METODOLOGA DE DETECCIN Y

CUANTIFICACIN DE
CIANOBACTERIAS Y CIANOTOXINAS
Antonio Quesada
Universidad Autnoma de Madrid

ndice
Identificacin y cuantificacin de
cianobacterias potencialmente txicas
Taxonoma de cianobacterias

Mtodos de deteccin y cuantificacin de

cianotoxinas
Mtodos cromatogrficos
Otros mtodos: ELISA, PP1

Resumen

METODOLOGAS
Recepcin de las
muestras
Identificacin
taxonmica

Fluormetro,
Microscopio

Preparacin

Filtracin, extraccin,
concentracin

Determinacin
Tox. disolucin

ELISA, LC/MS

Determinacin
Tox. particulada

ELISA, PP,
LC-MS, HPLC

IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN
DE CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TXICAS
MUESTRA DE AGUA VIVA

UTERMHL

FLOTACIN
FLUOROMETRA

IDENTIFICACIN (lista de gneros o especies)

CUANTIFICACIN

DISTRIBUCIN DE GRUPOS ALGALES (%)

BIOMASA DE CIANOBACTERIAS (CLOROFILA a)

ABUNDANCIA RELATIVA
(% Y/O CLASES )

CONCENTRACIN
DE CLULAS,
BIOVOLUMEN

TAXONOMA DE CIANOBACTERIAS
Criterios tradicionalmente morfolgicos (aspecto),
actualmente adems genticos y fisiolgicos.
rdenes familias (subfamilias) gneros
especies (variedades).
Ms de 2000 especies.

Constantes variaciones por revisin de expertos.

CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TXICAS

Alguna de sus cepas a nivel mundial ha sido txica.
Potencial siempre txico
Unos 20 gneros txicos descritos. Aprox. 25 especies
potencialmente txicas en Espaa.
Los ms importantes en Espaa:
Microcystis (Microcistinas), Aphanizomenon
(Cilindrospermopsina), Anabaena (anatoxina-a)
Cylindrospermopsis, Planktothrix, Woronichinia,etc

COLONIALES
(Orden Chroococcales)

Microcystis aeruginosa

50 m

FILAMENTOSAS SIN HETEROCISTOS

(Orden Oscillatoriales)

Planktothrix agardhii

10 m

FILAMENTOSAS CON HETEROCISTOS

(Orden Nostocales)

ACINETO
HETEROCISTO

ACINETO

HETEROCISTO

Aphanizomenon flos-aquae
Anabaena crassa

Aphanizomenon ovalisporum

FLOTACIN vs UTERMHL
FLOTACIN

UTERMHL

Tipo de muestra

Viva

Fijada (lugol)

Microscopio

ptico

ptico invertido

Cuantificacin

Abundancia relativa (%)

Concentracin de Clulas
Biovolumen

Rpido
Evita otras algas

Cuantificacin precisa
Mtodo estandarizado (norma
UNE-EN 15204:2007)

Inconvenientes

subestima taxones no
formadores de blooms
Cuantificacin poco precisa

Tedioso
Lugol altera aspecto real
Demasiadas especies
Posible subestimacin de
formadoras de scums??

Aplicacin recomendada

Gestin: deteccin rpida de

especies ms abundantes
formadoras de acumulados

Investigacin y/o gestin a medio

plazo: seguimientos temporales
precisos

Ventajas

Experto

Recomendable

Imprescindible

CLAVE DE IDENTIFICACIN (MUY) SIMPLIFICADA

Unicelular, colonial, filamentosa?

Unicelular

Filamentosa

Colonial

Heterocistos?

Microcystis?

Woronichinia?

NO

OSCILATORIALES

Planktothrix?

NOSTOCALES

Apuntamiento?

NO

Anabaena?
Cylindrospermopsis?

S
Aphanizomenon?

Mtodos de deteccin y cuantificacin

de cianotoxinas
Mtodos cromatogrficos de deteccin
Tcnicas para la separacin de compuestos en una mezcla que
permita una deteccin individualizada de uno o varios analitos
Constan de:
1.Separacin cromatogrfica
2.Deteccin
Empleados en muy diversos campos

Separacin cromatogrfica
1.Compuestos aadidos conjuntamente a una fase mvil
2.Compuestos atraviesan fase estacionaria

3.Los compuestos son retenidos o eluidos segn sus

caractersticas qumicas o fsico qumicas
4.Los compuestos abandonan la fase estacionaria ordenados
inversamente a su grado de retencin

RT: 0,56 - 77,23

646
13,44
612
12,73

100
95

NL:
6,81E8
TIC MS
09071605

90
85
80
599
12,46

75

723
15,04

70
2686
55,92 2707
56,36

65
60
55

72
1,48

50

570
11,86
540
11,23

774
16,10

2590
53,93

45
40
35
30

84
1,73

2288
47,64

468
9,73
126
2,61 298
6,19

25

2497
51,99
2256
46,97

899
18,71

20

2738
57,01
2768
57,63

15
990
20,60

10

1273
26,50

1705
35,49
1498
31,18

2137
44,49

2966
61,76

3700
77,04

3200
66,63

0
10

20

30

40
Time (min)

50

60

70

RT: 5,11 - 23,84

646
612
13,44
12,73

100
80
60
40

298
6,19

20

411 454
8,54 9,44

570
540
11,86
468 11,23
9,73

723
15,04

NL:
6,81E8
TIC MS
09071605

774
16,10
790
16,44

899
18,71

990
20,60

1105 1124
23,00 23,39
NL:
2,28E7
m/z=
994,50995,50 MS
09071605

898
18,69

100

-LR

80
60
40
20
0

294
6,11

359 407
7,46 8,46

468
9,73

100

839
826 17,46
17,19

650 683
642
556
13,52
11,56 13,36
14,21
598
12,44

80

912
18,98

1012 1091 1145

21,06 22,71 23,83
NL:
2,08E8
m/z=
519,50520,50 MS
09071605

-RR

60
40
20

311
6,46

366
7,61

450 497
581
9,36 10,34 12,08

614 669 749

12,77 13,92 15,58

844 895
924 991 1068 1141
17,56 18,62 19,23 20,62 22,23 23,75

791
16,46
788
16,40

100
80
60

871
18,12

NL:
1,48E7
m/z=
1044,501045,50 MS
09071605

-YR

40
20
0

294
6,11
6

575
387 464 468 504
8,04 9,65 9,73 10,48 11,96
8

10

12

643
13,38

860
17,89

709
14,75

14
Time (min)

16

895
18,62
18

1000 1027
20,81 21,37
20

22

1090
22,69

Otros mtodos de anlisis de Microcistinas

-Test de Inhibicin de Protein-fosfatasa (PPI)

- Ensayo de inmunodeteccin (ELISA)

PPI-test (Inhibicin enzimtica de la protein

fosfatasa)
Kit comercial (ZEU- Inmunotec)
Microcistinas Inhibicin de enzimas proteinfosfatasas (tipos 1 y 2A)
Principio: Reduccin de la defosforilacin como medida indirecta de su concentracin.

Extracto Pfasa +
Sustrato (pnitrofenolfosfato)

Microcistinas

Defosforilacin
(cambio de color)

Cuantificacin
por absorbancia
405nm

ELISA Enzyme-linked inmunosorbent assay

Kits comerciales (Envirogard, )
Basado en la interaccin entre anticuerpos y toxina.

Mecanismo:
1. Placa multipocillo con anticuerpos
2. Adicin de muestra [MC desconocida]
3. Adicin de conjugado MC-enzima

Unin competitiva a
sitios de unin

4. Adicin de sustrato (genera color en presencia del conjugado)

5. Medicin de la absorbancia a 450nm

Selectividad

100

RMN

MALDI-TOF
LC/MS

75

HPLC

50

25

ELISA
PP

Bioensayo

ng

pg

Sensibilidad

fg

Gracias!!