MINIEXTRACCIN DE ADN PLASMIDIAL - ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Resumen
La electroforesis en gel se encuentra entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados
en la separacin de macromolculas. Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido,
los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa ya que poseen poros de
diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y molculas trasladadas
durante el proceso electrofortico. De esta forma, la separacin no se produce slo por las
diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de tamao. Donde el material
a trabajar fue la extraccin de ADN plasmdo previamente aislado de la cepa E. coli DH5 alfa.
Donde se obtuvo como resultado que para el contenido de agarosa al 1%, el rango de pares de
bases de ADN (pb) debe estar entre 500 y 10 000. La solucin tampon se encarga de mantener el
pH estable a lo largo del corrido y garantizar la formacin de un campo elctrico.
Palabras claves: Electroforesis, gel de agarosa, ADN plsmidos, TBE.

INTRODUCCIN
Los plsmidos son molculas pequeas de
ADN circular capaces de replicarse de forma
autnoma,
independientemente
del
cromosoma. Son muy comunes en bacterias
y algunos de ellos, los ms pequeos,
existen en las clulas bacterianas en un
nmero elevado (hasta 100 copias por
clula). Los plsmidos son una herramienta
fundamental en Biologa Molecular e
Ingeniera Gentica ya que se pueden usar
como vectores para introducir en ellos
cualquier fragmento de ADN de inters.
(Pinto Yadira Y leana, 2014)
Miniextraccin de ADN Plasmidial
Se realiza en medio LB (Luria Bertani) es el
medio utilizado por excelencia para el
mantenimiento de las cepas de E. coli
recombinante en procesos de microbiologa
molecular ya que contiene peptona de
casena y extracto de levadura que
proporcionan al medio los nutrientes
necesarios para el desarrollo ptimo.
Los pasos bsicos de aislamiento de ADN
son la interrupcin de la estructura celular
para crear un lisado, la separacin del ADN
soluble de desechos celulares y otros
materiales insolubles y la purificacin del
ADN de inters de las protenas solubles y

otros cidos nuclicos. (Pinto Yadira Y leana,

2014)
En el desarrollo de la prctica se utiliz, la
lisis alcalina, en combinacin con el
detergente Dodecil Sulfato de Sodio, SDS, ha
sido usada para aislar ADN plasmdico de E.
coli. La exposicin de suspensiones
bacterianas a detergentes aninicos fuertes
en valores de pH altos desestabiliza la
envoltura celular, desnaturaliza el ADN
cromosomal y las protenas, y libera el ADN
plasmdico al sobrenadante. Aunque la
solucin alcalina separa completamente las
bases apareadas del ADN, las hebras de un
plsmido
circular
no
se
separan
completamente unas de otras debido a que
estn
topolgicamente
entrelazadas.
Mientras la intensidad y la duracin de la
exposicin al OH- no sea demasiado larga,
ambas hebras del ADN plasmdico se
renaturalizarn cuando los niveles de pH
retornen
a
sus
valores
neutros
reconstituyendo una molcula de ADN doble
cadena circular (Culteck, 2006).
Durante la lisis, las protenas bacterianas, la
pared celular rota y el ADN cromosomal
desnaturalizado
constituyen
grandes
complejos que se agregan y son cubiertos
con SDS. Estos complejos
17 son
precipitados eficientemente de la solucin

acuosa cuando los iones sodio son

reemplazados por potasio. Despus que este
material ha sido removido por centrifugacin,
el ADN plasmdico puede ser recuperado del
sobrenadante. (Culteck, 2006).
La principal consideracin para la purificacin
del plsmido es la separacin de ADN del
plsmido a partir del ADN y el ARN
cromosmico celular de la bacteria husped.
Varios mtodos han sido desarrollados para
generar un lisado que no slo elimine las
protenas y los lpidos, sino que tambin
elimine eficazmente la contaminacin de
ADN cromosmico del ADN plsmido,
dejndolo libre en la solucin (McGilvery
Robert, 1997)
Este mtodo explota las diferencias en las
propiedades
de
desnaturalizacin
y
renaturalizacin entre el ADN plasmdico
(pequeos crculos de ADN cerrados
covalentemente) y el ADN cromosmico
(fragmentado). La alcalinizacin con NaOH
en presencia de un detergente fuertemente
aninico (SDS), provoca la lisis celular, la
desnaturalizacin del ADN cromosmico y de
las protenas, y la liberacin de los
plsmidos. Los plsmidos se ven menos
afectados por su pequeo tamao y
estructura superenrollada. La neutralizacin
del medio en presencia de una concentracin
alta de sal (acetato potsico), provoca que se
cierre covalentemente el ADN plasmdico y la
precipitacin de las protenas (por el
tratamiento con el detergente y la
insolubilidad de la sal potsica del dodecil
sulfato) y la del ADN cromosmico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias).
Los agregados insolubles de protenas y ADN
cromosmico se separan por centrifugacin
del ADN plasmdico que queda en el
sobrenadante y conserva mayoritariamente
su estructura nativa (Pinto, 2014).
Electroforesis en Gel de Agarosa
Un mtodo que permite visualizar el ADN
plasmdico o fragmentos del mismo es la
electroforesis en gel de agarosa, en la cual

se separan los fragmentos de ADN en

funcin de su tamao (M. Somma, M. Querci,
2014).
Esta tcnica consiste en someter la mezcla
de molculas de ADN embebidas en un gel
de agarosa a un campo elctrico. Las
molculas de ADN son atradas al polo
positivo debido a la carga neta negativa de
ambas cadenas consecuencia de sus grupos
fosfato. Las molculas ms pequeas migran
ms rpido que las grandes al verse menos
frenadas por el gel de agarosa en su
desplazamiento. Cuando los fragmentos se
han separado, el gel se sumerge en una
solucin que contiene bromuro de etidio y
luego se ilumina con luz UV. El bromuro de
etidio (EtBr) es una molcula plana con
afinidad por el ADN que se intercala entre las
pares de bases y que tiene la particularidad
de que fluoresce cuando est unido a l. Al
iluminar el gel con luz UV se ven bandas de
fluorescencia que corresponden a molculas
de ADN (M. Somma, M. Querci, 2014).
La solucin Tampn se encarga de mantener
el pH estable a lo largo del corrido y
garantizar la formacin de un campo
elctrico, este es una solucin tampn el cual
es una solucin de Tris base, cido brico y
EDTA, adems posibilita la separacin de los
cidos nucleicos, en conjunto con la agarosa.
El Tris cumple la funcin del tamponamiento
por lo que contribuye a ajustar el pH y por
ende regularlo. El empleo del TBE como
buffer de electroforesis es particularmente til
para discriminar a pequeos fragmentos de
ADN (<500 bp) en geles de agarosa (en
comparacin al TAE). En trminos generales
los fragmentos grandes (>20 kbp) de ADN
tienden a migrar ms rpido en el TAE que
en el TBE, mientras que los fragmentos
pequeos (<300 bp) migran ms rpido en el
TBE que en el TAE. Esta capacidad
discriminatoria ha llevado a establecer
parmetros
optimizados
para
la
discriminacin de fragmentos en base a su
tamao. As pues, la mejor discriminacin de
fragmentos de entre 100 y 500 bp de ADN se

logra con geles de agarosa al 2% empleando

TBE como buffer, mientras que los
fragmentos de entre 900 y 2000 bp son mejor
separados con geles de agarosa al 0.8%
empleando TAE como buffer de electroforesis
(UASLP, 2008).

7. Cortar un trozo de papel parafilm para

colocar muestras del buffer de carga
(colorante) de 1 L. Cargar la micropipeta
con el volumen requerido de muestra (para
DNA vegetal cargue 5 L) y el colorante.
Homogeneizar la muestra con la micropipeta.

METODOLOGA

8. Cargar cuidadosamente el pozo con la

muestra evitando la transferencia a los pozos
contiguos. Cambiar la punta cada vez que se
va a cargar una nueva muestra con su
colorante.

1. Preparar la cubeta colocando los seguros

para conformar un contenedor para el gel y
colocar el peine en posicin.
2. Pesar la cantidad necesaria de agarosa
para la preparacin del gel. Es suficiente la
preparacin de 80 mL de gel para llenar la
cubeta, de manera que si se requiere un gel
de agarosa al 1%, pesar 0.8 g de agarosa y
llevar a volumen con tampn TBE 1X en el
erlenmeyer destinado para tal fin. (El tampn
generalmente se encuentra preparado en
una solucin concentrada 10X. Para
preparar, por ejemplo, 80 mL de tampn,
adicionar 8 mL de TBE concentrado en una
probeta y completar el volumen con agua
destilada estril).

9. Cerrar la cmara y conectarla a la fuente

de poder. Asegurarse que la posicin de los
pozos es correcta respecto a la direccin de
migracin del DNA.
10. Remueva el gel con cuidado y visualice el
resultado en transiluminador de luz blanca.
Limpie con alcohol la pantalla de ste antes y
despus de trabajar con el gel.

3. Calentar la solucin en el horno

microondas el tiempo necesario para que la
agarosa se diluya, alrededor de 30 seg., pero
evitando que hierva. Para lograrlo es
recomendable calentar por periodos cortos
(por 10 seg. cada vez por ejemplo).
4. Esperar unos minutos a que el gel se
enfre (se puede tener una medida de la
temperatura adecuada si se toca el recipiente
con el envs de la mano) y adicionar 1 L
SYBR Safe de (para una concentracin final
de 0.4 g/L) . Homogenizar el gel agitando
suavemente el erlenmeyer.
5. Transferir el gel a la cubeta lentamente
para evitar que se formen burbujas. Esperar
alrededor de 30 min. hasta que el gel
solidifique.
6. Cuando el gel est listo, quitar los seguros
y colocar en la cmara; adicionar suficiente
tampn TBE 1X para cubrir totalmente el gel.

RESULTADO

molculas las cuales se movilizan ms fciles

por los poros del gel.
Se tiene que el bromuro de etidio permite
observar el desplazamiento de las molculas
de ADN, que se intercala entre las bases del
mismo y son fluorescentes cuando se ilumina
con luz ultravioleta. Tambin permite realizar
el taponamiento y la regulacin del pH,
debido a su formacin por Tris base. Esto es
importante para poder percibir la migracin
del ADN, el cual depende de las cargas
negativas presentes en los fosfatos.

Figura 1.
Desplazamiento de las molculas de ADN
Plasmdico
DISCUSIN DE RESULTADO
Al depositar todas las muestras, incluyendo
el marcador de peso molecular (fragmentos
de ADN de tamao conocido), se cierra la
cmara y se conecta a la fuente de poder a
un voltaje de 90V por aproximadamente 15
minutos (desde el momento en el que es
seguro que la corriente est actuando en la
cmara). Al cabo del tiempo se remueve el
gel que se coloca sobre el transiluminador de
luz blanca y se observa el desplazamiento de
la muestra, comparndola con el marcador
de peso molecular.
Como se puede observar en la Figura 1, las
molculas del ADN plasmdico se van
desplanzando ya que gracias al grupo fosfato
que conforma los nucletidos (monmeros de
los cidos nucleicos) poseen una carga
elctrica negativa, que los dirigir al polo
positivo. Mientras que las protenas se
cargan al unirse con sustancias como el SDS
(detergente) o la solucin tampn TBE que
incorpora cargas negativas de una manera
dependiente de la masa molecular de la
protena (McGilvery, 1997). Se percibe que
el ADN que se extrajo, pas por la malla del
gel debido a que presentaban pequeas

Hay que tener en cuenta el pH ya que puede

alterar la migracin de las molculas de ADN
debido a que este altera la fuerza elctrica ya
que contiene una amplia variacin de cido
para equilibrar esto en el TBE se encuentra
el borato que ayuda ajustar el pH ya que se
requiere que este sea neutro. Se tiene que al
mezclar el TBE con el EDTA, este cuida los
cidos nucleicos con la degradacin
enzimtica que surge.
Para el contenido de agarosa al 1%, el rango
de pares de bases de ADN (pb) debe estar
entre 500 y 10 000 y los resultados se
encuentran dentro de este rango.
CONCLUSIONES

Se determin la importancia de la
concentracin de la agarosa ya que a
mayor concentracin se disminuye la
velocidad de desplazamiento de los
fragmentos de las molculas de
ADN.
Se evidencia experimentalmente que
la muestra inicial del ADN plasmdico
era realmente y contenido material
gentico de E. coli DH5 alfa.
Se identific que el ADN tiene una
carga negativa debido a los fosfatos
presentes, por ello tendi a
desplazarse a la parte positiva de la
cmara de electroforesis horizontal.
Se comprob el desplazamiento del
ADN gracias al bromuro de etidio y el
colorante GRC porque estos se

ubican dentro de las bases de ADN y

permite visualizar gracias a la luz
ultravioleta un color fluorescente.
Los pares de bases se determinaron
gracias al marcador de peso
molecular.

REFERENCIAS
Pinto
Yadira
Yleana,
2014,
Universidad de Santander, preparacin
de dna plasmdico por lisis alcalina con
sds. Consultado el 22 de marzo de 2014.
Uah, 2013, Biologa Molecular e
Ingeniera Gentica, 3, FarPurificacin y
anlisis de dna plasmdico- F-BMIG
plsmido17.doc.
Disponible
en:
http://www2.uah.es/bioquimica/fbmig/practics/plasmido.pdf
M. Somma, M. Querci. s.f, Anlisis de
la
Presencia
de
Organismos
Genticamente Modificados en Muestras
de Alimentos. Electroforesis en gel de

agarosa. European Commission. p. 11.

Consultado el 22 de marzo de 2014
Culteck, 2006 Electroforesis de
protenas.
Protocolo
y
Tcnicas.
Consultado el 22 de marzo de 2014
McGilvery Robert., 1997, Conceptos
bioqumicos. Consultado el 22 de marzo
de 2014.
UASLP - Universidad Autnoma de
San Luis Potos, 2008, Protocolos y
mtodos Preparacin de TAE y TBE
Laboratorio de Genmica Viral y
Humana. Consultado el 22 de marzo de
2014.
Senna, 2014, Transiluminadores de
luz
UV/Blanca.
Disponible
en:
http://www.cientificasenna.com/index.php
?
modulo=catalogo&accion=articulo&id=28
0.