Carbohidratos.

Monosacridos:
La forma ms bsica o simple de un carbohidrato es el monosacrido. La frmula
emprica de un monosacrido es (CH2O)n donde n es un valor entre 3 y 9.
El alto nmero de grupos hidroxilos (OH) presentes en los monosacridos hace
que la mayora de ellos sea soluble en agua. Los monosacridos dentro de un
espcimen de tejido se pierden durante la fijacin y el procesamiento, debido al
pequeo tamao y a la solubilidad de estas molculas.
Las propiedades o caractersticas de los polisacridos y los glicoconjudados estn
determinadas en gran parte por el tipo de monosacridos que constituyen estas
molculas, as como diversos grupos reactivos dentro de los monosacridos.
Polisacridos:
Un polisacrido es una larga macromolcula compuesta por mltiples
monosacridos unidos por enlaces covalentes conocidos como enlaces
glicosdicos.
El enlace glicosdicos alfa1-4 (tambin existe el enlace glicosdicos alfa1-6) es el
predominante entre los polisacridos glicgeno y almidn. Adems algunas de las
unidades de glucosa de esos polisacridos pueden participar en ms de un enlace
glicosdico, formando de esta manera un tipo de ramificacin de la estructura.
El glicgeno sirve como una forma importante de las reservas de energa
almacenadas en humanos. Los carbohidratos absorbidos despus de una comida
se convierten en glicgeno por los hepatocitos del hgado. El glicgeno ocupa un
volumen importante en el citoplasma de los hepatocitos e incluso pueden formar
inclusiones intranucleares. Clulas de musculo esqueltico y cardiaco tambin
almacenan importantes cantidades de glicgeno.
Hay una serie de procesos de la enfermedad o condiciones patolgicas en donde
la evaluacin histoqumica del contenido o acumulacin de glicgeno puede ser de
valor diagnostico (PNET, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewings, seminoma, etc).
Hay varias enfermedades de almacenamiento de glicgeno bien caracterizadas,
las cuales son el resultados de defectos heredados en una o ms de las enzimas
involucradas en la sntesis o ruptura del glicgeno. En la mayora de estos
desordenes, el hgado muestra acumulacin masiva de glicgeno. En algunas
enfermedades, la acumulacin de glicgeno tambin se observa en musculo
cardiaco (Enfermedad de Pompe) y esqueltico.
Mucinas:
Las mucinas, como los proteoglicanos, consisten en cadenas covalentemente
unidas a un core proteico. Una estructura que define a las mucinas epiteliales es la
presencia de repeticiones en tndem de secuencias aminoacidicas dentro del core
proteico.

El contenido de carbohidratos de una mucina puede representar hasta el 90% del

peso molecular. En contraste a los glicosaminoglicanos, los cuales son polianiones
fuertemente cidos, las cadenas de polisacridos de las mucinas varan desde
neutrales o dbilmente acidas a fuertemente acidas o sulfomucinas.
Las mucinas neutras contienen un alto contenido de monosacridos sin carga
tales como la manosa, la galactosa y la galactosamina. Las mucinas neutras son
encontradas en altas concentraciones en la superficie del epitelio de la mucosa
gstrica, en las glndulas de Brunners del duodeno, y en el epitelio prosttico.
La funcin de las mucinas depende, en parte, de la locacin del tejido, del tipo de
clula productora de mucina como tambin el tipo de mucina. En la mayora de los
casos, la mucina secretada provee lubricacin y proteccin a la clula secretante
y/o al tejido.
Las mucinas unidas a la membrana es probable que participen en la regulacin de
funciones celulares como la proliferacin celular y la adhesin celular.
Mientras que IHQ ha sustituido en gran medida las tinciones especiales en el
diagnstico diferencial en tumores anaplasicos o tumores de origen desconocido,
la deteccin de mucinas en un tumor puede ser una pista valiosa en la
identificacin de malignidad.
Carcinomas frecuentemente contienen mucinas detectables, por otra parte,
melanomas, linfomas y sarcomas raramente exhiben niveles relevantes de
mucinas.
Determinar el tipo de mucina puede ser muy til en evaluaciones de cambios
neoplsicos dentro del tejido. La deteccin de sulfomucinas dentro de la mucosa
gstrica puede ayudar en la deteccin y caracterizacin de metaplasia intestinal,
una lesin asociada con carcinoma gstrico.
Fijacin:
- Debido a la solubilidad en agua del glicgeno se recomienda evitar la fijacin con
fijadores con base acuosa tales como la formalina. Esto es aceptado ya que el
glicgeno se pierde durante la fijacin con formalina, por lo general no
compromete la habilidad para detectar glicgeno con tcnicas como la de PAS.
Esto se debe probablemente a la retencin de una porcin del glicgeno celular
por asociaciones no covalentes con protenas adyacentes.
Mecanismo de la tcnica de PAS:
La tcnica de PAS est basada sobre la reactividad de los grupos aldehdos libres
dentro de los carbohidratos con el reactivo de Schiff para formar un producto final
rojo o magenta. El paso inicial en la tcnica es la oxidacin de los grupos
hidroxilos unidos a los tomos de carbono adyacentes (1,2 glicol) dentro de los
carbohidratos. El resultado es la formacin de dos grupos aldehdos libres y la
escisin del carbono contiguo. La oxidacin del 1,2 glicol para formar grupos

aldehdos adyacentes se realiza con una solucin diluida de cido peryodico.

Otros oxidantes como el cido crmico y el permanganato de potasio se usan en
variaciones de la tcnica, sin embargo, estos oxidantes tienden ms a oxidar los
grupos aldehdos a grupos carboxlicos los cuales no reaccionan con el reactivo de
Schiff.
La intensidad del color que se desarrolla despus de la reaccin de Schiff
depende de la concentracin de glicoles reactivos en el tejido.

Preparacin del reactivo se Schiff:

Hay diferentes mtodos para la sntesis del reactivo de Schiff, todos estos
mtodos comparten un tema en comn en la produccin de una solucin acuosa
de cido sulfrico. El cido sulfrico puede ser generado por una reaccin de
metabisulfito de sodio (Na2S2O5) con un cido mineral como es el cido clorhdrico
(HCl), o por la reaccin de Cloruro de tionilo (SOCl2) con agua. El dixido de
azufre es el agente activo en la produccin del reactivo de Schiff y la fuente de
dixido de azufre no es crtica, siempre y cuando los subproductos de la reaccin
para producir el cido sulfrico no interfieran con la reaccin de cido sulfrico y la
fucsina bsica.
La reaccin del dixido de azufre con la fucsina bsica resulta en la adicin de
grupos de cido sulfnico al carbono central de la molcula de tirarilmetano.
Los grupos amino libres de triarilmetano reaccionan con uno o dos grupos
equivalentes de dixido de azufre para formar el reactivo de Schiff. Como se
describe anteriormente, el reactivo de Schiff reacciona con los aldehdos
generados por los grupos 1,2 glicol en el tratamiento de carbohidratos con cido
peryodico. El reactivo inicial conjugado monosacrido-Schiff es una reaccin
incolora intermedia. El sulfonato unido dbilmente al carbono central se elimina en
un posterior enjuague con agua. El restablecimiento de la estructura quinoide de la
molcula de triarilmetano resulta en la deposicin de una coloracin rojo/magenta
profundo en el sitio del complejo carbohidrato-Schiff.
Alcian Blue:
Est compuesta por un centro de cobre que contiene un anillo de ftalocianina
unido a cuatro grupos isotioronio por enlaces tioter. Los grupos isotioronio son
bases moderadamente fuertes y da cuenta de la naturaleza catinica del alcian
blue.
Mientras que el mecanismo exacto por el cual el alcian blue tie los carbohidratos
es desconocido, en general se cree que los grupos catinicos isotiorionios se
enlazan via enlaces electrostticos con molculas polianionicas dentro del tejido.

Los grupos sulfatos y carboxilatos del condritin, dermatan, heparan sulfato y cido
hialuronico a pH 2.5 y por lo tanto poseen una carga negativa. Esto da cuenta de
que los componentes proteoglicanos/cido hialuronico del tejido conectivo y
cartlago con alcian blue. De la misma manera las mucinas cidas epiteliales como
las sialomucinas y las sulfomucinas del intestino grueso son reactivas a pH 2.5.
Las mucinas neutras tales como las de la mucosa gstrica y las glndulas de
Brunners no son reactivas con alcian blue.
Mtodos metacromticos:
Metacromasia puede ser definida como la tincin del tejido o de los componentes
del tejido, de manera tal que el complejo de colorante unido al tejido difiere
significativamente del color del complejo original del colorante para dar un
marcado contraste.
Azul de metileno, Azur A y Azul de toluidina son colorantes catinicos planares
pequeos que tpicamente tien tejidos de azul. En condiciones de metacromasia,
estos colorantes tien componentes de tejidos purpura/rojos. El uso de tales
colorantes para identificar mucinas cargadas y proteoglicanos es uno de las ms
antiguas tcnicas histoqumicas para carbohidratos.
Se cree que la metacromasia resulta de una forma especfica de agregacin del
colorante, que est caracterizada por la formacin de nuevos enlaces
intramoleculares entre molculas del colorante adyacentes. Los enlaces entre las
molculas del colorande solo suceden entre situaciones en las cuales las
molculas son atradas en estrecha proximidad entre una y la otra. En el caso de
las mucinas acidas o proteoglicanos, los grupos anionicos de los carbohidratos
actan orientando las molculas del colorante catinico. En pocas palabras, la
estructura del carbohidrato anionico sirve como molde para inducir la formacin de
una estructura colorante polimrica en la cual las molculas del colorante
probablemente se unen una a otra a travs de puentes de hidrogeno o fuerzas de
van der Waals.
Para que ocurra la metacromasia, es necesario un cierto patrn de distribucin y
densidad de las estructuras anionicas repetidas. Los proteoglicanos altamente
anionicos con grupos sulfatos y carboxilatos alternantes cumplen ese criterio y
producen tinciones metracomaticas con colorantes tales como azul de toluidina,
azul de metileno y azur. En general, los proteoglicanos ms fuertemente cidos o
altamente sulfatados producirn la metacromasia ms fuerte y ms estable.
Metilacin:
Hay una serie de variaciones de esta tcnica que se han utilizado para identificar
el tipo (carboxilo o sulfato) de grupos cidos en las mucinas. Sin embargo, todas
esas tcnicas estn basadas en el tratamiento de los especmenes con una
solucin de metanol acidificado. En esta tcnica las secciones estan expuestas a

la solucin por un periodo relativamente corto (4 hrs) a 37C. Bajo estas

condicione, los grupos carboxlicos de las mucinas son convertidos a steres
metlicos. La prdida de la reactividad de alcian blue (pH 2.5) dentro de un
espcimen despus de este procedimiento es indicativo de una preponderancia de
los hidratos de carbono carboxilados.
El tratamiento de los especmenes con una solucin de metanol acidificado por 5
horas o ms a 60C, convierte los grupos carboxlicos a steres metlicos y
tambin, remueve o hidroliza grupos O-sulfato y N-sulfato en mucinas y
proteoglicanos. Las secciones tratadas de esta manera pueden demostrar una
prdida total a la reactividad de alcian blue. Esta tcnica es de poco valor si se
realiza sola y con frecuencia se lleva a cabo con la tcnica de saponificacin.
Saponificacin:
La eliminacin de grupo O-acetilo y la restauracin del grupo hidroxilo en el C7-C9
de la cadena lateral del cido silico tambin se restaura la reactividad PAS del
cido silico. Esta tcnica tambin es usada para revertir el efecto de la
metilacin. La saponificacin escinde los enlaces que los steres de metlicos
formados durante el proceso de metilacin y restaura los grupos carboxilatos.
Siguiendo el protocolo de metilacin la saponificacin restaurar la tincin de
alcian blue a los carbohidratos carboxilados. Los steres de sulfato que se pierden
debido a la metilacin ms agresiva no se recuperan por la saponificacin. La
restauracin de la tincin con alcian blue despus de la saponificacin se debe a
la presencia de sialomucinas o acido hialuronico.