Borrelia Canis WB IgG, IgM

MIKROGEN
Gebrauchsinformation
recomBlot Borrelia canis IgG IgM
recomBlot Borrelia canis IgG

recomBlot Borrelia canis IgM
Immunoblot-Test mit rekombinant produzierten und gelelektrophoretisch aufgetrennten Antigenen zur
Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikrpern gegen Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B.
afzelii in caninem Serum oder Plasma.
1.
Allgemeines
Der recomBlot Borrelia canis ist ein qualitativer in vitro Test zum Nachweis und zur sicheren
Identifizierung von IgG- bzw. IgM-Antikrpern gegen Borrelia burgdorferi in caninem Serum oder
Plasma. Der recomBlot Borrelia canis wird zur Besttigung von im Screening Test positiven Proben
verwendet. Der Test erlaubt durch die elektrophoretische Auftrennung der Antigene, im Unterschied zu
Enzymimmunoassays oder IFT, eine sichere Identifizierung und Lokalisation von spezifischen
Antikrpern. Antikrper gegen bestimmte Antigene knnen zustzliche Hinweise auf das Stadium der
Infektion geben.
2. Borrelia burgdorferi und canine Lyme Borreliose

Das zur Familie der Spirochaetaceae gehrende Bakterium Borrelia burgdorferi ist das aetiologische
Agens der Lyme Borreliose. Der Erreger wurde 1982 von W. Burgdorfer und A. Barbour entdeckt und
charakterisiert. Als bertrger werden verschiedene Zecken-Arten der Gattung Ixodes genannt. In
Europa ist dies die Schildzecke Ixodes ricinus. Die Lyme Borreliose ist weltweit die hufigste durch
Zecken bertragene Infektionskrankheit von Mensch und Haustier. Untersuchungen zur
Durchseuchungsrate von Ixodes ricinus mit Borrelia burgdorferi zeigten in verschiedenen
geographischen Regionen in Deutschland unterschiedliche Ergebnisse: So betrgt der Infektionsindex in
Bayern (Isarauen) 34% und in Thringen 30%, whrend fr Niedersachsen Werte zwischen 9% und
13% angegeben werden.
Die Lyme Borreliose beim Menschen wurde 1977 von A. Steere in den USA beschrieben. hnlich
vielgestaltig wie beim Mensch sind die klinischen Symptome der Borreliose beim Hund:
Gestrtes Allgemeinbefinden, Fieber, Schmerzen, Apathie und Anorexie (ca. 48%)
Akute und chronische rezidivierende Mono- und Polyarthritis (ca. 20%)
Unklare Lahmheit (ca. 48%)
Neurologische Ausfallerscheinungen, wie z. B. Ataxie, Muskeltremor, Tortikollis, HWS-Syndrom,

Tetraplegie (ca. 24%)
Hautvernderungen, verbunden mit Pyodermie, Erythem und Juckreiz (ca. 8%)
seltene Symptome sind

Glomerulonephritis u.a.
Lymphadenopathie,
Myocarditis,
Myositis,
Iritis,
Panophtalmie,
Die vielgestaltige Symptomatik der caninen Borreliose stellt, neben der hnlichkeit mit den klinischen
Erscheinungen anderer Erkrankungen des Hundes, eine groe Herausforderung an die Diagnostik dar.
3.
Diagnostik
Die direkte Kultivierung von Borrelia burgdorferi (Erregernachweis) ist der sicherste Beweis fr eine
Infektion. Der Erregernachweis aus Hautproben gelingt in 50 - 70 % der Flle mit Hautmanifestationen,
die bei Hunden aber wegen der Fellkleider schwer zu lokalisieren sind. Die Anzchtung ist allerdings
schwierig und sehr zeitaufwndig und bleibt somit Speziallabors vorbehalten.
Die serologische Untersuchung ist daher die praktikabelste Lsung fr das Routinelabor. Der indirekte
Immunfluoreszenz-Test (IFT), der indirekte Hmagglutinationstest (IHA), sowie Enzymimmunoassays
(EIA) werden eingesetzt. Der serologische Befund ist abhngig vom Stadium der Erkrankung, der Dauer
der Symptome und einer eventuell schon erfolgten Antibiotikatherapie oder Vakzinierung gegen Borrelia
burgdorferi.
Der Immunoblot weist gegenber den genannten immunologischen Verfahren zustzliche Kriterien
hinsichtlich Sensitivitt und Spezifitt auf. Er ermglicht den Nachweis und die Identifizierung von IgMund IgG-Antikrpern und dient, wenn er als Ergnzungstest verwendet wird dazu, die Ergebnisse der
indirekten Immunfluoreszenz und des Enzymimmunoassays zu besttigen.
-1-
MIKROGEN
Die Verwendung unterschiedlicher Borrelia burgdorferi Stmme als Antigen kann zu unterschiedlichen
EIA-Testergebnissen fhren. Im Frhstadium versagen die angefhrten Teste oftmals. Darber hinaus
kann die Serodiagnostik der caninen Borreliose durch Kreuzreaktionen mit anderen Spirochaeten, wie z.
B. Leptospira interrogans, oralen und intestinalen Treponemen, aber auch durch weit entfernt verwandte
Bakterien wie z.B. E.coli gestrt werden. Da die Testantigene im allgemeinen aus Lysaten des gesamten
Erregers bestehen, werden auch Antikrper gegen sogenannte "common antigens" erfasst. Dabei
handelt es sich um weit verbreitete und in ihrer Sequenz stark konservierte Proteine, wie zum Beispiel
den "heat shock" Proteinen.
Eine Mglichkeit, die genannten Einschrnkungen zu umgehen, ist die Verwendung von
gentechnologisch erzeugten Antigenen, wie sie von MIKROGEN in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. B.
Wilske und Prof. V. Preac-Mursic am Max von Pettenkofer-Institut entwickelt wurden.
4.
Testprinzip
Fr den recomBlot Borrelia canis werden spezifische Borrelia burgdorferi Antigene mit Hilfe
rekombinanter E. coli Zellen hergestellt.
Die Verwendung rekombinanter Proteine bietet als Vorteile gegenber den herkmmlichen Lysatblots
die Mglichkeit der Prsentation von Proteinen, die primr in vivo exprimiert werden (z.B. VlsE) sowie
zur Kombination von Proteinen von verschiedenen Borrelien-Genospezies. Darber hinaus wird durch
die selektive Auswahl von spezifischen und fr die sensitive serologische Diagnostik wichtigen Antigene
der Einfluss von strenden oder kreuzreagierenden Antigenen minimiert.
Im Gegensatz zum rekombinanten Blot bleiben beim Immunoblot mit Lysat-Antigen aus Borrelia
burgdorferi Zellen die Antigene p100, p39, p18 und VlsE unterreprsentiert. Dies gilt um so mehr fr das
OspC-Antigen. Es wird nicht oder nur in sehr geringen Mengen von dem Borrelia burgdorferi Stamm B31
gebildet. Zudem kann im Lysatblot wegen der Vielzahl mglicher Banden die Unterscheidung von
immunrelevanten Banden und sog. common antigens, z.B. den heat shock Proteinen, sehr erschwert
sein.
Verwendet werden im recomBlot Borrelia canis neben den ueren Membran-Proteinen OspA (31kD)
und OspC (22kD), die sehr spezifischen Borrelia burgdorferi Antigene p100, VlsE, p39 und p18 (=
Decorin binding protein A, DbpA, = Osp17), des weiteren p41 (Flagellin) und ein spezifischer interner
Teil des p41 Antigens p41/i.
OspC, p18 und VlsE sind in vivo-Proteine, die in Kultur nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert
werden. Die rekombinante Technik bietet somit die Mglichkeit, diese Antigene in ausreichenden
Mengen anzubieten. Gleichzeitig knnen homologe Proteine von verschiedenen Genospezies in einem
Test angeboten werden. Dies kommt hauptschlich bei sehr heterogenen Proteinen wie dem OspC und
dem VlsE zum Tragen. Im recomBlot Borrelia canis werden die OspCs aller drei Genospezies
angeboten und darber hinaus von zwei verschiedenen Stmmen der Genospezies B. garinii, Stamm
T25 (OspA Serotyp 7) und Stamm 20047 (OspA Serotyp 0), im folgenden als OspC von B. garinii 1 und
B. garinii 2 bezeichnet.
Neben der sicheren Besttigung von Antikrpern gegen smtliche Borrelien- Genospezies bietet der
rekombinante Immunoblot Anhaltspunkte zur Unterscheidung zwischen Vakzinierung und Infektion.
Whrend gegen das OspA nach einer Infektion nur sehr selten Antikrper gebildet werden, entstehen
diese nach einer Impfung fast immer in hoher Konzentration. Im Gegensatz dazu finden sich Antikrper
gegen VlsE fast ausschlielich bei Infektionsverlufen infolge von Zeckenbissen, kaum dagegen nach
einer Vakzinierung.
Zum Nachweis von Borrelien-spezifischen Antikrpern werden die Streifen mit der verdnnten
Serumprobe inkubiert, wobei die Antikrper sich an die Antigene auf den Streifen anlagern. Nicht
gebundene Antikrper werden anschlieend abgewaschen und die Streifen in einem zweiten Schritt mit
anti-Hund-IgG bzw. IgM inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Mit einer durch die
Peroxidase katalysierten Frbereaktion werden spezifisch gebundene Antikrper nachgewiesen. Falls
eine Reaktivitt gegen eines der Borrelien-Proteine gefunden wird, erscheint diese als dunkle Bande auf
dem Streifen.
Als Reaktionskontrolle ist am oberen Ende der Streifen - unter der Nummer - eine Bande mit antiImmunglobulin aufgetragen, die bei jedem Serum eine Reaktion zeigen muss.
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MIKROGEN
5. Packungsinhalt
Die Reagenzien einer Packung reichen fr 20 Bestimmungen.
Jeder Reagenziensatz enthlt:
100 ml
Waschpuffer (fnffach konzentriert)

Enthlt Tris-Puffer, NaCl, Detergenz, Konservierungsmittel und Protein
5.1.
45 ml
Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig)
2 Stck
Inkubations-Schalen mit je 10 Vertiefungen
Vorentwickelter Kontrollstreifen (kitspezifisch)
Auswertebogen
Jeder Reagenziensatz enthlt zustzlich zu den unter Punkt 5 aufgefhrten Komponenten:

2 Stck
40 l
Rhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,

beschichtet mit rekombinant hergestellten Borrelia burgdorferiAntigenen
Schwachpositiv Serumkontrolle IgG (Weie Verschlusskappe)
Caniner Ursprung, enthlt 0,1% MIT und 0,1% Oxypyrion
40 l
Anti-Hund IgG Konjugat (Grne Verschlusskappe)

Aus Kaninchen, enthlt NaN3.
5.2.
Jeder Reagenziensatz enthlt zustzlich zu den unter Punkt 5 aufgefhrten Komponenten:

2 Stck
Rhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,

beschichtet mit rekombinant hergestellten Borrelia burgdorferiAntigenen
40 l
Schwachpositiv Serumkontrolle IgM (Gelbe Verschlusskappe)

Caniner Ursprung, enthlt 0,1% MIT und 0,1% Oxypyrion
65 l
Anti-Hund IgM Konjugat (Lila Verschlusskappe)

Aus Kaninchen, enthlt NaN3
6. Zustzlich bentigte Reagenzien und erforderliches Zubehr

Deionisiertes Wasser, Absaugsystem mit Desinfektionsfalle, Mikropipetten, Plastikpinzette, Schttler,
Messzylinder.
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MIKROGEN
7. Hinweise zum Test und den Reagenzien

7.1.
Vorsichtsmaregeln
Seren und Plasma sind als potentiell infektis zu behandeln.
* Whrend des gesamten Testablaufs mssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden.

* Die Konjugate enthalten Natriumazid. Eine Berhrung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu
vermeiden.
* Smtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektisen Proben in Berhrung kommen,
mssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 1 Stunde bei 121C
autoklaviert werden.
* Inkubationsschalen nur einmal verwenden.

* Streifen vorsichtig mit einer Plastikpinzette handhaben.
7.2.
Hinweise zur Handhabung
Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2C - 8C lagern, nicht einfrieren. Vor Testbeginn sind alle
Bestandteile fr mindestens 30 Minuten auf 18C - 25C (Raumtemperatur) zu temperieren. Die
Testdurchfhrung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur.
Vor Gebrauch die Kontrollseren sowie die konzentrierten Konjugate gut durchmischen. Die
Patientenseren ebenfalls gut mischen.
Das Rhrchen mit den Teststreifen ist erst unmittelbar vor Gebrauch zu ffnen, um eine
Kondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht bentigten Streifen verbleiben im Rhrchen und werden
weiterhin bei 2C - 8C gelagert (Rhrchen wieder gut verschlieen, Teststreifen drfen vor
Versuchsbeginn nicht feucht werden!).
Die Schwachpositiv Kontrolle muss bei jedem Versuchsdurchgang unabhngig von der Anzahl der zu
testenden Seren mitgefhrt werden. Nur so ist die korrekte Testinterpretation mglich.
Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualittsgarantie mehr
bernommen werden kann.
Es drfen nur Einzelreagenzien verwendet werden, deren Chargennummer mit der entsprechenden
Chargennummer auf dem Etikett der Kitverpackung bereinstimmt.
Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzufhren.
Bei substantiellen nderungen am Produkt, bzw. der Anwendungsvorschrift kann die Anwendung
auerhalb der von MIKROGEN vorgegebenen Zweckbestimmung liegen.
Automatisierung ist mglich, nhere Informationen erhalten Sie von MIKROGEN.
7.3.
Herstellung der Lsungen
7.3.1. Herstellung des gebrauchsfertigen Waschpuffers

Dieser Puffer wird fr die Serum- und Konjugatverdnnung sowie die Waschschritte bentigt.
Vor dem Verdnnen ist das Volumen des Waschpuffers fr die entsprechende Anzahl der
durchzufhrenden Teste zu bestimmen. Der Waschpuffer ist direkt vor der Verwendung herzustellen.
Das Waschpuffer-Konzentrat enthlt eine lsliche Proteinkomponente. Das Aufschtteln des Puffers ist
nicht notwendig.
Ein Teil des Waschpuffer-Konzentrats wird mit vier Teilen deionisiertem Wasser verdnnt (Verdnnung
1 + 4). Die bentigten Mengen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Volumina fr in der Tabelle nicht
aufgefhrte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln.
Nicht bentigter, gebrauchsfertiger Waschpuffer muss verworfen werden.
-4-
MIKROGEN
Tabelle 1: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen
eingesetzte
Teststreifen
WaschpufferKonzentrat
Deionisiertes
Wasser
gebrauchsfertiger
Waschpuffer
5 ml
20 ml
25 ml
10 ml
40 ml
50 ml
15 ml
60 ml
75 ml
25 ml
100 ml
125 ml
10
50 ml
200 ml
250 ml
15
75 ml
300 ml
375 ml
20
100 ml
400 ml
500 ml
7.3.2. Herstellung der Konjugatlsungen

Die Konjugatlsung fr die IgG- bzw. IgM- Bestimmung ist direkt vor Gebrauch herzustellen, eine
Lagerung der gebrauchsfertigen Konjugatlsung ist nicht mglich.
Pro Teststreifen werden 1,5 l Anti-Hund IgG Konjugat auf 2 ml gebrauchsfertigen Waschpuffer
verwendet (1: 1333).
Pro Teststreifen werden 3 l Anti-Hund IgM Konjugat auf 2 ml gebrauchsfertigen Waschpuffer verwendet
(1: 667)
Die in Tabelle 2 aufgefhrten Mengen sind einzusetzen. Volumina fr in der Tabelle nicht aufgefhrte
Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln.
Tabelle 2: Volumina der Anti-Hund-IgG und IgM-Konjugat-Verdnnung
Eingesetzte
Teststreifen
IgG-KonjugatKonzentrat
IgM-KonjugatKonzentrat
Gebrauchsfertiger
Waschpuffer
1,5 l
3 l
2 ml
3,0 l
6 l
4 ml
4,5 l
9 l
6 ml
7,5 l
15 l
10 ml
10
15,0 l
30 l
20 ml
15
22,5 l
45 l
30 ml
20
30,0 l
60 l
40 ml
* Die Mengen sind ohne Totvolumen berechnet. Je nach Abarbeitung (manuell bzw. an einem Gert) bitte zustzliche
Konjugatlsung fr 1 bis 3 Streifen ansetzen.
7.3.3. Substratlsung
Das Substrat ist gebrauchsfertig! Vor Beginn der Frbung auf Raumtemperatur (18C - 25C) bringen.
Eine Kontamination der nicht verwendeten Substratlsung durch unsterile Pipettenspitzen etc. muss
unbedingt vermieden werden, da dadurch die Sensitivitt des Testes beeintrchtigt werden kann.
7.4.
Lagerung und Haltbarkeit
Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2C - 8C lagern.

Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann nicht gelagert werden.
Die Konjugatlsung muss immer frisch zubereitet werden.
-5-
8.
MIKROGEN
Probenmaterial
Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, das nach Entnahme mglichst rasch vom
Blutkuchen getrennt wurde. Hitzeinaktivierte Proben knnen zu erhhten Hintergrundreaktionen fhren.
Eine mikrobielle Kontamination der Probe ist unbedingt zu vermeiden. Unlsliche Stoffe sind vor der
Inkubation durch Zentrifugation aus der Probe zu entfernen.
Die Verwendung von lipmischen, hmolytischen oder trben Proben kann einen dunklen Hintergrund
im recomBlot Borrelia canis IgG/IgM ergeben. Diese Proben knnen darber hinaus zu verflschten
Ergebnissen fhren und sollten daher nicht verwendet werden.
Achtung!
Sollen die Bestimmungen nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu 2 Wochen bei
2C - 8C aufbewahrt werden. Eine lngere Lagerung der Proben ist durch Aufbewahrung bei 20C oder tiefer mglich. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben wird wegen der
Gefahr fehlerhafter Resultate nicht empfohlen.
9.
9.1.
Testdurchfhrung
Allgemeines
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hngt in starkem Mae vom gleichmigen Waschen der
Streifen ab. Die unter 9.3 und 9.5 beschriebenen Waschfrequenzen sollen deshalb immer eingehalten
werden.
9.2.
Inkubation der Proben
1.
Fr jeden Testansatz wird eine Vertiefung einer Inkubationsschale bentigt. In die Vertiefungen
werden je 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers pipettiert.
2.
Probenzugabe
IgG- und IgM-Testdurchfhrung: 8 l einer unverdnnten Probe (Hundeserum oder -plasma) bzw.
der entsprechenden Schwachpositiv Kontrolle werden in die dafr vorgesehenen Vertiefungen
pipettiert (Verdnnung 1 + 250).
Die beiden Flssigkeiten werden durch vorsichtiges horizontales Schtteln homogenisiert.
3.
Einlegen der Teststreifen

In die nun mit Waschpuffer-Proben-Gemisch gefllten Vertiefungen wird vorsichtig je ein
Teststreifen mit Hilfe einer Plastikpinzette eingetaucht. Die Streifennummerierung zeigt nach oben.
Es sollte darauf geachtet werden, das durch die Pinzette keine Flssigkeiten verschleppt werden.
Achtung!
Die Streifen mssen vollstndig mit dem Waschpuffer-Proben-Gemisch benetzt und
untergetaucht sein.
Verwendete Rhrchennummer und Streifennummer im Auswertebogen notieren.
Probennummern und zu detektierende Immunglobulinklasse (IgG oder IgM) im Auswertebogen
notieren.
Die Inkubationsschale wird mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt und unter leichtem Schtteln
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Achtung!
Es ist darauf zu achten, dass die Inkubationslsungen nicht in andere Vertiefungen
verschleppt werden; insbesondere beim ffnen und Schlieen des Deckels sind Spritzer zu
vermeiden.
-6-
MIKROGEN
9.3.
Waschen
1.
Nach der Inkubation wird der Kunststoffdeckel vorsichtig von den Inkubationsschalen abgenommen.
2.
Die Serumverdnnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt.

Achtung!
Nach dem Absaugen der Lsungen aus einer Vertiefung sind die Pipettenspitzen zu
wechseln oder nach jedem Absaugvorgang gut mit deionisiertem Wasser zu splen, da die
Gefahr einer Verschleppung besteht.
Bei maschineller Abarbeitung sind diesbezglich die Hinweise des Gerteherstellers zu
beachten.
3.
In jede Vertiefung werden anschlieend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und fr

5 Minuten unter leichtem Schtteln auf dem Schttler gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird
der Waschpuffer abgesaugt.
4.
Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt viermal durchgefhrt.
9.4.
Inkubation mit Peroxidase-Konjugat
Nach dem Waschen der Streifen werden in jede Vertiefung 2 ml der entsprechend vorbereiteten
Konjugatlsung (siehe Tabelle 2) gegeben und 1 Stunde unter leichtem Schtteln bei Raumtemperatur
inkubiert. Dabei wird die Inkubationsschale mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt.
9.5.
Waschen
Die Konjugatlsungen werden aus den Vertiefungen abgesaugt und die Streifen erneut gewaschen
(vergleiche 9.3).
9.6.
Substratreaktion
In jede Vertiefung werden 1,5 ml Substratlsung gegeben und 5 - 10 Minuten unter leichtem Schtteln
und unter Beobachtung bei Raumtemperatur inkubiert.
Achtung!
Den Frbungsprozess beobachten, und alle Streifen so lange in der Substratlsung belassen, bis
bei den mit der Schwachpositiven Serumkontrolle inkubierten Streifen folgende Banden zu
erkennen sind:
bei der IgG-Detektion p100
bei der IgM-Detektion p41
Bei hochpositiven Seren kann es zu einer berreaktion der Frbung kommen. Es wird
empfohlen, bei solchen Streifen die Frbung vorzeitig zu beenden.
9.7.
Abstoppen der Reaktion
1.
Nach Absaugen der Substratlsung werden die Streifen dreimal kurz mit deionisiertem Wasser
gewaschen.
2.
Die Streifen werden vorsichtig mit einer Plastikpinzette aus dem Wasser entnommen und zum
Trocknen fr ca. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfhigen Papiers gelegt. Anschlieend knnen
die Streifen auf dem beigelegten Auswertebogen aufgeklebt und die Ergebnisse protokolliert
werden.
3.
Die Streifen sollten vor Licht geschtzt aufbewahrt werden.
-7-
MIKROGEN
10. Zusammenfassung der Testdurchfhrung

1.
alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen.
2.
2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer einpipettieren
3.
jeweils 8 l von
homogenisieren
4.
vorsichtig die Streifen einlegen, die Streifen mssen komplett untergetaucht sein.
5.
Mit dem Deckel abdecken und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schtteln
inkubieren
6.
den Deckel vorsichtig abnehmen und die Flssigkeit aus den Vertiefungen absaugen
(Verschleppung vermeiden!).
7.
viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schttler waschen
8.
2 ml gebrauchsfertige Konjugatlsung zugeben und 1 Stunde unter leichtem Schtteln

abgedeckt inkubieren
9.
viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schttler waschen
10.
1,5 ml der Substratlsung zugeben; 5 - 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem

Schtteln inkubieren. Sollbanden siehe 9.6.
11.
mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen
12.
2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfhigen Papiers trocknen und das Ergebnis ablesen
der
Probe
bzw.
Schwachpositiv
Kontrolle
einpipettieren,
vorsichtig
11. Auswertung
11.1.
Bewertung der Bandenintensitt
1. Bei jeder Testdurchfhrung muss unabhngig von der Anzahl der Proben die SchwachpositivSerumkontrolle mitgefhrt werden. Die Schwachpositive Serumkontrolle dient zur Abgrenzung der
Reaktivitt von der Hintergrund-Reaktivitt (Cutoff).
2. Notieren Sie im beigefgten Auswertebogen Datum, Chargen- und Rhrchen-Nummer, sowie die
detektierte Antikrperklasse.
3. Tragen Sie die Proben-Identifizierungs-Nummern in das Protokollblatt ein.
4. Kleben Sie nun mit einem Klebestift die dazugehrigen Teststreifen in die entsprechenden Felder
des Auswertebogens. Richten Sie dazu die Teststreifen mit der Inkubations-Kontrollbande an der
eingezeichneten Markierungslinie aus. Kleben Sie dann mit einem durchsichtigen Klebeband die
Teststreifen links von der Markierungslinie an. Flchiges Ankleben der ganzen Teststreifen mit
Klebestift oder Klebeband kann zu Vernderungen der Frbung fhren.
5. Den vorentwickelten Kontrollstreifen mit den markierten Antigenbanden zur Orientierung an die
aufgeklebten Teststreifen legen, und die reagierenden Banden identifizieren. Der vorentwickelte
Kontrollstreifen ist kitspezifisch und stammt aus demselben Nitrozellulose-Block wie die Teststreifen
im Testkit. Die Molekulargewichte bzw. die Bezeichnungen der Antigenbanden sind markiert.
6. Die Bandenintensitten auf dem Probenstreifen werden im Vergleich zur Schwachpositiv-Kontrolle
gesondert fr jede Immunglobulinklasse bewertet (s. 11.2 bzw. Tabelle 3) und in den Auswertebogen
eingetragen.
-8-
MIKROGEN
11.2.
Kontrollergebnisse
Das Mitfhren der Schwachpositiv Kontrolle ist unerlsslich. Dabei sollen die Testbedingungen
(Sensitivitt) geprft und die Reaktivitt mit den einzelnen Antigenbanden besttigt werden. Die
Lokalisation der Banden muss mit dem beigefgten Kontrollstreifen bereinstimmen.
Die Kontrollbande unterhalb der Streifennummer dient zur berprfung der Testdurchfhrung, und muss
in jedem Fall eine deutliche Frbung zeigen.
Die mit der Schwachpositiv-Serumkontrolle inkubierten Teststreifen sollen nachfolgende Bandenmuster
aufzeigen.
IgG-Schwachpositiv-Kontrolle:
OspA
OspC
p41/i p41/i
p18
B.afzelii
p39
B.garinii
p41
B. garinii 2
p100
B. garinii 1
Reaktions-Ktr.
B. sensu stricu
+ B. afzelii
Es sollen folgende Banden zu sehen sein: Inkubationskontrolle, p100

Schwache Reaktivitt gegen andere Antigene kann vorhanden sein.
Zur Bewertung der Bandenintensitten wird beim IgG-Test die Intensitt der p100-Bande der
Schwachpositiv Kontrolle IgG herangezogen.
IgM-Schwachpositiv-Kontrolle:
OspA
OspC
p41/i
p41/i
p18
B.afzelii
p39
B.garinii
p41
B. garinii 2
p100
B. garinii 1
Reaktions-Ktr.
B. sensu stricu
+ B. afzelii
Es sollen folgende Banden zu sehen sein: Inkubationskontrolle, p41

Schwache Reaktivitt gegen andere Antigene kann vorhanden sein.
Zur Bewertung der Bandenintensitten wird beim IgM-Test die Intensitt der p41-Bande der
Schwachpositiv Kontrolle IgM herangezogen.
Tabelle 3: Bandenintensitt
Banden
Intensitt
keine Reaktion
geringere Intensitt als bei der Schwachpositiv- Kontrolle
+/-
gleiche Intensitt wie bei der Schwachpositiv- Kontrolle (Cutoff)
strkere Intensitt als bei der Schwachpositiv- Kontrolle
++
11.3.
Testergebnisse und Testinterpretation
Zur sicheren und einfachen Testauswertung wurde auf Grund von klinischen Evaluierungen und einer
mathematischen Analyse eine Punktebewertung der B. burgdorferi-Antigene im recomBlot Borrelia
canis durchgefhrt. Darauf basierend kann das Testergebnis durch Summierung der Punkte und
anschlieende Beurteilung erhalten werden.
-9-
MIKROGEN
11.3.1. IgG-Testauswertung
Das Testergebnis erhlt man durch Addition der entsprechenden Punktwerte der einzelnen Banden
(Tabelle 4 und Tabelle 5) Die resultierende Summe wird in die Spalte mit dem Summenzeichen
eingetragen. Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und
in die Spalte Beurteilung eingetragen werden. Dabei ist es unerheblich, wie stark die Reaktion
ausgefallen ist, die Punktwerte sind fr die + und ++ Reaktion gleich. Zu beachten ist, dass fr die
Reaktion der OspCs nur einmal der Punktwert berechnet werden darf, unabhngig davon, welche
und wie viele der drei OspCs reagieren.
Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und in die Spalte
Beurteilung eingetragen werden.
Tabelle 4: Punktebewertung der B. burgdorferi-Antigene im recomBlot Borrelia canis IgG
Protein/ Antigen
Name
Funktion/ Herkunft
Punkte
Molekulargewicht [kDa]
100
p100
B. afzelii
66*
VlsE
Fusionsprotein, reprsentiert die

immundominanten VlsE-Epitope von
verschiedenen Genospezies
41
p41
39
BmpA
31
OspA
Flagellin
B. burgdorferi sensu stricto
B. afzelii
Oberflchenprotein
B. afzelii
1
8
4
Oberflchenprotein
22
OspC
20
p41/i
18,5
p41/i
18
p18
B. garinii 1,
B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto,
B. garinii 2
Spezifischer interner Teil des Flagellins
Stamm B. garinii
Spezifischer interner Teil des Flagellins
Stamm B. afzelii
Oberflchenprotein
B. afzelii
1
1
8
*Das VlsE wird als 40 kDa Lipoprotein beschrieben. Im recomBlot Borrelia canis liegt VlsE als Fusionsprotein mit
66 kDa vor.
Tabelle 5: Beurteilung der Testergebnisse IgG

Summe der Punkte
Beurteilung IgG
<5
negativ
5-6
fraglich
>6
positiv
- 10 -
MIKROGEN
11.3.2. IgM-Testauswertung
Das Testergebnis erhlt man durch Addition der entsprechenden Punktwerte der einzelnen Banden
(Tabelle 6 und Tabelle 7). Die resultierende Summe wird in die Spalte mit dem Summenzeichen
eingetragen. Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und
in die Spalte Beurteilung eingetragen werden. Dabei ist es unerheblich, wie stark die Reaktion
ausgefallen ist, die Punktwerte sind fr die + und ++ Reaktion gleich. Zu beachten ist, dass fr die
Reaktion der OspCs nur einmal der Punktwert berechnet werden darf, unabhngig davon, welche
und wie viele der drei OspCs reagieren.
Die positive, fragliche oder negative Beurteilung der Probe kann dann direkt bestimmt und in die Spalte
Beurteilung eingetragen werden.
Tabelle 6: Punktebewertung der B. burgdorferi-Antigene im recomBlot Borrelia canis IgM
Protein/ Antigen
Name
Funktion/ Herkunft
Punkte
Molekulargewicht [kDa]
100
p100
B. afzelii
66*
VlsE
Fusionsprotein, reprsentiert die

immundominanten VlsE-Epitope von
verschiedenen Genospezies
41
p41
39
BmpA
31
OspA
Flagellin
B. afzelii
Oberflchenprotein
B. afzelii
0
3
4
Oberflchenprotein
22
OspC
20
p41/i
18,5
p41/i
18
p18
B. garinii 1,
B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto,
B. garinii 2
spezifischer interner Teil des Flagellins
Stamm B. garinii
spezifischer interner Teil des Flagellins
Stamm B. afzelii
Oberflchenprotein
B. afzelii
1
1
3
*Das VlsE wird als 40 kDa Lipoprotein beschrieben. Im recomBlot Borrelia canis liegt VlsE als Fusionsprotein mit
66 kDa vor.
Tabelle 7: Beurteilung der Testergebnisse IgM

Summe der Punkte
Beurteilung IgM
<7
negativ
fraglich
>7
positiv
- 11 -
11.4.
MIKROGEN
Hinweise zur Interpretation
Ein negatives recomBlot Borrelia canis-Testresultat kann eine Infektion mit Borrelia burgdorferi nicht
in jedem Fall ausschlieen. Insbesondere in der frhen Infektionsphase knnen Antikrper noch nicht
oder in nicht nachweisbarer Menge vorhanden sein. Antibiotikabehandlung im frhen Stadium kann eine
Bildung von nachweisbaren Antikrpern verhindern. Bei klinischem Verdacht auf Lyme Borreliose und
negativem bzw. fraglichem Serumbefund sollte nach drei Wochen eine erneute Probenentnahme und
Testung erfolgen.
Bei Proben aus der frhen Infektionsphase berwiegen in der Regel Antikrper der IgM-Klasse. Fr die
frhe Immunantwort (IgM) kann eine Reaktion mit OspC und p41, aber auch VlsE auftreten. Bei Seren
aus spten Stadien der Infektion (IgG) kommt es, neben der auch hier auftretenden Reaktion von OspC
und p41, zumeist zu einer starken Reaktion mit p100 und oft auch VlsE. Die Antikrperbildung kann
durch Borrelioseschutzimpfungen beeinflusst werden. Dabei werden in der Regel Antikrper gegen
OspA gebildet, die bei natrlichen Infektionen nur selten auftreten.
Ein positives Ergebnis im recomBlot Borrelia canis IgG bedeutet nicht in jedem Fall, dass eine aktive
Lyme Borreliose vorliegt. Da IgG-Antikrper lngere Zeit persistieren, knnen noch Antikrper einer
zurckliegenden Borrelia burgdorferi-Infektion nachweisbar sein.
Serologische Testergebnisse sollten immer im Zusammenhang mit dem klinischen Bild gesehen werden.
Bei unklaren oder fraglichen serologischen Ergebnissen wird eine erneute Testung im zeitlichen Verlauf
der Infektion empfohlen.
12. Evaluierung
In Infektionsstudien* wurden Hunde mittels Zecken mit Borrelien infiziert und der Infektionsverlauf
anhand der klinischen Erscheinungen sowie der histopathologischen und kulturellen Befunde
dokumentiert. Zustzlich wurde der Serostatus der Hunde mit dem recomBlot Borrelia canis bewertet.
Vor dem Zeckenkontakt waren die Hunde nicht mit Spirochaeten infiziert. Es konnte gezeigt werden,
dass in der Frhphase hufig nur Antikrper gegen das Membranprotein OspC, das Flagellin p41, aber
auch gegen VlsE gebildet werden. Diese Proteine scheinen beim Hund immundominant fr die IgMAntwort zu sein. Dabei weisen anti-OspC- und anti-VlsE-Antikrper gegenber anti-p41-Antikrpern eine
wesentlich grere Spezifitt auf. Im weiteren postinfektionren Verlauf werden IgG-Antikrper gegen
die Antigene p100, VlsE und p39 gebildet, whrend die anti-OspC-IgG-Antikrper einen meist
abnehmenden Titer zeigen. Nur in einem einzigen Fall wurden IgG-Antikrper gegen OspA gefunden.
Tabelle 8: Nachweis der Serokonversion nach der experimentellen Infektion
Anzahl infizierter Hunde
17
recomBlot Borrelia canis

positiv
negativ
16
11)
1)
Bei diesem Hund konnte weder eine Serokonversion mit dem recomBlot Borrelia canis noch eine
klinische Symptomatik beobachtet werden.
* Dankenswerterweise von Herrn Dr. R. Straubinger/ Universitt Leipzig zur Verfgung gestellt
Eine Zufallsauswahl von 106 Jagdhundeseren aus Sdwestdeutschland** zeigt mit dem recomBlot
Borrelia canis folgende Ergebnisse (Tabelle 9).
- 12 -
MIKROGEN
Tabelle 9: Seren ohne klinische Verdachtsdiagnose einer Infektion mit Borrelia burgdorferi.
Anzahl
positiv
58
54,7
fraglich
4,7
negativ
43
40,6
gesamt
106
100
Anzahl
positiv
6,6
fraglich
0,9
negativ
98
92,5
gesamt
106
100
** Diplomarbeit von Frau Sandra Wittmann / Fachbereich Wildbiologie, Jagdkunde, Hochschule fr Forstwirtschaft
Rottenburg, zur Lyme-Borreliose bei Jagdhunden
Im Rahmen einer Impfstudie***, in der neun Hunde vor und nach einer Borrelioseschutzimpfung
(Impfstoff Merilym) mit dem recomBlot Borrelia canis untersucht wurden, fhrte die Impfung in acht
Fllen zur Entwicklung einer starken IgG-Immunantwort gegen OspA; in nur einem einzigen Fall wurden
durch die Impfung schwache anti-VlsE-IgG-Antikrper induziert.
*** Die Studie wurde in Zusammenarbeit mit den Firmen MedPharm GmbH und Merial GmbH durchgefhrt.
13. Literatur
Die ausfhrliche Literaturliste finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation ab Seite 3.
Auf Anforderung senden wir Ihnen gerne weiterfhrende Literatur zur Borrelien-Diagnostik zu.
14. Erklrung der Symbole

Die Tabelle mit der Erklrung der Symbole finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation auf
Seite 3.
- 13 -
recomBlot Borrelia IgG/IgM
Instructions for use
MIKROGEN

Immunoblot test, with recombinant produced antigens separated by gel electrophoresis, for the
determination of IgG and IgM antibodies against Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii and B.
afzelii in canine serum or plasma.
1. General Aspects
recomBlot Borrelia canis is a qualitative in vitro test for the detection and safe identification of IgG or
IgM antibodies against Borrelia burgdorferi in canine serum or plasma. recomBlot Borrelia canis is
used to confirm the results obtained from samples that have proved positive in the screening test. Unlike
enzyme immunoassays or spot tests, this test permits the safe identification and localisation of specific
antibodies because the antigens are electrophoretically separated. Antibodies against particular antigens
can provide further indication of the stage of the infection.
2. Borrelia burgdorferi and Lyme Borreliosis

The bacterium Borrelia burgdorferi belongs to the family Spirochaetaceae and is the etiologic agent of
Lyme borreliosis. This pathogen was first reported and characterised by W. Burgdorfer and A. Barbour in
1982. It is transmitted by various tick species of the genus Ixodes. In Europe, the vector is the tick
Ixodes ricinus. Lyme borreliosis is the most common tickborne infectious disease of human beings and
domestic animals in the world. It occurs in all areas of Germany and, unlike the early summer
meningoencephalomyelitis, is not restricted to a few endemic regions.
The rates of ticks infected by Borrelia varies depending on the region, e.g. in Germany from 10% in the
North to 30% in the South.
Lyme borreliosis was described by A. Steere in the United States in 1977. Similar as in human beings
the clinical symptoms of borreliosis in dogs are variform:
disturbed general condition, fever, pains, apathies and anorexia (approx. 48 %)
acute and chronic recidivating monoarthritis and polyarthritis (approx. 20 %)
unclear lameness (approx. 48 %)
neurological functional deficiencies, like e.g. ataxia, muscle tremor, tortikollis, neck spines shoulder
syndrome, tetraplegia (approx. 24 %)
dermatological changes, combined with pyodermia, erythema and itch (approx. 8 %)
rare symptoms are lymphadenopathia, myocarditis, myositis, iritis, panophtalmia, glomerulonephritis.
This variety of symptoms in the canine borreliosis and the similarity between the manifestations of Lyme
borreliosis and other diseases of dogs poses a big diagnostic challenge.
3. Diagnosis
Apart from clinical diagnosis, direct cultivation of Borrelia burgdorferi (pathogen detection) is the safest
proof of infection. Cultivation from skin samples is successful in 50 - 70 % of cases with skin
manifestations, but they are hardly to localise because of dogs skin. However, cultivation is difficult and
very time consuming and, therefore, can be performed only in special laboratories.
For this reason, serological testing is the most convenient solution for the routine laboratory. The indirect
immunofluorescence test (IFT), the indirect hemagglutination test (IHA) and enzyme immunoassays
(EIA) are used. The serological result depends on the stage of the disease, duration of symptoms and a
possible previous antibiotic therapy or vaccination against Borrelia burgdorferi.
In comparison with the immunological test methods mentioned above, the immunoblot exhibits additional
criteria with regard to sensitivity and specificity. It allows the detection and identification of IgM and IgG
antibodies and is used to confirm the results of the indirect immunofluorescence and enzyme
immunoassay.
- 14 -
MIKROGEN
recomBlot Borrelia canis IgG/IgM
The use of different strains of Borrelia burgdorferi as antigen can result in varying EIA results. The
tests mentioned above frequently fail in the early stage. Another problem is the cross reactivity with
various other Spirochaetaceae, e.g. Leptospira interrogans, oral and intestinal Treponemae, but also
with distantly related bacteria e.g. E. coli. Since the test antigens generally consist of lysates of the
whole pathogen, antibodies against common antigens are also detected. These are widely distributed
proteins that have a highly conserved sequence, e.g., heat shock proteins.
All these limitations can be avoided by the use of antigens produced by genetic engineering, as
developed by MIKROGEN in collaboration with Prof. Dr. B. Wilske and Prof. V. Preac-Mursic at the Max
von Pettenkofer Institute.
4. Test Principle
For the recomBlot Borrelia canis, specific Borrelia burgdorferi antigens are produced with the help of
recombinant E. coli cells.
The use of recombinant proteins has the advantages over conventional lysate blots that proteins can be
presented that are expressed in vivo primarily and that protein combinations from different Borrelia
genospecies can be offered in one test. Furthermore the selection of specific antigens that are important
for the sensitive serological diagnosis minimises the influence of disturbing or cross reactive antigens.
In contrast to the recombinant blot, in the immunoblot with lysate antigen from Borrelia burgdorferi cells
the antigens p100, p39, p18 are underrepresented. This applies even more in the case of the OspC
antigen. It is not produced by the Borrelia burgdorferi strain B31, or in very small amounts only. Also, the
many different potential bands in the lysate blot can make it very difficult to differentiate immunorelevant
bands from so-called common antigens, e.g. heat shock proteins.
The antigens used in recomBlot Borrelia canis, in addition to the outer surface proteins OspA (31kD)
and OspC (22kD), include the highly specific Borrelia burgdorferi antigens p100, p39 and p18 (=decorin
binding protein A, DbpA = OspC17), as well as p41 (flagellin) and a specific internal part of the p41
antigen (p41/i).
OspC, VlsE and p18 are in vivo proteins, that are not expressed in culture, or only in very small amounts.
Thus the recombinant technique makes it possible to provide these antigens in sufficient amounts. At the
same time, homologues proteins from different genospecies can be offered in one test. This applies in
particular in the cases of highly heterogeneous proteins such as OspC. In recomBlot Borrelia canis,
the OspCs of all three genospecies are offered, plus those from two different strains of the genospecies
B. garinii, strain T25 /OspA serotype 7) and strain 20047 (OspA serotype 0), designated below as OspC
from B. garinii 1 and B. garinii 2.
Besides the safe identification of antibodies against all relevant Borrelia genospecies the recombinant
immunoblot provides an indication for the distinction between vaccination and infection. Whereas
antibodies against OspA are developed rarely in the course of an infection, they are formed after an
vaccination almost always in high concentrations. In contrast, antibodies against VlsE are found in high
frequency in the course of infections after tick bites, but seldom after a vaccination.
For the detection of Borrelia specific antibodies, the strips are incubated with the diluted serum sample,
whereby the antibodies bind to the antigens on the strip. Unbound antibodies are then flushed away and
the strips are incubated in a second step with anti-dog IgG or IgM coupled with horse radish peroxidase.
Specifically bound antibodies are detected by means of colour reaction catalysed by the peroxidase. If
an antigen-antibody reaction has taken place, a dark band appears at the corresponding locus on the
strip.
As a control for proper serum incubation, anti-dog immunoglobulin is applied below the identification
number of the strip. This reaction control band must show a reaction to every serum.
- 15 -
MIKROGEN
5. Package contents
The reagents in a pack are sufficient for 20 determinations.
Each reagent set contains:
100 ml
Wash buffer (five times the concentration)

Contains Tris buffer, NaCl, detergent, preservative and protein
45 ml
Substrate solution Tetramethylbenzidin (TMB, ready-to-use))
2 pieces Incubation trays with 10 wells each
5.1.
Predeveloped control strip (kit specific)
Evaluation form
Additionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains:
2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test strips
coated with Borrelia burgdorferi antigens
40 l
Weak positive serum control IgG (white screw cap)

Canine origin, contains 0,1% MIT and 0,1% Oxypyrion
40 l
Anti-dog IgG conjugate (green screw cap)

From rabbit, contains NaN3
5.2.
Additionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains:
2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test strips
coated with Borrelia burgdorferi antigens
40 l
Weak positive serum control IgM (yellow screw cap)

Canine origin, contains 0,1% MIT and 0,1% Oxypyrion
65 l
Anti-dog IgM conjugate (lilac screw cap)

From rabbit, contains NaN3
6. Additional reagents and accessory equipment required

Deionised water, vacuum extraction system with disinfection trap, micro pipettes, plastic forceps, shaker,
metric cylinder with graduations.
7. Information on test and reagent

7.1.
Precautions
Sera and plasma are to be treated as being potentially infectious.
* Suitable single-use gloves must be worn during the entire test procedure.
* The conjugates contain sodium azide. Avoid contact with skin or mucosa.
* All reagents and materials contaminated with potentially infectious samples must be treated with
suitable disinfectants or autoclaved at 121C for at least 1 hour.
* Use incubation trays once only.

* Handle strips carefully with a plastic forceps.
- 16 -
MIKROGEN
7.2.
Handling information
Store reagents before and after use at 2C - 8C, do not freeze. Temper all components before starting
the test for at least 30 minutes to 18C - 25C (room temperature). Both the test and incubation
procedures are carried out at room temperature.
Mix the control sera and concentrated conjugates well before use. Mix the patient sera well before use
as well.
Do not open the tube containing the test strips until just before use to avoid condensation of water. The
strips that are not used must be left in the tube and stored further at 2C - 8C (reclose tube tightly, test
strips must not become moist before testing!).
Weak positive controls must always be run parallel to the sera being tested, regardless of how many
sera are tested. This is the only way to ensure correct test interpretation.
A quality guarantee can only be given up to the expiry date on the packages.
Only reagents with lot numbers corresponding to the respective lot number on the label of the kit
package may be used.
The test must be performed by well-trained and authorised qualified personnel.
In case of substantial modifications of the product or the instructions for use, the application of the test
might differ from the purpose intended by MIKROGEN.
Automation is possible, please refer to MIKROGEN for details.
7.3.
Preparation of solutions
7.3.1. Preparation of ready-to-use wash buffer

This buffer is used for serum and conjugate incubation as well as for the washing steps.
Prior to dilution, the volume of wash buffer required for the corresponding number of tests must be
determined. Prepare the ready-to-use wash buffer immediately prior to use.
The wash buffer concentrate contains a soluble protein component. It is not necessary to shake up the
buffer.
One part of wash buffer concentrate is diluted with four parts of deionised water (dilution 1 + 4). See
Table 1 for the amounts required. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to be
determined by calculation.
Ready-to-use wash buffer not needed has to be discarded.
Table 1: Wash buffer per test strip used
Test strips
used
Wash buffer
concentrate
Deionised water
Ready-to-use wash
buffer
5 ml
20 ml
25 ml
10 ml
40 ml
50 ml
15 ml
60 ml
75 ml
25 ml
100 ml
125 ml
10
50 ml
200 ml
250 ml
15
75 ml
300 ml
375 ml
20
100 ml
400 ml
500 ml
- 17 -
MIKROGEN
7.3.2. Preparation of the conjugate solutions

The conjugate solution for the IgG resp. IgM test has to be prepared immediately before use. It is not
possible to store the ready-to-use conjugate solution.
Per test strip 1.5 l anti-dog IgG conjugate in 2 ml ready-to-use-wash buffer are to be used (1: 1333).
Per test strip 3 l anti-dog IgM conjugate in 2 ml ready-to-use-wash buffer are to be used (1: 667).
The amounts used are listed in Table 2. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to
be determined by calculation.
Table 2: Volumes for anti-human IgG resp. IgM conjugate dilution
Test strips
used
IgG conjugate
concentrate
IgM conjugate
concentrate
Ready-to-use wash
buffer
1,5 l
3 l
2 ml
3,0 l
6 l
4 ml
4,5 l
9 l
6 ml
7,5 l
15 l
10 ml
10
15,0 l
30 l
20 ml
15
22,5 l
45 l
30 ml
20
30,0 l
60 l
40 ml
* The volumes have been calculated without dead volume. Depending on handling (manually or by machine processing) please
prepare conjugate solution for additional 1 to 3 strips.
7.3.3. Substrate solution

The substrate is ready for use! Bring to room temperature (18C - 25C) before starting the colour
reaction.
Avoid contamination of the unused substrate solution by nonsterile pipette tips, etc. at all costs since this
may affect test sensitivity.
7.4.
Storage and stability
Store reagents at 2C - 8C before and after use.

Ready-to-use wash buffer cannot be stored.
The conjugate solution is to be prepared always freshly.
8. Sample material
The sample material can be serum or plasma that is separated from the coagulum as soon as possible
after sampling. Heat-inactivated samples may result in raised background reaction levels. A microbial
contamination of the sample has to be avoided at all costs. Insoluble substances have to be removed
from the sample prior to incubation by centrifugation.
Use of lipaemic, haemolytic or turbid samples may result in a dark background in the recomBlot
Borrelia canis IgG/IgM. These samples may also result in false results and should therefore not be
used.
Important!
If the tests are not carried out immediately, the samples can be stored for up to 2 weeks at 2C 8C. Longer storage of the samples is possible at -20C or below. Repeated freezing and thawing
of the samples is not recommended because this may affect the quality of the results.
- 18 -
MIKROGEN
9. Test Procedure
9.1.
General
The reproducibility of the results depends to a great extent on consistent washing of the strips. The
washing frequencies described under 9.3 and 9.5 should therefore always be maintained.
9.2.
Incubation of samples
1.
One well in the incubation tray is required per sample to be tested. 2 ml of ready-to-use wash buffer
is pipetted into each well.
2.
Adding the samples

IgG and IgM test procedure: 8 l of the undiluted sample (canine serum or plasma) resp. of the
corresponding weak positive control are to be pipetted into the proper well (dilution 1 + 250).
The liquids are homogenised by careful horizontal shaking.
3.
Adding the test strips

With the help of plastic forceps, one test strip is carefully dipped into each of the wells filled with
mixture of ready-to-use wash buffer and sample. The number of the strip must face upwards. Avoid
carry over of liquids by using the forceps.
Important!
The strip must be completely wet and immersed in the mixture of ready-to-use wash buffer
and sample.
Record the tube and strip numbers used on the evaluation sheet.
Record the sample numbers and the immunoglobulin class (IgG or IgM) on the evaluation sheet.
Cover the incubation tray with the plastic lid and incubate for 2 hours at room temperature while
shaking gently.
Important!
Make sure the incubation solutions are not carried over into other wells; be particularly
careful to avoid splashing when opening and closing the lid.
9.3.
Washing
1.
Following incubation, the plastic lids are carefully removed from the incubation trays.
2.
The serum dilution is carefully aspirated from the individual wells.

Important!
When the solutions have been aspirated from a well, the pipette tip has to be changed or
rinsed well with deionised water after each aspiration procedure to prevent carry over.
In the case of machine processing the references of the equipment manufacturer have to be
considered.
3.
Then add 2 ml of the ready-to-use wash buffer in each well and wash in the shaker while shaking
gently for 5 minutes. The wash buffer is aspirated after the washing procedure.
4.
Carry out the washing step under 3 a total of four times.
9.4.
Incubation with peroxidase conjugate
After washing the strips, add 2 ml of the appropriately prepared conjugate solution (see Table 2) into
each well and incubate for 1 hour while shaking gently at room temperature, whereby the incubation tray
is covered with the plastic lid.
9.5.
Washing
The conjugate solutions are aspirated from the wells and the strips are washed again (see 9.3).
- 19 -
9.6.
MIKROGEN
Substrate reaction
Add 1.5 ml substrate solution into each well and incubate for 5 - 10 minutes, shaking gently and under
observation at room temperature.
Important!
Observe the colour reaction process and leave all strips in the substrate solution until the strips
incubated with the weak positive serum control show the following bands:
IgG detection: p100
IgM detection: p41
The colour reaction may be excessive with highly positive sera. Recommendation: Stop the
colour reaction in such strips earlier.
9.7.
Stopping the reaction
1. After the solution is aspirated, wash the strips briefly three times with deionised water.
2. Use a plastic forceps to remove the strips carefully from the water and place them between 2 layers of
absorbent paper to dry for about 2 hours. The strips may be adhesively attached to the enclosed
evaluation sheet and the results may be entered in the protocol.
3. The strips should be stored protected from exposure to light.
10. Summary of the test procedure

1.
bring all reagents to room temperature
2.
pipette 2 ml of the ready-to-use wash buffer
3.
8 l of the undiluted sample resp. of the weak positive control is pipetted into the designated
well. Homogenise the sample with the pipetted buffer
carefully place the test strips into the wells. The strips must be completely immersed in the
liquid
5.
cover the incubation tray and incubate at room temperature for 2 hours while shaking
gently
6.
carefully remove the lid and withdraw the liquid from the wells (avoid carry over).
wash on the shaker four times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time
8.
add 2 ml appropriately prepared conjugate solution and incubate at room temperature for
1 hour while shaking gently
9.
wash on the shaker four times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time
10
add 1.5 ml of the substrate solution, incubate while shaking at room temperature for
5 10 minutes. Bands see 9.6.
11. wash the strips at least three times with deionised water
12. dry the strips between 2 layers of absorbent paper for 2 hours and read off the result
- 20 -
MIKROGEN
11. Evaluation
11.1.
Evaluation of band intensity
1. A weak positive control must be included in each test run, irrespective of the number of samples. The
reactivity of the weak positive control serves as cutoff and as a discrimination from the background
reactivity.
2. On the attached evaluation sheet, record the date, batch and tube number, and the detected
antibody class.
3. Enter the sample identification number on the protocol sheet.
4. Now attach the corresponding test strips with a glue stick into the corresponding fields of the
evaluation sheet. To do this, place the test strips with the reaction control band on the marking lines.
Then use clear adhesive tape to attach the test strips left from the marking line. Complete sticking of
the test strip with glue or adhesive tape may lead to aberrations of the colouring.
5. Place the predeveloped control test strip with the labelled antigen bands on the fixed test strips in
such a way that the incubation control bands are aligned. The predeveloped test strip is kit specific
and comes from the same nitrocellulose sheet as the test strips in the test kit. The molecular weights
and names of the antigen bands are marked.
6. Band intensities are assessed by comparison with the weak positive control separately for each
immunoglobulin class (refer to 11.2 resp. Table 3). Please record the values in the evaluation sheet.
11.2.
Control results
Weak positive controls must always be run parallel to the sera being tested. The test conditions
(sensitivity) are to be examined and reactivity with the individual antigen bands are to be confirmed. The
localisation of the antigen bands must agree with the attached control strip (kit specific).
The control band (reaction control) below the strip number is used to check the correct performance of
the test. This band must show a distinct colouring.
The test strips incubated with the weak positive serum control should show the following band patterns.
IgG Weak Positive Control:
OspA
OspC
p41/i p41/i
p18
B.afzelii
p39
B.garinii
p41
B. garinii 2
p100
B. garinii 1
Reaction-Ctrl.
B. sensu stricto
+ B. afzelii
The following bands should be visible: reaction control, p100

Weak reactivity against other antigens may be visible.
All bands are evaluated with reference to the p100 band of the weak positive control.
IgM Weak Positive Control:
OspC
p41/i
p41/i
p18
B.afzelii
OspA
B.garinii
p39
B. garinii 2
p41
B. garinii 1
p100
B. sensu strico
+ B. afzelii
The following bands should be visible: Reaction control, p41

Weak reactivity against other antigens may be visible.
All bands are evaluated with reference to the p41 band of the weak positive control.
- 21 -
MIKROGEN
Table 3: Band intensity

Bands
Intensity
no reactivity
intensity weaker than the weak positive control
+/-
same intensity as with the weak positive control (Cutoff)
stronger Intensity than with the weak positive control
++
11.3.
Test Results and Test interpretation
On the basis of clinical testing and a mathematical analysis a point evaluation of B. burgdorferi antigens
in recomBlot Borrelia was carried out for safe and easy test evaluation. According to this, the test result
can be obtained by adding up the points and subsequent evaluation.
11.3.1. IgG Evaluation
The test result is obtained by the addition of the point values of the separate bands, that are determined
as + or ++. (Table 4 and Table 5). The resulting total of points is to be entered into the column, marked
with the sign for sums. Regardless the intensity of the reaction, whether assigned as + or ++, the point
values remain the same. It should be noted, that the point value for the OspC`s must be calculated
only once, even if all 3 OspC-bands will react.
Finally the positive, borderline or negative result can be determined depending on the point value and
entered into the column evaluation.
Table 4: Point evaluation of B. burgdorferi antigens in recomBlot Borrelia canis IgG
Protein/ Antigen
Molecular weight
[kDa]
Name
Function/ Origin
Points
100
p100
B. afzelii
66*
VlsE
Fusion protein, represents the immunodominant

VlsE epitopes of different genospecies
41
p41
Flagellin
IgG

39
BmpA
B. afzelii
31
OspA
Surface protein
B. afzelii
22
OspC
Surface protein
B. garinii 1
B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii
B. garinii 2
20
p41/i
Specific part of Flagellin
B. garinii
18,5
p41/i
B. afzelii
18
p18
Surface antigen
B. afzelii
* VlsE is described as 40 kDa lipoprotein. In recomBlot Borrelia canis a VlsE fusion protein with 66 kDa is used.
- 22 -
MIKROGEN
Table5: Test evaluation IgG

Sum of points
Evaluation IgG
<5
negative
5-6
borderline
>6
positive
11.3.2. IgM Evaluation

The test result is obtained by the addition of the point values of the separate bands, that are determined
as + or ++. (Table 6 and Table 7). The resulting total of points is to be entered into the column, marked
with the sign for sums. Regardless the intensity of the reaction, whether assigned as + or ++, the point
values remain the same. It should be noted, that the point value for the OspC`s must be calculated
only once, even if all 3 OspC-bands will react.
Finally the positive, borderline or negative result can be determined depending on the point value and
entered into the column evaluation.
Table 6: Point evaluation of B. burgdorferi antigens in recomBlot Borrelia canis IgM
Protein/ Antigen
Molecular weight
[kDa]
Name
Function/ Origin
Points
100
p100
B. afzelii
66
VlsE
Fusion protein, represents the immunodominant

VlsE epitopes of different genospecies
41
p41
Flagellin
IgM

39
BmpA
B. afzelii
31
OspA
Surface protein
B. afzelii
22
OspC
Surface protein
B. garinii 1
B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii
B. garinii 2
20
p41/i
B. garinii
18,5
p41/i
B. afzelii
18
p18
Surface antigen
B. afzelii
* VlsE is described as 40 kDa lipoprotein. In recomBlot Borrelia canis a VlsE fusion protein with 66 kDa is used.
Table 7: Test evaluation IgM

Sum of points
Evaluation IgG
Evaluation IgM
<7
negative
negative
borderline
borderline
>7
positive
positive
- 23 -
11.4.
MIKROGEN
Directions for Interpretation
A negative recomBlot Borrelia canis test result can not exclude an infection with Borrelia burgdorferi.
Especially in the early phase of infection, it is possible that antibodies are not or not yet present in
detectable amounts. Treatment with antibiotics in the early stage can prevent the formation of detectable
antibodies. If Lyme Borreliose is clinically suspected and the serum is negative or borderline, sample
withdrawal and testing should be repeated after three weeks.
In samples of the early phase of infection, IgM antibodies are usually predominating. Reaction with OspC
and p41 is characteristic of the early immune response (IgM). Sera from late stages of infection (IgG)
show, in addition to reactions with OspC and p41, strong reactions with p100 and of VlsE often as well.
The production of antibodies could be influenced by Borreliosis vaccination.
A positive result in recomBlot Borrelia canis IgG does not indicate an active Lyme Borreliosis in every
case. Since IgG antibodies use to persist for a longer time, antibodies from a past infection with Borrelia
burgdorferi can still be detectable.
Serological test results should always be considered in connection with the clinical picture. If the
serological results are unclear or borderline, it is recommended to repeat the test in the course of
infection.
12. Clinical Results

In infection studies dogs were infected with Borrelia burgdorferi by use of ticks. The progress of the
infection was documented with clinical, histological and bacteriological findings. Additionally the
serological status of the dogs was evaluated using the recomBlot Borrelia canis. Prior to contact with
the ticks the dogs were not infected with Spirochaetacea. It was shown that in the early stages
antibodies were often formed only against the outer surface protein OspC and the flagellin p41, but also
against VlsE. These proteins are immunodominant for dogs in the IgM response. Thereby anti-OspCantibodies show a significant greater specificity than anti-p41-antibodies. In the progress of the infection
IgG antibodies against p100, VlsE and p39 are generated, whereas the concentration of anti-OspCantibodies decreases mostly.
Table 8: Detection of the seroconversion after the experimental infection
Number of infected dogs
17
recomBlot Borrelia canis

positive
negative
16
11)
1)
This dog showed no clinical pathology nor could a seroconversion be detected by the recomBlot
Borrelia canis.
* Kindly provided by Dr. R. Straubinger/ University of Leipzig
- 24 -
MIKROGEN
A random selection of 106 hounds from South-western Germany shows the following results by testing
with recomBlot Borrelia canis (Table 9).
Table 9: Sera without clinical suspect of an infection by Borrelia burgdorferi

positive
borderline
negative
total
Number
58
5
43
106
%
54,7
4,7
40,6
100

positive
borderline
negative
total
Number
7
1
98
106
%
6,6
0,9
92,5
100
** Diploma thesis by Ms Sandra Wittman/ Faculty Wild Biology, Academy for Forestry, Rottenburg, Germany:
Lyme Borreliosis in Hounds.
In the course of an vaccine study*** nine dogs were examined by the recomBlot Borrelia canis before
and after a Borreliosis vaccination (vaccine Merilym). In 8 of the 9 cases a strong IgG immune
response developed, with focus on the OspA. Only in one case a weak response to VlsE was induced.
*** The study was performed in cooperation with the companies MedPharm GmbH and Merial GmbH
- 25 -
MIKROGEN
13. Literature
(1)
Fawcett, P.T., O`Brien, A.F. and Doughty, R.A. (1989). An absorption procedure to increase the specificity of enzyme - linked
immunosorbent assays for Lyme disease without decreasing sensitivity. Arthr. Rheumat., 32: 1041 - 1044.
(2)
Bergmann, J. et al. (1992) Borreliose VET 2: 12 -15.
(3)
Fuchs R., Jauris S., Lottspeich F., Preac-Mursic V., Wilske B., Soutschek E. (1992) Molecular analysis and expression of a Borrelia
burgdorferi gene encoding a 22kDa protein (pC) in Escherichia coli. Mol Microbiol 6(4), 503 - 509.
(4)
Zumstein G., Fuchs R., Hofmann A., Preac-Mursic V., Soutschek E., Wilske B. (1992) Genetic polymorphism of the gene encoding the
outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgdorferi. Med Microbiol Immunol 181, 57 - 70.
(5)
Wilske B., Preac-Mursic V., Gbel U. B., Graf B., Jauris S., Soutschek E., Schwab E., Zumstein G. (1993): An OspA Serotyping System for
Borrelia burgdorferi Based on Reactivity with Monoclonal Antibodies and OspA Sequence Analysis. J Clin Microbiol 31, 340 350
(6)
Schillborn van Veen, T.W., Murphy, A.J. and Colmery,B. (1993). False positive Borrelia burgdorferi antibody - titres associated with
peridontal desease in dogs. Vet. Rec., 132: 512.
(7)
Wittenbrink, M.M., Failing, K. and Krauss,H. (1996). Enzyme - linked immunosorbent assay and immunoblot analysis for detection of
antibodies to Borrelia burgdorferi in dogs -The impact of serum absorbtion with homologous and heterologous bacteria. Vet. Microbiol. 48:
257 - 268.
(8)
Magnarelli L.A., Flavell R.A., Padula S.J., Anderson J.F., Fikrig E. (1997) Serologic Diagnosis of Canine and Equine Borreliosis: Use of
Recombinant Antigens in Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Journal of Clinical Microbiology Jan. 1997, 169-173
(9)
Liebisch G., Liebisch A. (1999) Lyme-Borreliose beim Hund: Infektionsrisiko sowie Interpretation der Labordiagnose and Impfung. Prakt.
Tierarzt 80:5
(10) Medpharm, Medpharm - News 5/99, Augsburg 1999.

(11) Hovius J.W.R., Hovius K.E., Oei A., Houwers D.J., van Damm A.P. (2000) Antibodies against Specific Proteins of and Immobilizing Avtivity
against Three Strains of Borrelia burgdorferi Sensu Lato Be Found in Symptomatic but Not in Infected Asymptomatic Dogs. Journal of
Clinical Microbiology July 2000, 2611-2621
(12) Guerra M.A., Walker E.D., Kitron U., (2000) Quantitative Approach for the Serodiagnosisof Canine Lyme Disease by the immunoblot
Procedure. Journal of Clinical Microbiology July 2000, 2628-2632
(13) Callister S.M., Jobe D.A., Schell R.F., Lovrich S.D., Onheiber K.L., Korshus J.B. (2000) Detection of Borreliacidal Antibodies in Dogs after
Challenge with Borrelia burdorferi-Infected Ixodes scapularis Ticks. Journal of Clinical Microbiology 38(10), 3670-3674
(14) Runge M. (2003) Durch Zecken bertragene Borrelien: Bedrohung fr Mensch and Tier. Niederschsischer Jger 20/2003, 20-21
(15) Korshus J.B., Munderloh U.G., Bey R.F., Kurtii T.J. (2003) Experimental infection of dogs with Borrelia burgdorferi senso stricto using
Ixodes scapularis ticks artificially infected by capillary feeding. Med Microbiol Immunol
We will be pleased to send you further literature on the diagnosis of Lyme borreliosis.
- 26 -
MIKROGEN
14. Explanation of the Symbols
yC
xC
Contains sufficient for < n > tests

(number of tests)
Inhalt ist ausreichend fr < n > Anstze

(Anzahl der Anstze)
Consult instructions for use
Gebrauchsinformation beachten
Contains
in vitro diagnostic device
Batch code
Do not freeze
Inhalt, enthlt
In vitro Test
Chargen-Nummer
Nicht einfrieren
Catalogue number
Use by
expiry date
Bestell-Nummer
Verwendbar bis
Mindesthaltbarkeitsdatum
Temperature limitation
Store between xC and yC
Lagerung bei xC bis yC
Artikel-Nr./ Article No.:

4202
Gebrauchsinformation/ Instructions for use:
GIRBBBC008DE.DOC
gltig ab/ valid from:
Juli/Juliy 2005
MIKROGEN GmbH
Floriansbogen 2-4
D-82061 Neuried
Germany
www.mikrogen.de
Tel:
Fax:
+49 (0)89 54 80 1-0

+49 (0)89 54 80 1-100
mikrogen@mikrogen.de
QM-SYSTEM zertifiziert durch:

QM System certified according to:
- 27 -
- 28 -
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recomBlot Borrelia canis IgG IgM

recomBlot Borrelia canis IgG

2. Borrelia burgdorferi und canine Lyme Borreliose

Gestrtes Allgemeinbefinden, Fieber, Schmerzen, Apathie und Anorexie (ca. 48%)

Akute und chronische rezidivierende Mono- und Polyarthritis (ca. 20%)

Unklare Lahmheit (ca. 48%)

Neurologische Ausfallerscheinungen, wie z. B. Ataxie, Muskeltremor, Tortikollis, HWS-Syndrom,

Hautvernderungen, verbunden mit Pyodermie, Erythem und Juckreiz (ca. 8%)

seltene Symptome sind

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

Waschpuffer (fnffach konzentriert)

Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig)

Inkubations-Schalen mit je 10 Vertiefungen

Vorentwickelter Kontrollstreifen (kitspezifisch)

recomBlot Borrelia canis IgG

Jeder Reagenziensatz enthlt zustzlich zu den unter Punkt 5 aufgefhrten Komponenten:

Rhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,

Anti-Hund IgG Konjugat (Grne Verschlusskappe)

recomBlot Borrelia canis IgM

Jeder Reagenziensatz enthlt zustzlich zu den unter Punkt 5 aufgefhrten Komponenten:

Rhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen,

Schwachpositiv Serumkontrolle IgM (Gelbe Verschlusskappe)

Anti-Hund IgM Konjugat (Lila Verschlusskappe)

6. Zustzlich bentigte Reagenzien und erforderliches Zubehr

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

7. Hinweise zum Test und den Reagenzien

Seren und Plasma sind als potentiell infektis zu behandeln.

* Whrend des gesamten Testablaufs mssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden.

* Inkubationsschalen nur einmal verwenden.

Hinweise zur Handhabung

Herstellung der Lsungen

7.3.1. Herstellung des gebrauchsfertigen Waschpuffers

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

Tabelle 1: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen

7.3.2. Herstellung der Konjugatlsungen

Lagerung und Haltbarkeit

Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2C - 8C lagern.

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

Inkubation der Proben

Einlegen der Teststreifen

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

Die Serumverdnnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt.

In jede Vertiefung werden anschlieend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und fr

Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt viermal durchgefhrt.

Inkubation mit Peroxidase-Konjugat

Abstoppen der Reaktion

Die Streifen sollten vor Licht geschtzt aufbewahrt werden.

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

10. Zusammenfassung der Testdurchfhrung

alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen.

2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer einpipettieren

viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schttler waschen

2 ml gebrauchsfertige Konjugatlsung zugeben und 1 Stunde unter leichtem Schtteln

viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schttler waschen

1,5 ml der Substratlsung zugeben; 5 - 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem

mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen

Bewertung der Bandenintensitt

recomBlot Borrelia canis IgG IgM

Es sollen folgende Banden zu sehen sein: Inkubationskontrolle, p100

Es sollen folgende Banden zu sehen sein: Inkubationskontrolle, p41

geringere Intensitt als bei der Schwachpositiv- Kontrolle

gleiche Intensitt wie bei der Schwachpositiv- Kontrolle (Cutoff)