ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Mikroorganisme di alam tersebar luas, mulai dari tempat terdingin dikutub

sampai di dalam tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Hal
tersebut mengakibatkan sulitnya pengamatan mikroba secara spesifik. Oleh
sebab itu diperlukan teknik isolasi dan pemurnian agar didapatkan media murni.
Bakteri berasal dari bahasa latin bacterium (jamak : bacteria), adalah kelompok
raksasa dari organisme hidup, berukuran sangat kecil (mikroskopik) dan
kebanyakan

uniseluler

(bersel

tunggal),

dengan

struktur

sel

yang

relatif sederhana tanpa nucleus atau inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti
mitokondria dan kloroplas. Bakteri adalah yang paling berlimpah dari semua
organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai
simbiosis dan organisme lain.
Bakteri adalah salah satu contoh mikroorganisme yang penting dan
memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri berhubungan dengan
makanan. Adanya

bakteri

dalam bahan pangan dapat

mengakibatkan

pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan

melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan. Di
alam fungi dan yeast/khamir juga tidak pernah berada di suatu tempatanya dalam
satu spesies. Karena itu untuk memperoleh populasi fungi dan yeast/khamir
dalam kultur murni, juga harus dilakukan teknik isolasi dan pemurnian.

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

Metodenya serupa bakteri, sumber fungi hampir sama dengan bakteri.

Perbedaannya bahwa populasi fungi di air lebih sedikit dibandingkan lingkungan
dengan

pH

rendah.

Pertumbuhan

fungi

pada

medium

menunjukkan

penampakkan yang pada umumnya berupa benang-benang putih dan sangat

mudah untuk dilihat. Sedangkan yeast/khamir akan tampak seperti koloni bakteri
yang tidak mengkilap. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan
mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga

diperoleh kultur murni atau

biakan murni.

B. Tujuan

Tujuan pada pratikum ini adalah :

1. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan untuk memisahkan
mikroba tertentu dari populasi campurannya untuk mendapatkan kultur murni.
2. Untuk mengetahui karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni.
C. Manfaat

Manfaat dari praktikum ini adalah :

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

1. Memahami

metode-metode

yang

digunakan

untuk

memisahkan

mikroorganisme tertentu dari populasi campurannya untuk mendapatkan

kultur murni.
2. Memahami karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Teori Umum
Nama bakteri berasal dari kata bakterion (bahasa Yunani) yang berarti
tongkat atau batang. Sejalan dengan pertambahnya pengetahuan, sekarang bakteri
digunakan untuk mikroorganisme bersel satu, berkembang biak dengan
pembelahan diri, serta memiliki ukuran mikron sehingga hanya tampak dengan
mikroskop. Bakteri aerob merupakan bakteri yang membutuhkan O2 untuk
pertumbuhannya. Sistem enzimnya membutuhkan O2 sebagai elektron aseptor
pada proses fosforilasi oksidatifnya. Secara alami, mikroba di alam ditemukan

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

dalam populasi campuran. Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan

isolasi yang diawali dengan pengenceran bertingkat. Proses isolasi mikroba
adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari
campuran berbagai mikroba untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan
sifat mikroba lainnya(Puspitasari dkk, 2012).
Kultur yang menunjukkan indikasi adanya pertumbuhan bakteri pengoksidasi
amonia diambil dan diisolasi secara tabur. Kultur tersebut kemudian diinkubasi
pada suhu ruang selama 3-5 hari. Isolat yang tumbuh kemudian dimurnikan dan
dipindahkan pada media agar miring. Isolat yang diperoleh diseleksi kemampuan
tumbuhnya dengan cara menumbuhkannya dalam erlenmeyer yang berisi 50 ml
media basal. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang diatas penggoyang
(shaker). Pertumbuhan bakteri pengoksidasi amonia ditentukan dengan mengukur
perubahan amonia dan pembentukan nitrit secara kualitatif, menggunakan
indikator penentu ammonium dan indikator penentu nitrit (Agustiyani dkk,2004).
Bakteri pendegradasi phenanthrene diisolasi pada medium minimum agar
ONR7a dengan menggunakan metode sebar (spread). Medium yang telah
diinokulasikan kemudian disublimasi dengan cara memanaskan senyawa
phenanthrene pada suhu optimum yaitu 100C selama 10 menit. Kondisi
demikian menyebabkan senyawa tersebut menguap, lalu tertangkap pada medium
yang diberi pendingin berupa batu es (Gambar 2). Pemberian batu es di atas
medium yang telah diinokulasi untuk mencegah mencairnya medium agar karena

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

terkena uap panas senyawa phenanthrene. Medium yang telah disublimasi

kemudian diinkubasi selama 7 hari pada temperatur 300C. Bakteri yang dapat
mendegradasi senyawa phenanthrene ditandai dengan terbentuknya zona bening
di sekeliling koloni (Riffiani,2010).
Inokulasi adalah proses penempatan eksplan atau spora jamur pada media
PDA dalam kondisi aseptik Caranya, eksplan atau spora dimasukkan kedalam
media PDA dalam tabung reaksi. Setelah itu, mulut tabung langsung ditutup
dengan kapas untuk menghindari kontaminasi. Proses inokulasi ini juga dilakukan
di dalam ruang atau kotak inokulasi (Rahmat dan Nurhidayat, 2011).
Kultur Piyrosporum ovale dengan menggunakan metode agar miring, dimana
pengkulturan dilakukan pada LAF (Laminar Air Flow) dan semua alat yang
digunakan telah disterilkan dahulu dengan menggunakan autoklaf. Satu ose kamir
berumur 2 hari digoreskan pada medium agar SDA di dekat api bunsen, setelah
itu ditutup dengan kapas steril dan diinkubasi selama 48 jam di dalam inkubator
dengan

suhu

37oC

untuk

kemudian

digunakan

pada

uji

antifungi

(Mahataranti,2012).
Metode agar tuang,seperti halnya metode perhitungan jumlah kuman hidup
lainnya, dilakukan dengan mencampurkan sampel pada media padat yang
mendukung pertumbuhan mikroorganisme, dan kemudian menginkubasi pelat
sehingga setiap sel bakteri dapat membelah dan dapat membentuk koloni. Dengan
demikian, jumlah koloni yang tumbuh tersebut dapat dihitung. Karena kita pada

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

umumnya tidak mempunyai gambaran tentang jumlah bakteri dalam sampel,

penyiapan pengenceran berseri hampir selalu dibutuhkan untuk memastikan
bahwa kita akan mendapatkan pengenceran dengan jumah bakteri yang dapat
dihitung (Harmita dan Radji,2008).
Indikator waktu inkubasi optimum adalah waktu dimana senyawa antimikroba
bakteriosin diproduksi optimal yang ditandai dengan besarnya zona bening yang
terbentuk di sekitar sumur pada semua mikroba uji. Hasil uji aktivitas antimikroba
supernatan Lactobcillus sp.RED4 dapat menghasilkan antimikroba bakteriosin,
yang ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat disekitar koloni bakteri
uji (Khoiriyah dkk,2014).

B. Uraian Bahan

1. Agar (Ditjen POM Edisi III, 1979)

Nama resmi

: AGAR

Pemerian

: Tidak berbau atau bau lemah, berasa

musilago pada lidah.

Kelarutan

: Tidak larut dalam air dingin, dan larut dalam

air mendidih.

Kegunaan

: Sebagai bahan pemadat medium.

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA

O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.

2. Pepton (Ditjen POM Edisi III, 1979)

Pemerian

: Serbuk ; kuning kemerahan sampai coklat; bau khas

tidak busuk

Kelarutan

: Larut dalam air ; memberikan larutan coklat

kekuningan yang bereaksi agak asam ; praktis
larut dalam etanol ( 95% ) P dan dalam

tidak

eter P.

Kegunaan

: Sumber protein untuk pertumbuhan mikroorganisme.

Penyimpanan

: Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak

tembus

cahaya.

3. Ekstrak Beef (Ditjen POM Edisi III, 1979)

Nama resmi

: BEEF EXTRACT

Pemerian

: Berbau dan berasa pada lidah. Kaldu daging sapi

konsentrat diperoleh dengan mengekstraksi daging sapi
segar tanpa lemak, dengn cara merebus dalam air dan
menguapkan kaldu pada suhu rendah dalam hampa
udara sampai terbentuk residu kental berbentuk pasta.
Massa berbentuk pasta, berwarna coklat kekuningan
sampai coklat tua, bau dan rasa seperti daging, sedikit
asam.

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

Kelarutan

: Larut dalam air dingin.

Kegunaan

: Sumber protein untuk pertumbuhan mikroorganisme.

Penyimpanan

: Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak

tembus cahaya.

4. Aquadest (Ditjen POM Edisi III, 1979)

Nama resmi

: AQUA DESTILLATA

Pemerian

: Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

tidak berasa.

Kegunaan

: Sebagai sumber nutrien mikroba dan pelarut medium.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.

5. Dekstrosa (Ditjen POM Edisi III, 1979)

Nama resmi

: DEXTROSUM

Sinonim

: Glukosa, Dekstrosa

RM / BM

: C6H12O6/180,16

Pemerian

: Hablur tidak berwarna, serbuk halus atau butiran

putih, tidak berbau, rasa manis.

Kelarutan

: Mudah larut dalam air, sangat mudah larut dalam

air mendidih, agak sukar larut dalam etanol
(95%).

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

Kegunaan

: Sebagai sumber nutrient yang spesifik untuk

mikroba jamur.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.

6. Alkohol ( farmakope indonesia IV, hal: 63 )

Nama resmi

: Aethanolum

Nama lain

: Etanol / Alkohol

Rumus molekul

: C2H6O

BM

: 46,07

Pemerian

: Cairan mudah menguap, jernih, tidak berwarna,

bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada
lidah. Mudah menguap meskipun pada suhu rendah dan
mendidih pada suhu 78C dan mudah terbakar.

Kelarutan

: Bercampur dengan air dan praktis bercampur

dengan semua pelarut organik.

Berat Jenis

: 0,812 0,816 g/ml.

Stabilitas

: Mudah menguap walaupun pada suhu rendah.

OTT

: Bahan pengoksidasi Bila dicampur dengan

alkali, warna akan menjadi gelap.

Konsentrasi

: 60-90 %.

Kegunaan

:Anti mikroba, desinfektan, pelarut,dan penetrasi

Penyimpanan

: Wadah tertutup rapat jauh dari api.

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

10

C. Uraian Mikroba Uji

1. Staphyloscoccus aureus
a. Klasifikasi
Kingdom : Monera
Divisio

: Firmicutes

Class

: Bacilli

Order

: Bacillales

Family

: Staphylococcaceae

Genus

: Staphilococcus

Species

: Staphilococcus aureus

b. Morfologi
Staphyloscoccus aureus adalah bakteri berbentuk bulat, bersifat
gram positif, biasanya tersusun dalam rangkaian tidak beraturan seperti
buah anggur. Beberapa diantaranya tergolong flora normal pada kulit
dan selaput mukosa manusia, menyebabkan penanahan, abses, berbagai
infeksi piogen dan bahkan septikimia yang fatal. S. aureus mengandung
polisakarida dan protein yang berfungsi sebagai antigen dan merupakan
substansi penting didalam struktur dinding sel (Jawetz,E. 2005).

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

11

BAB III
METODE KERJA

A. Alat Dan Bahan

1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan Isolasi dan Inokulasi
Mikroorganisme adalah :
Tabel 1: Alat yang digunakan berserta fungsinya
No.
1.

Nama Alat
Cawan petri

Fungsi
Tempat pertumbuhan dan penyimpanan
mikrobia, baik dalam media cair maupun

2.

Inkubator

media padat.
Menginkubasi/ menumbuhkan mikroba pada

3.

Jarum Ose lurus

suhu optimum. Suhu maximumnya 70 C.

Untuk memindahkan mikroorganisme
dengan cara menusuk pada medium yang ada

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

4.

Laminar Air Flow

pada tabung reaksi.

untuk pengerjaan secara

12

aseptic

karena

mempunyai pola pengaturan dan penyaringan

aliran sehingga aseptis. Untuk aplikasi sinar
5.

Lampu spiritus
(Bunsen)

UV beberapa jam sebelum digunakan.

Untuk sterilisasi panas dan mempertahankan
sterilisasi ruang inokulasi, isolasi dan transfer

6.

Gelas ukur

mikroba.
Untuk mengambil cairan dengan volume

7.

Spoit

tertentu.
Untuk memindahkan cairan dengan skala
yang akurat dan zat hasil pengukuran, atau zat

8.

Tabung reaksi

yang mau di uji.

Tempat menyimpan media,larutan atau bahan.

9.

Rak Tabung Reaksi

Untuk menyimpan tabung-tabung reaksi baik

yang digunakan pada saat praktikum ataupun

10.

Labu Erlenmeyer

yang tidak digunakan.

Sebagai wadah larutan, bahan atau cairan.

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan Isolasi dan Inokulasi
Mikroorganisme adalah :
SERLYANA BR. TAMBUNAN
NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

13

Tabel 2: Bahan yang digunakan beserta fungsinya

No.
1.

Nama Bahan
Alkohol

Sebagai Antiseptik.

Tisu

.Untuk membersihkan semua alat yang akan

3.

Aquades

digunakan.
Untuk melarutkan bahan medium, sebagai

4.

Larutan NA 50 ml

sumber air.
Untuk melihat pertumbuhan pada bakteri.

5.

Kain Kasa

Untuk melapisi kapas sebelum menutup

Kapas
Plastik wrap

tabung reaksi.
Untuk menutup tabung reaksi.
Untuk melapisi cawan petri agar tidak

8.

Kertas bekas

terkontaminasi.
Untuk melapisi cawan petri yang telah dilapisi

10.

Kertas Label

plastic wrap terlebih dahulu.

Untuk memberikan tanda diatas cawan petri.

2.

6.
7.

Fungsi

B. Cara Kerja
Pembuatan Media
-Metode Agar Sebar
NA padat 15 ml (padat)
Diambil 0,1 ml pada cawan petri
-Metode Agar Tuang

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

14

Dimasukan 1 ml dari pengenceran

Dimasukan 10 ml pada media NA

Langkah kerja
1. Disiapkan semua alat dan bahan.
2. Diambil tabung reaksi sebanyak 6 buah dan diberi kertas label 10-1 sampai
10-6 yang telah disterilkan dengan alkohol.
3. Diambil air steril dengan menggunakan spoit dan diisi tabung reaksi masingmasing 9 ml/tabung.
4. Diambil air kemasan dengan menggunakan spoit sebanyak 1 ml dan gojog
hingga homogen.
5. Dilakukan pengenceran dari tabung reaksi pertama sampai tabung reaksi
terakhir.
6. Dituangkan larutan NA 50 ml pada labu Erlenmeyer dan dituangkan lagi ke
gelas ukur hingga 15 ml.
7. Dibakar bunsen, dekatkan cawan petri lalu diambil larutan dari tabung reaksi
10-6 sebanyak 0,1 ml untuk metode sebar dan 1 ml untuk metode tuang
dengan spoit tuangkan ke dalam cawan petri serta tuangakn larutan NA 15 ml
ke dalam cawan petri.
8. Ditutup kembali cawan petri, dan diratakan dengan membentuk angka 8.
9. Diberikan kertas label di kedua cawan petri dan tunggu hingga beku.
SERLYANA BR. TAMBUNAN
NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

15

10. Dibungkus dengan menggunakan plastic wrap serta dilapisi kembali

menggunakan kertas bekas, untuk metode tuang sebelum dibungkus cawan
petrinya di balik terlebih dahulu.
11. Dimasukkan ke dalam autoclave, dan amati hasilnya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.

Hasil Pengamatan
1. Gambar hasil pengamatan
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HALU OLEO

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

16

Sebelum Disterilkan

Setelah Disterilkan
1

1
3

Ket
3e

rang

n:
1.

Plastik Warp
2. Gelas Erlenmeyer
3. Medium
MEDIUM : Nutrient Borth (NB) Sintetik
B.

Pembahasan

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

17

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
B. Saran

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

18

SERLYANA BR. TAMBUNAN

NABILA SARASWATI HENDRA
O1A114029