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Cuantificacin del
producto de PCR
zTericamente en cada ciclo se duplica la
cantidad de producto: Producto (P) aumenta
exponencialmente con el nmero de ciclos
de PCR (n)
z El producto de PCR depende del nmero
de copias inicial del molde de cDNA (T)
Si partimos del doble de molculas iniciales de
cDNA obtendremos el doble de producto
P = (2)n T
Representacin
grfica de la PCR
Visin lineal
Deteccin PCR
tradicional
Elevada
variabilidad
Elevada
precisin
Visin logartmica
Elevada
precisin
Deteccin PCR
tradicional
Problemas asociados
a la PCR tradicional
zDeteccin fase final
zBaja resolucin del gel de agarosa: no se
pueden detectar pequeos cambios
zProcesamiento post-PCR
zTincin de bromuro de etidio no es muy
cuantitativa
zPobre precisin y menor sensibilidad
Problemas asociados
a la PCR tradicional
Misma cantidad de material de inicio
da lugar a diferente cantidad de
producto final
Solucin: PCR a
tiempo real
z Detecta la acumulacin de amplicn o producto
durante la reaccin.
z La deteccin se realiza por medio de la
fluorescencia
El producto de PCR es marcado con un fluorocromo
reporter
La cantidad de fluorescencia es directamente
proporcional a la cantidad de producto
Se cuantifica la cantidad de fluorescencia en cada ciclo
y se representa una grfica: fluorescencia vs. Ciclo PCR
El anlisis de los datos y cuantificacin de producto se
realiza en la fase exponencial de la PCR, elevada
precisin.
Escala lineal
Resultados de PCR a
tiempo real
Fluorescencia
CT: Threshold
cycle o ciclo
umbral
Umbral o Threshold
Lnea base
Baseline
Valor CT
Fluorescencia basal
Fluorescencia
Escala logartmica
Definiciones
z Lnea Base o Baseline:
Anlisis de
resultados o
cuantificacin
z Se emplean muestras estndar, muestras con
concentracin conocida. En expresin gnica se
emplean diluciones seriadas de un cDNA de
concentracin conocida.
z Se determina el CT de las muestras estndar y de
las muestras desconocidas
z Se realiza una curva estndar a partir de los datos
de CT y concentracin de las muestras estndar.
z Se calcula la concentracin de las muestras
desconocidas extrapolando el valor de CT de
dichas muestras en la curva estndar.
Anlisis de resultados:
determinacin de CT y cuantificacin
Determinacin de CT en escala logartmica
(en verde, la curva de la muestra
desconocida)
Fluorescencia
CTs
y y y y yy y y
CT value
y
y
Log [cDNA]
Ventajas de la PCR a
tiempo Real
z Elevada precisin y
exactitud en la
cuantificacin
Ventajas de la PCR a
tiempo Real
z Elevada sensibilidad (capaz de detectar 0.5 femtogramos de RNAr)
z Amplio rango dinmico lineal: 9-logs
Qumica: tipos de
fluorocromos
Sondas especficas
z Basadas en la tcnica FRET (fluorescence
resonance energy transfer)
Marcadas con dos fluorocromos, uno de elevada
energa (Reporter), y el otro de baja energa (Quencher)
Cuando ambos fluorocromos estn cercanos, la energa
emitida por el Reporter es absorbida por el Quencher:
No hay emisin de fluorescencia
Cuando se separa el Reporter del Quencher ste no
absorve energa y se detecta un aumento en la
fluorescencia del Reporter
Sondas TaqMan
Reporter
: FAM o VIC
Quencher:
Excitation
TAMRA
FRET
Emission
FRET
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
Amplicon
5-3 exonuclease
5 Exonucleasa
Sondas TaqMan
MGB
NFQ: non-fluorescent Quencher
MGB: Minor Groove Binder
R
NFQ
MGB
Fluorocromo no
especfico: SYBR
Green
Desnaturalizacin
Hibridazin
Polimerizacin
La fluorescencia de SYBR
Green es proporcional a la
cantidad de producto
Fluorocromo no
especfico: SYBR
Green
z Solucin:
Diseo muy estricto y cuidadoso de los primers
Optimizacin de la reaccin PCR
Deteccin de productos
inespecficos
Diseo y Validacin de la
reaccin
Diseo de primers y
sondas especficas
Diseo de sondas
especficas
z Tm : 8- 10 C superior a la Tm de los primers
z Sondas TaqMan:
Mximo 30 pb de largo (si no, disear sondas MGB), mnimo 13
pb
Contenido GC 30-80%
Evitar runs de nucletidos idnticos (>3), especialmente 4 o ms Gs.
No Gs en el extremo 5 (quencher)
Seleccionar la hebra que contenga ms Cs que Gs
Validacin de la
eficiencia de PCR
zUnos resultados reproducibles requiere que
la eficiencia de la PCR sea del 100 %
(duplicacin del producto en cada ciclo)
P = T(1 + E)
Eficiencia de la PCR
zLa realidad es que las eficiencias no son del
100%
10,000,000,000
100% EFF
1,000,000,000
AMOUNT OF DNA
100,000,000
90% EFF
10,000,000
80% EFF
70% EFF
1,000,000
100,000
10,000
1,000
100
10
1
0
10
20
30
Clculo de la
eficiencia de PCR
Slope: -3.34
La eficiencia se
calcula a partir
de la pendiente
(slope) de la
curva estndar
Clculo de la
eficiencia de PCR
Controles y
replicados
z Siempre migrar replicados de las reacciones
Comenzar por triplicados. Desviacin estndar entre
triplicados <0.30
Cuantificacin de la expresin
gnica
Cuantificacin relativa
Cuantificacin
relativa
zAnaliza los cambios de expresin del gen
analizado de una muestra dada respecto a la
expresin dicho gen en una muestra de
referencia (calibrador)
Calibrador: muestra de referencia respecto a la
que se cuantifica los cambios de expresin
zMuestra no tratada, t=0 de estimulacin, muestra
normal, sano, tejido de referencia, ratn salvaje, etc.
Control endgeno o
gen de referencia
z Housekeeping genes o genes de mantenimiento, estn presentes en
todos los tipos celulares
z Su expresin se mantiene relativamente constante en las condiciones
del ensayo
Entre diferentes tejidos, durante el tratamiento o estimulacin, etc.
Tipos de controles
endgenos
z Esta es una lista de los controles endgenos ms utilizados
Beta-actina
GAPDH
Beta-2-microglobulina
TATA box binding protein (TBP)
Ciclofilina (varias tipos, mejor la ciclofilina B)
18S rRNAs
Receptor de transferrina
HPRT
Ribosomal protein, large PO
Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2)
Factor de elongacin 1 alpha
-glucuronidasa
Cuantificacin relativa
en Real time PCR
z Tres mtodos alternativos:
z Mtodo de la curva estndar
Una curva estndar para cada gen, target y referencia
Ventaja: se puede aplicar cuando ambos genes tienen distintas
eficiencias
Comparacin de
eficiencias
Curvas estndar
Mtodo PffafI
CT comparativo
Mtodo del CT
comparativo
Mtodo del CT
comparativo
zSe normaliza la cantidad o CT del gen target
respecto al gen referencia (CT)
zSe comparan los CT de cada muestra
experimental o referencia (c) (CT, r), con el
CT de la muestra calibrador (CT, cb):
CT
zLa cantidad relativa en cada muestra viene
definida por la siguiente frmula
Mtodo del CT
comparativo
CT
c-myc
CT
GAPDH
CT
c-mycGAPDH
CT
CT CT,cerebro
Cerebro:
Calibrador
30.49
23.63
6.86
0.00
1.00
Rion
27.03
22.66
4.37
-2.50
5.66
Hgado
26.25
24.60
1.65
-5.21
37.0
Muestra
2- CT
C-myc relativo
al cerebro
GAPDH
R2 = 0.999
Y = -3.488x + 39.04
R2 = 0.995
Y = -3.33x + 37.21
Log [IL-1]
Log [gapdh]
Muestra
[IL-1]
[GAPDH]
[IL-1]
[GAPDH]
[IL-1]
[GAPDH]
Cerebro:
Calibrador
0.039
0.54
0.07
1.00
Rion
0.41
1.02
0.40
5.7
Hgado
0.70
0.28
2.49
35.6
relativo al calibrador
Mtodo PffafI