Professional Documents
Culture Documents
Mestrado Integrado
em Cincias Farmacuticas
Expresso de GFP
- clulas GHOST
3 Edio
Lisboa 2008
HIV-2ALI; JM Azevedo Pereira resultados no publicados
Este manual foi elaborado com o objectivo de dar apoio s aulas prticas da cadeira de Virologia do
Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa.
Aqui so abordados vrios temas relacionados com o diagnstico laboratorial das infecces virais. Para
algumas das infecces virais mais importantes, so aprofundados os conceitos e procedimentos usados
nesse diagnstico.
Docentes:
Jos Miguel Azevedo Pereira (Professor Auxiliar da FFUL)
Contacto: Telf: 217946400; ext: 266
e-mail: miguel.pereira@ff.ul.pt
home page: http://web.mac.com/jmiguelap/Entrada_geral/Entrada.html
http://www.ff.ul.pt/paginas/jazevedo/Site/Welcome.html
Quirina Santos Costa (Assistente da FFUL)
Contactos: Telf.: 217946200; ext: 226
e-mail: quirina.c@ff.ul.pt
home page: http://web.mac.com/santoscostaq/santoscostaq/Santos-CostaQ.html
Abreviaturas usadas:
Ac- Anticorpo
Ag- Antignio
CMSP- Clulas mononucleadas do sangue perifrico
CMV- Citomegalovirus
DNA- cido Desoxirribonucleico
EBV- Vrus Epstein-Barr
EIA- Ensaio imunoenzimtico
HHV-8- Herpes vrus humano tipo 8
HIV- Vrus da Imunodeficncia Humana
HPV- Vrus do Papiloma Humano
HSV- Vrus Herpes Simplex
ndice
I- Mtodos de diagnstico em Virologia
1- Mtodos directos
2- Deteco de anticorpos especficos (serologia)
3- Cultura de clulas eucariotas
4
12
15
17
1- Caractersticas gerais
2- Diagnstico
17
19
21
1- Caractersticas
2- Diagnstico
21
21
25
1- Caractersticas
2- Sndroma de Rubola congnita
3- Diagnstico laboratorial
25
25
25
28
1- Caractersticas
2- Diagnstico da infeco pelo HBV
28
28
32
1- Caractersticas
2- Organizao genmica
3- Ciclo replicativo
4- Patognese da infeco
5- Diagnstico da infeco pelo HIV
6- Principais problemas no diagnstico da infeco pelo HIV
7- Outros marcadores de diagnstico e monitorizao da infeco
8- Mtodos usados na monitorizao e prognstico da infeco:
9- Quantificao da carga viral
32
32
33
35
35
39
40
40
41
Anexos
43
43
43
Prticas de Virologia
I- Mtodos de diagnstico em
Virologia
1- Mtodos directos
1.1. Deteco de antignio viral
A principal vantagem destes mtodos a rapidez com que o resultado obtido. No entanto,
na maior parte dos casos, trata-se de tcnicas
que envolvem a correcta interpretao das observaes feitas, o que torna os resultados menos objectivos. A sensibilidade e especificidade
so igualmente menores quando comparadas
Figura 1- Clula
infectada
HSV-1 epitelial
detectada
por IF
pelo HSV-1 detectada por IF
Prticas de Virologia
com outras tcnicas. Est muito dependente da
qualidade da amostra clnica. So ainda tcnicas no automatizadas que envolvem a interveno frequente do operador.
Exemplos de deteco de antignios como mtodo de diagnstico de viroses: deteco de
clulas infectadas por RSV, ou adenovirus, em
aspirados naso-farngeos ou bronco-alveolares;
deteco de HSV (Figura 1) ou VZV em zaragatoas de leses cutneas (exemplos em que se
utiliza a tcnica de imunofluorescncia); deteco de rotavirus ou adenovirus nas fezes (por
reaco de aglutinao de partculas de ltex);
deteco de antignio p24 do HIV no soro ou
plasma (antigenmia); deteco de antigenmia
pp65 do CMV (por mtodos imunoenzimticos
- EIA).
A rapidez outra das vantagens da ME, podendo por isso ser usada em diagnstico virolgico
rpido. No entanto, exige que na amostra clnica existam partculas virais em quantidade suficiente para poderem ser visualizadas (105-106
partculas virais/ml). Devido a isso, a sua sensibilidade baixa, podendo, no entanto, ser aumentada utilizando a imuno-microscopia electrnica
(IME), onde so usados anticorpos especficos
do vrus a pesquisar, por forma a aglutinar as
partculas virais, tornando-as mais fceis de visualizar e reconhecer. Para alm da sua baixa
sensibilidade, a ME tem como desvantagem ser
uma tcnica dispendiosa, quer na aquisio do
equipamento, quer na sua manuteno e utilizao, exigindo pessoal devidamente treinado.
Devido a isso, e ao facto dos mtodos de deteco de antignios e de diagnstico molecular, se terem tornado mais fiveis, sensveis e
econmicos, fizeram com que cada vez menos
se utilize a ME como mtodo de diagnstico. Actualmente a ME usada no diagnstico de gastrenterites virais a partir das fezes (rotavirus,
adenovirus - Fig 3, astrovirus, calicivirus, etc).
Menos frequentemente pode ser usada para
a deteco de vrus em leses cutneas, como
por exemplo o HSV ou o HPV.
Prticas de Virologia
A
B
Figura
5- Exemplo
de reaco
de hibridao
in situ.
Deteco
clulasinfectadas
infectadas com
com oo vrus
Figura
5- Exemplo
de reaco
de hibridao
in situ.
A-ADeteco
dede
clulas
vrus do
papiloma
humano
numa
amostra
obtida
do coloB-do
tero; B-de
Deteco
clulas com o
do papiloma
humano
numa
amostra
obtida
do colo
do tero;
Deteco
clulas de
infectadas
amostra
de uma leso
doleso
Sarcoma
de Kaposi
infectadasHHV-8
com o numa
HHV-8
numa amostra
de uma
do Sarcoma
de Kaposi
Prticas de Virologia
presena real duma patologia. Casos como a
deteco de genomas virais identificados como
sendo do vrus da hepatite G ou do TTV (transfusion transmited virus) no permitem, por si s,
fazer a respectiva associao com qualquer estado patolgico agudo ou crnico. Tambm nos
casos de infeces por vrus que se mantm
latentes no hospedeiro, a deteco de genoma
viral a nvel celular, no implica necessariamente que esteja a ocorrer uma manifestao patolgica desse vrus.
Dentro deste grupo de testes h ainda a referir os que utilizam as reaces de hibridao in
situ (Fig. 5). Neste caso a integridade da clula
mantida, sofrendo somente uma permeabilizao de forma a permitir a entrada da sonda
molecular marcada com uma enzima. Uma vez
que a estrutura celular e tecidular so mantidas, permite quantificar o nmero de clulas infectadas e quais os tipos de clulas, ou compartimentos celulares, onde o genoma viral existe.
Figura 6- Exemplos de efeitos citopticos (ECP) induzidos por alguns vrus. Da esquerda para a direita: ECP do HSV-1, HIV-2 e RSV
Prticas de Virologia
gos slidos, existindo aderentes entre si, mantero essa propriedade in vitro.
Quanto ao tipo de clulas, estas podem ser classificadas como clulas primrias, clulas secundrias e clulas contnuas (ver mais adiante no
texto).
Alternativamente, a presena de vrus em cultura pode ser feita recorrendo tcnica de hemaglutinao ou tcnica de interferncia viral.
No primeiro caso, pesquisa-se a presena de
protenas com capacidade de aglutinar hemcias de espcies animais especficas (humanas
tripsinizadas, de pombo, etc.). Essas protenas
so pesquisadas no sobrenadante da cultura
infectada pondo em contacto esse sobrenadante com uma suspenso de hemcias em placas
com cpulas de fundo em V. Caso existam hemaglutininas, as hemcias ficam em suspenso
no se concentrando no fundo da cpula (vrtice do V). Os resultados possveis esto representados na Figura 11.
A tcnica de interferncia viral usada nos casos em que nenhuma das anteriores tcnicas
pode ser usada. O seu princpio baseia-se no
facto de haverem determinados vrus que interferem com a replicao de outros que se multiplicam nas mesmas clulas, impossibilitando
estes ltimos de fazerem o seu ciclo replicativo.
O sistema vrus-clula portanto constitudo
por um tipo de clulas e por dois vrus: o vrus
que se pretende detectar (vrus A que interferente) e o vrus indicador (vrus B). Este ltimo ter de ser capaz de induzir um ECP claro e
rpido. Caso na cultura celular inoculada existir
o vrus A, ele vai impedir que, aps inoculao
posterior do vrus B, este possa fazer o seu ciclo de replicao e por isso no aparea o ECP
esperado. Caso no exista o vrus A na cultura,
a inoculao do vrus B ir resultar no aparecimento do ECP esperado e caracterstico. Este
procedimento obviamente mais laborioso e,
como j foi dito s usado em casos particulares em que nenhuma das tcnicas anteriores
passvel de ser utilizada. Alm disso, impe a
conhecimento presuntivo de qual o vrus que
dever estar presente em cultura para que a
escolha do vrus B possa ser convenientemente
feita. Essa suspeita baseia-se em vrios parmetros dos quais os mais importantes so: tipo
de sintomatologia, amostra biolgica usada e o
facto de se verificar a ausncia de ECP.
Prticas de Virologia
clula onde esse vrus foi capaz de se replicar
(susceptibilidade celular). No entanto, para a
identificao cabal e objectiva do vrus em questo, torna-se necessrio recorrer a tcnicas
como a imunofluorescncia, imunoperoxidase,
neutralizao, inibio da hemaglutinao, microscopia electrnica e eventualmente a tcnicas de biologia molecular (amplificao, clonagem e sequenciao do genoma viral).
1.5.3. Vantagens e desvantagens do isolamento e cultura do vrus in vitro
A principal vantagem do isolamento viral, no
mbito do diagnstico viral, a especificidade
e a capacidade de usar os vrus obtidos para
futuras caracterizaes. No entanto esta tcnica tem vrias desvantagens: necessidade de
existirem linhas celulares adequadas em cultura, laboratrio devidamente apetrechado para
a manipulao de amostras contendo vrus patognicos, pessoal devidamente treinado, custos elevados. Alm disso, as culturas celulares
so, devido aos meios de cultura extremamente
ricos que so utilizados, facilmente contaminveis por bactrias e/ou fungos.
10-6
10-7
Prticas de Virologia
Diluio
viral
N de
culturas
infectadas/
inoculadas
Total
acumulado
de culturas
infectadas
Total
acumulado
no
infectadas
Taxa de
infeco
Percentagem
infectadas
10-4
5/5
10
10/10
100%
10-5
4/5
5/6
83%
10-6
1/5
1/6
17%
10-7
0/5
10
0/10
0%
A diluio correspondente TCID50 est localizada entre as diluies 10-5 e 10-6 (83% e 17%,
respectivamente). Para se calcular essa diluio recorre-se formula de interpolao:
% de infeco > 50% - 50%
% de infeco > 50% - % de infeco < 50%
No caso do exemplo ser:
83 - 50/83-17 = 33/66 = 0,5
O valor encontrado multiplicado pelo negativo do log10 do factor de diluio, que no caso do
exemplo d igual a -1, ficando por isso
-1 x 0,5 = -0,5
O log10 da diluio que corresponde TCID50 obtido adicionando o valor obtido anteriormente
ao valor do log10 da diluio acima dos 50%. Ou seja:
-5 + (-0,5) = -5,5
Ou seja, a diluio correspondente TCID50 igual a 10-5,5 e portanto o ttulo da suspenso
105,5 TCID50
de vrus), adicionado o corante vermelho neutro que ir corar de vermelho as clulas vivas
e manter incolor as clulas mortas (Figura 9).
O clculo da concentrao de partculas virais
feita usando a diluio que melhor contagem
apresentar (nem demasiado elevada nem baixa demais). Nessa, sero contadas as zonas de
morte celular (denominadas placas), e multiplicadas pelo inverso da diluio usada como inculo (ex: 50 placas na diluio 10-5, correspon-
10
Prticas de Virologia
Vrus
Vero, Hep-2
Varicela-Zona (VZV)
Citomegalovirus (CMV
Adenovirus
Hep-2, HEK
Poliovirus
Coxsackie B
Echovirus
Influenza A e B
Parainfluenza
MK, LLC-MK2
Papeira
Hep-2, Vero
Rinovirus
HEK, HEL
Sarampo
MK, HEK
Rubola
Vero, RK13
11
Prticas de Virologia
12
Prticas de Virologia
o no est.
2.3- Limitaes do diagnstico serol- ticorpos devem ser detectados no LCR. Em situgico
aes de meningite ou encefalite, podero ser
A utilidade do diagnstico serolgico vai depender do vrus em questo.
Assim:
Para vrus como os da rubola ou da hepatite A, o aparecimento dos sinais clnicos
coincide com o desenvolvimento de anticorpos. Desta forma, a deteco de IgM ou ttulos de IgG aumentados no soro do indivduo,
indica uma infeco activa
Noutros casos, no entanto, os sinais clnicos surgem antes do aparecimento dos
anticorpos. o caso dos vrus responsveis
por infeces respiratrias ou por diarreias.
Nestes casos, o diagnstico serolgico ser
sempre retrospectivo e por isso sem interesse prtico.
Outros vrus provocam o aparecimento
de manifestaes clnicas muitos meses/
anos aps a seroconverso. Servem de
exemplos para esta situao o HIV e o vrus
da raiva. Nestes casos a simples presena
de anticorpos suficiente para fazer um
diagnstico definitivo, excepto nas situaes
em que esses anticorpos possam ter sido
transmitidos passivamente (caso da transmisso vertical do HIV).
Em casos de infeces localizadas, como
por exemplo as leses herpticas a nvel labial ou genital, podem no induzir uma resposta humoral significativa
Ocorrncia de reaces cruzadas entre
vrus devidas a identidades antignicas (por
ex: HSV/VZV) que podem levar a falsos resultados positivos
Ocorrncia de falsos positivos devido a
anticorpos interferentes: frequente em doentes com Lupus Eritematoso disseminado
ou com mononucleose infecciosa.
Indivduos imunodeficientes podem ter
uma resposta humoral ausente ou muito
reduzida.
13
Prticas de Virologia
14
Prticas de Virologia
em estudo (ex: maior diluio=1:160, logo o culturas celulares de trs formas: pela forma
como se propagam in vitro, conforme a sua
ttulo=160).
morfologia e consoante o tipo de clulas.
2.5.3- Mtodos imunoenzimticos (EIA) e imu1- Quanto forma de propagao, as culturas
no-radioactivos (RIA)
Baseiam-se na formao de complexos Ag-Ac celulares podem-se classificar em:
Culturas em suspenso: as clulas crese posterior deteco destes complexos pela
cem sem estarem aderentes entre si ou ao
adio de um segundo Ac marcado enzimatisuporte slido (paredes interiores do frasco
camente (EIA) ou radioactivamente (RIA). No
de cultura ou outro recipiente onde estejam
segundo caso, quanto maior o nmero de coma ser cultivadas)
plexos Ag-Ac formados maior a quantidade de
Culturas em monocamada: crescem
radioactividade presente. No primeiro caso, a
aderindo ao suporte slido e entre si. Estas
quantidade destes imuno-complexos ir deterclulas necessitam, para serem transferiminar a quantidade de enzima presente e esta
das para outro suporte slido, de serem dispor sua vez ir degradar em maior quantidade
sociadas entre si e do suporte slido onde
o substracto adequado, entretanto adicionado
se fixaram. Os mtodos de dissociao se reaco, donde resulta um composto corado.
ro referidos mais adiante.
Assim, quanto maior a intensi dade da colorao, maior a quantidade de enzima e, portanto,
maior a quantidade de complexo Ag-Ac forma- 2- Quanto sua morfologia as clulas podem-se
classificar em:
dos no incio (Fig 12).
Epiteliais: com morfologia poligonal
Os mtodos EIA e RIA apresentam maior sensi Fibroblsticas: com morfologia fina e
bilidade, maior especificidade e so mais prtialongada
cos de executar, tendo ainda a vantagem de se Outras: com outros tipos de morfologias
rem automatizveis, com benefcios em termos
(clulas sanguneas, nervosas, musculares,
de diminuio de erros de execuo, de maior
etc.)
objectividade e rapidez e de permitir uma melhor organizao do laboratrio.
3- Cultura de clulas
eucariotas
As culturas celulares em virologia so fundamentais, na medida em que permitem a multiplicao in vitro dos vrus presentes nas amostras biolgicas. So, por isso, um elemento
fundamental em todos as tcnicas virolgicas
que envolvam o isolamento (no diagnstico das
infeces virais) ou a propagao (estudos de
caracterizao fenotpica) de vrus.
Tratando-se de vrus causadores de patologias
no ser humano, as clulas a utilizar tm de ser
necessariamente eucariotas (os fagos multiplicam-se em clulas procariotas). As clulas
eucariotas so muito mais difceis de manter
em cultura do que as clulas procariotas. Elas
exigem meios de cultura muito ricos e so, por
isso, muito susceptveis contaminao por microorganismos como as bactrias e fungos.
Duma forma simples, podemos distinguir as
15
Prticas de Virologia
16
Prticas de Virologia
Figura 15- Latncia ao nvel dos gnglios nervosos do trigemio, associada infeco oro-
Figura1616-Exemplo
Exemplode
deleso
lesooro-labial
oro-labial
causaFigura
causada
da por HSV-1
por HSV-1
labial pelo HSV
Aps o primeiro contacto com o HSV (primoinfeco), podem surgir sinais e sintomas
envolvendo leses nas mucosas. A durao
dos sintomas, a infecciosidade das leses e a
possibilidade de complicaes durante a primo-infeco maior do que nos episdios de
Prticas de Virologia
18
Prticas de Virologia
Figura1919-Exemplos
Exemplos de
de ECP
ECP induzido
pelo
Figura
induzido pelo
HSV in vitro
HSV in vitro
Prticas de Virologia
Figura
Esquemada
da reaco
reaco de
Figura
20-20Esquema
dePCR
PCR
Figura 21- Imunofluorescncia em clulas no infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direiFigura
21- Imunofluorescncia
em
clulas
no infectadas
(esquerda)
e infectadas
pelo
ta).
Fluorocromo
usado: FITC; a
cor
vermelha
das clulas
no infectadas
deve-se
ao HSV-1
uso do(direita).
contraFluorocromo usado: FITC; a cor vermelha
das clulas
infectadas deve-se ao uso do contra-corante,
corante,
azul no
de Evans
azul de Evans
20
Prticas de Virologia
pelo CMV pode tornar-se extremamente preocupante. Exemplos destes grupos so os imunodeficientes e a mulher grvida, esta ltima pelo
risco de poder transmitir a infeco ao feto.
Durante a gravidez, o maior risco para o feto
provm de uma primo-infeco (Fig. 23). Nas
situaes em que j tenha ocorrido uma infeco por CMV no passado (reactivaes), o risco
para o feto praticamente nula. Ainda dentro
da infeco me-filho, de referir que o risco
maior est associado infeco congnita (adquirida durante a gestao). As infeces perinatal (trabalho de parto) ou ps-natal (aleitamento) esto, em geral. associadas a situaes
de muito menor gravidade para a criana.
me
infantrio
relaes
sexuais
criana
adolescente
adulto
transfuso
transplante
Figura 22- Esquema das vias de transmisso da infeco pelo CMV
21
Prticas de Virologia
Figura 23- Esquema mostrando as consequncias de uma infeco primria na mulher grvida
interpretaes de primo-infeces.
Por outro lado, a presena de IgG no recm
nascido no tem qualquer significado, visto elas
terem sido adquiridas passivamente a partir do
sangue materno. Tambm nas crianas, a pesquisa de IgM pode conduzir a interpretaes
errneas, uma vez que a sua ausncia pode ser
somente devido imaturidade do seu sistema
imunolgico e no real ausncia de uma primo-infeco.
Por tudo isto, o uso da deteco de anticorpos
especficos para o CMV (IgG ou IgM) carece de
uma cuidadosa interpretao. Mais recentemente, a quantificao do grau de avidez das
IgG revelou-se extremamente til como auxiliar
da interpretao dos dados serolgicos uma
vez que permite, com alguma segurana, descriminar as infeces antigas (h mais de 3
meses) das mais recentes. Pode-se assim confirmar, ou no, a existncia de uma possvel primo-infeco recente, o que, a verificar-se numa
22
Prticas de Virologia
Urina
Negativo
Positivo
Positivo
Infeco perinatal
Infeco congnita
Figura 24- Esquema do procedimento a seguir no diagnstico ps-natal, no caso da amostra ser colhida aps as 3 primeiras semanas de vida
23
Prticas de Virologia
pos recentemente formados, terem uma menor afinidade para os respectivos antignios, do
que os que resultam de infeces mais antigas.
Esta diferena de afinidade pode ser posta em
evidncia se, durante a incubao do soro com
os antignios da fase slida, estiver presente
um agente desnaturante (ureia, normalmente). A presena deste composto, ir dificultar a
formao dos complexos antignio-anticorpo,
diminuindo a quantidade de complexos formados. No final, devido reduo de anticorpo ligado, o resultado da reaco colorimtrica (ou
outra, consoante o formato do teste usado) vir
significativamente menor, quando comparado
com a mesma incubao feita na ausncia de
ureia. A razo do valor da reaco na presena
da ureia, sobre o valor na ausncia desta ser,
caso a avidez dos anticorpos seja baixa, significativamente inferior a 1 (na realidade ser inferior a 0,65). Desta forma possvel identificar
os soros provenientes de indivduos que tiveram
uma infeco recente dos que tiveram uma infeco h mais tempo.
O recurso ao teste de avidez das IgG no caso do
CMV (e em geral em todas as infeces virais)
tem interesse sempre que os testes serolgicos apresentem resultado positivo ou duvidoso
para IgM, com a presena bvia de IgG especficas.
Para alm do CMV, existem outras infeces
virais nas quais se torna importante determinar a avidez das IgG para identificar infeces
recentes:
Rubola
VZV
HSV
HHV 6
Parvovirus B19
HCV
EBV
Vrus do Sarampo
IgM positiva
(desconhecimento do estado
imunitrio antes da gravidez)
<0,6
>0,8
Avidez
IgG
0,6- 0,8
Compatvel com
Infeco Primria
Recente
Semanas de
gestao
>12
Pos
Westernblot IgM
Provvel
Infeco Primria
Recente
Neg
<12
Compatvel com
Infeco antiga
Figura
25-25Esquema
dodo
procedimento
a terano
caso
uma
de umade
grvida
apresentar
IgM
Figura
Esquema
procedimento
ter
no de
caso
deamostra
uma amostra
uma grvida
apresentar
IgM
positiva
positiva
24
Prticas de Virologia
2- Sndroma de Rubola
congnita
Durante a virmia, o vrus da rubola pode, numa
mulher grvida, atravessar a placenta e causar
infeco fetal. Esta infeco ocorre em praticamente todos os casos numa situao de primoinfeco materna durante o primeiro trimestre
de gravidez. Os riscos para o feto advm dos
mecanismos patognicos envolvidos na infeco por este vrus: morte celular, aberraes
cromossomais e paragem do ciclo celular. Este
conjunto de acontecimentos particularmente
gravoso durante a fase de embriognese (primeiro trimestre de gravidez), levando ao aparecimento de graves mal-formaes. A partir do
primeiro trimestre, o risco de mal-formaes
decresce significativamente.
Perante este cenrio, fcil perceber que o
principal objectivo no diagnstico da infeco
pelo vrus da rubola o de identificar primoinfeces na mulher grvida e de as localizar
no perodo de gestao: primeiro trimestre, vs.
segundo ou terceiro trimestre.
3- Diagnstico laboratorial
Testes serolgicos
A deteco de anticorpos especficos constitui
a base do diagnstico do vrus da rubola. Uma
infeco recente pelo vrus da rubola pode ser
identificada por:
25
Prticas de Virologia
Prticas de Virologia
Reinfeco
27
Prticas de Virologia
V- Diagnstico da Infeco
pelo vrus da hepatite B
(HBV)
1- Caractersticas
28
Prticas de Virologia
A sua presena est geralmente associada com a deteco de DNA viral no soro.
Aparece em circulao pouco tempo
aps o aparecimento do AgHBs, e normalmente antes do aparecimento dos sintomas.
No caso de infeco aguda com resoluo, desaparece de circulao antes do
AgHBs, dando-se a seroconverso para
anti-HBe.
Deriva do AgHBc por modificaes pstraduo
Nos indivduos infectados por vrus com
mutaes na regio promotora do gene
core e pr-core (denominados mutantes do
pr-core), o AgHBe pode no ser detectado
em circulao
Ag
HBs
Ag
HBe
DNAHBV
-/+
Fase de incubao
Fase aguda
-/+
-/+
-/+
+/-
+/-
Interpretao
* Estes mutantes podero prevalecer no incio da infeco (estirpe infectante), ou serem seleccionados no decurso da infeco. Tm sido associados a situaes mais graves como hepatites fulminantes, uma taxa mais elevada de cirrose e reactivaes mais frequentes ao longo da infeco crnica.
29
Prticas de Virologia
Soro
Neg
AgHBs
Pos
AntiHBc
Neg
AntiHBc
Pos
Neg
AntiHBs
Neg
Susceptvel
AntiHBs
Pos
Neg
Pos
Perodo
de
incubao
Pos
Imune
Quatro
Imune
devido
interpretaes devido
a vacinao**
possveis*
a infeco
natural
AntiHBc
IgM
Neg
Pos
AntiHBs -
AntiHBs -
Infeco
crnica
Infeco
aguda
* Convalescena de uma infeco aguda (perodo de janela); Infeco antiga (a sensibilidade do teste no suficiente para detectar as baixas concentraes de anti-HBs); Susceptvel (falso positivo
para anti-HBc); Infeco crnica (nveis indetectveis de AgHBs).
** Nveis protectores de anti-HBs pressupem um ttulo 10 mU/ml. O teste ps-vacinao deve ser
efectuado 1-2 meses aps a ltima (3) dose da vacina.
30
Prticas de Virologia
3- AgHBc: antignio do core
um antignio intracelular que detectado nos hepatcitos infectados mas no no
soro
4- Anti-HBs: anticorpo especfico do AgHBs
Marca a recuperao e resoluo da infeco pelo HBV, podendo persistir por toda
a vida, conferindo imunidade protectora.
Em cerca de 10% dos pacientes com hepatite aguda pelo HBV no se desenvolve o
anti-HBs (infeces crnicas)
Pode coexistir com o AgHBs em situaes excepcionais onde tenha havido lugar
a sobre-infeco por subtipos diferentes de
vrus.
Deve estar presente aps vacinao eficaz.
5- Anti-HBc: anticorpo especfico do AgHBc
IgM
Predomina durante a fase aguda da infeco
o primeiro anticorpo a ser detectado
Surge cerca de 1 ms aps o aparecimento do AgHBs, desaparecendo, em geral,
ao fim de 6 meses.
Em geral a sua deteco significa uma
infeco aguda pelo HBV
Pode, no entanto, persistir, em baixos ttulos, nas infeces crnicas.
IgG
No indicador de imunidade, nem induzido pela vacinao
Pode aparecer isoladamente durante o
perodo de janela, quando o AgHBs j no
detectado e o anti-HBs ainda no apareceu.
Em certas circunstncias pode ainda
surgir isoladamente muitos anos aps a infeco crnica pelo HBV (quando o anti-HBs
tem nveis indetectveis) ou durante a infeco crnica quando o AgHBs apresente nveis abaixo do limite de deteco.
31
Prticas de Virologia
2- Organizao genmica
O vrus da imunodeficincia humana (HIV) pertence famlia Retroviridae, sub-famlia Orthoretrovirinae e ao gnero Lentivirus. Existem dois
tipos, HIV-1 e HIV-2, e so ambos os agentes
causais do sndroma de imunodeficincia adquirida (SIDA).
A estrutura da partcula viral (Fig. 29) revela a
presena de um invlucro de natureza lipdica,
onde se inserem duas protenas de origem viral:
a glicoprotena de superfcie (SU) e a glicoprotena transmembranar (TM). A sua cpside tem
um formato cnico, contendo no seu interior as
duas molculas de RNA genmico e vrias enzimas necessrias ao ciclo replicativo viral, nomeadamente a retrotranscriptase (RT). Esta DNA
polimerase RNA-dependente caracterstica
de todos os retrovrus e sintetiza uma cadeia
de DNA a partir de um molde de RNA.
Figura
Esquema da
viral
do HIV
Figura
29-29Esquema
dapartcula
partcula
viral
do HIV
32
Prticas de Virologia
gp140;
gp105;
gp36
Figura 30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais
Figura
30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais e a
e a tracejado os genes reguladores e acessrios. Esto referidos ainda, os principais antignios
tracejado os genes reguladores
acessrios. por
Esto
referidos
ainda, os principais antignios virais,
virais,e codificados
cada
gene estrutural
codificados por cada gene estrutural
3- Ciclo replicativo
clulas dendrticas.
Resumidamente, o ciclo replicativo do HIV (Fig.
Durante o seu ciclo replicativo, o HIV infecta c- 31) pode ser dividido em duas fases: a primeira
lulas que possuam na sua membrana os recep- que culmina com a integrao do genoma protores CD4 e um dos receptores das quimioci- viral (j sob a forma de DNA de dupla cadeia) no
nas (normalmente o CCR5 ou o CXCR4). Devido genoma celular; a segunda que culmina com a
a isso, o seu tropismo celular in vivo resume-se produo de novas partculas virais.
praticamente aos linfcitos T-auxiliadores (ou Durante a primeira fase, intervm quase excluT-CD4+), aos moncitos, aos macrfagos e s sivamente protenas e enzimas de origem viral.
adsoro
descapsidao
Virio
maduro
transporte
para o ncleo
sada do
ncleo
citoplasma
CD4
RE, Golgi
ncleo
Processamento
do env
CCR5 ou
CXCR4
Virio
imaturo
PIC
core
Vif, Vpr
e Vpu
Reunio das
protenas
PR
Nef
Clivagem
Rev
Tat
Gag
RT
IN
Transcrio
reversa
Integrao
Figura 31- Esquema representando as principais etapas do ciclo replicativo do HIV. RT= retrotransFigura
31Esquema representando
as principais
etapas do ciclo
replicativo RE=
do HIV.
RT= endocriptase;
core=
nucleocpside;
PIC= complexo
de pr-integrao;
IN= integrase;
retculo
retrotranscriptase; core= nucleocpside;
PIC=
complexo
de
pr-integrao;
IN=
integrase;
RE=
plasmtico; PR= protease
33
Prticas de Virologia
Figura3333-Esquema
Esquemada
dareaco
reaco
imunoenzimti-com
Figura
imunoenzimtica
ca com leitura
final
colorimtrica
leitura final
colorimtrica
Prticas de Virologia
fectado possvel detectar-se o DNA proviral
nas clulas alvo do HIV: linfcitos e moncitos
(clulas mononucleadas do sangue perifrico CMSP).
4- Patognese da infeco
Figura 34- Esquema da reaco de WB, desde a separao das protenas, em gel de poFigura
34- Esquema
reaco de
desde a especficos
separao das
protenas,
em gel de
liacrilamida,
at da
deteco
dosWB,
anticorpos
para
cada antignio
35
Prticas de Virologia
36- Seroconverso
numa infeco
pelo
FiguraFigura
36- Seroconverso
numa infeco
pelo HIV-1.
HIV-1. As amostras de soro colhidas ao longo
As amostras de soro colhidas ao longo dos vrios
dos vrios dias aps a infeco (referidos
dias
aps a infeco (referidos direita), foram
direita), foram testadas em simultneo. A ltestadas
emdesimultneo.
A ltima
de WB potima tira
WB representa
umtira
controlo
representa um controlo
sitivo positivo
36
Prticas de Virologia
Teste de
rastreio de 4
gerao positivo
Agp24 c/
dissociao
Pos
Pepti-LAV
Neg
Neg
HIV-1 +
WB para
o HIV-1
HIV-2 +
WB para
o HIV-2
HIV-1 e
HIV-2 +
WB para
o HIV-1
e HIV-2
Figura
da reaco
reaco de
PCR (A)
(A)eeresultado
resultado final
dada
amplificao
de
Figura3939-Esquema
Esquema da
de PCR
final
amplificao
de
fragmento
DNA
com
cerca
300pb,
pb,visualizado
visualizado
num
gel
agarose
umum
fragmento
de de
DNA
com
cerca
dede300
num
gel
dede
agarose
e
e corado
coradocom
com brometo
brometode
deetdeo
etdeo(B)
(B)
37
Prticas de Virologia
38
Plasma+plaquetas
Centrifugao
Ficoll
CMSP
Ficoll
Sangue
Prticas de Virologia
PMN+hemcias
Figura 40- Separao das CMSP (linfcitos e moncitos) por centrifugao em gradiente de Ficoll
6- Principais problemas
no diagnstico da infeco pelo HIV
De forma a resumir os problemas inerentes
utilizao dos testes indirectos como mtodos
de diagnstico do HIV, so de seguida referidos as principais causas desses problemas, os
quais podem-se traduzir em falsos positivos ou
falsos negativos:
1- Inmeros subtipos, principalmente no HIV-1:
possibilidade de alguns desses subtipos induzirem anticorpos suficientemente diferentes que
39
Prticas de Virologia
41C
Promotor da T7
RNA-polimerase
Primer 1
Cyclic Phase
5
3
RT
5
5
5
5
3
RT
RT
Primer 2
3
3
3
3
3
5
5
5
5
5
3
5
3
5
RNase H
5
3
Primer 1
5
3
3
5
3
3
RNase H
Primer 2
5
T7 RNA
Polymerase
RT
3
5
7- Outros marcadores de
diagnstico e monitorizao da infeco
Para alm dos mtodos j aqui referidos, existem outros que podero ser usados, em casos
muito particulares, como auxiliares no diagnstico da infeco pelo HIV. Outros so usados
principalmente como marcadores de prognstico ou de monitorizao da teraputica. Do primeiro grupo temos como exemplos:
Pesquisa de anticorpos da classe das
IgA ou IgM
Imuno-histoqumica e IF directa: deteco de clulas infectadas expressando antignios virais
3- Falsos negativos (resultados de testes de
Hibridao in situ: deteco de clulas
rastreio negativos em situaes onde exista recontendo DNA proviral usando sondas maralmente infeco pelo HIV):
cadas
Recm-infectados (janela imunolgica)
2-microglobulina e neopterina
Infectados por subtipo extico
Seroconverso tardia devida, nomeada8- Mtodos usados na momente:
Hipogamaglobulinmia
nitorizao e prognsti
Disfuno das clulas B
co da infeco:
Quimioterapia
4- Recm-nascidos de mes seropositivas
40
Prticas de Virologia
Fase slida
que acontece no RT-PCR, a molcula que amplificada o RNA viral e no o DNA. A enzima interveniente nesta amplificao a T7-RNA polimerase. A reaco inicia-se com a ligao do
2- Quantificao de linfcitos CD4 e CD8
primer (primer 1 - P1) regio alvo da molcula
Relao CD4:CD8
de RNA viral. Este P1 tem a particularidade de,
Contagem absoluta de linfcitos CD4
na sua extremidade 5, possuir o promotor da
T7-RNA polimerase, enquanto que a sua extre9- Quantificao da car- midade 3 complementar da regio alvo da cadeia de RNA viral. Aps o annealing deste P1,
ga viral
a RT faz uma cpia (cDNA) da cadeia de RNA
Os mtodos que so usados para a quantifica- alvo. Fica assim formado um hbrido RNA:DNA.
o da carga viral usam, como lquido biolgico, Pela fraco RNAseH da RT, a cadeia de RNA
o plasma. Qualquer um deles expressa o resul- degradada e, novamente por intermdio da
tado em nmero de cpias de RNA viral/ml de RT (agora pela sua actividade DNA polimerase
DNA-dependente), e aps hibridao de um seplasma.
O mtodo clssico o RT-PCR em que a reaco gundo primer (Primer 2 - P2), sintetiza-se uma
de PCR normal precedida de uma reaco de dupla cadeia de DNA, contendo o promotor da
retrotranscrio mediada pela RT (transcripta- T7-RNA polimerase totalmente funcional. Este
se reversa). Como todas as reaces de PCR, promotor ento reconhecido pela T7-RNA pocomposta por trs ciclos que ocorrem, normal- limerase que sintetiza uma grande quantidade
mente, a temperaturas diferentes: desnatura- de RNA de cadeia simples, correspondente ao
o, hibridao dos primers e elongamento das RNA viral inicial. Cada uma destas novas cadeias
ir ser usada na fase de amplificao (Cyclic
cadeias)
O mtodo NASBA (nucleic acid sequence-based Phase), na qual se repete os passos referidos
amplification) um mtodo alternativo em que anteriormente (annealing do P1, sntese do
toda a reaco se processa mesma tempe- cDNA, sntese do DNA de dupla cadeia, produratura (Fig 41). Neste mtodo, ao contrrio do o de RNA pela T7-RNA polimerase), aumen NASBA
bDNA
41
Prticas de Virologia
42
Prticas de Virologia
Anexos
Perfil serolgico de uma infeco crnica pelo VHB
43