,58
k~
r,=k
7$
l+4Y,~
~,
dCx
yox di
3,58+4.Y~>j
(6
1+tYrp
C~ 41358.1
12 K4 C02
yy
3~58+4.Y1~~))
C
1
k<C0
?~ATPP
=1,2
2.1.-
420
Resumen y Conclusiones
k<7)={ 0,94 (T- 1945) f1-exp(/,399(T-34,24))]}2
k<T) = 2,913+2,0481
Y,~>< (T) = (0,597. (T -24,35)11 exp(0 205- (T -37,16))]
-
Y~ftT) =0,340+(6,1.]0<T
2.3.-
20
lo-
o.
25
30
35
Resumen y Conclusiones
30
a
>0.4
lo
lO
YO
l ~(h)
10
00
03
[0
lO
20
0<LiJnin>
422
Resumen y Conclusiones
3.- La citometria de flujo es una tcnica excelente para el seguimiento y anlisis de
componentes intracelulares, tales como DNA, RNA y protenas, durante una
fermentacin.
b)
c)
423
Resumen y Conclusiones
a) El protocolo de preparacin de las muestras en esta tcnica no incluye
la rotura celular y, por tanto, tampoco la extraccin de los
componentes. con lo que la espectrofluorimetra permite solventar los
problemas encontrados con las tcnicas bioqumicas convencionales.
b)
analizar.
En este trabajo,
para Xanrhomonas
1(g/L)
3,46
~1<
. FD
(Xex%5364 xernL623)
(xexc=494~ xeIflI=520)
(xexc=494;
xenh=52o)
b)
0 (g / L) = (0,25 IP 5,95) ED NC
Cm
C\RV]
(g L)
0,11
ED NC
(Xe~c%536; >5=623)
(Xex~=494;
xern=520)
fiable de
la concentracin de
componentes
Resumen y Conclusiones
4.- En el Captulo 6 de la presente Memoria se ha propuesto un mtodo para
desarrollar un modelo cintico de clula basado en las siguientes etapas:
t-
dCp~
It
+ ICDNI
It
It
It
ICR\04
It
dCDNA
di
dCPR
ICPRE
It
It
dC
NII4~
It
18(1,4.
2,75
136,5
103,5
2,75
478,6
491,7
425
Resumen> Conclusiones
Siendo:
rJ=lqC\
/?4.C
.2
.5
(m
5.1.-
C~
=k C~
52.-
0,150
k5(T) =0,1 98
kJTt
{ 0,041
-y
(T- 21)11- expj0,352 (7- 35,08))J
de predecir la influencia de la
5.3.-
426
de predecir la influencia de la
6.-
tIC RVA
tIC DAOA
di
+-
It
dCppj
dt
dCRV
It
ICDV
It
tIC
IC
PRI
It
r,
It
dC
136,5
It
IC~180J
It
0,933(
5,94 ICp
923,2 Ir
136,5
)0,5(
0,3 dC~
923,2 Ir
2,75
1 k4C0, CF
12 K4C02
[
103,5
)1,08(
491,87
/%
478,6
358
2,75
it
491,7
14Ym Vil
3,58+4Y~~ )jJ
)1,12(
486,7
K4 CQ y3,58+4Y~~~)
It
IC0,
dr
103,5
CQ
ICx
~--
CQ
k~C
K
O2CI
~ C
It
141%,
3,584.YTPJ
0,
2
1 k4C0,
= 12K4C0,
~13S8(
37
14Yrp
3,584Y4~
427
y,
~34
41p1>
Siendo:
r1=k,C
C~
r3=k3 C ,~,
r2m =k, C
0,150
<(7)
0,198
k,1~(T)
0,001080,00003T
k(T~
kYT)
>lw (T)
6.1.-
2,9132,0487
Resumen y Conclusiones
Con este modelo se considera la evolucin de otro componente intracelular
no considerado en el modelo cintico de clula. Este componente se ha
denominado hidratos de carbono, y el parmetro de la reaccin de formacin
de este compuesto,
kHG,
temperatura.
6.2.-
30-
25
20
5
y
o.
O
00
200
300
400
9. ~~,pm>
Figura 8.3.- Evolucin de la concentracin de xantano alcanzada a las 60 horas
de fermentacin con diferentes concentraciones iniciales de amonio.
429
Nomenclatura
9.- NOMENCLATURA
Absorbancia (u.a.).
Compartimento en los modelos de Bijkerk y Hall (1977) y de Nielsen y col.
(1991a y 1991b).
,C
3).
Parmetro del modelo de Wayman y Tseng (1976) (kg~/m
Concentracin de oxigeno en el momento en que se inicia la aireacin (04).
Citometra de Flujo.
2
C2,
Cm
CMiF
d
D
431
Nomenclatura
Enzima de la ruta
ED
Factor de Dilucin.
IF
1<,,
kLav
0, ,k02
migu
432
Nomenclatura
NA
NC
Nmero de Clulas.
Nmero de componentes clave.
Pl
Controlador proporcional-integral.
PID
Controlador proporcional-integral-diferencial
q02
Re
Sustrato.
Sc
SRC
3/min) (m/h).
Caudal (cm
Velocidad especfica de formacin del compuesto i (modelo de Pons y col,
1989).
2/kg~h).
2/~f).
Tiempo (h).
Parmetro estadstico, t de Student.
T
Temperatura (0C).
tlat
Volumen (L).
Caudal de aire aportado al fermentador, (IN/l/min) (m3/m3/h).
We
433
Ao,nenclatu, a
YE
Extracto de levadura.
Y,j
Y0= :
Letras Griegas
Incremento.
2.
Longitud de onda.
Velocidad especfica de crecimiento (It).
Viscosidad relativa al modelo de Casson (Pas).
Viscosidad efectiva relativa al modelo de Ostwald-deWaele (Pas)
3 kgsh).
).
-y
434
Vomenclauua
Subndices
b
Referido a biomasa.
Condiciones iniciales.
cnt
DNA
Referido al DNA.
ef
Eficaz o medio.
exp
Experimental.
max
mm
>4
N,A
N,DNA:
N,RNA:
N,T
O,
Referido al oxgeno.
PR
Referido a Proteinas.
PRE
PRI
PRT
435
jVomencaturo
RNA:
Referido al RNA.
Teor
Referido a la biomasa.
Referido a xantano (modelo de Pons y col., 1989).
Superindices
A
Referido a absorbancia.
CN4F
Referido a Fluorimetra.
436
y col., 1989).
Valor de saturacion.
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