"Ao de la Diversificacin Productiva y del Fortalecimiento de

la Educacin",
ASIGNATURA :
BIOTECNOLOGA

DOCENTE

:
MSc. GARCA LPEZ Jhon.

TEMA

:
APTMEROS Y CHIPS DE PROTENA

INTEGRANTES :
FLORES SANTOS ALDEMIR
HERRERA CADENILLA JUANCARLOS
RAMOS SONO, Daniel.
SANTAMARIA VELIZ, Olivia.
CICLO

:
2014 - II
LAMBAYEQUE, FEBRERO DEL 2015

I. INTRODUCCION

Los aptmeros son molculas de cido nucleico de cadena sencilla que constan de no ms de 120
nucletidos y que presentan una seria candidatura como alternativa a los anticuerpos monoclonales
en la investigacin biomdica . Pueden ser utilizados en el mbito del diagnstico, como sensores
moleculares, y en el teraputico, ya que interfieren en las funciones biolgicas de molculas diana.
En la ltima dcada hemos asistido a un rpido avance en protemica, siendo los microarrays o
arrays( trminos tomados del ingls) de protenas una de las tecnologas ms prometedoras en este
campo para el estudio a gran escala de proteomas complejos. En este sentido, la comunidad cientfica
ha adoptado las tcnicas tradicionales de deteccin, acercndose a disciplinas que como la
nanotecnologa permiten satisfacer la creciente demanda de estudios protemicos en formatos de alto
rendimiento. Las aplicaciones de la nanotecnologa en la protemica surgieron de la necesidad de
detectar protenas minoritarias, en tiempo real y formato multiplex, en mezclas complejas de
protena

II. APTAMEROS
1. Definicin
Los aptmeros son cidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, con una estructura tridimensional
especfica que les permite unirse con alta afinidad a la molcula diana.
Etimolgicamente el trmino aptmero proviene del latn aptus que significa fijar o unir y del
griego meros que significa partcula.
2. SELEX
En 1990, dos grupos diferentes identificaron el mtodo para la generacin de aptmeros denominado
SELEX (por la sigla en ingls de systematic evolution of ligands by exponential enrichment) .
Este mtodo utiliza la qumica combinatoria para la seleccin de cidos nucleicos sintticos con alta
afinidad por su molcula diana. La qumica combinatoria consiste en la sntesis de un nmero
significativo de molculas de estructura similar que forman colecciones (bibliotecas) consiguiendo
una gran diversidad qumica, y en la cual se puede tamizar una molcula diana para encontrar
miembros (es decir, secuencias) de dicha biblioteca que presenten afinidad .
En SELEX, estas secuencias individuales se han denominado aptmeros. El mtodo SELEX consiste
en la seleccin de los miembros de una biblioteca (aproximadamente 1015 secuencias diferentes) que
se unen a la molcula diana.
2.1. Pasos del mtodo SELEX
Se puede dividir este mtodo en tres pasos principales:
a. La interaccin entre los miembros de la biblioteca y la molcula diana;
b. La seleccin de los miembros que poseen afinidad por la molcula diana
c. El enriquecimiento de la biblioteca mediante amplificacin usando pcr (por la sigla en ingls
de polymerase chain reaction).

Figura 1. SELEX (systematic evolution of ligand by exponential enrichment). A) El inicio consiste

en la sintesis quimica de la biblioteca, que contiene aproximadamente 1015 secuencias diferentes. B)
La biblioteca y la molecula diana entran en contacto y solo los miembros con afinidad permanecen
unidos. C) Se separan los miembros de la biblioteca que se unen y se descartan las secuencias poca
afinidad por la molecula diana. D) Enriquecimiento mediante PCR en las bibliotecas de ADN o por
transcripcion reversa y PCR en el caso de las bibliotecas de ARN. E) Comienza un nuevo ciclo, que
se repetira hasta encontrar bibliotecas que contengan un grupo indeterminado de secuencias que se
unen a la molecula diana. F) Secuenciacion del ultimo ciclo para determinar las secuencias
individuales con alta afinidad
3. Composicin de los aptameros
La composicin natural de los aptmeros incluye ADN y ARN. Sin embargo, se han incorporado
satisfactoriamente al proceso enzimtico o de sntesis secuencias con cidos nucleicos modificados.
Estos ltimos han sido evaluados exitosamente mediante ensayos in vitro o modelos in vivo. En el
caso de ADN-SELEX , la doble cadena se separa y una de sus cadenas sencillas es la forma funcional
de la biblioteca. En ARN-SELEX se requieren la transcripcin para hacer funcional la biblioteca
partiendo de ADN y la transcripcin reversa para enriquecerla posteriormente mediante
PCR .

4. Caractersticas de los aptameros

a. La posibilidad de obtener aptmeros bajo condiciones diferentes a las fisiolgicas abre
la puerta para la seleccin de elementos de reconocimiento en condiciones no
convencionales.
Un ejemplo de la versatilidad en este aspecto es la toxicidad de una molcula diana. La seleccin de
aptmeros no se ve limitada en ningn caso por la toxicidad u otras condiciones diferentes a las
fisiolgicas, dado que el proceso se lleva a cabo in vitro. Esta es una ventaja de los aptmeros con
respecto a los anticuerpos, que generalmente solo pueden ser generados en condiciones fisiolgicas,
en las que la toxicidad es un factor determinante. Por lo anterior, es poco probable o no viable el
desarrollo de anticuerpos para un gran nmero de toxinas. En la actualidad se ha seleccionado un
buen nmero de aptmeros que reconocen una gran variedad de molculas diana, entre las cuales
se encuentran: toxinas, compuestos inorgnicos y orgnicos,nucletidos y sus derivados,
cofactores, aminocidos, carbohidratos, antibiticos, pptidos y protenas, al igual que
estructuras complejas como clulas . Esta diversidad de aptmeros, aunada al hecho de que su
seleccin se hace sin importar el pH o la toxicidad de la molcula diana, lleva a considerar el SELEX
como un mtodo genrico que tericamente permitira seleccionar aptmeros para cualquier molcula
bajo las condiciones elegidas.
b. La afinidad de los aptmeros
La afinidad de los aptmeros se encuentra muy frecuentemente en un rango bajo de nanomolaridad,
similar a la reportada para los anticuerpos . En los aptmeros la afinidad est ligada al nmero de
ciclos de SELEX que se lleven a cabo y a la efectividad del proceso de separacin de secuencias que
se unen con alta o baja afinidad a la molcula diana. En algunos casos ha sido posible obtener
aptmeros con afinidades destacadas que evidentemente superan a los anticuerpos y para las que se
reportan valores de un dgito picomolar .
c. La especificidad
Otra caracterstica interesante de estos elementos de biorreconocimiento, que se evidencia en su
capacidad para diferenciar cambios estructurales mnimos entre la molcula diana y molculas
inespecficas. Un ejemplo claro de esta caracterstica es el aptmero antiteofilina, que distingue
especficamente la teofilina de la cafena, a pesar de que solo un grupo metilo diferencia estas dos
molculas.
5. Aptameros y anticuerpos
En la mayora de las aplicaciones mdicas, se logran altos niveles de afinidad y especificidad
utilizando anticuerpos, pero existen limitaciones en el uso de estos en diversas pruebas clnicas.
Algunas de estas limitaciones estn relacionadas principalmente con su produccin (se requieren

animales o clulas), variabilidad de cada lote de anticuerpos, frecuente inmunogenicidad, su tamao

que dificulta el acceso a compartimentos biolgicos pequeos y su susceptibilidad en procesos de
desnaturalizacin. En contraste, los aptmeros se seleccionan in vitro y se generan de forma
reproducible utilizando procedimientos convencionales de sntesis en fase slida con el mtodo del
fsforo-amidita. De igual forma, se los puede modificar fcilmente en el proceso de sntesis para
mejorar su estabilidad frente a nucleasas o adicionarles grupos funcionales (ejemplo: grupos
fluorescentes) para incrementar su aplicabilidad. La tabla 1 muestra las principales ventajas y
desventajas en el uso de aptmeros y anticuerpos.
Aptameros
- Produccin sencilla y reproducible
- Pueden ser modificados para incrementar
su estabilidad frente a nucleasas (cidos
nucleicos modificados) y tambin
para aumentar su tamao (pegilacin) y
evitar la rpida filtracin renal
- Pueden ser desnaturalizados y utilizados
repetidamente
- Pueden ser seleccionados en condiciones
fisiolgicas y no fisiolgicas
- No son inmunognicos
- Su aplicacion clinica est en los primeros
pasos
- Por su tamao (5-20 Kda) son eliminados
rapidamente
por
filtracion
renal,
generalmente se requieren modificaciones
para alcanzar niveles teraputicos
- Son degradados por nucleasas en
ambientes fisiolgicos,
generalmente deben ser modificados para
uso clnico
- SELEX es un mtodo patentado que
requiere pago de propiedad intelectual para
uso comercial

Anticuerpos
- Son las moleculas mas ampliamente
usadas en terapia
y diagnostico clinico
- Su tamano (~150 Kda) reduce su
eliminacion mediante filtracin renal, y
generalmente su vida media
es suficiente para la accin teraputica
- Son muy estables en condiciones
fisiolgicas, no presentan degradacin por
nucleasas
- Pueden producirse sin pago de propiedad
intelectual
- Produccin dependiente de animales o
clulas
(variabilidad en cada lote)
- Su modificacin genera en muchos casos
reduccin o prdida de su capacidad de
reconocimiento
- Cualquier episodio de desnaturalizacin
generalmente
reduce o anula su capacidad de
reconocimiento
- Solo pueden ser seleccionados en
condiciones fisiolgicas
- La inmunogenicidad es un problema
asociado al uso de anticuerpos

Se ha explorado la utilizacin de aptmeros como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo

de numerosos tipos de biosensores, integrndolos de forma eficiente a distintos sistemas
transductivos.

Una ventaja de los aptmeros en el desarrollo de biosensores es la estabilidad durante su vida til,
que es generada por su naturaleza qumica. Los aptmeros pueden ser desnaturalizados mediante
aumento de la temperatura o del pH, pero luego pueden retornar a su estado activo utilizando las
condiciones ptimas de reconocimiento (buffer, temperatura, etc.) . Todo lo anterior contrasta con los
anticuerpos en los que cualquier episodio de desnaturalizacin generalmente les produce una prdida
en la capacidad de reconocimiento y por lo tanto en su funcin en un sensor.
Es de destacar que algunos aptmeros han sido adaptados exitosamente a mtodos convencionales
como ELISA , PCR , citometra de flujo y microscopa de fluorescencia . De igual forma, algunas
tcnicas mucho ms sofisticadas han incorporado los aptmeros como molculas de reconocimiento;
entre ellas se encuentran SPR (por la sigla en ingls de superficial plasmon resonance)
y AFM (por la sigla en ingls de atomic forc microscopy) . Uno de los ejemplos ms claros de la
flexibilidad que ofrecen estos cidos nucleicos es el aptmero antitrombina (TBA, por la sigla en
ingls de
thrombin-binding aptamer): es una secuencia de ADN con 15 oligonucletidos (5GGTTGGTGTGGTTGG-3) y es posiblemente el aptmero ms popular y con el mayor nmero de
aplicaciones cientficas, con ms de 400 publicaciones. TBA fue seleccionado por
Bock y colaboradores y desde entonces se lo ha utilizado como modelo en diversas aplicaciones
nanotecnolgicas .

Una particularidad de este aptmero es su estructura G-cudruple (figura 2), que ha facilitado su
adaptacin a diferentes biosensores entre los que se destacan los de tipo ptico , fluorescente y
electroqumico . Con la idea de profundizar en el diagnstico clnico y la terapia basados en
aptmeros, hemos seleccionado un ejemplo representativo en cada caso. Analizaremos los aptmeros
anti-IgE y anti-VEGF en los contextos
diagnstico y teraputico, respectivamente.

Figura 2. A) Esquema de la estructura G-cuadruple de TBA. B) Estructura 3D de TBA, utilizando

resonancia magntica nuclear. C) Su interaccion con trombina (gris). Las guaninas estan
representadas en verde y las timinas en azul

6. Aplicaciones de aptamermos

a. Aptmeros en el diagnstico clnico

A pesar de los grandes avances en la identificacin de aptmeros y la utilidad demostrada como
molculas de biorreconocimiento, solo en algunos casos se los ha utilizado en el diagnstico en
muestras clnicas.
Por esa razn, se puede decir que an falta un paso definitivo que genere evidencia sobre su
aplicabilidad en dicho diagnstico. Sin embargo, un gran avance en esta direccin lo estn llevando
a cabo Gold y colaboradores.

Sensor protemico basado en aptmeros

Recientemente han descrito un sensor protemico basado en aptmeros que mide simultneamente
813 protenas diferentes provenientes de una pequea muestra de sangre. La efectividad clnica de
este multisensor se demostr mediante la identificacin del perfil de protenas de enfermedades como
la falla renal crnica y el cncer de pulmn. Es, sin duda, un buen comienzo para la entrada definitiva
de los aptmeros en el campo del diagnstico clnico.

Aptmero anti-igE

Otro buen ejemplo en este sentido es el aptmero anti-IgE que se utiliz en la identificacin de IgE
presente en el suero sanguneo de 50 muestras clnicas. Utilizaremos este aptmero como modelo
ilustrativo de la aplicabilidad de estos elementos de biorreconocimiento en muestras clnicas.
Aptmero anti-IgE
Las personas que sufren cuadros alrgicos presentan con frecuencia niveles elevados de IgE
comparadas con las no alrgicas. Por lo tanto, se puede deducir la importancia de cuantificar los
niveles de IgE en el tratamiento de un episodio alrgico.
La determinacin de IgE se hace generalmente mediante ELISA o radioinmunoanlisis (RIA). Sin
embargo, estos mtodos son costosos y consumen mucho tiempo. Partiendo de la necesidad de una
deteccin de IgE mucho ms rpida y confiable, Yao y colaboradores desarrollaron un sensor basado
en aptmeros que mide en 15 minutos los niveles de IgE, de forma especfica y reproducible . Este
sensor utiliza una microbalanza de cristal de cuarzo en la que previamente se ha inmovilizado el
aptmero anti-IgE. Una vez que dicho aptmero reconoce la IgE en solucin (suero), el biosensor
traduce su nivel que es directamente proporcional a la masa depositada en l (figura 3). Este tipo de
dispositivos abre una puerta hacia la utilizacin generalizada de aptmeros en muestras clnicas,
campo en el que an predominan los anticuerpos como molculas de biorreconocimiento. Es posible
entonces, que la tecnologa basada en aptmeros sea una alternativa futura para el diagnstico clnico,
cuando se generen sensores eficientes y de bajo costo que puedan competir con los mtodos
convencionales.

Figura 3. Esquema de la deteccion de IgE utilizando aptameros: el dispositivo desarrollado por Yao
y colaboradores utiliza una microbalanza de cuarzo, en la que previamente se inmoviliza el aptamero
anti-IgE (A). Se inyecta el suero sanguneo (B) y la IgE presente en la muestra se detecta por el
aptamero anti-IgE. La union entre el aptamero anti-IgE y la IgE presente en la solucion genera un
aumento de la masa en la superficie del sensor (C). Este cambio de masa se traduce en un cambio de
frecuencia (senal) que es directamente proporcional a la concentracion de IgE
b. Aptmeros como agentes teraputicos

Los aptmeros han tenido un gran impacto en el desarrollo de nuevas terapias; se destacan las
orientadas a las enfermedades hematolgicas ,el cncer y la infeccin por VIH .
En la revisin llevada a cabo por Keefe y colaboradores, se recopilaron los aptmeros ms destacados
en modelos teraputicos.
Los aptmeros se pueden usar en dos formas diferentes en el desarrollo de procesos teraputicos:
1. Como molculas efectoras para reconocer un receptor y ejercer directamente la funcin teraputica;

2. Como vehculos para la entrega de una molcula secundaria. En este caso, se utiliza el aptmero
nicamente como elemento de biorreconocimiento, que es modificado con la molcula secundaria
encargada de la accin teraputica .
Dada la facilidad de modificacin de los aptmeros, incluso en el proceso de sntesis, actualmente
estn compitiendo con pptidos y anticuerpos en el desarrollo de nuevos enfoques teraputicos, lo
que evidencia el notorio avance logrado durante los ltimos aos en este campo.
En la actualidad ocho aptmeros se encuentran en fase clnica y uno ya fue aprobado para uso clnico
(tabla 2). Este ltimo es el aptmero anti-VEGF (por la sigla en ingls de vascular endothelial growth
factor) y lo analizaremos ms detenidamente a manera de ejemplo.

Aptmero anti-VEGF

El anti-VEGF (pegaptanib - Macugen) es el primer aptmero aprobado por la FDA y se lo utiliza

en el
tratamiento de la degeneracin macular asociada a la edad (DMAE) . Esta enfermedad oftalmolgica
se caracteriza por el deterioro de la mcula, tejido de color amarillento sensible a la luz, localizado
en el centro de la retina, cuya funcin est ligada a la nitidez visual; por lo tanto, est encargado de

las percepciones visuales finas . El proceso patolgico consiste en la prdida de nitidez y agudeza
visuales.
De hecho, la DMAE es la principal causa mundial de ceguera .Por esta razn, se han hecho esfuerzos
significativos para el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad. Una de las estrategias se
basa en utilizar el aptmero anti-VEGF inyectado intravtreo que reconoce la molcula VEGF165, lo
que inhibe la unin a su receptor natural y es as como se genera el proceso teraputico, porque se
evita la proliferacin y migracin de vasos sanguneos hacia el humor vtreo . Los reportes de la
utilizacin de este aptmero son promisorios: ha generado una inhibicin de 65% y 80% en modelos
animales y 80% de los pacientes que participaron en las pruebas clnicas se estabilizaron o mejoraron
despus de tres meses de tratamiento .
En la actualidad ms de 50.000 pacientes han sido tratados con pegaptanib con resultados
satisfactorios. Con base en aptmeros hay, sin lugar a dudas, una posibilidad real de desarrollar
nuevos enfoques teraputicos y cabe destacar que se estn adelantando pruebas clnicas para otros
aptmeros de los que se tendrn noticias en los prximos aos. Esperamos entonces que el aptmero
anti-VEGF sea solo el inicio de una generacin de nuevos agentes teraputicos.

III. CHIPS DE PROTEINAS

Para la deteccin de pptidos y protenas, adems de las tcnicas de electroforesis bidimensional (twodimensional gel electrophoresis, o 2DE) y la cromatografa lquida con espectrometra de masas
(liquid chromatography mass spectrometry. o LC-MS). recientemente han aparecido al menos dos
sistemas de biochips adaptados a la identificacin de estas molculas, cuyo desarrollo promete
abaratar y agilizar los procesos de caracterizacin de estos biocompuestos. Ambos sistemas se
fundamentan en la especificidad de la unin entre protenas, algo que suele compararse con el ejemplo
de una llave que hace juego con su cerradura. Para poder utilizar esta propiedad, se crean matrices de
microsuperficies capaces de unirse de forma especfica a diversos tipos de pptidos y protenas.
Las diversas tcnicas para lograr este propsito, as como los procedimientos utilizados con la
deteccin de las mismas pueden diferir bastante, y por ello dar lugar a biochips tambin distintos.
En todos los casos la muestra a estudiar es preparada (a veces la preparacin puede ser mnima en
fluidos como suero, sangre, orina: pero si se trata de tejidos, estos se machacan y homogeneizan para
crear una sopa de protenas), a continuacin se depositan unas pocas gotas sobre el chip, se deja
transcurrir un tiempo variable para que ambos interacten (tiempo durante el que las protenas se
unirn a las diversas regiones especficas de aquel por procesos de absorcin segn su afinidad con
las superficies tratadas) y se pasa a la etapa de revelado o deteccin de peptdica.
Veamos con algo ms de detalle uno de estos chips proteicos, el denominado Sistema ProteinChip
que fue desarrollado por la compaa Ciphergen Biosystems Ltd., de Palo Alto (California). Est
formado de un sustrato de aluminio en el que existen matrices con multitud de pequeas superficies
de hasta 1 mm de dimetro que han recibido un recubrimiento qumico (hidrfobo, hidrofilico, inico,
etc) o bioqumico (con receptores, anticuerpos, etc) para interactuar con determinadas protenas.
unirse a ellas y retenerlas.
1. Microarrays de protenas
El estudio del proteoma humano puede llegar a constituir una tarea ardua y desalentadora debido al
elevado nmero de protenas existentes, codificadas por alrededor de un total de 25.000 genes
distintos, a part ir de los que se generan mltiples variantes proteicos por modificaciones posttransducionales. En el intento por desarrollar una plataforma metodolgica para el estudio del
proteoma humano que pueda manejar la gran cantidad de datos sobre las distintas protenas y sus
variantes, aparecieron los micro arrays (en adelante utilizaremos arrays) de protenas. Los arrays
de protenas son una plataforma que permite el anlisis masivo, en paralelo y simultneo de
interacciones proteicas. En general, las protenas se depositan e inmovilizan sobre superficies planas,

permitiendo el estudio de un gran nmero de protenas y/o de interacciones, confiriendo a este tipo
de plataforma un gran potencial para la caracterizacin biolgica de poblaciones celulares o tejidos.
Hasta la fecha, se han desarrollado y empleado diferentes formatos de arrays de protenas en distintas
aplicaciones, donde se incluyen la identificacin de biomarcadores o el desarrollo de vacunas.
Un microarray de protenas (o chip de protena) es un mtodo de alto rendimiento utilizado para
el seguimiento de las interacciones y las actividades de las protenas, y para determinar su funcin, y
la determinacin de la funcin en una gran escala.
El concepto y la metodologa de microarrays de protenas fue introducido por primera vez y se ilustra
en microarrays de anticuerpos (tambin conocidos como matriz de anticuerpo ) en 1983 en una
publicacin cientfica y una serie de patentes. La tecnologa de alto rendimiento tras el microarray
de protenas fue relativamente fcil de desarrollar, ya que se basa en la tecnologa desarrollada
para los microarrays de ADN , que se han convertido en los ms utilizados microarrays .

En trminos generales, los arrays de protenas pueden clasificarse en microarrays diana

("target"), arrays en fase reversa y microarrays in situ (Figura 4).

Figura 4. Esquema de distintos in situ arrays de protenas. a.-NAPPA arrays. b.- PISA arrays. c.Puromycin arrays.

En los arrays de protenas diana, los agentes de captura pueden ser de distinta naturaleza (p.ej:
anticuerpos o protenas recombinantes) y se inmovilizan sobre la superficie del array para luego
incubarse con la muestra de inters. Estos arrays se emplean comnmente para el estudio de patrones
diferenciales de expresin proteica, de acuerdo a su afinidad, especificidad u otras caractersticas. No
obstante, pueden presentar algunas limitaciones, tales como reactividad cruzada y/o prdida de
actividad de las protenas inmovilizadas. En general, se ha desarrollado un amplio abanico de posibles
aplicaciones en investigacin clnica, particularmente en el campo de la inmunologa.

A su vez, los arrays de fase reversa (RPP) se generan mediante la inmovilizacin de lisados celulares
o de tejidos o fluidos corporales, para la posterior deteccin de protenas de inters mediante
anticuerpos especficos contra las protenas diana. Esta interaccin antgeno-anticuerpo se visualiza
mediante el empleo de anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta que permita amplificar la
seal de deteccin. En este caso, la intensidad de la seal ser directamente proporcional a la
especificidad, la afinidad y la accesibilidad espacial entre la protena diana y el anticuerpo. Por todo
ello, la probabilidad de no detectar una protena de inters es relativamente alta, si se encuentra en
muy baja concentracin, o si el anticuerpo empleado tiene escasa afinidad por la misma. Los arrays
RPP se han empleado con xito para el anlisis de modificaciones post-transducionales o para el
estudio de las rutas de sealizacin; por lo cual, resultan relevantes a la hora de generar mapas
funcionales de vas de sealizacin celular de inters en el desarrollo de terapias personalizadas.

Finalmente, en el caso de los arrays de protenas in situ se emplean en sistemas de expresin libres
de clulas (p. ej.: E. coli 30 o germen de trigo). Para dotar de contenido a estos arrays, se requiere una
coleccin de clones que contengan los ORF ( "Open Reading Frame"). Durante los ltimos aos se
han desarrollado numerosos tipos de arrays de protenas in situ; entre ellos destacan: PISA arrays (
Protein in situ arrays), DAPA arrays ( Printing protein arrays from DNA arrays), NAPPA arrays
( Nucleic Acids Programmable Protein Arrays) ( Figura 4).

3. Constitucin
El chip consta de una superficie de soporte tal como un portaobjetos de vidrio, membrana de
nitrocelulosa, perla o placa de microtitulacin , a la que una serie de protenas de captura es
obligado. de la sonda molculas, normalmente marcados con un colorante fluorescente, se aaden a
la matriz. Cualquier reaccin entre la sonda y la protena inmovilizada emite una seal fluorescente
que es ledo por un escner lser .

4. La motivacin para el desarrollo

Microarrays de protenas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de ADN
para determinar los niveles de expresin gnica en protemica . La cantidad de ARNm en la clula a
menudo no refleja los niveles de expresin de las protenas que corresponden dado que por lo general
es la protena, ms que el ARNm, que tiene el papel funcional en la respuesta de las clulas, se
necesitaba un enfoque novedoso. Adems modificaciones post-traduccionales , que a menudo son
crticas para la determinacin de la funcin de protenas, no son visibles en microarrays de
ADN. Microarrays de protenas reemplaza las tcnicas tradicionales tales como la protemica
electroforesis 2D en gel o cromatografa , que se consume mucho tiempo, mano de obra y tratos
adecuado para el anlisis de protenas de baja abundancia.
5. Hacer la matriz
Las protenas estn dispuestos sobre una superficie slida tal como portaobjetos de microscopio,
membranas, perlas o placas de microtitulacin. La funcin de esta superficie es proporcionar un
soporte sobre el cual las protenas pueden ser inmovilizados. Se debe demostrar propiedades de unin
mxima, mientras que el mantenimiento de la protena en su conformacin nativa de modo que se
conserva su capacidad de unin. Los portaobjetos de vidrio o silicio son una opcin popular, ya que
son compatibles con los arrayers robticos fcilmente obtenidos y escneres lser que se han
desarrollado para la tecnologa de microarrays de ADN.
La superficie slida elegido se cubre entonces con un recubrimiento que debe servir las funciones
simultneas de inmovilizacin de la protena, evitando su desnaturalizacin , orientndolo en la
direccin apropiada de modo que sus sitios de unin son accesibles, y proporcionar
un hidrfilo entorno en el que la reaccin de unin puede ocurrir. Adems, tambin necesita mostrar
no especfica mnima de unin con el fin de minimizar el ruido de fondo en los sistemas de
deteccin. Adems, tiene que ser compatible con los diferentes sistemas de deteccin. Agentes de
inmovilizacin incluyen capas de aluminio o de oro, polmeros hidrfilos, y los geles de
poliacrilamida , o el tratamiento conaminas , aldehdos o epoxi . Tecnologas de pelcula delgada
como la deposicin fsica de vapor (PVD) y deposicin qumica de vapor (CVD) se emplean para
aplicar el recubrimiento a la superficie de apoyo.
Un ambiente acuoso es esencial en todas las etapas de fabricacin matriz y operacin para evitar la
desnaturalizacin de protenas. Por lo tanto tampones de muestra contienen un alto por ciento
de glicerol (para bajar el punto de congelacin), y la humedad del entorno de fabricacin se regula

cuidadosamente. Microcubetas tienen la doble ventaja de proporcionar un ambiente acuoso al tiempo

que evita la contaminacin cruzada entre las muestras.
En el tipo ms comn de la matriz de protena, robots colocan un gran nmero de protenas o
sus ligandos sobre un soporte slido recubierto en un patrn predefinido. Esto se conoce como
impresin por contacto robtico o manchado robtico. Otro mtodo de fabricacin es de tinta de
chorro , una, el mtodo sin contacto drop-on-demand de dispersar los polmeros de la protena sobre
la superficie slida en el patrn deseado. piezoelctrico manchado es un mtodo similar a la
impresin de chorro de tinta. El cabezal de impresin se mueve a travs de la matriz, y en cada lugar
utiliza la estimulacin elctrica para entregar las molculas de protena sobre la superficie a travs de
pequeos chorros. Este es tambin un proceso sin contacto. La fotolitografa es un cuarto mtodo de
poner en orden las protenas sobre la superficie. La luz se utiliza en asociacin con mscaras , placas
opacas con agujeros o transparencias que permiten que la luz brille a travs de un patrn definido. Una
serie de tratamientos qumicos a continuacin, permite la deposicin de la protena en el patrn
deseado sobre el material de debajo de la fotomscara.
Las

molculas

de

captura

dispuestos

en

la

superficie

slida

pueden

ser anticuerpos , antgenos , aptmeros (ligandos basados en cidos nucleicos), aficuerpos (molculas
pequeas diseados para imitar los anticuerpos monoclonales), o protenas de longitud
completa. Fuentes de tales protenas incluyen sistemas basados en clulas de expresin de protenas
recombinantes , la purificacin a partir de fuentes naturales, la produccin in vitro por sistemas de
traduccin libres de clulas , y mtodos sintticos para pptidos . Muchos de estos mtodos pueden
ser automatizados para la produccin de alto rendimiento, pero se debe tener cuidado para evitar las
condiciones de sntesis o extraccin que resultan en una protena desnaturalizada que, puesto que ya
no reconoce a su pareja de unin, hace que la matriz intil.
Las protenas son altamente sensibles a cambios en su microambiente. Esto presenta un desafo en el
mantenimiento de arrays de protenas en una condicin estable durante largos perodos de tiempo. En
situ mtodos implican la sntesis en el chip de protenas, cuando sea necesario, directamente a partir
del ADN usando sistemas de expresin de protenas libres de clulas. Dado que el ADN es una
molcula muy estable que no se deteriora con el tiempo y por lo tanto es adecuado para el
almacenamiento a largo plazo.Este enfoque tambin es ventajosa porque evita los procesos laboriosos
y, a menudo costosos de purificacin de protenas y separada de clonacin de ADN , ya que las
protenas se hacen y se inmovilizan de forma simultnea en un solo paso sobre la superficie del
chip. Ejemplos de tcnicas in situ en Are PISA (protena en conjunto situ), NAPA (cido nucleico
programable gama de protenas) y DAPA (matriz de ADN a la matriz de protenas).

5.1. Tipos de matrices

Hay tres tipos de microarrays de protenas que se utilizan actualmente para estudiar las actividades
bioqumicas de las protenas.
a. Microarrays analticos tambin son conocidos como matrices de captura.
En esta tcnica, una biblioteca de anticuerpos, aptmeros o aficuerpos se visti sobre la superficie de
apoyo. Estos se utilizan como molculas de captura ya que cada une especficamente a una protena
particular. La matriz se sonde con una solucin de protena compleja, tal como un lisado celular . El
anlisis de las reacciones de unin resultantes utilizando diversos sistemas de deteccin pueden
proporcionar informacin sobre los niveles de expresin de determinadas protenas en la muestra, as
como las mediciones de afinidades y especificidades de unin. Este tipo de microarrays es
especialmente til en la comparacin de la expresin de protenas en diferentes soluciones. Por
ejemplo, la respuesta de las clulas a un factor particular puede ser identificado mediante la
comparacin de los lisados de clulas tratadas con sustancias especficas o cultivados bajo ciertas
condiciones con los lisados de las clulas de control. Otra aplicacin es en la identificacin y
elaboracin de perfiles de los tejidos enfermos.
b. Microarrays de protenas funcionales (tambin conocidos como matrices de protena
diana) se construyen mediante la inmovilizacin de grandes cantidades de protenas
purificadas y se utilizan para identificar protena-protena, protena-DNA, en protenas de
ARN , en protenas fosfolpido , y las interacciones de molculas de protena pequeas, para
ensayar actividad enzimtica y para detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se
diferencian de las matrices de anlisis en que las matrices de protenas funcionales estn
compuestos de matrices que contienen protenas funcionales de longitud completa o dominios

de la protena. Estos chips de protenas se utilizan para estudiar las actividades bioqumicas
de todo el proteoma en un solo experimento.
c. Microarrays de protenas de fase inversa (RPPA) implican muestras complejas, tales
como lisados de tejidos. Se aislan las clulas de diversos tejidos de inters y se lisan. El lisado
se visti sobre el microarray y se sonde con anticuerpos contra la protena diana de
inters. Estos anticuerpos se detectan normalmente con quimioluminiscente , fluorescente
o colorimtricas ensayos. Los pptidos de referencia se imprimen en las diapositivas para
permitir la cuantificacin de protenas de los lisados de la muestra. RPA permiten la
determinacin de la presencia de protenas alteradas u otros agentes que pueden ser el
resultado de la enfermedad. Especficamente, las modificaciones post-traduccionales, que
tpicamente son alterados como resultado de la enfermedad se pueden detectar utilizando
RPA.
6. Deteccin
Los mtodos de deteccin de protenas matriz deben dar una seal de alto y un fondo bajo. El mtodo
ms comn y ampliamente utilizado para la deteccin es el etiquetado de fluorescencia que es
altamente sensible, seguro y compatible con escneres lser de microarrays fcilmente
disponibles. Otras etiquetas se pueden utilizar, tal como la afinidad, fotoqumicos o un radioistopo
las etiquetas. Estas etiquetas estn unidas a la propia sonda y pueden interferir con la reaccin de la
protena sonda-diana. Por lo tanto un nmero de mtodos de deteccin libre de la etiqueta estn
disponibles, tales como resonancia de plasmn superficial (SPR), nanotubos de carbono, sensores de
nanocables de carbono (donde se produce la deteccin a travs de cambios en la conductancia) y del
sistema microelectromecnicos (MEMS) voladizos. Todos estos mtodos de deteccin gratuitas
etiqueta son relativamente nuevo y todava no son adecuados para la deteccin de la interaccin de
protenas de alto rendimiento; sin embargo, s ofrecen una gran promesa para el futuro.
6.1. Mtodos de deteccin asociados a los arrays de proteinas
En general, en el mtodo de deteccin ideal para arrays de protenas debe conocerse su sensibilidad
y lmite de deteccin, su rango dinmico, capacidad de multiplicacin multiplex y su nivel de
resolucin. Aunque en la actualidad existen diversos mtodos de deteccin para arrays de protenas,
estas pueden agruparse genricamente en mtodos basados en etiquetas y mtodos libres de etiquetas.

6.1.1. Mtodos basados en marcaje con etiquetas

Hasta la fecha, en la gran mayora de aplicaciones de los microarrays de protenas se emplean tcnicas
de deteccin basadas en etiquetas, debido a la amplia disponibilidad tanto de reactivo como de la

instrumentacin. Adems, se estn introduciendo nuevas estrategias con la incorporacin de

nanoetiquetas como las quantum dots, nanotubos de carbono, etc.... Incluso se han obtenido resultados
muy prometedores combinando el uso de microesferas fluorescentes y citometra de flujo.

Marcaje fluorescente convencional

Entre los primeros procedimientos de deteccin aplicados a arrays de protenas merece destacar los
radioistopos (por ej.: 32P) empleados con xito en el estudio de interacciones proteicas.
Posteriormente, adquiere especial relevancia el uso de fluorocromos convencionales (fluorescena,
BODIPY, cianinas,). En este caso, la eleccin de los fluorocromos es importante, dependiendo de
la naturaleza de la muestra y el soporte, de los espectros de emisin y excitacin, la auto-fluorescencia
presente en la muestra/array.

En este rea, las cianinas (p.ej.: Cy3 y Cy5) se encuentran entre los flurocromos ms empleados para
la deteccin en microarrays de protenas; debido principalmente a su mnima interaccin con otras
biomolculas, su elevada intensidad y la gran versatilidad de conjugacin qumica.
Adems, su combinacin permite el empleo de 2 fluorocromos para la identificacin simultnea de
mltiples biomarcadores, tal como se ha desarrollado tanto en cncer de prstata y en suero de
pacientes con fibrosis qustica . En este sentido, los arrays de protenas permiten el estudio simultneo
con respecto a los ensayos tipo "sandwich" con una capacidad limitada (<50 antgenos). Adems, los
arrays de anticuerpos se han utilizado con xito para el estudio de vas de sealizacin como
ErbB/Neu de la familia de EGFR . En este sentido, destaca recientemente una nueva estrategia con
dos fluorocromos para la deteccin de protenas sricas con un array de anticuerpos, que permiti
analizar un total de 75 citoquinas con sensibilidades de femtomolar .

6.1.2.-Mtodos de deteccin para arrays de esferas

6.1.2.1. Arrays de esferas de citometra de flujo
Tradicionalmente, la citometra de flujo (CF) se ha empleado para la identificacin y caracterizacin
de distintas poblaciones celulares evaluando entre otras, sus caractersticas fenotpicas. ltimamente,
la CF se ha empleado para la deteccin de protenas solubles presentes en fluidos corporales o en
lisados celulares empleando microesferas .

De esta ltima metodologa, nacen los arrays de microesferas basado en el empleo simultneo de
distintas poblaciones de microesferas marcadas con varios fluorocromos, recubiertos cada una por

anticuerpos diferentes, a incubar muestra biolgica de inters. Para el revelado de la unin de

protenas diana a las microesferas en un CF se dispondr al menos de dos lseres, para el anlisis
cualitativo y cuantitativo de dichas poblaciones. El nmero de lseres y detectores, la configuracin
de los filtros y el procesamiento de datos est directamente relacionado con el nmero de anticuerpos
y fluorocromos; por tanto de protenas diana a ser evaluadas simultneamente.

Respecto a las tcnicas fluorescentes convencionales, la CF permite la evaluacin cuantitativacualitativa rpida y precisa de un nmero elevado de protenas, con bajo coste y alta sensibilidad.

Recientemente, se ha desarrollado un gran nmero de ensayos basados en microesferas con

anticuerpos de captura para la deteccin simultnea de mltiples analitos provenientes de distintas
fuentes de muestras (Figura 5).

Figura 5.-Arrays de protenas basados en esferas. a.-Arrays de anticuerpos para deteccin por
citometra de flujo. b.-Arrays de anticuerpos en microesferas magnticas. c.-Quantum-dots . d.Nanopartculas magnticas.

ltimamente se ha descrito una plataforma para la deteccin de protenas aisladas de diferentes

compartimentos celulares mediante tcnicas combinadas de cromatografa por exclusin y citometra
de flujo . El anlisis mediante esta plataforma bidimensional, proporciona informacin sobre los

perfiles de elucin permitiendo la identificacin a gran escala de complejos proteicos en distintas

fracciones cromatogrficas.

En la actualidad, existen en el mercado arrays de esferas dirigidas a detectar mltiples protenas

solubles por CF dirigidas a aplicaciones concretas en investigacin bsica y clnica, como una
plataforma verstil para la evaluacin y anlisis de interacciones proteicas .

Sistemas de esferas magnticas.

Desde hace tiempo se emplean sistemas de esferas magnticas acopladas con anticuerpos para la
deteccin de protenas diana (Figura 5). Esta plataforma permite la captura de protenas solubles con
una alta reproducibilidad y sensibilidad, asociada a un bajo ruido de fondo, un amplio rango dinmico
y bajo coste . Recientemente, se ha realizado una comparacin entre la utilidad de estos arrays de
anticuerpos acoplados a esferas magnticas para la deteccin de 12 auto-antgenos en 21 muestras de
suero de pacientes con enfermedades de carcter autoinmune, demostrndose las mltiples ventajas
del nuevo mtodo.

6.1.2.2 Sistemas de revelado fluorescente mediante Quantum dots

Los Quantum dots (QDs) son nano-cristales, formados por un ncleo de material semiconductor y
fluorescente (por ej.: seleniuro de cadmio) recubierto de otro semiconductor (por ej.: sulfuro de
cadmio o de zinc), que presentan propiedades pticas muy estables y un gran hueco entre las
longitudes de onda de emisin y excitacin del complemento (Figura ). Estos compuestos presentan
un amplio abanico de aplicaciones de tcnicas de imagen, y otros mtodos (p. ej. citometra de flujo)
dirigidos a la deteccin de biomarcadores en muestras biolgicas .

Los QDs son partculas nanomtricas que se pueden conjugar con molculas utilizadas para el bioreconocimiento (pptidos o anticuerpos) de componentes celulares, siendo su utilizacin como
etiquetas biolgicas o sondas fluorescentes. Respecto a los fluorocromos tradicionales, proporcionan
ventajas relacionadas con una elevada fluorescencia, mayor foto-estabilidad, excitacin multicolor,
un espectro de emisin ajustable y estrecho, y su mayor rendimiento cuntico, comparados con los
fluorocromos orgnicos (39, 18). En otras aplicaciones, los QDs se han utilizado unidos a
estreptavidina para la deteccin de citocinas con un array de anticuerpos . Asimismo, los QDs se han
asociado a una mayor sensibilidad a la hora de la identificar biomarcadores tumorales, p. ejem.: CEA,
CA125) en suero de pacientes de cncer .

No obstante, estos compuestos presentan baja estabilidad y corta vida media, debido a su elevada
susceptibilidad a la oxidacin y la fotolisis. Adems, el uso de este tipo de compuestos se asocia a
riesgos para la salud humana y el medio ambiente.

6.1.2.3. Nanopartculas magnticas como etiqueta

Las nanopartculas de oro constituyen otra herramienta atractiva para los arrays de protenas, por sus
propiedades pticas, eficiencia cuntica y compatibilidad con una amplia gama de longitudes de onda
. Hasta la fecha se han desarrollado inmunoensayos con nanopartculas para la deteccin "multiplex"
del antgeno prosttico especfico (PSA), alcanzndose una sensibilidad relativamente elevada con
un lmite de deteccin en el suero de concentraciones 300 amol . De forma similar, se han detectado
molculas anti-bacterianas, pudiendo discriminar selectivamente entre diferentes cepas de bacterias .
6.1.3. -Mtodos de deteccin libres de etiqueta (label-free)
En la actualidad existe un gran inters en el empleo de metodologas de deteccin que superen las
limitaciones asociadas al uso de etiquetas, especialmente aquellas relacionadas con la conjugacin y
la alteracin de las biomolculas.

Las tcnicas de deteccin sin etiqueta son tiles en el estudio de cinticas de interaccin proteicas,
evitando los impedimentos estricos causados por la presencia de etiquetas.

En el rea de los arrays de protenas, uno de los principales requisitos para los mtodos de deteccin
es su compatibilidad con formatos masivos, la deteccin de pequeas molculas y la existencia de un
amplio rango dinmico. En este sentido, en la actualidad existen diferentes aproximaciones a la
deteccin de interacciones proteicas , empleando arrays de protenas, destacando la resonancia de
plasmon superficial, microcantilevers y la microscopia de fuerza atmica.

6.1.3.1..-Resonancia de Plasmn Superficial (SPR)

La tecnologa SPR se basa en la generacin de plasmones en una superficie. Los plasmones son
oscilaciones de electrones libres propagadas paralelamente a la interfase metal/medio, lo que permite
medir los cambios en el ndice de refraccin de la superficie del sensor . La aparicin de asociaciones
o disociaciones moleculares se traduce en plasmones superficiales que dependen de la variacin de
intensidad de la luz reflejada y/o el ngulo de incidencia (Figura 6). De esta forma, los SPR permiten
determinar la relacin entre la asociacin y disociacin de biomolculas entre s, adems tambin
permite evaluar la afinidad y especificidad dichas interacciones, facilitando la medicin de

interacciones biomoleculares en tiempo real con alta sensibilidad . Por sus caractersticas, esta
tecnologa resulta muy prometedora y atractiva en investigacin biomdica.

A modo de ejemplo, Lausted et al. emplearon SPRi para la deteccin de biomarcadores tumorales
con fines diagnsticos mediante arrays de anticuerpos.

6.1.3. 2. Microcantilevers
Los microcantilevers son lminas finas de silicio recubiertas de una superficie de oro asociadas a
sistemas nanomecnicos de reconocimiento biomolecular. Por este motivo, se inmovilizan los
anticuerpos o protenas sobre dichas lminas, de forma que cuando existe una interaccin entre estas
molculas y sus posibles ligandos podemos medir la variacin en la posicin de la lmina empleando
distintos sistemas pticos o electrnicos (Figura 6).

Figura 6.-Mtodos de deteccin sin marcaje ( "label-free") para arrays de protenas.a.-Resonancia

de Plasmn Superficial. b.-Microcantilevers. c.-Microscopa de Fuerza Atmica. Sobre este modelo
de plataforma de deteccin, se han evaluado interacciones proteicas de distintos frmacos en
diferentes reas clnicas. Dado que se trata de un sistema relativamente simple, rpido y de fcil
utilizacin, los microcantilevers representan una herramienta prometedora para ser empleadas en
combinacin con los arrays de protenas para la deteccin de interacciones biomolculares.

2.3.-Microscopa de Fuerza Atmica (AFM)

Brevemente, se podra describir la AFM como el anlisis a nivel microscpico observando
nicamente las variaciones topolgicas de la superficie de un objeto (Figura 6). En los ltimos aos,
esta herramienta de anlisis microscpico de la superficie de los arrays de protenas, se ha utilizado
para la evaluacin de la inmovilizacin de biomolculas con una resolucin micromtrica, y para la
deteccin de interacciones proteicas. Con esta tecnologa, Soultani-Vigneron et al. desarroll una
tcnica para la inmovilizacin de oligopptidos en microarrays de protenas combinando AFM,
espectroscopa infrarroja y microscopia de fluorescencia.
7. Aplicaciones
Hay cinco reas principales en las que se estn aplicando arrays de protenas: diagnstico, la
protemica, anlisis funcional de protenas, caracterizacin de anticuerpos y desarrollo del
tratamiento

Diagnstico implica la deteccin de antgenos y anticuerpos en muestras de sangre; la

elaboracin de perfiles de los sueros para descubrir nuevas enfermedadesbiomarcadores ; la
vigilancia de las enfermedades y las respuestas a la terapia en la medicina personalizada; la
vigilancia del medio ambiente y la comida.

La protemica se refiere a la expresin de protenas de perfiles es decir, que las protenas se

expresan en el lisado de una clula particular.

Anlisis funcional La protena es la identificacin de las interacciones protena-protena (por

ejemplo, identificacin de los miembros de un complejo de protenas), las interacciones
protena-fosfolpido, blancos pequeos de molculas, enzimticos sustratos (en particular los
sustratos de quinasas ) y los ligandos del receptor.

Caracterizacin de anticuerpos est caracterizando reactividad cruzada , especificidad y

cartografa eptopos .

El tratamiento implica el desarrollo el desarrollo de terapias especficas de antgeno para la

autoinmunidad , el cncer y las alergias; la identificacin de objetivos pequeos molcula
que potencialmente podra ser utilizado como nuevos medicamentos.

8. Retos
Los desafos incluyen:

La bsqueda de una superficie y un mtodo de fijacin que permite a las protenas para
mantener su secundaria o estructura terciaria y por lo tanto su actividad biolgica y sus
interacciones con otras molculas,

La produccin de una matriz con una larga vida til de modo que las protenas en el chip no
desnaturalizar durante un corto perodo de tiempo,

Identificacin y aislamiento de anticuerpos u otras molculas de captura en contra de cada

protena en el genoma humano,

La cuantificacin de los niveles de protena unida asegurando al mismo tiempo la sensibilidad

y evitando el ruido de fondo,

Extraer la detectada protena desde el chip con el fin de analizar ms a fondo que,

La reduccin de la unin no especfica por los agentes de captura,

La capacidad del chip debe ser suficiente como para permitir una representacin completa
del proteoma a ser visualizado como sea posible; protenas abundantes abruman la deteccin
de protenas menos abundantes como molculas de sealizacin y los receptores, que
generalmente son de mayor inters teraputico.

Ventajas

Su principal ventaja radica en el hecho de que gran nmero de protenas pueden ser rastreados
en paralelo.

Microarrays de protenas son rpido, automatizado, econmico y altamente sensible, el

consumo de pequeas cantidades de muestras y reactivos.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

"Protein Arrays". Functionalgenomics.org.uk. 2009-05-20. Retrieved 2013-01-19.

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