Biorremediacao de Solo Argiloso Contaminado

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
DOUGLAS GUEDES FERREIRA
Biorremediao de Solo Argiloso Contaminado com Gasolina Aditivada

com Diferentes Teores de Etanol
RIO DE JANEIRO
2010
DOUGLAS GUEDES FERREIRA
Biorremediao de Solo Argiloso Contaminado com Gasolina Aditivada

com Diferentes Teores de Etanol
Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-graduao em Tecnologia
dos Processos Qumicos e Bioqumicos,
Escola de Qumica, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como requisito parcial para a
obteno do Ttulo de mestre em Cincias
Orientao: Prof. Dra. Eliana Flvia Camporese Srvulo

Prof. Dra. Denise Dias de Carvalho
RIO DE JANEIRO
2010
F383b
Ferreira, Douglas Guedes

Biorremediao de Solo Argiloso Contaminado com Gasolina Aditivada com
Diferentes Teores de Etanol/ Douglas Guedes Ferreira. - 2010
xx, 113 f.: il.
Dissertao (Mestrado em Tecnologia dos Processos Qumicos e
Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Qumica, Rio
de Janeiro, 2010.
Orientadoras: Eliana Flvia Camporese Srvulo e Denise Dias de Carvalho.
1. Solo Argiloso. 2. Gasolina. 3. Biorremediao. Teses. I. Srvulo, Eliana
Flvia Camporese (Orient.). II. Carvalho, Denise Dias (Orient.). III. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Programa de Ps-graduao em Tecnologia dos
Processos Qumicos e Bioqumicos, Escola de Qumica. IV. Ttulo.
CCD 363.7
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer:
Deus pela sua iluminao e conforto at mesmo nos momentos mais difceis;
Aos meus pais, em especial ao meu pai que hoje um exemplo de serenidade e
sabedoria que me permite encontrar o equilbrio mesmo nos momentos mais
turbulentos;
Professora Eliana que foi muito mais que uma orientadora durante toda a nossa
convivncia, emprestando seus ombros e ouvidos como uma grande amiga e
ainda o colo confortvel de uma me amorosa;
Professora Denise pela colaborao;
Dra Mrcia e toda a equipe do Laboratrio de Biocorroso e Biodegradao,
Instituto Nacional de Tecnologia (Ana, Luciana, Mariana, Miriam e Viviane), que
permitiram a realizao deste trabalho tanto pelo fornecimento do espao fsico
quanto pela ajuda na realizao dos ensaios;
equipe do Laboratrio de Microbiologia Industrial pela amizade e contribuio,
principalmente a Juliana e Kally por compartilhar dos momentos de aflio;
equipe do Laboratrio de Tecnologia Ambiental pela colaborao na realizao
desse trabalho, principalmente as tcnicas Suzana e Vernica;
equipe do Laboratrio de Geotecnia/COPPE pela colaborao na realizao
desse trabalho, principalmente a Dra Alcione Chagas;
s minhas amigas de faculdade que me permitem compreender que mesmo com
a vida atribulada ainda possvel manter os laos de amizade, em especial a
Aline, Andreza, Carol B., Carol K., Juliana, Patrcia e Tatiana;
minha amiga Fernanda por muitas vezes ser meus olhos, ouvidos e
conscincia;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e
PETRORAS pelo fornecimento de bolsa e todo o suporte financeiro para a
realizao desse trabalho;
E, todos aqueles que participaram de forma direta ou indireta para que eu
alcanasse esse meu objetivo.
Qualquer coisa que voc fizer na

vida ser insignificante, mas muito
importante que voc o faa
Mahatma Ghandi
RESUMO
O solo um ecossistema rico em biodiversidade, entretanto as atividades

antrpicas ameaam a dinmica e at mesmo a permanncia das espcies de
microrganismos, animais e vegetais que compem esse bioma. O uso intensivo do
petrleo e seus derivados podem ser apontados como uma das origens dessa
ameaa ambiental. Dentre os derivados do petrleo, a gasolina se destaca pela
gerao de efeitos agressivos ao meio ambiente e sade humana. No caso da
gasolina brasileira ainda existe um agravante, pois a legislao nacional determina
que a gasolina comercial contenha 25% (v/v) de etanol. Essa adio aumenta a
solubilidade da gasolina em gua permitindo a maior difuso do contaminante, e, por
conseguinte aumentando a rea contaminada. Desse modo, h a necessidade de se
aplicar mtodos de tratamento nas reas afetadas pela contaminao. As opes de
tratamento incluem tcnicas fsico-qumicas e/ou biolgicas, contudo as tcnicas
biolgicas so, em geral apresentam custos inferiores s tcnicas fsico-qumicas e,
ainda, possuem maior aceitabilidade por parte da sociedade e agncias reguladoras.
Por isso, este estudo dividiu-se em duas partes, a primeira foi realizada em
microcosmos e teve por finalidade avaliar as condies nutricionais e de umidade na
biorremediao da gasolina em solo argiloso, bem como verificar se a variao no
percentual de etanol na gasolina interfere no processo de biorremediao. J a
segunda parte foi realizada em colunas cilndricas de 60 cm de comprimento e 10
cm de raio visando verificar a realizao do processo em diferentes profundidades
de solo. Os resultados obtidos na primeira etapa indicaram que o teor de etanol
testado (25%) no interfere no processo de biorremediao, por outro lado, o ajuste
do solo para 50 ppm de fsforo permitiu a remoo de mais 50% do contaminante
nos ensaios. Baseado nisso, verificou-se que o maior teor de umidade (40%)
colabora para a maior eficincia do processo. Na segunda etapa, o etanol tambm
no interferiu na biorremediao, entretanto permitiu que o contaminante atingisse o
fundo da coluna em um menor intervalo de tempo. A degradao do contaminante
foi irrisria no solo sem ajuste de nutrientes, enquanto que nos ensaios com ajuste
de 50 ppm de fsforo foi possvel remover cerca de 70% do contaminante. Esses
dados indicam que a biorremediao pode ser aplicada no tratamento de solos
contaminados com gasolina, que introduo de nutrientes crucial para isso, e
tambm pde-se observar que a presena do etanol no interfere nesse processo.
ABSTRACT
Soil is an ecosystem rich in biodiversity, however human activities threaten the

dynamic and even the permanence of microorganisms, animals and plants species
which compose this biome. The intensive use of oil and its derivatives are one of the
causes these environmental threats. Among the petroleum, gasoline promotes
harmful effects to the environment and human health. Additionally, the Brazilian
gasoline still has an aggravating, because the legislation provides that the
commercial gasoline contains 25% (v / v) ethanol. This addition increases the water
solubility of gasoline and allows greater diffusion of the contaminant, therefore
increases the contaminated area. So, its necessary to apply treatment methods in
the areas affected by contamination. Treatment options include physico-chemical
techniques and / or biological, but biological techniques have generally lower costs
than physico-chemical techniques, and also have greater acceptance by society and
regulator agency. Therefore, this study was divided into two parts, the first one was
performed in microcosms and aimed to evaluate the nutritional status and moisture
for gasoline bioremediation in clay soil and verify if the variation in the ethanol
percentage in gasoline interfere in bioremediation process. The second part was
performed in cylindrical columns with 60 cm long and 10 cm in radius in order to
verify the completion of the process in different soil depths. The results obtained in
the first stage indicated that the concentration of ethanol tested (25%) did not
interfere in bioremediation process, however, adjusting the soil to 50 ppm of
phosphorus allowed the removal of over 50% of the contaminant in the assays.
Based on that, it was found that the higher moisture content (40%) contributes to
greater efficiency. In the second stage, ethanol also did not interfere in
bioremediation, however allowed the contaminant to reach the bottom of the column
in a shorter time interval. The degradation of the contaminant was negligible in the
soil of nutrients without adjustment, while tests with adjustment of 50 ppm of
phosphorus was possible to remove about 70% of the contaminant. These data
indicate that bioremediation can be applied in the treatment of soils contaminated
with gasoline, the introduction of nutrients is crucial for this, and could also be
observed that the presence of ethanol does not interfere in this process.
LISTA DE FIGURAS
PGINA
Figura 1 Representao dos cinco horizontes de um solo completo
18
Figura 2 Classificao textural dos solos segundo departamento de
20
agricultura dos Estados Unidos da Amrica, 1993

Figura 3 Distribuio dos argissolos e dos latossolos no territrio
21
brasileiro
Figura 4 Processo de refino do petrleo e as reaes de transformao
27
dos produtos da destilao

Figura 5 Principais fontes poluidoras do estado de So Paulo
32
Figura 6 Causas da poluio por postos de combustveis na cidade de
33
So Paulo
Figuras 7 Principais combustveis contaminantes do solo no estado de
33
So Paulo
Figura 8 Local de coleta do solo argiloso
43
Figura 9 Ilustrao do reator usado no ensaio de diversidade
52
microbiana
Figura 10 Testes de percolao do contaminante feitos em coluna
53
(mido: 20% de umidade; saturado: 40%)

Figura 11 Placa multipoo usada para a estimativa da concentrao de
55
bactrias hidrocarbonoclsticas pela tcnica do nmero mais provvel

Figura 12 Ciclo usado na reao de PCR (polymerase chain reaction)
57
para a identificao de culturas isoladas

Figura 13 - Avaliao da ecotoxicidade
60
Figura 14 - Constituio granulomtrica do solo argiloso utilizado
61
Figura 15 Teores finais de hdrocarbonetos totais do petrleo, expressos
69
em valores mdios, para a biorremediao de latossolo contaminado com

10% (m/m) de gasolina em diferentes condies de etanol, fertilizante e
umidade.
Figura
16
Concentraes
inicial
final
de
bactrias
73
hidrocarbonoclsticas para biorremediao de solo contaminado com

gasolina nas diferentes condies ensaiadas usando solo mido.
Figura
17
Concentraes
inicial
final
de
bactrias
hidrocarbonoclsticas para biorremediao de solo contaminado com

gasolina nas diferentes condies ensaiadas usando solo saturado.
74
Figura 18 Comparao entre o percentual de remoo de HTP e a
76
variao da concentrao de BHC nos ensaios do planejamento fatorial

(Quadros 5 e 6).
Figura 19 Percentual de mortalidade de minhocas nos ensaios do
79
planejamento fatorial
Figura 20 Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis
82
estudadas na remoo de hidrocarbonetos totais do petrleo

82
estudadas para o crescimento das bactrias hidrocarbonoclsticas

83
estudadas na mortalidade de minhocas (Eisenia fetida)

Figura 23 Grfico das Mdias relacionando a mortalidade de minhocas
84
e a concentrao de fsforo, com base na umidade (mido-20%;

saturado-40%)
Figura 24 Teor de hidrocarbonetos totais do petrleo no ensaio EB-1
87
em diferentes profundidades ao longo de 60 dias

87

88
diferentes profundidades ao longo de 60 dias

88

Figura 28 Variao da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas no
90
controle CEB-I em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

91
controle CEB-II em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo

91
ensaio EB-1 em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

92

94

ensaio EB-4 em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo
95
LISTA DE QUADROS
PGINA
Quadro 1 Distribuio de microrganismos em vrias profundidades do
22
solo
Quadro 2 Fraes tpicas do petrleo
26
Quadro 3 - Componentes da gasolina identificados por Solid Phase
29
Microextraction (SPME)
Quadro 4 Parmetros analisados para caracterizao do solo
46
Quadro 5 Quadro 5 Matriz do Planejamento Fatorial 22 em Solo com
49
20% de umidade
Quadro 6 Matriz do Planejamento Fatorial 22 em Solo com 40% de
49
umidade
Quadro 7 Matriz dos ensaios controles realizados
50
Quadro 8 Matriz do Ensaio de Biorremediao em Coluna
52
Quadro 9 Concentrao final dos reagentes na reao de PCR
57
Quadro 10 Caractersticas fsico-qumicas do solo
64
Quadro 11 Caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas do solo
67
corrigido
Quadro 12 Bactrias isoladas do solo in natura e de amostras dos
ensaios de biorremediao
98
SUMRIO
PGINA
1. INTRODUO E OBJETIVOS
12
2. REVISO BIBLIOGRFICA
16
2.1. Solo
16
2.1.1. Formao do Solo
16
2.1.2. Caractersticas do Solo
18
2.1.3. Solo Brasileiro
21
2.1.4. Microbiologia do Solo
22
2.1.4.1. Fatores que Afetam a Microbiota do Solo
23
2.2. Petrleo e Derivados
25
2.2.1. Gasolina
28
2.2.2. Mistura Gasolina/lcool
30
2.3. Contaminao dos Solos
31
2.4. Tratamento de Solos Contaminados
34
2.4.1. Biorremediao
35
2.4.1.1. Fatores que Afetam a Biorremediao
37
2.4.1.2. Avaliao da toxicidade do solo
40
2.5. Ferramentas Estatsticas
41
3. MATERIAL E MTODOS
43
3.1. Solo
43
3.2. Combustveis
44
3.3. Fertilizante
44
3.4. Ajuste do pH do Solo
44
3.5. Preparo do Inculo
45
3.6. Detalhamento dos Ensaios de Biorremediao
46
3.6.1. Caracterizao do Solo
46
3.6.2. Ensaios de Biorremediao em Mocrocosmos
47
3.6.3. Avaliao da Biorremediao em Colunas
51
3.7. Anlises Quantitativas
54
3.7.1. Anlises Microbiolgicas
54
3.7.1.1. Quantificao das Bactrias Heterotrficas Cultivveis Totais
54
3.7.1.2. Quantificao das Bactrias Hidrocarbonoclsticas Cultivveis
54
3.7.1.3. Mtodos Moleculares
55
3.7.1.3.1. Extrao de DNA
56
3.7.1.3.2. PCR (polymerase chain reaction)
56
3.7.1.3.3. Seqenciamento das Culturas Isoladas
58
3.8. Anlises Fsico-Qumicas
58
3.8.1. pH (potencial de Hidrognio)
58
3.8.2. Teor de Umidade Total
58
3.8.3. Teor de Hidrocarbonetos Totais do Petrleo (TPH)
59
3.9. Anlise de Ecotoxicidade
59
3.9.1. Teste de mortalidade de Minhocas
59
3.10. Anlise Estatstica
60
4. RESULTADOS E DISCUSSO
61
4.1. Solo
61
4.2. Avaliao de Parmetros para a Biorremediao da Gasolina
67
4.2.1. Anlise Estatstica do Planejamento Fatorial
80
4.3. Ensaio de Biorremediao em Colunas
85
4.4. Isolamento e Identificao de Microrganismos
96
5. CONCLUSES
101
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
104
Ferreira, D.G.
Introduo e Objetivos
1. INTRODUO E OBJETIVOS
A superfcie do planeta Terra composta por trs camadas distintas, que so a
atmosfera, hidrosfera e litosfera. Essas camadas consistem, respectivamente, na
camada de ar que envolve a superfcie do planeta, e nos ecossistemas aquticos e
terrestres. Por sua vez, a associao dessas trs camadas permite a existncia de vida,
representada por seres humanos, animais, vegetais e microrganismos, que juntos
compem a biosfera (Oliveira, 2008).
A biosfera varia com o ambiente. Por exemplo, o solo um ecossistema rico em
biodiversidade, em grande parte composta por microrganismos. Por outro lado, a
dinmica dessas espcies microbianas autctones pode ser alterada artificialmente por
atividades antrpicas, principalmente, em conseqncia do desenvolvimento dos
centros urbanos e dos setores industriais. As atividades humanas tm provocado a
poluio do meio ambiente, de modo crescente e descontrolado, particularmente pela
circulao da elevada frota de veculos automotores.
Um levantamento realizado na cidade de So Paulo mostrou que os postos de
combustveis so as maiores fontes de poluio, sobretudo atravs de vazamentos em
tanques de armazenamento e em tubulaes (CETESB, 2005; CETESB, 2006). No
caso dos vazamentos nos tanques de armazenamento de combustveis, 72% dos
registros foram atribudos ao derramamento de gasolina, seguidos pelo leo diesel
(19%) e etanol combustvel (2%). Esses dados, obviamente, so decorrentes da grande
circulao de veculos nos grandes centros urbanos, da maior frota de veculos movidos
a gasolina, e do tempo de vida til dos tanques de armazenamento, de
aproximadamente 30 anos, j ter expirado (CETESB, 2005).
Os
vazamentos
de
gasolina
apresentam
grande
importncia,
poisos
hidrocarbonetos que compem esse combustvel provocam impactos graves ao meio

ambiente e sade humana (Corseuil & Fernandes, 1999; Niven, 2005).
A gasolina uma mistura complexa de hidrocarbonetos, que pode variar de
acordo com a composio do leo de origem e dos aditivos adicionados para a
comercializao. Em geral, os hidrocarbonetos que compem esse combustvel
12
Ferreira, D.G.
apresentam cadeias de estrutura varivel que possuem de 4 a 12 tomos de carbono

(Harris, Whiticar & Eek, 1999). Dentre os hidrocarbonetos, destacam-se os compostos
aromticos volteis benzeno, tolueno, etilbenzeno e os ismeros orto-, para- e metaxileno (BTEX), pela sua elevada toxicidade sade humana atuando como, por
exemplo,
depressores
do
sistema
nervoso
central,
agentes
mutagnicos
carcinognicos. Alm disso, em relao aos demais hidrocarbonetos presentes na

gasolina, os BTEX apresentam maior solubilidade em gua, o que permite que, em
casos de vazamento, esses compostos possam no s ser nocivos as atividades no
solo, mas tambm comprometer a potabilidade das guas subterrneas (Corseuil &
Fernandes, 1999; Niven, 2005).
No caso da gasolina comercializada no territrio nacional, a presena de 25%
etanol (Art. 1, Resoluo CIMA, n37 de 27/06/2007) tem sido motivo de preocupao
para os rgos ambientais. Isto se deve a solubilidade do etanol em gua que, pelo
fenmeno de co-solvncia, poderia agir como uma ponte para a solubilizao dos
hidrocarbonetos. Dessa forma a presena do lcool permitiria que, em casos de
vazamento, o contaminante se alastrasse mais, atingido uma maior rea de solo e,
inclusive, que maiores concentraes alcanassem as guas subterrneas (Corseuil &
Fernandes, 1999; Niven, 2005).
Portanto, no caso de ocorrerem acidentes seja por vazamentos de tanques de
armazenamento de gasolina ou pelo seu transporte imprescindvel que sejam
definidas estratgias para a remediao da rea impactada, de modo a conter o
contaminante e tentar reconstituir a condio natural da rea afetada (Riser-Roberts,
1998).
Algumas tcnicas j foram desenvolvidas para o tratamento de reas
contaminadas por petrleo e seus derivados. Dentre essas, as tcnicas fsico-qumicas,
que envolvem o emprego de substncias qumicas e fatores fsicos como, por exemplo,
temperatura e presso, so de uso freqente devido grande eficincia e ao curto
perodo de tratamento. Porm, alm do alto custo, esses tratamentos apresentam
inconvenientes, como a gerao de grandes volumes de rejeitos contaminados (guas
13
Ferreira, D.G.
e solventes), e risco de poluio atmosfrica atravs da volatilizao de alguns

compostos (Riser-Roberts, 1998; Khan, Husain & Ramzi, 2004).
Uma alternativa aos mtodos fsico-qumicos so os mtodos biolgicos que
consistem na aplicao de organismos vivos capazes de atuar na remoo do
contaminante. Os tratamentos biolgicos tambm apresentam grande eficincia, em
geral, so menos onerosos e possuem maior aceitabilidade por parte da sociedade e
agncias reguladoras. Entretanto, tambm possuem desvantagens como tempo maior,
a dependncia de condies ambientais e a especificidade do processo (Riser-Roberts,
1998; Iwamoto & Nasu, 2001; Khan, Husain & Ramzi, 2004).
A biorremediao um exemplo de tratamento biolgico que se baseia na
capacidade dos microrganismos de modificar ou decompor o contaminante. Essa
tcnica, diferentemente das tcnicas fsico-qumicas, pode permitir como benefcio
mximo a mineralizao do contaminante (Riser-Roberts, 1998; Khan, Husain & Ramzi,
2004).
Nos solos, a biorremediao da rea contaminada, pode ser efetuada pela ao
dos microrganismos autctones que, dependendo do caso, pode ser estimulada pela
introduo de nutrientes (bioestimulao). Alm disso, quando a concentrao de
microrganismos baixa ou a microbiota nativa no capaz de degradar os compostos
xenobiticos, pode ser feita a introduo no solo de microrganismos com potencial
degradador (bioaumento), a fim de aumentar a remoo do contaminante (Bento et al.,
2005; Olaniram, Pillay & Pillay, 2006; Serrano et al., 2007; Stucki et al., 2007).
A aplicao da biorremediao no tratamento de ecossistemas contaminados com
gasolina j foi alvo de alguns estudos (Corseuil et al., 1996; Phelps & Young, 1999;
Yerushalmi, Manuel & Guiot, 1999; Barbaro & Barker, 2000; Kao & Wang, 2000;
Solano-Serena et al., 2000; Rahman et al., 2002; Silva & Alvarez, 2002; Landmeyer &
Bradley, 2003; Ghazali et al., 2004; Nardi et al., 2005; Tiburtius, Peralta-Zamora &
Emmel, 2005; Baldwin, Nakatsu & Nies, 2007; Dou et al., 2007). No entanto, poucos
trabalhos deram nfase ao papel e aos efeitos da presena de lcool em associao a
adio de fertilizante no processo. As informaes disponveis na literatura indicam que
a presena de lcool na gasolina resulta no aumento dos danos ao ambiente e interfere
14
Ferreira, D.G.
negativamente na atividade microbiana (Corseuil et al., 1996; sterreicher-Cunha et al.,

2004; Niven, 2005; sterreicher-Cunha et al., 2007; sterreicher-Cunha et al., 2009).
Ademais, no h registros sobre os efeitos da variao da concentrao de etanol na
gasolina, tampouco registros relacionados interferncia das condies nutricionais ou
de umidade. Nesse contexto, e considerando a relevncia da contaminao dos solos
urbanos com combustveis, fundamental conhecer as possveis implicaes da
interao do contaminante com o ecossistema.
Este estudo teve como objetivo principal a avaliao do processo de
biorremediao da gasolina, aditivada ou no com etanol anidro, em solo argiloso, em
funo da condio nutricional, da umidade do solo e da profundidade do solo. Para
tanto, foram delineados os seguintes objetivos especficos:
Caracterizar o solo quanto aos seus aspectos fsico-qumicos e microbiolgicos;

Realizar ensaios em microcosmos, baseados em um planejamento fatorial, para
verificar a significncia da umidade, da concentrao de etanol na gasolina e do
bioestmulo no processo de biorremediao da gasolina;
Determinar o efeito da adio e da concentrao de etanol (0, 12,5 e 25%)
gasolina no processo de biorremediao, atravs do planejamento fatorial;
Estimar a influncia da condio nutricional do solo na degradao dos
hidrocarbonetos do petrleo pelo ajuste da concentrao de fsforo para 25 e 50
ppm, atravs do planejamento fatorial;
Avaliar a toxicidade do solo aps a biorremediao, nos ensaios de microcosmos,
utilizando aneldeos da espcie Eisenia fetida;
Realizar ensaios em colunas para avaliar o efeito da concentrao de etanol na
gasolina e da umidade do solo na percolao do contaminante no solo;
15
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1. Solo
Segundo a Pedologia*, o solo pode ser definido como um corpo natural
resultante da ao conjunta de vrios processos pedogenticos quer biolgicos quer
ambientais, que se constituem nos fatores de formao do solo (Jenny, 1994;
Oliveira, 2008).
2.1.1. Formao do Solo

Em geral, a formao e a evoluo do solo ocorrem atravs da ao de quatro
fatores de formao: material de origem; clima; relevo; e seres vivos (Oliveira, 2008).
O solo tem sua origem nas rochas presentes na litosfera, do grego, lithos, que
significa pedra, basicamente formada por trs grandes grupos de rochas:
magmticas; metamrficas; e sedimentares (Oliveira, 2008).
As rochas magmticas so resultado do resfriamento e da consolidao do
magma, enquanto que as rochas sedimentares se originam da compactao dos
sedimentos. J, a formao das rochas metamrficas ocorre a partir da ao da
temperatura e da presso atmosfrica sobre as rochas sedimentares e magmticas
(Amaral & Leinz, 2001).
Esses trs tipos de rocha apresentam composio elementar semelhante, em
geral, compostos por: oxignio (62,6%), silcio (22,1%), alumnio (6,5%), sdio
(2,6%), ferro (1,9%), clcio (1,9%), magnsio (1,4%) e potssio (1%) (Oliveira,
2008).
Na superfcie, as rochas ficam expostas a uma srie de fatores ambientais biticos (ao dos seres vivos) e abiticos (ao de interaes qumicas e de
agentes climticos) - que provocam o desgaste e o enfraquecimento das rochas.
Esse fenmeno denominado intemperismo, e pode ser classificado como qumico,
fsico ou biolgico de acordo com o seu agente promotor (Gordon & Dorn, 2005;
Turkington, Phillips & Campbell, 2005; Oliveira, 2008). Ademais, o grau de
intemperismo possibilita a formao de diferentes tipos de solo.
* Pedologia cincia que estuda o solo.
16
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Na formao do solo, o clima e o relevo agem de maneira integrada, e

interferem diretamente na ocorrncia e na velocidade dos fenmenos, uma vez que
esto relacionados a dinmica e ao escoamento da gua no solo, a incidncia da
radiao solar na sua superfcie, e conseqentemente, na temperatura do solo
(Oliveira, 2008). Como a radiao solar atinge apenas a superfcie do solo, nela
onde ocorrem as maiores variaes de temperatura. Entretanto, com o aumento da
profundidade, a temperatura tende a diminuir at um ponto de isotermia, que em
solos da regio intertropical ocorre a partir da faixa entre 50 e 100 cm (Oliveira,
2008).
Os seres vivos flora, fauna e microbiota colaboram diretamente no processo
de formao do solo, seja em sua superfcie ou em seu interior. Particularmente, a
microbiota nativa atravs dos microrganismos autotrficos atuam desde os estgios
iniciais do intemperismo, com a secreo de produtos do seu metabolismo capazes
de dissolver sais e outros nutrientes inorgnicos da rocha matriz. A esfoliao das
rochas por esses agentes qumicos promove o acmulo de partculas sobre a rocha
matriz, que formam a camada superficial do solo. Ao longo do tempo, essa camada
superficial se expande e a matria orgnica presente, oriunda principalmente dos
microrganismos, viabiliza que outros seres possam se desenvolver. Assim,
microrganismos heterotrficos, animais e vegetais, do continuidade ao processo de
formao e evoluo do solo.
A evoluo do solo tambm est envolvida no aumento da espessura dessa
camada superficial, afastando cada vez mais a rocha matriz da superfcie do solo. E
entre a superfcie do solo e a rocha matriz so formadas camadas de solo
denominadas de horizontes que diferem, entre si, em composio e em grau de
intemperismo (Oliveira, 2008). O nmero de horizontes varia com o tipo e o estgio
de evoluo do solo, uma vez que o processo evolutivo do solo ininterrupto e,
portanto, estando em constante transformao e sujeito a ao dos fatores de
formao (Oliveira, 2008).
Genericamente, um solo com o seu processo de formao concludo apresenta
cinco diferentes horizontes (O, A, B, C e R), como mostra a Figura 1 (EMBRAPA,
1988). Ressalta-se que a separao entre os horizontes no abrupta, mas sim
gradativa. Assim, possvel observar regies intermedirias que apresentam
caractersticas mistas tanto na camada superior quanto na inferior.
17
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Em paralelo s aes naturais, as atividades antrpicas, tais como a

agricultura, o desmatamento, o reflorestamento, as construes e a poluio
tambm esto envolvidas no processo de transformao e evoluo do solo
(Oliveira, 2008).
Fonte: Adaptao de http://www.dct.uminho.pt/pnpg/gloss/gifs/perfil_ampl.jpg; Oliveira (2008).
Figura 1 Representao dos cinco horizontes de um solo completo.
2.1.2. Caractersticas do Solo

O solo se divide basicamente em trs fases: lquida (gua e soluo do solo),
gasosa (vapor dgua, CO2, O2, NH3 e outros gases) e slida (partculas de solo e
seres vivos). As fases lquida e gasosa so complementares e ocupam os espaos
vazios formados entre os slidos (Prevedello, 1996).
A gua ao penetrar no solo dissolve alguns dos componentes qumicos nele
presentes, formando uma soluo constituda de diferentes ons como, por exemplo,
NO3-, H2PO4-, SO42-, Cl-, Na+, K+, Ca2+, H+ e NH4+. Essa soluo recebe o nome de
soluo do solo. A composio qumica da soluo do solo, bem como o grau de
intemperismo
conferem
ao
solo
diferentes
caractersticas,
principalmente
relacionadas consistncia, textura, porosidade, permeabilidade e colorao

(Oliveira, 2008).
18
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
A consistncia o aspecto ttil que o solo assume baseado nas interaes das
partculas (foras de coeso) entre si e com a soluo do solo (foras de adeso).
Por isso, a consistncia pode variar de acordo com a umidade, composio qumica
e tamanho das partculas do solo (Lodi, 2007).
O tamanho das partculas de solo tambm interfere na textura do solo, sendo
as principais partculas quelas com tamanho inferior a 2 mm (areia, silte e argila).
No solo, essas partculas se arranjam formando espaos vazios, que se constituem
nos poros do solo. O tamanho dos poros varivel, distinguindo-se em macro e
microporos. Os macroporos so importantes para a aerao e infiltrao da gua no
solo, j os microporos esto relacionados com o armazenamento da gua no solo.
Para os poros de tamanhos intermedirios, atribui-se a conduo dos gases e da
gua no solo (Oliveira, 2008).
A proporo das partculas de areia, silte e argila adotada para classificao
dos solos em trs grandes grupos: arenoso, siltuoso e argiloso. No entanto, classes
intermedirias tambm podem ser encontradas como ilustra a Figura 2
(Departamento de Agricultura dos EUA, 1993).
Na escala textural, as partculas de areia so as maiores (2,0 a 0,05 mm) e se
compem, principalmente, por materiais resistentes ao intemperismo como, por
exemplo, quartzo e dixido de titnio (TiO2). Em geral, essas partculas apresentam
superfcie especfica reduzida e fracas interaes de coeso e adeso. Por conta do
seu tamanho e das interaes qumicas, os solos com alto teor de areia apresentam
alta permeabilidade e porosidade (CETESB, 2001; Oliveira, 2008).
J as partculas de silte, com dimetro entre 0,05 e 0,002 mm, so constitudas
tanto por materiais resistentes (dixido de titnio e quartzo), quanto por materiais
sensveis ao intemperismo (feldspatos, micas, anfiblios e outros minerais
primrios). As partculas de silte apresentam fortes interaes entre si, o que faz
com que, em comparao com as partculas de areia, apresentem menor
permeabilidade e maior capacidade de reteno de gua (CETESB, 2001; Oliveira,
2008).
19
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Clay Argila
Sand Areia
Silt Silte
Loam Franco
Percent - Percentual
Fonte: http://media-2.web.britannica.com/eb-media/21/24021-004-3F055051.gif;
(Departamento de Agricultura dos EUA, 1993).
Figura 2 Classificao textural dos solos.
Comparativamente, a argila a partcula de menor tamanho, com dimetro

inferior a 0,002 mm, e, portanto, grande superfcie especfica (CETESB, 2001;
Oliveira, 2008). Tambm apresentam carga inica pela presena xidos de ferro e
de alumnio. Em relao areia e ao silte, a argila a que possui a maior
capacidade de interagir com ons e reter gua.
Os solos podem apresentar diversas coloraes que dependem da proporo
dos compostos qumicos neles presentes. Por exemplo, a existncia de altas
concentraes de xidos de ferro e/ou alumnio no solo confere a ele coloraes que
variam do amarelo ao vermelho. J xidos de mangans causam o enegrecimento
do solo, enquanto o carbonato de clcio gera o seu branqueamento. Por outro lado,
a presena de material orgnico confere ao solo uma colorao mais escura
(EMBRAPA, 1999). Considerando que a concentrao dos compostos qumicos
varia no solo, este pode apresentar diferentes matizes (EMBRAPA, 1999; Oliveira,
2008).
20
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
2.1.3. Solo Brasileiro

No Brasil h predomnio de duas classes de solos argilosos - Latossolos e os
Argissolos (Oliveira, 2008) - cuja distribuio pode ser observada na Figura 3. Essas
duas classes de solo se subdividem em diversos tipos que se distinguem quanto as
constituies qumica, granulomtrica e estrutural. As denominaes desses solos,
normalmente, esto relacionadas a estrutura, colorao e textura, como, por
exemplo, Argissolo amarelo distrfico arnico (EMBRAPA, 1999).
Argissolo
Latossolo
Fonte: Adaptao de http://www.dcs.ufla.br/Cerrados
Figura 3 Distribuio dos Argissolos e dos Latossolos no territrio brasileiro.
Os Latossolos ocupam mais de 50% da extenso do territrio nacional e

caracterizam-se pelo avanado estgio de intemperismo e reduzida reserva de
nutrientes. Enquanto que os Argissolos recobrem pouco mais de 30% do solo
nacional, e se caracterizam pela presena de uma camada mineral subsuperficial
com caracterstica franco-arenosa imediatamente abaixo ao horizonte A (Santos et
al., 2006).
21
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
2.1.4. Microbiologia do Solo

Em geral, o solo um ecossistema composto por um elevado nmero de
organismos, com predominncia de microrganismos em termos quantitativos e em
diversidade de espcies (Moreira & Siqueira, 2006). A microbiota autctone dos
solos engloba seres procariotos (Archaeas e Bactrias) e eucariotos (Fungos,
Microalgas e Protozorios).
A atividade biolgica mais intensa na camada superficial do solo (at cerca de
20 cm de profundidade), pois nessa camada encontra-se um maior acmulo de
nutrientes, que resultam da deposio de materiais vegetais e animais (Madigan,
Martinko & Parker, 2004; Moreira & Siqueira, 2006). A variao qualitativa e
quantitativa das populaes microbianas encontradas nas diferentes camadas de
solo pode ser observada no Quadro 1.
Quadro 1 Distribuio de microrganismos em vrias profundidades do solo

Microrganismos por grama de solo
Profundidade
Bactrias
Aerbicas
Bactrias
Anaerbicas
Actinomicetos
Fungos
Algas*
3-8
7,8 x 106
2,0 x 106
2,1 x 106
1,2 x 105
2,5 x 104
20-25
1,8 x 106
3,8 x 105
2, 5 x 105
5,0 x 104
5 x 103
35-40
4,72 x 105
9,8 x 104
4,9 x 104
1,4 x 104
5 x 102
65-75
1,0 x 102
1 x 103
5 x 103
6 x 103
1 x 102
135-145
1,0 x 101
4 x 102
3 x 102
*Inclui as cianobactrias
Fonte: Moreira & Siqueira (2006).
Os microrganismos tm papel de destaque no processo de formao do solo.

No entanto, uma vez o solo formado, os microrganismos continuam participando
ativamente de fenmenos como decomposio de matria orgnica, produo de
hmus, ciclagem de nutrientes e de energia, decomposio de compostos
xenobiticos e no controle biolgico de pragas e doenas (Riser-Roberts, 1998;
Madigan, Martinko & Parker, 2004). Em geral, essas atividades so realizadas pela
interao das diferentes espcies microbianas em comunidades, o que torna o solo
um ecossistema rico em biodiversidade. Todavia, a biodiversidade pouco
22
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
conhecida devido a uma srie de limitaes metodolgicas, tais como, a

heterogeneidade espacial, a adeso dos microrganismos na matriz do solo ou nos
tecidos vegetais, a similaridade morfolgica dos microrganismos, as ambigidades
nas chaves taxonmicas e a dificuldade do cultivo in vitro de vrias espcies pela
impossibilidade de se reproduzir as condies nutricionais e ambientais de cada
micronicho (Hill et al., 2000; Kirk et al., 2004). Alm da importncia de conhecer as
espcies que compem a biodiversidade do solo h tambm um grande interesse no
potencial biotecnolgico dessas espcies, principalmente naquelas capazes de
degradar compostos xenobiticos.
Os estudos iniciais foram feitos baseados em mtodos fenotpicos que, devido
pequena quantidade de microrganismos cultivveis e semelhana na estrutura e
na composio celular, mostraram-se pouco representativos (Hill et al., 2000; Kirk et
al., 2004). Todavia, os avanos tecnolgicos e cientficos permitiram que atualmente
diversas metodologias possam ser aplicadas para o estudo da dinmica e da
biodiversidade dos mais variados ecossistemas, baseadas nas caractersticas dos
microrganismos, quer fenotpicas quer genotpicas (Hill et al., 2000; Kirk et al., 2004;
Leckie, 2005; Liu et al., 2006). Como exemplos, as tcnicas moleculares, que
embora apresentem algumas desvantagens para estudos da biodiversidade em
solos, ainda so mais fidedignas e representativas do que as tcnicas baseadas em
cultivos in vitro (Wolk, Mitchell & Patel, 2001; Kirk et al., 2004).
Alguns autores j conseguiram mostrar que, no solo, h uma grande e intensa
dinmica populacional microbiana estimulada por diversos fatores ambientais, como
estresse nutricional, variaes de pH, distribuio de gases, quantidade de gua e
variaes de temperatura (Degens et al., 2001; Insam, 2001; Moreira & Siqueira,
2006).
2.1.4.1. Fatores que Afetam a Microbiota do Solo

Em geral, o solo contm uma ampla diversidade de compostos orgnicos e
inorgnicos, cujas concentraes variam de acordo com o tipo e as caractersticas
do solo. Naturalmente, a matria orgnica presente no solo origina-se de resduos
de plantas, animais e microrganismos, no entanto em alguns casos de contaminao
tambm podem ser encontrados compostos xenoiticos.
23
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
No solo, a matria orgnica formada basicamente por resduos de plantas,

animais e microrganismos e, em casos de contaminao, por compostos
xenobiticos. A distribuio da matria orgnica varia, e sua degradao depende
das propriedades qumicas, fsicas e biolgicas dos micro-habitats, bem como da
disponibilidade desses compostos degradao (Moreira & Siqueira, 2006). A baixa
concentrao de nutrientes no solo pode ser um fator limitante para o metabolismo
microbiano, interferindo na sntese de energia, na diviso celular, na mobilidade e
at nas relaes simbiticas (Moreira & Siqueira, 2006).
Alm da disponibilidade de nutrientes, o pH um dos fatores essenciais para a
atividade microbiana. A maioria dos solos apresenta valor de pH na faixa entre 4,0 e
8,5. Os horizontes superficiais dos solos, em regies de clima mido, tendem a ser
mais cidos devido lixiviao dos compostos formados pela decomposio da
matria orgnica. Por outro lado, em regies de clima seco, o solo tende a
apresentar um carter alcalino (Moreira & Siqueira, 2006).
A diversidade metablica dos microrganismos permite que fungos e bactrias
apresentem pH timo desde extremamente cido at extremamente bsico. No
entanto, de forma genrica, o pH ideal para o metabolismo fngico ligeiramente
cido, em torno de 5,0, enquanto que as bactrias so mais adaptadas a valores
prximos a neutralidade, variando de 6 a 8 (Madigan, Martinko & Parker, 2004).
No solo, as variaes de pH podem afetar a fisiologia dos microrganismos
autctones por: desnaturao de protenas estruturais e enzimas, desestabilizao
da membrana e canais de troca inica, disponibilidade de ons, e aumento da
toxicidade de alguns compostos inicos, principalmente queles contendo alumnio,
ferro e mangans (Moreira & Siqueira, 2006).
Outra limitao para o metabolismo microbiano a disponibilidade de oxignio.
A disponibilidade de oxignio est diretamente relacionada com a umidade do solo
posto que os gases ocupam os espaos no ocupados pela gua, o que por sua vez
contribui para a sua solubilizao na soluo do solo. A solubilizao do oxignio
um dos pontos crticos, no caso dos solos mais midos, pois a solubilidade dos
gases em gua geralmente baixa e depende do tipo de gs, da temperatura, da
concentrao de sais e da presso local (Moreira & Siqueira, 2006).
24
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
A disponibilidade de oxignio determina o tipo de metabolismo que ir ocorrer

no solo. O metabolismo aerbico mais vantajoso, pois resulta na mineralizao da
matria orgnica e na gerao de maior quantidade de energia. No entanto,
considerando a baixa disponibilidade de oxignio no solo, o metabolismo anaerbio
poder ser o mais recorrente (Moreira & Siqueira, 2006). Neste caso, haver
predomnio dos microrganismos anaerbios e facultativos se desenvolvendo em
condio de anaerobiose, cujo metabolismo mais lento, e pode levar formao
de compostos nocivos como gs sulfdrico, nitrito, etc.
Ademais, independentemente do tipo de metabolismo, a velocidade das
reaes metablicas dependente da temperatura. O solo com cobertura vegetal
pode ser considerado um isolante trmico. Nos 5 cm superficiais, a temperatura
varia de 15 a 18C, mas com o aumento da profundidade tende reduzir de 1 a 2C a
partir dos 30 cm de profundidade, at atingir um ponto de isotermia.
Em geral, a temperatura tima para a atividade de microrganismos mesfilos se
situa na faixa entre 25 e 30C, embora ainda sejam capazes de manter o seu
metabolismo ativo em temperaturas um pouco acima ou abaixo dessa faixa de modo
mais lento (Madigan, Martinko & Parker, 2004; Moreira & Siqueira, 2006).
A diminuio da temperatura reduz a atividade microbiana, principalmente, pelo
enfraquecimento das ligaes entre as protenas, o que compromete a fluidez da
membrana celular e, por conseguinte, a entrada de nutrientes e sada dos produtos
do metabolismo. Por outro lado, o aumento da temperatura provoca a desnaturao
das protenas celulares (enzimas) inviabilizando as reaes metablicas (Madigan,
Martinko & Parker, 2004; Moreira & Siqueira, 2006).
2.2. Petrleo e Derivados

O petrleo um combustvel fssil composto predominantemente por uma
mistura complexa de hidrocarbonetos distinguindo-se em: parafnicos normais,
parafnicos ramificados, parafinicos cclicos (naftnicos), aromticos, e resinas e
asfaltenos (Corra, 2003; Thomas, 2004).
No estado lquido, o petrleo uma substncia oleosa, inflamvel, menos
densa que a gua, com cheiro caracterstico e cor variando entre o negro e o
25
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
castanho-claro. Apesar de sua composio qumica variar em funo do

reservatrio, os diferentes tipos de petrleo apresentam semelhanas na anlise
elementar, sendo constitudos (%m/m) de: carbono (83-87); hidrognio (11-14);
enxofre (0,06-8); nitrognio (0,11-1,7); oxignio (0,1-2); e metais (at 0,3).
Como mostrado no Quadro 2, os derivados de petrleo so obtidos atravs de
destilao do petrleo em fraes de diferentes pontos de ebulio.
Quadro 2 Fraes tpicas do petrleo

Temperatura de
Ebulio (oC)
Composio
aproximadamente
Aplicaes
At 40
C1 C2
C3 C4
gs combustvel engarrafado, uso

domstico e industrial.
Gasolina
40 175
C5 C10
combustvel de automveis,
solvente.
Querosene
175 235
C11 C12
iluminao, combustvel de
avies a jato.
Gasleo leve
235 305
C13 C17
diesel, fornos.
Gasleo pesado
305 400
C18 C25
combustvel, matria-prima para

lubrificantes
Lubrificantes
400 510
C26 C38
leos lubrificantes.
Acima de 510
C38+
asfalto, piche,
impermeabilizantes.
Frao
Gs residual
Gs Liquefeito de
Petrleo GLP
Resduo
Fonte: Thomas, 2004
Aps a destilao, as fraes so submetidas a alguns processos qumicos de

sntese, como a alquilao e a reforma cataltica, e de craqueamento, conforme
apresentado na Figura 4. Os processos qumicos tm por objetivo modificar as
fraes sem interesse econmico para gerar produtos de alto valor agregado como
combustveis veiculares, na forma de querosene de aviao, gasolina, leo diesel, e
combustveis industriais, como propano e butano, e ainda na fabricao de
borrachas, lubrificantes e asfalto (Thomas, 2004).
Dentre os combustveis derivados do petrleo, a gasolina a mais importante
dentro dos centros urbanos, uma vez que grande parte dos veculos que circulam
nas cidades movido gasolina.
26
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Fonte: Adaptao de http://www.galpenergia.com
Figura 4 Processo de refino do petrleo e as reaes de transformao dos produtos da

destilao.
27
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
2.2.1. Gasolina
A gasolina, um dos principais derivados do petrleo utilizados no cotidiano dos
habitantes das cidades, basicamente composta por hidrocarbonetos que possuem
uma
cadeia
carbnica
relativamente
pequena,
quando
comparada
aos
hidrocarbonetos constituintes do leo bruto e do leo diesel.

Os hidrocarbonetos da gasolina diferem entre si quanto ao tamanho (com 4 a
12 tomos de carbono) e estrutura das cadeias, que se distinguem em: abertas,
cclicas e aromticas. As variaes de tamanho e estrutura da cadeia definem as
propriedades fsico-qumicas e, portanto, a qualidade do combustvel. No Quadro 3
esto discriminados alguns dos diferentes hidrocarbonetos constituintes da gasolina.
As duas caractersticas de maior interesse no uso da gasolina como
combustvel so o ponto de ebulio e o ndice de auto-detonao (ou octanagem)
dos hidrocarbonetos nela presentes. O primeiro pode variar desde temperaturas
ambientes, em torno de 30C, at temperaturas elevadas, acima dos 200C.
Enquanto que o segundo varia de 40 a 101, estando, em geral, prximo a 85. Como
o ndice de auto-detonao relativamente baixo, pode-se elev-lo pela introduo
de substncias com maior poder de detonao, denominadas aditivos (Cruz, 2003).
No Brasil, desde a dcada de 1970, a gasolina aditivada com etanol anidro
em substituio ao chumbo tetraetila, com o intuito de reduzir a emisso de
poluentes e aumentar a qualidade do combustvel (Corseuil & Fernandes, 1999;
Niven, 2005). Atualmente, toda a gasolina comercializada em territrio nacional
recebe a adio de 25% de etanol anidro, por determinao da legislao (CIMA,
n37; Lei 10.203/2001).
A gasolina um combustvel relativamente estvel capaz de preservar as suas
caractersticas por at seis meses se estocada em condies apropriadas. A
deteriorao do combustvel ocorre quando h a precipitao de compostos
formados pela reao entre os hidrocarbonetos insaturados e ons de cobre, que
constituem os reservatrios de combustvel (Hamilton, 1995).
28
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Quadro 3 Componentes da gasolina identificados por Solid

Phase Microextraction (SPME)
Nome Qumico
Propano
2,2-dimetilhexano
Isobutano
Tolueno
n-Butano
2,3,4-trimetilpentano
trans-2-buteno
3-metilheptano
cis-2-buteno
2-metilheptano
3-metil-1-buteno
n-octano
Isopentano
2,4,4-trimetilhexano
1-penteno
2,2-dimetilheptano
2-metil-1-buteno
Etilbenzeno
2-metil-1,3-butadieno
p-xileno
n-pentano
m-xileno
Trans-2-penteno
3,3,4- trimetilhexano
2-metil-2-buteno
o-xileno
2-metil-1,2-butadieno
2,2,4-trimetilheptano
3,3-dimetilbutano
n-nonano
Ciclopentano
3-metil-1-penteno
n-propilmenzeno
2,3-dimetilbutano
2-metilpentano
1,3,5-trimetilbenzeno
3-metilpentano
1,2,4-trimetilbenzeno
n-hexano
n-decano
Metilciclopentano
Metilpropilbenzeno
2,2-dimetilpentano
Dimetilbenzeno
Benzeno
n-undecano
Ciclohexano
1,2,4,5-tetrametilbenzeno
2,3-dimetilpentano
1,2,3,4-tetrametilbenzeno
3-metilhexano
1,2,4-trimetil-5-etilbenzeno
3-etilpentano
1,2,3,4-trimetiletilbenzeno
n-heptano
n-dodecano
2,2,4-trimetilpentano
Naftaleno
Metilciclohexano
Metilnaftaleno
Fonte: Harris, Whiticar & Eek, 1999.
29
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Alguns dos hidrocarbonetos constituintes da gasolina apresentam baixos

pontos de ebulio, podendo passar para a fase gasosa temperatura ambiente.
Alm da perda de parte do combustvel, a volatilizao gera poluio atmosfrica.
Os hidrocarbonetos volteis mais importantes so conhecidos pela sigla BTEX, que
o acrnimo de benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (Corseuil & Fernandes,
1999; Niven, 2005).
Os compostos BTEX so nocivos sade humana pelo seu potencial
mutagnico e carcinognico. Esses compostos penetram pela mucosa nasal,
atingindo o sistema nervoso central (SNC) e a medula ssea vermelha. A curto
prazo, a exposio a altas concentraes causa enjos, alucinaes e perda de
conscincia, e a longo prazo pode provocar leucemia e leses irreparveis ao SNC,
fgado e rins (Corseuil & Fernandes, 1999; Niven, 2005; Durmusoglu, Taspinar &
Karademir, 2010).
A transferncia dos BTEX para a fase gasosa pode ser potencializada pela
presena de alcois. Nesse caso, a gasolina brasileira pelo seu contedo de etanol
aumenta as chances de volatilizao desses compostos e, conseqentemente,
aumenta os danos sade humana (Corseuil & Fernandes, 1999; Niven, 2005).
2.2.2. Mistura Gasolina/lcool

Desde o incio do emprego de gasolina como combustvel automotor houve
adio de compostos com o propsito de elevar a sua octanagem. Inicialmente,
utilizavam-se compostos altamente agressivos ao meio ambiente como o chumbo
tetra-etila. Com os avanos tecnolgicos e a ampliao da conscincia ambiental,
foram desenvolvidas novas formas para aumento da octanagem.
Atualmente, em vrios pases e no Brasil, o chumbo tetra-etila no mais
aplicado. Em substituio adiciona-se o etanol, que individualmente apresenta um
ndice de octanagem de 110. A adio de etanol gasolina permite a
comercializao do combustvel com ndices de octanagem entre 87 e 95 (Santos &
Peixoto, 2008).
O uso da mistura etanol e gasolina ao invs da gasolina pura tambm contribui
para a reduo na emisso de poluentes. Isto porque alm da queima de menor
30
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
quantidade do combustvel fssil que gera vrios compostos, muitos dos quais
poluentes como o monxido de carbono (CO) e xidos de enxofre (SOx) e nitrognio
(NOx), a combusto do etanol completa com formao de CO2 e gua.
Em decorrncia dos grandes impactos ambientais pelo uso de combustveis
fsseis, somados a impossibilidade da sua renovao, vrias pesquisas esto sendo
desenvolvidas para a otimizao de processos de obteno de biocombustveis. O
etanol combustvel uma alternativa tcnica e economicamente vivel em uso
desde a dcada de 1970 (Corseuil & Fernandes, 1999; Niven, 2005; Santos &
Peixoto, 2008).
Comercialmente, o etanol usado como combustvel e como aditivo da gasolina
produzido pela fermentao alcolica do caldo da cana-de-acar. Em geral, a
fermentao do caldo da cana realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae.
O mosto fermentado destilado e comercializado na forma hidratada (92,6%, v/v)
quando usado como combustvel, ou na sua forma anidra (99,3% v/v) quando usado
como aditivo da gasolina.
Cabe enfatizar que apesar das vantagens citadas para a adio de etanol
gasolina, isto pode trazer conseqncias srias ao meio ambiente. O etanol, alm de
aumentar a capacidade de volatilizao dos BTEX, pode aumentar a solubilidade
dos hidrocarbonetos da gasolina em gua. Logo, em caso de derrames, ir ocorrer
maior difuso do contaminante na rea impactada, com grande risco de atingir as
guas subterrneas (Corseuil & Fernandes, 1999; Niven, 2005).
2.3. Contaminao dos Solos

comum a aplicao de conceitos errneos no que concerne a contaminao
dos solos. H uma tendncia a aplicar os conceitos de poluio e contaminao
como sinnimos. Contudo, segundo Nass (2002) a poluio um termo abrangente,
que consiste em qualquer alterao causada por atividades antrpicas que
provoquem danos ao meio ambiente. Por outro lado, a contaminao mais
restritiva e se refere exclusivamente introduo de compostos nocivos sade
humana e ao ambiente (Nass, 2002). Portanto, acidentes ambientais envolvendo
petrleo e seus derivados, so considerados como contaminantes.
31
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Segundo o relatrio da Companhia Ambiental do Estado de So Paulo

(CETESB, 2006), os postos de combustveis so as principais fontes de
contaminao dos solos, como mostra a Figura 5.
Indstria
15%
Comrcial
6%
Resduo
4%
Acidentes
1%
Postode
combustvel
74%
Desconhecida
0%
Fonte: CETESB (2006).
Figura 5 Principais Fontes de Contaminao do Estado de So Paulo.
Os acidentes relacionados aos postos de combustveis tm inmeras causas,

conforme ilustra a Figura 6. Nesses acidentes, o combustvel mais recorrente foi a
gasolina, como pode ser observado na Figura 7 (CETESB, 2005). E, esses dados,
possivelmente, so decorrentes da maior frota de veculos movidos a gasolina e do
maior potencial corrosivo desse combustvel em relao aos demais.
A maioria desses acidentes ocorreu pela deteriorao dos tanques de
armazenamento de combustveis, pois a validade desses reservatrios de no
mximo 30 anos e grande parte dos postos de combustveis foi construdos na
dcada de 1970. E, a fim de evitar esses danos ambientais a legislao se tornou
mais restritiva em relao construo dos reservatrios de combustveis.
Atualmente a construo e a instalao dos reservatrios de combustveis
devem seguir as orientaes da resoluo CONAMA no 273, que prev, inclusive,
que o postos de revenda de combustveis obrigatoriamente sejam licenciados e
fiscalizados periodicamente pelas agncias reguladoras. Alm de determinar que os
reservatrios possuam diversos mecanismos para evitar vazamentos, como parede
32
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
dupla (NBR 13785) com a parte externa no metlica, vlvulas de controle e cmara
de conteno
.
Tubulaesdo
No
Tanque
Identificada
4%
1%
Postos
Desativados
3%
Passivo
Ambiental
18%
Outros
5%
Descarte
6%
Extravazamento
8%
Caixa
Separadora
1%
Tubulao
17%
Bomba
4%
Tanque
33%
Figura 6 Causas da poluio por postos de combustveis na cidade de So Paulo.
Resduo
2%
leo
Lubrificante
1%
No
Identificado
2%
GNV
2%
Diesel
19%
lcool
2%
Gasolina
72%
Figura 7 Principais Combustveis Contaminantes do Solo no Estado de So Paulo.

33
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
No entanto, mesmo com o aumento das medidas para evitar os acidentes, a

sua ocorrncia em alguns casos inevitvel, sendo necessria a realizao de
aes corretivas que possam, inicialmente, impedir a propagao do dano, e
posteriormente restabelecer o equilbrio da rea afetada, bem como as suas
condies naturais (Dias & Mello, 1998).
2.4. Tratamento de Solos Contaminados com Hidrocarbonetos

O tratamento das reas contaminadas envolve a identificao da fonte de
contaminao e da extenso da rea atingida, o conhecimento das caractersticas
da rea e dos contaminantes envolvidos, e informaes quanto legislao
aplicvel (Riser-Roberts, 1998; Khan, Husain & Ramzi, 2004).
As diversas tcnicas para o tratamento de reas impactadas com compostos
xenobiticos se dividem em processos fsico-qumicos e processos biolgicos. Em
alguns casos, inclusive, pode ser feita a combinao de duas ou mais tcnicas a fim
de se obter o melhor resultado possvel.
Independente do processo em que o tratamento conduzido, a remediao
pode ocorrer no local onde o processo ser conduzido (in situ), ou pode ser feita a
remoo do material contaminado para uma rea externa onde o tratamento ser
efetuado (ex situ). Sendo que na maioria dos casos de tratamento ex situ o material
removido devolvido ao local de origem (Riser-Roberts, 1998; Khan, Husain &
Ramzi, 2004).
A principal vantagem do tratamento in situ que o material contaminado no
precisa ser transportado, o que reduz os custos. Porm, tem como desvantagens a
necessidade de adequao das condies do local contaminado e o elevado tempo
necessrio para que ocorra a descontaminao. Por outro lado, as tecnologias ex
situ so realizadas em menor prazo uma vez que permitem estabelecer as
condies ideais para a atividade microbiana. Entretanto, faz-se necessria a prvia
remoo do material contaminante, implicando na escavao do local contaminado e
o transporte de todo o material coletado at a rea de tratamento (Baptista, 2003).
Existem diversas tcnicas fsico-qumicas para a remediao das reas
contaminadas, mas no que concerne s reas contaminadas com gasolina
34
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
destacam-se o tratamento trmico que consiste no aquecimento do solo

transferindo o contaminante para a fase gasosa, a extrao de vapores por um
sistema de suco vcuo instalado em poos no local contaminado e o air
stripping que se baseia na injeo de ar na rea contaminada, favorecendo a
transferncia dos compostos volteis para a fase gasosa que em seguida so
coletados por um sistema de coleta de gases. (Riser-Roberts, 1998; Iwamoto &
Nasu, 2001; Baird, 2002; Khan, Husain & Ramzi, 2004).
Essas
trs
tcnicas
so
potencialmente
eficientes
na
remoo
dos
contaminantes volteis, contudo se no forem instalados equipamentos de captao

dos compostos volteis gerados pode haver a promoo da poluio atmosfrica
pela transferncia do contaminante para a atmosfera.
Uma estratgia interessante para o tratamento de reas contaminadas com
eficincia equivalente aos mtodos fsico-qumicos, em geral, de menor custo e
maior aceitabilidade pelos rgos ambientais e pela sociedade so os processos
biolgicos. Esses se baseiam no uso de seres vivos para a remoo do
contaminante. No caso do organismo aplicado para a remoo do contaminante ser
uma planta, o processo denominado fitorremediao, j quando so utilizados
microrganismos o processo recebe o nome de biorremediao (Riser-Roberts, 1998;
Iwamoto & Nasu, 2001; Khan, Husain & Ramzi, 2004).
2.4.1. Biorremediao
O conceito de biorremediao pode sofrer pequenas alteraes de acordo com
o autor, no entanto de uma forma geral um processo que se baseia em reaes
qumicas realizadas por microrganismos, em condies aerbias e/ou anaerbias,
sobre compostos estranhos ao ambiente natural. Essa ao microbiana capaz de
modificar ou decompor o composto original em formas mais simples, atxicas ou
menos txicas, sendo a mineralizao do contaminante o benefcio mximo
alcanado nesse processo (Riser-Roberts, 1998; DelArco, 1999; Semple, Reid &
Fermor, 2001)
Esse processo pode ocorrer naturalmente pela ao dos microrganismos
autctones, processo denominado atenuao natural. No entanto, em geral, os solos
apresentam limitaes nutricionais que submetem os microrganismos a condies
35
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
estarvantes, o que reduz a eficcia da biorremediao por atenuao natural.

Nesses casos o solo pode receber a introduo de nutrientes, como fontes de
nitrognio e fsforo que ao estimular o metabolismo microbiano, contribuiro para o
aumento das chances de sucesso do tratamento, e principalmente oxignio para
favorecer
atividade
dos
microrganismos
aerbicos.
estimulao
dos
microrganismos pela introduo de fontes nutricionais denominada bioestimulao

(Serrano et al., 2007; Stucki et al., 2007).
Contudo, em algumas situaes a melhora nas condies nutricionais do solo
no suficiente para atingir os resultados esperados. Por exemplo, quando
inexistem microrganismos hbeis em atuar na modificao e decomposio dos
compostos xenobiticos ou seu nmero muito baixo. Ento, torna-se necessrio
realizar a introduo de microrganismos endgenos, processo conhecido como
bioaumento (Bento et al., 2005; Olaniram, Pillay & Pillay, 2006; Serrano et al., 2007;
Stucki et al., 2007).
Existem diversas tecnologias de biorremediao, sendo o bioslurry, biosparging
e o bioslurping as mais adequadas no tratamento em casos de contaminao com
gasolina. Essas trs metodologias se baseiam na introduo de nutrientes para a
estimulao do metabolismo microbiano, variando em relao a forma de conduo
do processo e os nutrientes aplicados.
O bioslurry uma tecnologia ex situ que utiliza um reator contendo o material a
ser tratado misturado a uma grande quantidade de gua acrescida de nutrientes,
formando uma espcie de pasta, e no caso do tratamento de volteis h tambm um
sistema de introduo e captao de gases acoplado ao reator (Banerji et al., 1995).
Por outro lado o biosparging uma tecnologia in situ que consiste na unio de
duas metodologias, o bioventing (introduo de oxignio para a estimulao do
metabolismo aerbio) e o air sparging (introduo de ar no solo para a remoo dos
compostos volteis), dessa forma essa metodologia permite, atravs da injeo de
fontes de nutrientes e oxignio no solo, a remoo dos contaminantes volteis e no
volteis (EPA, 1994).
Assim como o biosparging, o bioslurping tambm uma tecnologia in situ
baseada na associao do bioventing com metodologias de extrao dos vapores,
36
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
que pode ser aplicada na remoo do contaminante de guas subterrneas e dos

compostos volteis do solo.
As
tcnicas
acima
apresentadas
viabilizam
recuperao
da
rea
contaminada, entretanto, sempre que h o envolvimento de microrganismos

necessrio o monitoramento e a avaliao de uma srie de fatores limitantes que
interferem no metabolismo microbiano e, por conseguinte, na eficincia e eficcia do
processo (Riser-Roberts, 1998; Iwamoto & Nasu, 2001; Khan, Husain & Ramzi,
2004). Em geral, a avaliao do processo de biorremediao feita pelo
monitoramento da concentrao do contaminante e/ou pela estimativa dos
microrganismos
envolvidos
na
biodegradao.
monitoramento
dos
microrganismos pode ser feito diretamente por tcnicas de contagem microbiana, ou

de forma indireta atravs de tcnicas baseadas na atividade metablica.
A quantificao do nmero de microrganismos no solo, geralmente, feita por
diluies seriadas semeadas em meios de cultura especficos, onde podem ser
feitas a contagem de unidades formadoras de colnias (UFC), ou a estimao do
nmero mais provvel de clulas (NMP) presentes em conhecida quantidade de
amostra (Balba, Al-Awadhi & Al-Daher, 1998).
2.4.1.1. Fatores que Afetam a Biorremediao

O nmero de microrganismos e a diversidade de espcies so fatores
primordiais para a eficcia do tratamento por biorremediao da rea impactada.
Sabe-se que quanto maior for a versatilidade enzimtica e o nmero de clulas
metabolicamente ativas, maior ser a eficincia da degradao do contaminante.
A diversidade microbiana do solo ainda pouco conhecida, no entanto alguns
gneros bacterianos apresentam destaque no que concerne biorremediao de
compostos xenobiticos, principalmente queles derivados de combustveis fsseis.
As espcies dos gneros Nocardia, Pseudomonas, Micrococcus e Bacillus j
so amplamente difundidas pela capacidade de degradar hidrocarbonetos presentes
em combustveis derivados do petrleo (Solano-Serena et al., 2000; Ghazali et al.,
2004; Silva & Alvarez, 2004; Dou et al., 2007). Mas, embora as bactrias tenham
papel de destaque, os demais grupos microbianos (fungos, actinobactrias e
37
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
cianobactrias) tambm j foram descritos pelo seu potencial para a biodegradao

de derivados do petrleo (Reddy, 1995; Alvarez, 2003; Gallego et al., 2006;
Mancera-Lopez et al., 2007).
Em geral, a composio qumica dos contaminantes heterognea e altamente
complexa. Dessa forma improvvel a existncia de um nico microrganismo, que
naturalmente, seja capaz de decompor todas as substncias qumicas presentes.
Por isso, em processos de biorremediao comum o emprego de consrcios
microbianos para obter um melhor resultado final (Ghazali et al., 2004).
Os microrganismos com a capacidade de utilizar petrleo e seus derivados
como fontes de carbono e energia so chamados de hidrocarbonoclsticos. Essa
populao microbiana possui em seu material gentico, os genes especficos para a
produo das enzimas que atuam no processo de biodegradao.
possvel encontrar essas espcies em ambientes sem histrico de
contaminao. Nesse caso, a sua deteco pode ser dificultada pela predominncia
de outras populaes mais adaptadas ao ambiente natural. Contudo, em casos de
contaminao pode haver a seleo e aumento das populaes tolerantes e com
potencial para a degradao ao contaminante (Hamme, Sigh & Ward, 2003; Ollivier
& Magot, 2005).
Entretanto, importante ressaltar que o aumento da populao com potencial
degradador s ocorre se o solo apresentar condies favorveis para isso (Semple,
Reid & Fermor, 2001). A biorremediao de solos pode ser afetada por diferentes
fatores como a concentrao de oxignio dissolvido, pH, temperatura, presena de
metablitos txicos, potencial de oxi-reduo, disponibilidade de nutrientes e
umidade (Rodriguez, 2006). Por exemplo, em alguns casos, o solo pode conter um
grande teor de matria orgnica que se encontra humificada e, portanto, no
disponvel para o consumo imediato. Essa caracterstica permite que as fontes de
carbono sejam lanadas paulatinamente no solo funcionando como um mecanismo
de controle da dinmica populacional (Moreira & Siqueira, 2006).
No ambiente natural, resduos de plantas e animais mortos so fontes de
carbono disponveis para a pronta assimilao pelos microrganismos autctones.
Em contrapartida, em situaes de contaminao o xenobitico pode interagir com a
matriz do solo e tornar-se indisponvel para a biodegradao (Alexander, 1999).
38
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Alm da fonte de carbono, outros elementos nutricionais so limitantes para o

desenvolvimento dos microrganismos, em especial fontes de nitrognio e fsforo,
cujas concentraes devem ser convenientemente ajustadas. Esses elementos so
fundamentais para as funes vitais dos microrganismos como na sntese de
material gentico (RNA e DNA) e protenas, e para a gerao de energia (ATP)
(Rogers et al., 1993).
A presena de oxignio, que atua como doador de eltrons, estimula o
metabolismo aerbico, permitindo a gerao de maior quantidade de energia para as
clulas. No entanto, na sua ausncia outros compostos podem substitu-lo como, por
exemplo, NO-3, SO4-2, Mn+4 e Fe+3, estabelecendo uma condio de anaerobiose
(Madigan, Martinko & Parker, 2004).
A presena de gua e sua disponibilidade, assim como os nutrientes tambm
so fundamentais, j que esto diretamente relacionadas homeostase e ao
transporte de nutrientes atravs da membrana celular. Com exceo dos perodos
de chuva ou irrigao, os solos contm quantidades de gua insuficientes para
suportar o pleno funcionamento do metabolismo microbiano, pois normalmente a
gua drenada at atingir o lenol fretico (Moreira & Siqueira, 2006).
Nos solos, a temperatura na camada superior, onde se concentra o maior
nmero de microrganismos, praticamente no varia, estando prxima da
temperatura ambiente do local. Por isso, os microrganismos so predominantemente
mesfilos (Madigan, Martinko & Parker, 2004).
A concentrao do on hidrognio no solo outro parmetro de relevncia que
deve ser considerado. Em geral, em solos cidos predominam fungos, enquanto que
em solos neutros predominam bactrias. O pH tambm afeta o potencial de oxireduo (Eh), que pode ainda ser influenciado pela temperatura, presso e
compostos presentes. A coexistncia de microrganismos aerbios, facultativos e
anaerbios na mesma amostra de solo indica que podem haver micronichos
prximos com diferentes valores de Eh (DEsposito, 1999).
39
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
2.4.1.2 Avaliao da toxicidade do solo

Independente da tcnica de remediao aplicada necessrio que antes de se
determinar a concluso do tratamento seja feita uma avaliao adequada da
toxicidade dos compostos residuais, pois ao longo da degradao pode haver a
formao de compostos to ou mais nocivos que o composto original, o que ir
provocar efeitos ainda mais danosos ao ambiente (Balba et al., 1998; Riser-Roberts,
1998; Phillips et al., 2000; Niven, 2005).
Bioensaios de ecotoxicidade so metodologias analticas que permitem
caracterizar a toxicidade de efluentes e substncias qumicas em geral sobre o meio
ambiente a partir da exposio de organismos vivos (bioindicadores) a estas
substncias e da observao e quantificao dos efeitos txicos das mesmas sobre
aqueles organismos. Em funo da elevada sensibilidade dos bioindicadores a
efeitos txicos em seu ambiente, estas valiosas ferramentas de anlise ambiental,
apenas recentemente introduzidas no Brasil, j vm sendo utilizadas extensivamente
e com timos resultados em pases desenvolvidos.
No caso de solos, os testes para essa avaliao podem ser baseados no uso
de seres vivos como sementes de vegetais, organismos invertebrados ou algas, ou
ainda kits comerciais baseados na bioluminescncia e na mutao de culturas
microbianas padro (Amadi, Dickson & Maate, 1993; Xu & Johnson, 1995;
Chaineau, Morel & Outdot, 1997; Balba et al., 1998; Ratte, Hammers-Wirtz &
Cleuvers, 2003; Ogboghodo et al., 2004; Labud, Garcia & Hernandez, 2007; Silva et
al., 2009).
A atividade enzimtica pode ser utilizada para descrever os efeitos de
compostos txicos sobre a populao microbiolgica do solo. No caso da
biorremediao, comum o teste da atividade desidrogensica, uma vez que a
maioria das reaes de oxidao biolgica de compostos orgnicos um processo
de desidrogenao (Ratsep, 1991). O composto qumico mais usado nessa anlise
o cloreto-2,3,5-trifeniltetrazlico (TTC) que age como aceptor final de eltrons de
enzimas desidrogensicas, sendo reduzido a trifenilformazan (TPF) de cor vermelha,
cuja intensidade diretamente proporcional atividade microbiana, e pode ser
determinada por espectrofotometria (Bitton & Koopman, 1992; Gong et al., 1997).
40
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
As minhocas tambm tm sido empregadas como bioindicadores. As espcies

recomendadas pelo padro OECD (1984) e ASTM (1995) so Eisenia fetida e
Eisenia andrei,
facilmente cultivveis em laboratrio. Os efeitos usados para
diagnstico podem ser o crescimento, comportamento, reproduo e processos

fisiolgicos, bem como, observaes de mudanas patolgicas externas como leso
ou dureza. H tambm o teste de fuga de minhocas que, em muitos casos, pode ser
um indicador mais sensvel para avaliar compostos txicos no solo, para nvel de
estresse baixo dos organismos (Kapanen & Itavaara, 2001).
A fitotoxicidade pode ser determinada pela germinao das sementes,
alongamento das raizes e crescimento de mudas. Muitos estudos tm demonstrado
e eficincia de espcies como pepino e agrio (Helfrich et al., 1998), alface e soja
(Gundersson et al., 1997) em testes de toxicidade.
Knoke et al. (1999) avaliaram a toxicidade de solo contaminado com
hidrocarbonetos do petrleo aps a utilizao de tcnicas de biorremediao como
bioestmulo e bioaumento. Foram avaliados ensaios com adio de nutrientes como
fsforo e/ou bioumento com Pseudomonas sp UG30, com capacidade de degradar
compostos xenobiticos. Aps os ensaios de biodegradao, observaram que os
testes feitos com minhoca e com a germinao de alface, a adio de fsforo ao
solo aumentou a toxicidade enquanto que os testes com o bioaumento houve
reduo da toxicidade, sugerindo que dependendo da tcnica de biorremediao
utilizada a toxicidade pode aumentar ou diminuir.
2.5. Ferramentas Estatsticas

No mbito da pesquisa cientfica busca-se continuamente a melhor forma de
obter o mximo de informaes com o mnimo de experimentos, o que reduz os
custos dos estudos. E, uma das formas de se organizar experimentos nesse
contexto a aplicao de ferramentas estatsticas, como o planejamento fatorial
(Barros-Neto, Scarminio & Burns, 2007).
O planejamento fatorial pode ser aplicado quando h diversos fatores que
interagem entre si e podem interferir na realizao de um processo, esses fatores na
linguagem estatstica so conhecidos como variveis independentes. E, os valores
atribudos a esses fatores so denominados nveis.
41
Ferreira, D.G.
Reviso Bibliogrfica
Essa ferramenta estatstica permite a combinao das diversas variveis

independentes, inclusive em diferentes nveis. Tal fato permite analisar os resultados
integrados e os fatores que influenciam o processo. Em termos prticos, um
planejamento fatorial deve ser feito em 2 ou 3 nveis, pois o uso de mais nveis
aumentaria o nmero de experimentos, inviabilizando a sua aplicao (Calado &
Montgomery, 2003).
Uma vez organizados e realizados os experimentos, a interpretao estatstica
dos dados obtidos pode ser executada atravs de vrios critrios estatsticos de
significncia, como por exemplo, o Teste p, o Teste t e o modelo matemtico
proposto, atravs do coeficiente de correlao (Rodrigues & Iemma, 2005).
O Teste p fundamenta-se na probabilidade de se descartar os efeitos principais
e de interao da varivel em estudo, em um nvel de confiana pr-determinado. o
valor do nvel de confiana normalmente encontrado em trabalhos de 95%, no
entanto a sua determinao varia de acordo com a acurcia desejada.
No caso do Teste t de Student a sua anlise feita atravs dos efeitos
calculados (sejam eles positivos ou negativos), considerados significativos e
diferentes de zero, em um determinado nvel de confiana.
O coeficiente de correlao mede a aproximao entre os pontos experimentais
e uma curva qualquer. Quando este valor se aproxima de 1, tem-se um bom ajuste
dos pontos curva, indicando que o modelo proposto pode ser usado para a
previso de resultados dentro da faixa estudada.
Embora o planejamento experimental seja til, difcil identificar a influncia de
uma ou mais variveis sobre outra varivel de interesse. O sistema, inicialmente,
considerado com uma funo desconhecida que atua sobre as variveis de entrada
(os fatores) e produz como sada, as respostas observadas. Sendo assim, o intuito
principal do planejamento fatorial identificar a funo que represente de modo mais
fidedigno o processo (Rodrigues & Iemma, 2005; Barros-Neto, Scarminio & Burns,
2007).
42
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3. MATERIAL E MTODOS
3.1. Solo
Nesse trabalho foi utilizado um solo, coletado no municpio de Belford Roxo-RJ
no ms de dezembro de 2006, de uma rea urbana sem histrico de contaminao.
Esse solo caracterstico do estado do Rio de Janeiro e por isso foi estudado no
tratamento de biorremediao de solos contaminados com petrleo ou seus
derivados.
Logo aps a coleta, o solo foi peneirado grosseiramente para a retirada de
material como plantas, razes, pedras e gravetos. Em seguida, o solo foi quarteado,
com o intuito de homogeneizar o solo a ser utilizado nos ensaios de biorremediao,
de modo que as amostras de solo aplicadas nos diferentes ensaios possussem
caractersticas similares em relao a sua composio granulomtrica, fsicoqumica e microbiolgica.
Todos os ensaios de biorremediao foram realizados com solo de um mesmo
lote, isto , de mesma procedncia e data. Para tanto, aps o quarteamento o solo
foi acondicionado em sacos plsticos de 10 kg cada, os quais foram armazenados
sob refrigerao a 51C, at o momento do uso.
Figura 8 Local de coleta do solo argiloso

43
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.2. Combustveis
Foram usados dois combustveis comerciais, gasolina automotiva e etanol
anidro, misturados em diferentes propores (100:0; 100:12,5; 100:25). Ambas as
amostras foram provenientes da Petrobras de modo a garantir a sua pureza, ou seja,
a ausncia de qualquer aditivo ou adulterao que pudesse interferir nos resultados
obtidos nesse estudo.
A gasolina e o etanol so combustveis estveis e no sofrem degradao
quando armazenados sobre refrigerao e em recipientes no metlicos. Portanto,
os combustveis utilizados nos ensaios de biorremediao foram coletadas do
mesmo local e data, e ao chegar no laboratrio foram armazenados em bombonas
de polietileno a 51C, at o momento do uso.
3.3. Fertilizante
Em algumas condies ensaiadas foi feita a adio de fontes de nutrientes,
atravs da aplicao do fertilizante comercial da marca ULTRAVERDE, com relao
Nitrognio:Fsforo:Potssio de 4:14:8. O ajuste da condio nutricional do solo foi
baseada no teor de fsforo presente no solo, podendo ser de 25 ou 50 ppm de
acordo com o ensaio.
3.4. Ajuste do pH do Solo

De um modo geral os solos argilosos possuem um carter cido, ento a fim de
favorecer o metabolismo bacteriano, elevando o pH a um valor prximo
neutralidade, foi realizada a calagem do solo com Carbonato de Clcio (CaCO3).
Para tanto foi adicionado 15 g de CaCO3 em cada quilo de solo utilizado antes da
realizao dos ensaios.
44
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.5. Preparo do Inculo

A fim de reduzir o tempo dos ensaios de biorremediao, a populao
microbiana autctone do solo foi aumentada atravs da introduo das culturas
endgenas previamente adaptadas ao contaminante (gasolina). Com esse propsito,
foi produzido um inculo em fase slida conforme metodologia desenvolvida por
Baptista (2007).
O preparo do inculo em fase slida foi conduzido em recipiente plstico
retangular (40 cm x 80 cm x 20 cm), onde foi distribudo aproximadamente 15 kg do
solo. Em seguida, esse solo recebeu ajuste da umidade (para aproximadamente
25%) e da condio nutricional para 50 ppm de fsforo. Esses ajustes foram feitos
pela solubilizao de 3,2 g de fertilizante por quilo de solo em gua e ento
aplicados paulatinamente no solo, ajustando a condio nutricional e de umidade
concomitantemente.
Aps uma semana o solo foi contaminado artificialmente uma nica vez com
5% (v/m) de gasolina automotiva sem adio de etanol. Aps a contaminao o
inculo foi incubado em local arejado com temperatura mdia de 30C por 21 dias,
atingindo nesse perodo uma quantidade de bactrias metabolicamente ativas e
adaptadas ao contaminante. Nesse nterim a umidade foi ajustada pela disperso de
gua destilada na superfcie do solo.
O
monitoramento
das
populaes
cultivveis
de
interesse
(bactrias
heterotrficas totais e bactrias hidrocarbonoclsticas) foi feito atravs da

quantificao semanal de cultivos das amostras retiradas do sistema em meios
especficos (Item 3.7.1.).
Finalizadas
as
etapas
de
ativao
do
metabolismo
das
bactrias
hidrocarbonoclsticas (BHC) e sua adaptao aos hidrocarbonetos da gasolina,

amostras desse solo foram incorporadas aos ensaios de biorremediao na
proporo de 10%(m/m).
45
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.6. Detalhamento dos Ensaios de Biorremediao

Esse trabalho foi realizado em etapas seqenciais, na primeira foi feita a
caracterizao granulomtrica, fsico-qumica e microbiolgica do solo. Na segunda
foram realizados ensaios em microcosmos baseados em um planejamento fatorial
para definir a significncia da condio nutricional, da umidade e da concentrao de
etanol adicionada na gasolina no processo de biorremediao. E, na terceira foram
conduzidas algumas condies propostas pelo planejamento fatorial em colunas de
60 cm a fim de reproduzir condies mais prximas da realidade e estudar a
biorremediao e a percolao vertical da gasolina adicionada com 25% de etanol.
3.6.1. Caracterizao do solo

A caracterizao do solo foi feita baseada na sua granulometria, condio
nutricional, fsico-qumica e microbiolgica. No Quadro 4 podem ser observadas as
metodologias utilizadas nessa caracterizao.
Quadro 4 Parmetros analisados para caracterizao do solo

Parmetro
Metodologia
Granulometria
ABNT-NBR 7181/84
Matria orgnica (mg/Kg), Nitrognio

e Fsforo
Cobre, Ferro, Mangans, Zinco,
Alumnio, Clcio, Magnsio, Potssio
pH
Jaramillo, 1996
Raij et al., 2001

Baptista, 2007
Espectrmetro de
Umidade
infravermelho
Bactrias Heterotrficas Totais
Pour plate
Cultivveis
Bactrias Hidrocarbonoclsticas
Cultivveis
Nmero Mais Provvel
46
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
A anlise granulomtrica foi realizada segundo a metodologia descrita na

norma ABNT-NBR 781/84. A determinao da condio nutricional do solo foi
baseada nas metodologias descritas por Jaramillo (1996) e por Raij et al. (2001). O
pH foi feito seguindo a metodologia descrita por Baptista (2007) e o teor de umidade
foi determinado atravs de um espectrmetro de infravermelho.
E, as anlises
microbiolgicas foram feitas pela tcnica de pour plate para as bactricas

heterotrficas totais cultivveis e pela tcnica do nmero mais provvel para as
bactrias hidrocarbonoclsticas cultivveis.
A caracterizao granulomtrica (ABNT-NBR 781/84) e a dosagem de Cobre,
Ferro, Mangans, Zinco, Alumnio, Clcio, Magnsio e Potssio (Raij et al., 2001)
foram realizadas pelo Laboratrio de Geotecnia (COPPE/UFRJ). A dosagem de
matria orgnica, nitrognio e fsforo (Jaramillo, 1996) foram realizadas no
Laboratrio de Tecnologia Ambiental (Escola de Qumica/UFRJ). E a determinao
do pH e da umidade foram realizados no Laboratrio de Biocorroso e
Biodegradao (Instituto Nacional de Tecnologia).
3.6.2. Ensaios de Biorremediao em Microcosmos

Aps a sua caracterizao, esse solo foi usado como base para o estudo da
interferncia da umidade, da condio nutricional e da presena de etanol na
gasolina no processo de biorremediao. Para tanto, foram organizadas 12 ensaios
usando duas matrizes de planejamento fatorial completo de dois nveis e dois fatores
(22), conforme apresenta os Quadro 5 e 6.
A condio nutricional e a adio de etanol na gasolina foram definidos como
variveis independentes. E, nos Quadros 5 e 6 pode-se observar
os fatores
(parmetros) e os nveis (valores mnimo, mximo e intermedirio) atribudos para

cada uma das variveis independentes.
Os nveis atribudos concentrao de fsforo (0; 25 e 50 ppm) foram
estabelecidos de acordo com a classificao de solo, em termos nutricionais,
segundo Jaramillo (1996) em pobre ou rico. Em relao ao teor de lcool adicionado
gasolina (0; 12,5 e 25%), os percentuais foram baseados na legislao brasileira,
47
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
que determina a adio de 25% de lcool na gasolina comercial (CIMA, n37; Lei
10.203/2001). E, as duas condies de umidade estudadas contemplaram uma
condio normal de solo mido (aproximadamente 20%) e outra saturada
(aproximadamente 40%).
Os valores mnimos e mximos estabelecidos para cada um dos fatores foram
combinados de forma a organizar todas as condies experimentais possveis, e
tambm foram realizadas duas rplicas do ponto central.
Alm de avaliar a condio nutricional e a presena de lcool, tambm foi
estudada o efeito da umidade no processo de biorremediao. Dessa forma, foram
estudados duas condies de umidade, uma com o solo apresentando um aspecto
mido (aproximadamente 20% de umidade) e outra com o solo visualmente
encharcado (cerca de 40% de umidade).
O aspecto visual que o solo apresenta est intimamente ligado sua
capacidade de reteno de gua (CRA), ou seja, a CRA consiste no mximo de
gua que as partculas de solo so capazes de absorver. Assim, quando um solo
apresenta a formao de filmes de gua, ele se encontra saturado, tendo sido
ultrapassado o volume mximo de gua que as partculas do solo foram capazes de
absorver.
O solo utilizado nesse estudo apresenta uma CRA de aproximadamente 30%,
sendo assim os valores de umidade estudados foi 10% inferior no caso do solo
mido (67% da CRA) e 10% superior para o solo encharcado (133% da CRA). E, no
Quadro 5 e 6 podem ser observadas as condies ensaiadas em 20 e 40% de
umidade, respectivamente.
Ademais, foram realizados oito ensaios controle, sendo quatro em solo mido e
outros quatro em solo encharcado. Portanto, considerando os ensaios do
planejamento fatorial, as rplicas do ponto central e os controles, foram realizados
um total de vinte experimentos, os quais so descritos nos Quadros 5, 6 e 7.
Os experimentos descritos nos Quadros 5, 6 e 7 foram realizados em
recipientes plsticos redondos de 6 cm de raio, nos quais foram acondicionados
300g de solo, com o pH ajustado para a faixa da neutralidade, e com diferentes
48
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
concentraes de nutrientes, contaminante e condio de umidade. Todos os

ensaios do planejamento (Quadros 5 e 6) e, ainda, os controles CPF-I e CPF-V
(Quadro 7) sofreram bioaumento atravs da incorporao de 10% (m/m) inculo
preparado em solo (item 3.4). Esses controles foram realizados com o propsito de
avaliar o comportamento do bioaumento em solo no contaminado. Por outro lado,
os controles CPF-II, CPF-III, CPF-IV, CPF-VI, CPF-VII e CPF-VIII foram conduzidos
sem bioaumento e com adio do biocida formaldedo, na concentrao de 2%(v/m),
de modo a avaliar a degradao abitica, isto , as perdas ocorridas durante o
tratamento.
Quadro 5 Matriz do Planejamento Fatorial 22 em Solo com 20% de umidade

Ensaio
Teor de lcool
(%v/v)
Concentrao de
fertilizante
(ppm de Fsforo)
Umidade
(%)
PF-1
20
PF-2
25
20
PF-3
50
20
PF-4
25
50
20
PF-9
12,5
25
20
PF-10
12,5
25
20
PF - Planejamento Fatorial
Quadro 6 Matriz do Planejamento Fatorial 22 em Solo com 40% de umidade

Ensaio
Teor de lcool
(%v/v)
Concentrao de
fertilizante
(ppm de Fsforo)
Umidade
(%)
PF-5
40
PF-6
25
40
PF-7
50
40
PF-8
25
50
40
PF-11
12,5
25
40
PF-12
12,5
25
40
PF - Planejamento Fatorial
49
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
Quadro 7 Matriz dos Ensaios Controles Realizados

Ensaio
Descrio do Ensaio
Umidade
(%)
CPF-I
Solo + Inculo
20
CPF-II
Solo + Gasolina*
20
CPF-III
Solo + Gasolina com 25% de lcool*
20
CPF-IV
Solo + Gasolina com 12,5% de lcool*
20
CPF-V
Solo + Inculo
40
CPF-VI
Solo + Gasolina*
40
CPF-VII
Solo + Gasolina com 25% de lcool*
40
CPF-VIII
Solo + Gasolina com 12,5% de lcool*
40
CPF Controle do Planejamento Fatorial

*Controles abiticos, receberam a adio de 2% de formaldedo
Uma vez que a condio nutricional do solo e a adio do inculo (dependente

do ensaio realizado) foram feita, cada ensaio recebeu a contaminao com 10% de
gasolina (m/m) com teor de etanol variando em funo da condio estudada.
Para todos os ensaios, independentemente da condio, e inclusive os
controles, foi feito o monitoramento peridico da umidade dos solos, de modo a
controlar esse parmetro na condio definida para o estudo. E, aps um perodo de
30 dias em ambiente arejado, com temperatura mdia de 28 C (2C), amostras
foram retiradas de todos os sistemas para a determinao do teor residual de
hidrocarbonetos
totais
do
petrleo
(HTP),
quantificao
de
bactrias
hidrocarbonoclsticas. Tambm foram feitos bioensaios com aneldeos a fim de

avaliar a toxicidade do solo residual aps cada um dos tratamentos ensaiados.
Devido ao nmero elevado de ensaios, os 20 experimentos no foram
realizados concomitantemente, sendo ento escolhidos randomicamente formando
dois grupos de 10 condies. Tambm por essa razo, com exceo do ponto
central, no foram feitas rplicas dos ensaios, embora as anlises realizadas a partir
das amostras coletadas desses ensaios foram feitas em duplicada.
50
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.6.3. Ensaios de Biorremediao em Colunas

A partir dos ensaios anteriores (item 3.5.1) foram reproduzidas algumas das
condies operacionais para a biorremediao de solo contaminado com gasolina. O
tratamento foi ento conduzido em uma escala maior, de modo a possibilitar a
avaliao do processo simulando as condies em campo, inclusive, em diferentes
profundidades.
Para tanto, foi especialmente construdo um sistema para a conduo desse
estudo que consistiu de uma coluna cilndrica de PVC composta por trs partes
superpostas, de modo a permitir avaliar a atividade microbiana e a degradao ao
longo de 60 cm de uma dada rea, como ilustra a Figura 9. Cada uma das 3 clulas
da coluna possua 10 cm de raio e 20 cm de altura, com 4 pontos de coleta (2 de
cada lado). Assim, como mostra a Figura 9, a coluna apresentava um total de 12
pontos de coleta localizados em 6 alturas distintas. Na parte inferior do reator foi
instalada uma vlvula a fim permitir, caso fosse necessrio, a coleta do material
percolado e a sua reintroduo no sistema.
Em cada ensaio foi empregada uma quantidade total de solo de cerca 21 kg
(aproximadamente 7 kg por seo), includo o bioaumento de 10% (m/m).
Como mostra o Quadro 7, nas colunas de PVC, foram ensaiadas as condies
dos ensaios PF-1, PF-2, PF-3 e PF-4, descritos no Quadro 5, e do controle CPF-I,
apresentado no Quadro 7. Simultaneamente, foi feito um controle (CEB-II) para
avaliar o perfil de crescimento dos microrganismos pelo bioaumento do solo na
presena de fertilizante (Quadro 8).
Ao longo de 60 dias, os ensaios foram mantidos em local arejado com
temperatua mdia de 28C (2C) com ajustes peridicos de umidade, atravs da
disperso de gua na superfcie do solo, e coletas semanais de amostras de solo a
fim de monitorar a populao de bactrias hidrocarbonoclsticas, o teor de
contaminante e, ainda, para as medies de pH do solo.
Conforme indicado no Quadro 8, os ensaios na coluna de PVC foram
realizados apenas com o solo mido, ou seja, com 20% de umidade. Isso foi devido
interferncia da umidade na percolao do contaminante, j que quando no solo
51
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
encharcado (40% de umidade) no ocorria a permeao do contaminante, como

pode ser observado nos testes realizados preliminarmente em provetas, contendo
300 g de solo, por 7 dias, como ilustrado na Figura 10.
10 cm
60 cm
Pontos
de
coleta
Coletor do
percolado
Figura 9 Ilustrao do reator usado no ensaio de biorremediao.
Quadro 8 Matriz do Ensaio de Biorremediao em Coluna

Ensaio
Descrio do Ensaio
EB-1
Solo mido + Inculo + Gasolina (PF-1)
EB -2
Solo mido + Inculo + Gasolina com lcool (PF-2)
EB -3
Solo mido + Inculo + Fertilizante + Gasolina (PF-3)
EB -4
Solo mido + Inculo + Fertilizante + Gasolina com lcool (PF-4)
CEB -I
Solo mido + Inculo (CPF-I)
CEB -II
Solo mido + Inculo + Fertilizante
EB Ensaio de Biorremediao
CEB Controle Ensaio de Biorremediao
52
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
Esses testes foram realizados com distintos teores de gua: umidade natural
do solo; solo mido (20% de umidade); e solo encharcado (40% de umidade). Como
mostra a Figura 10, quando o solo com teor de umidade natural foi contaminado com
10% (m/m) de gasolina, ocorreu absoro total do contaminante pelas partculas de
solo, sem sequer atingir o fundo da proveta.
Por outro lado, no solo com
aproximadamente 40% de umidade, a saturao causou a impermeabilidade do

solo, impedindo a penetrao do contaminante. Somente na condio com
aproximadamente 20% de umidade que foi possvel estabelecer a percolao da
gasolina at a base da proveta. A mesma situao observada inicialmente em cada
proveta se manteve mesmo aps 30 dias, o que descartou a possibilidade de usar o
solo encharcado ou a umidade natural do solo nessa etapa do estudo.
solo sem ajuste

de umidade
solo com 20%

de umidade
solo com 40%

de umidade
Figura 10 Testes de percolao do contaminante feitos em coluna (mido: 20% de

umidade; encharcado: 40%).
53
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.7. Anlises Quantitativas

3.7.1. Anlises Microbiolgicas
A quantificao de microrganismos foi feita utilizando 5 g de solo, devidamente
homogeneizadas e diludas em srie na proporo de 1:10 em soluo fisiolgica
(0,85% de NaCl). A partir dessas diluies foi feita a quantificao de duas
populaes bacterianas cultivveis de interesse as heterotrficas totais (BHT)
atravs da tcnica de plaqueamento em profundidade (Vermelho, Pereira & Coelho,
2006), e as hidrocarbonoclsticas (BHC) atravs da tcnica do nmero mais
provvel (NMP) (Van Hamme, Singh & Ward, 2003) em gar nutriente e bushnell
Haas, respectivamente.
Essas anlises foram realizadas em dois diferentes laboratrios, as amostras
coletadas a partir ensaios em microcosmos foram analisadas no Laboratrio de
Microbiologia Industrial II (Escola de Qumica/CT/UFRJ), enquanto que as amostras
oriundas dos ensaios em coluna foram analisadas no Laboratrio de Biocorroso e
Biodegradao (Instituto Nacional de Tecnologia)
3.7.1.1. Quantificao das Bactrias Heterotrficas Totais Cultivveis

As BHT foram quantificadas utilizando como meio de cultura o agar nutriente
(Merck). Aps incubao das placas semeadas 282C por 48 h. foi feita a
contagem de unidades formadoras de colnia (UFC), e os resultados foram
calculados e expressos em UFC/g de solo seco.
3.7.1.2. Quantificao das Bactrias Hidrocarbonoclsticas Cultivveis

As BHC foram estimadas atravs do NMP em placas multipoos contendo 1,8
ml do meio mineral Bushnell Haas. Aps inoculao com 0,2 ml de cada uma das 8
diluies (10-1 a 10-8), em cada poo foi distribudo aproximadamente 25 l de leo
rabe leve, como a nica fonte de carbono presente. A seguir, as placas foram
incubadas em estufa bacteriolgica por 7 dias a 282C. Ao fim do perodo de
incubao foi feita a leitura, considerando os poos com aparente degradao da
gota de leo como positivos, e como negativos aqueles onde a camada de leo
54
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
permaneceu inalterada, conforme ilustrado na Figura 11. Determinados os poos

positivos e negativos foram feitos os clculos levando em conta a diluio, e os
resultados expressos em NMP/g de solo seco.
CO
CO
CM
Figura 11 Placa multipoo usada para a estimativa da concentrao de BHC por NMP (A:
degradao positiva; B: negativa; CO: controle de leo; CM: controle de meio).
3.7.1.3. Mtodos Moleculares

A partir das dos poos das placas de NMP (Figura 11) onde foi constatada a
degradao do leo (resultados positivos) foram tomadas alquotas para isolamento
de bactrias potencialmente degradadoras de hidrocarbonetos. Com este fim, as
alquotas foram inoculadas em caldo nutriente (Merck), por 24 h, de onde foram
tomadas novas alquotas que foram plaqueadas em superfcie em gar nutriente. As
colnias obtidas foram identificadas posteriormente por seqenciamento. Tambm
foi feito o isolamento das culturas presentes no solo que apresentaram capacidade
degradadora.
Essas
anlises
foram
realizadas
no
Laboratrio
de
Biocorroso
Biodegradao (Instituto Nacional de Tecnologia), com exceo do seqenciamento,

cujas amostras foram enviadas para a Universidade de So Paulo.
55
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.7.1.3.1. Extrao de DNA

As culturas isoladas a partir dos solos aps biorremediao e, tambm,
diretamente do solo virgem tiveram o seu material gentico extrado atravs do kit
comercial MOBio Ultra CleanTM Microbial DNA Isolation. As concentraes dos DNA
assim obtidos foram determinadas por espectrofotometria no aparelho Nanodrop
Espectrophotometer, modelo ND-1000.
3.7.1.3.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

A tcnica de PCR permite a gerao de um grande nmero de cpias de um
determinado fragmento de DNA. Os produtos dessa reao, no caso desse trabalho,
foram utilizados para a identificao das culturas isoladas, por meio de
seqenciamento (Item 3.7.1.3.3).
Para que a reao de PCR acontea necessrio o preparo de um mix de
reagentes contendo gua, tampo, dNTPs (desoxirribonucleotideos trifosfatados),
iniciadores (primers) e enzima (Taq DNA polimerase). A concentrao final de cada
um desses reagentes no mix de reao, bem como a sua funo apresentada no
Quadro 9.
De acordo com o tamanho do fragmento a ser amplificado so usados
diferentes pares de primers. A reao de PCR para a identificao das culturas
isoladas, que necessita de fragmentos com aproximadamente 1500 pb, foi feita com
os primers Sadir (foward: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3') e S17 (reverse: 5'GTTACCTTGTTACGACTT-3 (Altschul et al., 1990).
As reaes de PCR foram feitas no termociclador PCR System 9700, da
Applied Biosystems. A Figura 12 ilustra o ciclo usado na reao de PCR para a
identificao das bactrias isoladas. Uma vez concluda a reao, o produto gerado
foi visualizado por eletroforese em gel de agarose (1%, m/v), purificado com o kit
comercial MOBio Ultra CleanTM Purification, e quantificados por espectrometria no
aparelho
Nanodrop
Espectrophotometer,
modelo
ND-1000.
Aps
obter
concentrao necessria, os produtos de PCR foram seqenciados.
56
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
Quadro 9 Concentrao final dos reagentes na reao de PCR

Reagente
Concentrao Final
Funo
gua ultra-pura
estril
Completar o volume final do mix, mantendo as

concentraes finais
Tampo de PCR
10X
1X
Garantir a estabilidade do pH e das

concentraes inicas
Mix de dNTP
0,2 mM (de cada

dNTP)
Bases nitrogenadas (Adenina, Timina, Citosina

e Guanina) para a construo das cpias do
fragmento de DNA
MgCl2
1,5 mM
Funciona como cofator da enzima DNA

polimerase
Primer Foward
0,5 M
Iniciador para a formao da fita no sentido

35
Primer Reverse
0,5 M
Iniciador para a formao da fita no sentido

53
Taq Polimerase
2,5 U
Criao do novo fragmento de DNA pela

introduo dos dNTPs complementares fita
molde
DNA alvo
10 pg-10 g
Material gentico molde para a formao de

outras fitas
Fonte: Lodish et al., 2002
30 ciclos
C
Tempo
94
5
94
72
30
30
55
30
72
5
4
Figura 12 Ciclo usado na reao de PCR para a identificao de culturas isoladas.
57
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
3.7.1.3.3. Seqenciamento das Culturas Isoladas

Os produtos de PCR das culturas isoladas foram enviados Universidade de
So Paulo, onde foram seqenciados, pelo mtodo de Sanger, no equipamento ABI
PRISM 3100 GeneticAnalyzer/HITACHI. As seqncias foram obtidas atravs do
tratamento dos dados recebidos com os softwares Chromas Lite e Bioedit permitindo
a sua comparao com o dados disponveis no GeneBank e ento a sua
identificao.
3.8. Anlises Fsico-Qumicas

3.8.1. pH (potencial de Hidrognio)
A medio do pH foi feita baseada na metodologia usada por Baptista,
Camporese & Freire (2006). Para tanto, 10 g de solo em 25 ml de gua destilada
foram agitados em vrtex por cerca de 5 min. para homogeneizao. A seguir, o pH
da soluo de solo foi medido diretamente em potencimetro digital.
Tecnologia Ambiental (Escola de Qumica/CT/UFRJ), enquanto que as amostras
3.8.2. Teor de Umidade Total

A determinao da umidade da amostra foi feita atravs do Analisador de
Umidade, Gehaka IV 2000. Esse sistema composto por balana, permite a secagem
da amostra por infra-vermelho, e fornece diretamente o percentual de gua nela
contido.
Tecnologia Ambiental (Escola de Qumica/CT/UFRJ), enquanto que as amostras
58
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos

3.8.3. Teor de Hidrocarbonetos Totais do Petrleo (HTP)

A determinao do teor de HTP foi realizada por dois mtodos distintos. Nos
ensaios preliminares a determinao foi feita atravs do espectrofotmetro de
infravermelho Horiba OCMA-350. Por esse aparelho, o HTP do solo determinado
aps a extrao com o solvente comercial S-316 (EPA, 2001). No caso das
amostras oriundas dos ensaios realizados nas colunas de PVC, a anlise de HTP foi
feita pela empresa Bioagri Ambiental por cromatografia gasosa seguindo a norma
EPA SW 846-8015 (EPA, 1997).
3.9. Anlise de Ecotoxicidade

3.9.1. Teste de mortalidade de Minhocas
Os ensaios de ecotoxicidade foram realizados atravs do Teste de Mortalidade
de Minhocas (adaptao de OECD, 1984), que consiste na exposio do aneldeo
da espcie Eisenia foetida a uma amostra de solo. Os aneldeos utilizados para essa
avaliao eram mantidos em um minhocrio no Laboratrio de Tecnologia Ambiental
(Escola de Qumica/CT/UFRJ)
Para tanto, em bequeres de vidro com capacidade de 400 ml foram distribudos
180 g de amostra de solo misturado com 20 g de esterco e, a seguir, introduzidas 10
minhocas. Os bequeres foram envoltos com papel alumnio para proteg-los da luz,
e deste modo simular as condies naturais, mesmo porque as minhocas no
toleram a luminosidade direta. Com o mesmo fim, e ainda para evitar a fuga das
minhocas, as aberturas dos becheres foram cobertas com tecido permevel ao ar.
Aps um perodo de incubao de 7 dias a 201C,
foi feita a contagem das
minhocas sobreviventes, e estimado o percentual de mortalidade. A Figura 13 ilustra

as vrias etapas de execuo dos ensaios de ecotoxicidade realizados com
minhocas.
59
Ferreira, D.G.
Material e Mtodos
A anlise de ecotoxicidade das amostras coletadas nos ensaios em

microcosmos foi realizada no Laboratrio de Tecnologia Ambiental (Escola de
Qumica/CT/UFRJ).
Figura 13 Avaliao da ecotoxicidade por meio do Teste de Mortalidade das Minhocas,

utilizando O aneldeo Eisenia foetida (A); B e C Frasco vazio envolto por papel laminado;
D Seleo das minhocas a serem utilizadas nos ensaios; E Solo com as minhocas
selecionadas; F As minhocas cobertas pelo resto de solo completando 200 g; G e H
Frasco rotulado e fechado.
3.10. Anlise Estatstica

A anlise estatstica dos dados experimentais de biorremediao obtidos pelo
planejamento fatorial foi realizada usando o software Statistica verso 6.0.
60
Ferreira, D.G.
Resultados e Discusso
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Caracterizao do solo
Inicialmente, o solo utilizado nesse estudo foi submetido a anlises
granulomtrica, fsico-qumicas e microbiolgicas, a fim de determinar o tamanho e a
proporo das suas partculas, a sua composio nutricional e, por fim, a existncia
de populaes microbianas com potencial degradador. Esses dados, que
influenciam na biodegradao dos hidrocarbonetos, so fundamentais para
implementar uma eficiente descontaminao do solo por biorremediao.
A distribuio granulomtrica do solo revelou a predominncia de partculas de
argila, conforme apresentado na Figura 14. Os teores de argila, areia e silte
determinados permitiram classificar o solo como argiloso, segundo a classificao
textural de solos do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (1993),
apresentada na Figura 2 (pgina 20). Esse tipo de solo caracterstico da maior
parte do territrio nacional, conforme ilustrado na Figura 3 (pgina 22).
Silte
6%
Areia
34%
Argila
60%
Argila
Silte
Areia
Figura 14 Constituio granulomtrica do solo argiloso utilizado.
61
Ferreira, D.G.
A eficcia da degradao microbiana de hidrocarbonetos no solo pode ser

limitada por diversos fatores, dentre eles, a porosidade e a umidade (Baptista, 2003).
Neste contexto, a textura do solo se destaca, pois as partculas de argila e silte tm
efeito direto na soro de hidrocarbonetos (Millioli et al., 2008).
A frao de argila presente na maioria dos solos constituda de minerais
muito diferentes, em composio e propriedades fsicas, em relao queles
presentes na areia e silte. Como a maior frao da gua presente no solo se
encontra como um filme aderido superfcie das partculas de argila, a quantidade
de argila presente no solo exerce importante influncia na sua capacidade total de
reteno de gua (Resende et al., 2002).
A umidade do solo outro fator de grande importncia na biorremediao do
solo, visto que redues relativamente pequenas da umidade resultam em
significativas redues da atividade microbiolgica do solo (Jacques et al., 2010). E
ainda, o monitoramento da umidade do solo nos locais onde a biorremediao est
em curso tem sido negligenciado em favor de fatores qumicos, como adubaes
fosfatadas e nitrogenadas, com comprometimento da eficincia da biorremediao.
fundamental manter bons nveis de umidade para favorecer a atividade
metablica no ambiente contaminado, visto que a gua o veculo para o transporte
de nutrientes para dentro da clula, bem como para a externalizao de produtos do
seu metabolismo (Cunha, 1996). No caso de contaminao por compostos qumicos
de baixa solubilidade em gua, como o caso dos hidrocarbonetos do petrleo,
estes so facilmente adsorvidos pela argila ou fraes de hmus no solo e passam
lentamente para a fase aquosa, tornando-se, ento disponveis para serem
metabolizados pelos microrganismos (Bardi et al., 2000). Por isso, em solos com
baixo teor de umidade a biodegradao de hidrocarbonetos do petrleo
influenciada pela rea de interface entre o leo e a gua (Huang et al., 2000).
Os solos com elevados teores de argila e silte, em combinao com uma alta
umidade apresentam permeabilidade bastante reduzida, se constituindo em uma
barreira fsica para a infiltrao das guas pluviais no solo e para a difuso de gases,
dificultando o processo de biodegradao (Robaina et al., 2001; Jacques et al.,
2007). A permeabilidade do solo um fator limitante para o desenvolvimento das
62
Ferreira, D.G.
tecnologias de tratamento biolgico in situ. Um solo de baixa permeabilidade pode

reduzir a capacidade de contato entre microrganismos e contaminante e, assim,
restringir a eficincia do processo.
Por outro lado, o excesso de gua pode inviabilizar o processo de
biodegradao no solo, j que a ocupao pela gua reduz a rea ocupada pelos
gases, criando condies anxicas, e, ainda, provocando alteraes no pH da
soluo do solo (U.S.EPA, 1990).
Dessa forma, observa-se que a biorremediao em solos com elevado
contedo de argila um processo complexo e que deve considerar,
principalmente, a aerao do sistema a fim de beneficiar o metabolismo aerbio,
pois permite a mineralizao do contaminante e, em geral, apresenta maior
velocidade quando comparado ao metabolismo anaerbio.
No Quadro 10 esto discriminados alguns componentes qumicos do solo.
Dentre eles, as concentraes de ferro (Fe) e alumnio (Al) que so os principais
responsveis pela colorao desse tipo de solo. Nesse quadro pode-se observar a
predominncia de ferro em relao ao alumnio, o que explica a colorao vermelhoalaranjada do solo analisado. Assim, considerada a colorao do solo, a
granulometria e as observaes de campo, pode-se classific-lo como Latossolo
vermelho-alaranjado.
As partculas de argila presentes no Latossolo apresentam grande superfcie
de contato polarizada facilitando sua interao com ons, gua e, principalmente,
com as clulas microbianas, tornando difcil a separao das clulas aderidas s
partculas de argila (Moreira & Siqueira, 2006; Oliveira, 2008). Os Latossolos so
ricos em xidos de Fe e Al, que, inclusive, favorecem a fixao de fsforo no solo
(Resende, 2002).
Qualquer que seja o tipo de solo fundamental que ele apresente propriedades
fsicas e qumicas que permitam a biodegradao dos poluentes (Gaivizzo, 2001).
Os elementos qumicos, relacionados no Quadro 10, so essenciais para as funes
vitais das clulas microbianas. Os nutrientes, independentemente de serem micro ou
macronutrientes, so indispensveis para o bom funcionamento celular. Contudo,
cabe ressaltar que a matria orgnica, o nitrognio e o fsforo so os nutrientes de
63
Ferreira, D.G.
maior importncia, por estarem envolvidos em diferentes atividades celulares, tais

como: equilbrio osmtico da clula; cofatores para reaes enzimticas; gerao de
energia; e sntese de constituintes celulares, sejam eles estruturais ou genticos
(Brunken & Szarfare, 1999; Gomes, 2005; Moreira & Siqueira, 2006).
Quadro 10 Caractersticas Fsico-Qumicas do Solo

Caractersticas fsico-qumicas
Micronutrientes
Macronutrientes
Caractersticas
Fsico-Qumicas
Valores (ppm*)
Cobre
0,1
Ferro
Mangans
0,1
Zinco
0,3
Alumnio
0,5
Clcio
0,4
Fsforo
Matria Orgnica
3000
Magnsio
0,1
Nitrognio
675
Potssio
0,1
pH
5,0
Umidade
10% (v/m)
*ppm corresponde a mg/kg
Segundo a literatura cientfica a relao C:N:P ideal para o metabolismo

microbiano de 100:10:1 (Riser-Roberts, 1998). Assim, o solo analisado pode ser
considerado fora das condies ideais para o desenvolvimento de microrganismos,
j que apresenta uma relao de C:N:P, aproximadamente de 100:22:0,2. Isso
impe a suplementao do solo com fontes de fsforo de modo a estabelecer
condies nutricionais apropriadas para a atividade microbiana. Nesse caso, o
emprego de fertilizantes recomendado pelo seu baixo custo e por conter a fonte de
fsforo para a suplementao.
Alm da limitao de nutrientes, esse solo tem um carter cido, com um valor
de pH de 4,7. Normalmente, esse valor favorvel atividade fngica, mas no
64
Ferreira, D.G.
para o crescimento da maioria das bactrias, que necessitam de pH ideal prximo

neutralidade (Madigan, Martinko & Parker, 2004). Portanto, considerando que a
participao das bactrias mais efetiva no processo de biorremediao, visto a sua
maior velocidade de crescimento, foi necessrio o aumento do pH do solo (RiserRoberts, 1998; Neto, Figueirdo & Queiroz, 2005; Moreira & Siqueira, 2006).
Com relao ao percentual de gua, seu teor no solo foi de aproximadamente
10%. Esse valor restringe a atividade metablica da maioria dos microrganismos, j
que, conforme mencionado anteriormente, a gua o veculo de transporte de
nutrientes atravs da membrana celular e tambm est relacionada com a
homeostase (Madigan, Martinko & Parker, 2004). Assim, para a realizao dos
ensaios houve a necessidade de aumentar a umidade do solo. Porm, devido ao
carter argiloso do solo, foram estabelecidos dois valores de umidade (mido- 20% e
saturado-40%) de modo a poder avaliar o desempenho dos microrganismos em
diferentes condies ambientais.
importante ressaltar que no meio ambiente as caractersticas do solo so
variveis, sendo que essas variaes so mais acentuadas no sentido vertical, em
conseqncia das camadas formadas no processo de formao dos solos. Portanto,
importante que o monitoramento da biodegradao seja conduzido em diferentes
profundidades.
As condies ambientais timas para o metabolismo celular variam de acordo
com a espcie microbiana. Em geral, a temperatura tima de crescimento est na
faixa entre 25 e 30C, enquanto o pH deve estar prximo neutralidade para as
bactrias e ligeiramente cido para os fungos (Riser-Roberts, 1998; Madigan,
Martinko & Parker, 2004; Neto, Figueirdo & Queiroz, 2005; Moreira & Siqueira,
2006).
Apesar das caractersticas fsico-qumicas e nutricionais determinadas para o
solo estudado serem limitantes para a atividade de bactrias, o solo utilizado nesse
estudo apresentou cerca de 105 UFC/g de solo de bactrias heterotrficas cultivveis
totais (BHT) e 102 NMP/g de solo de bactrias hidrocarbonoclsticas (BHC).
A presena de bactrias hidrocarbonoclsticas nesse solo ratifica a
possibilidade de se detectar e isolar espcies de microrganismos com potencial
65
Ferreira, D.G.
degradador, mesmo em solos sem histrico de contaminao (Atlas, 1981; RiserRoberts, 1998). Tal fato corrobora a biodiversidade dos solos, assim como a
versatilidade das comunidades microbianas neles presentes quanto degradao
de fontes complexas de carbono e energia.
Por outro lado, alguns autores preconizam que baixas concentraes de
espcies com potencial degradador em condies ambientais desfavorveis
dificultam a remoo biolgica de um eventual contaminante (Vidali, 2001; Singh &
Ward, 2004). Dentre as alternativas indicadas para a biorremediao de petrleo e
seus derivados tm-se o bioaumento pela incorporao no solo tanto de populaes
endgenas do solo com potencial degradador, quanto de populaes microbianas
exgenas especficas, essa adio de microrganismos recebe o nome de
bioenriquecimento.
No caso de j existirem espcies potencialmente degradadoras na comunidade
microbiana, possvel aumentar o seu nmero to somente pelo ajuste da condio
nutricional e do pH (bioestmulo). Entretanto, a ausncia ou a baixa concentrao
dessas espcies induz a introduo de microrganismos exgenos juntamente com o
bioestmulo. Em ambas situaes o intuito garantir uma efetiva atividade
microbiana no local e, conseqentemente, um tratamento mais efetivo e mais rpido.
No Brasil, onde a legislao ambiental restringe a introduo de espcies no
nativas ou modificadas geneticamente, sendo apenas possvel a realizao de
bioaumento pela introduo de espcies autctones autorizadas pelo IBAMA
(CONAMA no 237, 1997; CONAMA no 314, 2002).
No caso do bioestmulo h que se monitorar as concentraes de nutrientes
durante o tratamento para que essas no fiquem abaixo dos nveis necessrios para
a atividade celular ou, ao contrrio,
atinjam nveis txicos que ultrapassem as
concentraes permitidas pela legislao (Riser-Roberts, 1998; Resoluo CONAMA

n 357/2005).
Como o solo do presente estudo possui microrganismos com potencial
degradador, foi definido realizar bioaumento e bioestmulo a fim de incrementar a
biodegradao com microrganismos autctones.
66
Ferreira, D.G.
4.2. Avaliao de Parmetros para a Biorremediao da Gasolina

Em face da caracterizao microbiolgica do solo empregado ter apontado
uma baixa concentrao de bactrias hidrocarbonoclsticas (102 NMP/g de solo),
preliminarmente foi realizado o preparo do inculo para o bioaumento, a fim de
aumentar o nmero de clulas metabolicamente ativas e adaptadas ao
contaminante. E, assim, tentar aumentar a eficincia da biodegradao da gasolina
no Latossolo, em um menor intervalo de tempo. Segundo vrios autores, o emprego
de uma populao microbiana adaptada ao contaminante crucial nos tratamentos
de biorremediao (Vidali, 2001; Olaniram, Pillay & Pillay, 2006).
O inculo foi preparado em fase slida, isto , no prprio solo. Para tanto,
houve a necessidade tambm de ajustar os parmetros fsico-qumicos, visto que as
anlises do solo mostraram condies inadequadas de concentrao de nutrientes,
pH e teor de umidade para a proliferao de bactrias (Quadro 10).
O monitoramento do Latossolo, aps os ajustes devidos de umidade e pH e
dos acrscimos de fertilizante comercial (cerca de 50 ppm de P) e de 5%(v/m) de
gasolina, revelou o aumento da concentrao de bactrias, cujos resultados,
decorridos 21 dias, so apresentados no Quadro 11. Nesse quadro tambm constam
as caractersticas fsico-qumicas do solo aps o bioestmulo.
Quadro 11 Caractersticas Fsico-Qumicas e Microbiolgicas do Solo Corrigido
Caractersticas
Nutrientes
Populaes Microbianas
Caractersticas FsicoQumicas
Concentrao
Matria Orgnica
26,6 g/kg
Nitrognio
1g/kg
Fsforo
50 mg/kg
Potssio
20 mg/kg
BHT*
108 UFC/g
BHC**
105 NMP/g
pH
7,4
Umidade
30%
*BHT Bactrias Heterotrficas Totais; inicial: 10 UFC/g

**BHC Bactrias Hidrocarbonoclsticas; inicial: 102 NMP/g
67
Ferreira, D.G.
Com o ajuste da condio nutricional para 50 ppm de fsforo, estabelecendo

uma relao C:N:P de aproximadamente 530:20:1, houve um aumento da populao
inicial de bactrias hidrocarbonoclsticas de 102 NMP/g de solo para 105 NMP/g,
demonstrando a capacidade de espcies do consrcio de microrganismos
autctones de usar o contaminante como fonte de carbono (Pala, 2003; Pala et al.,
2004; Baptista, Camporese & Freire, 2006). Pode-se ainda evidenciar um aumento
de trs ordens de grandeza para a populao de bactrias heterotrficas cultivveis
totais, o que sugere que o metabolismo das BHC gerou compostos qumicos
passveis de serem assimilados pelas BHT, resultando em um aumento.
Uma vez tendo alcanado uma concentrao apropriada de microrganismos
degradadores em solo, amostras foram usadas para efetuao do bioaumento nas
diferentes condies experimentais, dando incio aos ensaios de biorremediao
propriamente ditos. Atravs do bioaumento, verificou-se um aumento da populao
de BHC de uma ordem de grandeza. Embora esse aumento possa ser considerado
baixo as clulas introduzidas estavam metabolicamente ativas e adaptadas ao
contaminante.
Nesta etapa, o foco principal foi avaliar a interferncia de alguns parmetros na
biorremediao da gasolina, em especial a presena de etanol, que usado
comercialmente como aditivo no Brasil. Para isso, foram avaliadas diferentes
combinaes de concentrao de fsforo, teor de etanol e umidade atravs de um
planejamento fatorial (Quadros 5 e 6). A interferncia do etanol na biorremediao
da gasolina, e as melhores condies de fertilizante e umidade para a conduo do
processo foram avaliadas com base no monitoramento da populao de bactrias
hidrocarbonoclsticas, do teor de hidrocarbonetos totais de petrleo (HTP) e da
toxicidade dos compostos residuais no solo para minhocas. Ressalta-se que o teor
de HTP no solo foi a principal resposta para a estimativa da eficincia do processo
de biorremediao.
Os teores de HTP ao final de 30 dias para os diferentes sistemas ensaiados
so apresentados na Figura 14. Em todos os ensaios (PF-1 a PF-12) foi evidenciada
reduo da concentrao de HTP pela ao dos microrganismos. Entretanto, em
nenhuma das condies ensaiadas, o contaminante foi totalmente removido.
68
Ferreira, D.G.
Provavelmente, em funo do esgotamento das fontes nutricionais e/ou ao tempo de

tratamento.
Destaca-se ainda que a reduo da concentrao de HTP variou com a
bioestimulao. De modo que, nos ensaios realizados com a maior adio de
fertilizante (PF-3, PF-4, PF-7 e PF-8), foram detectadas as menores concentraes
residuais do contaminante. Enquanto que nos ensaios sem adio do fertilizante
(PF-1, PF-2, PF-5 e PF-6) foram detectadas as maiores concentraes finais de
HTP. Interessante notar que a variao da umidade s interferiu nos ensaios
conduzidos com a mxima quantidade de fertilizante.
10000
ConcentraodeHTPnosolo(mg/Kg)
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Ensaios
*O desvio padro mdio de aproximadamente 6%
Figura 15 Teores finais de HTP, expressos em valores mdios, para a biorremediao de latossolo
contaminado com 10% (m/m) de gasolina em diferentes condies de etanol, fertilizante e umidade.
Teor de HTP inicial: 30.000 mg/kg. Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): PF-1
(0%;0ppm;20%); PF-2 (25%;0ppm;20%); PF-3 (0%;50ppm;20%); PF-4 (25%;50ppm;20%); PF-5
(12,5%;25ppm;20%);
PF-10
(12,5%;25ppm;20%);
(12,5%;25ppm;40%);
CPF-I
(Solo;Inculo;20%);
PF-11
CPF-II
(12,5%;25ppm;40%);
(Solo;Gasolina;20%);
PF-12
CPF-III
(Solo;Gasolina(25%);20%); CPF-IV (Solo;Gasolina(12,5%);20%); CPF-V (Solo;Inculo;40%); CPF-VI

(Solo;Gasolina;40%); CPF-VII (Solo;Gasolina;40%); CPF-VIII (Solo;Gasolina(12,5%);40%).
69
Ferreira, D.G.
Embora o solo tenha sido contaminado com 10% (m/m) de gasolina, ou seja,
100.000 mg/kg de solo, a metodologia utilizada para monitorar a concentrao de
HTP detectou em mdia 30.000 mg/kg de solo. Essa discrepncia de valor deve-se
principalmente ao fato de a tcnica utilizada avaliar o teor de contaminante adsorvido
nas partculas de solo e no todo o HTP introduzido. Assim, comparando a
concentrao inicial detectada com a concentrao de HTP final dos ensaios
controle mais de 75% do contaminante foi perdido atravs de fatores abiticos, isto
, sem a interferncia dos microrganismos. Esse percentual foi determinado com
base na comparao entre a concentrao inicial e final detectada nos controles
abiticos (CPF-II, CPF-III, CPF-IV, CPF-VI, CPF-VII e CPF-VIII).
sterreicher-Cunha et al. (2004) observaram que logo nas primeiras 24 h aps
a contaminao do solo com gasolina houve uma grande volatilizao de
hidrocarbonetos que, em alguns casos, chegou a atingir 80% da quantidade inicial.
Com o decorrer do tratamento, a concentrao de hidrocarbonetos foi decrescendo
gradativamente, no sendo mais detectada decorridos 80 dias.
A biorremediao da gasolina um processo que j foi alvo de alguns estudos,
seja em processos aerbicos (Corseuil et al., 1996; Barbaro & Barker, 2000; Kao &
Wang, 2000; Solano-Serena et al., 2000; Rahman et al., 2002; Landmeyer &
Bradley, 2003; Ghazali et al., 2004; Tiburtius, Peralta-Zamora & Emmel, 2005;
Baldwin, Nakatsu & Nies, 2007) ou anaerbicos (Corseuil et al., 1996; Phelps &
Young, 1999; Yerushalmi, Manuel & Guiot, 1999; Silva & Alvarez, 2002; Nardi et al.,
2005; Dou et al., 2007). Entretanto, poucos trabalhos avaliaram o papel e os efeitos
da adio de etanol na biorremediao da gasolina.
O percentual de remoo do contaminante para cada condio ensaiada foi
calculado deduzindo as perdas abiticas, a partir dos dados dos respectivos ensaios
controle. Assim, o maior percentual de degradao do contaminante para os ensaios
realizados sem adio de fertilizante (PF-1, PF-2, PF-5 e PF-6) foi inferior a 30%.
Esses resultados foram similares aos dos ensaios realizados nas condies dos
pontos centrais do planejamento (PF-9 a PF-12), que apresentaram redues de
contaminao de aproximadamente 35%. Nessas condies, a variao na condio
de umidade no interferiu de maneira efetiva na biodegradao dos hidrocarbonetos.
70
Ferreira, D.G.
Em contrapartida, nos ensaios realizados com a adio do valor mximo de

fertilizante, a biodegradao variou em funo da condio de umidade. Para os
solos saturados (PF-7 e PF-8), a remoo do contaminante foi superior a 50%,
enquanto que para o menor teor de umidade (ensaios PF-3 e PF-4), a reduo do
teor de contaminante foi inferior a 40%.
De um modo geral, a variao do contedo de etanol na gasolina no provocou
diferenas notrias na concentrao final de HTP. Ao contrrio das informaes
disponveis na literatura que indicam que a adio de etanol gasolina interfere
negativamente no processo de biorremediao, e aumenta os danos ao ambiente
(Corseuil et al., 1996; Lovanh, Hunt & Alvarez, 2002; Corseuil, Kaipper & Fernandes,
2004; sterreicher-Cunha et al., 2004; Niven, 2005; Silva & Alvarez, 2004; Mackay,
et al., 2006; Gusmo et al., 2006; sterreicher-Cunha et al., 2007; sterreicherCunha et al., 2009). Uma vez que, segundo a maioria desses autores, o etanol
tambm retarda a biodegradao dos hidrocarbonetos constituintes da gasolina.
O maior tempo de processo requerido para a degradao da gasolina quando
na presena de etanol se justifica pela menor complexidade do biocombustvel
quando comparado aos hidrocarbonetos do petrleo, fazendo com que o lcool seja
assimilado preferencialmente pelos microrganismos, e dessa forma retardando o
consumo dos hidrocarbonetos (Corseuil & Moreno, 2001; Lovanh, Hunt & Alvarez,
2002; Corseuil, Kaipper & Fernandes, 2004; Malamud et al., 2005; Silva & Alvarez,
2004; Mackay, et al., 2006; Gusmo et al., 2006; sterreicher-Cunha et al., 2009).
Existe ainda a possibilidade de ocorrer oxidao do etanol cido actico gerando
um ambiente cido e anaerbico
Alm de interferir no processo de degradao microbiana dos hidrocarbonetos,
a presena de etanol na gasolina provoca o aumento da concentrao de
hidrocarbonetos dissolvidos em gua (Banerjee & Yalkowsky, 1988). Isso ocorre
porque o lcool se dissolve facilmente em gua, atuando como uma ponte para a
transferncia de hidrocarbonetos hidrofbicos para a fase aquosa, atravs do
fenmeno de co-solvncia.
Essa
transferncia
propaga
distribuio
dos
hidrocarbonetos
pelo
ecossistema, aumentando a extenso da rea contaminada, e, por conseguinte,

71
Ferreira, D.G.
ampliando os efeitos da contaminao (Corseuil & Fernandes, 1999; Corseuil,

Kaipper & Fernandes, 2004). Contudo, os efeitos da co-solvncia so dependentes
da concentrao de etanol misturado gasolina, uma vez que a transferncia de
hidrocarbonetos para a fase aquosa ocorre apenas em teores de etanol superiores a
10% (v/v) (Banerjee & Yalkowsky, 1988; Corseuil, Kaipper & Fernandes, 2004).
Como anteriormente mencionado, os impactos negativos no processo de
biorremediao so decorrentes dos efeitos nocivos do contaminante sobre as
populaes microbianas. Em geral, a contaminao reduz as populaes de
bactrias, embora, aps uma fase de adaptao, algumas espcies sejam capazes
de se restabelecer e, portanto, retomar o seu crescimento.
sterreicher-Cunha et al. (2004), avaliando a bioventilao no tratamento de
solo contaminado com gasolina, verificaram que logo aps a contaminao houve
um decrscimo considervel da concentrao celular. Entretanto, em um intervalo de
apenas 24 h, ocorreu o restabelecimento das espcies microbianas (103 UCF/g de
solo), e passados 30 dias, no solo foi detectada a concentrao de 105 UCF/g.
Nas Figuras 16 e 17, podem ser observadas as contagens de bactrias
hidrocarbonoclsticas para os diferentes ensaios (PF-1 a PF-12) e controles (CPF-I
a CPF-IV), definidos segundo planejamento fatorial (Quadro 5), para solos em
condies de umidade distintas. A anlise da figura mostra que a contaminao
provocou uma ligeira reduo dessa populao bacteriana nos ensaios que no
receberam bioestmulo, embora, diferentemente do observado por sterreicherCunha et al. (2004), no tenha sido observado o seu aumento (PF-1, PF-2, PF-5 e
PF-6), nem mesmo decorridos 30 dias, independentemente do teor de umidade
(Figuras 16 e 17).
Possivelmente, as limitaes nutricionais impediram que a populao
bacteriana utilizasse todo o seu potencial metablico, o que, conseqentemente,
resultou na baixa remoo dos hidrocarbonetos do solo (Figura 15). Para os ensaios
com bioestmulo (PF-3, PF-4, PF-7 e PF-8), foi verificado aumento da concentrao
de BHC, com valores mximos semelhantes independentemente da presena ou
no de etanol, e do teor de umidade (20 ou 40%).
72
BHCNMP/g(log10)
Ferreira, D.G.
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
PF1
PF2
PF3
PF4
PF9
PF10
CPFI
CPFII
CPFIII
CPFIV
Ensaios
Inicial
30diasapsacontaminao
*O desvio padro mdio de aproximadamente 5% (inicial), e de 2% (30 dias aps a contaminao)
Figura 16 Concentraes inicial e final de bactrias hidrocarbonoclsticas (BHC) para

biorremediao de solo contaminado com gasolina nas diferentes condies ensaiadas usando solo
mido. Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): PF-1 (0%;0ppm;20%); PF-2
(25%;0ppm;20%); PF-3 (0%;50ppm;20%); PF-4 (25%;50ppm;20%); PF-10 (12,5%;25ppm;20%); PF11
(12,5%;25ppm;40%);
PF-12
(12,5%;25ppm;40%);
CPF-I
(Solo;Inculo;20%);
CPF-II
(Solo;Gasolina;20%); CPF-III (Solo;Gasolina(25%);20%); CPF-IV (Solo;Gasolina(12,5%);20%);
Por outro lado, para os controles abiticos (CPF-II, CPF-III, CPFIV, CPF-VI,
CPF-VII e CPF-VIII), no foram detectados microrganismos viveis ao 30 dia de
tratamento, como mostram as Figuras 16 e 17. Dessa forma pode-se garantir que os
microrganismos autctones dos solos desses ensaios foram inibidos pela adio de
formaldedo, o que comprova que a reduo de HTP (Figura 15) no foi atravs da
ao microbiana sobre o contaminante. Logo, a perdas de HTP desses controles
podem ser atribudos apenas aos fatores abiticos.
Conforme ilustrado na Figura 18, as maiores redues de HTP ocorreram para
os ensaios onde o crescimento de BHC foi maior. Portanto, pode-se aferir que a
concentrao de bactrias hidrocarbonoclsticas metabolicamente ativas e o teor de
HTP so parmetros interligados.
73
BHCNMP/g(log10)
Ferreira, D.G.
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
PF5
PF6
PF7
PF8
PF11
PF12
CPFV
CPFVI CPFVII CPFVIII
Ensaios
Incial
30diasapsacontaminao
*O desvio padro mdio de aproximadamente 2% (inicial), e de 1% (30 dias aps a contaminao)
Figura 17 Concentraes inicial e final de bactrias hidrocarbonoclsticas (BHC) para

biorremediao de solo contaminado com gasolina nas diferentes condies ensaiadas usando solo
saturado. Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): PF-5 (0%;0ppm;40%); PF-6
(25%;0ppm;40%); PF-7 (0%;50ppm;40%); PF-8 (25%;50ppm;40%); PF-11 (12,5%;25ppm;40%); PF12
(12,5%;25ppm;40%); CPF-V (Solo;Inculo;40%); CPF-VI (Solo;Gasolina;40%); CPF-VII
(Solo;Gasolina;40%); CPF-VIII (Solo;Gasolina(12,5%);40%).
A reduo de parte da populao de BHC no impediu que as espcies

remanescentes promovessem o consumo dos hidrocarbonetos da gasolina (ensaios
PF-1, PF-2, PF-5 e PF-6). Fato tambm observado por Bento e colaboradores
(2005). Segundo esses autores, a contaminao, dependendo das condies
ensaiadas pode reduzir o nmero de bactrias viveis, embora possa haver aumento
da
atividade
metablica.
Logo,
as
clulas
remanescentes
continuam
metabolicamente ativas e atuando na remoo do contaminante. Isso se deve,

principalmente, ao fato de a contaminao provocar uma seleo natural das
espcies com potencial para tolerar e degradar o composto xenobitico introduzido
no ecossistema.
Por outro lado, como mostra a Figura 18, a bioestimulao, principalmente nos
ensaios PF-3, PF-4, PF-7 e PF-8, promoveu o aumento da populao de bactrias
74
Ferreira, D.G.
degradadoras, que culminou na remoo das maiores concentraes de

contaminante. Esses resultados diferem do estudo de Bento e colaboradores (2005),
onde a remoo do contaminante foi igual ou pior quando a bioestimulao foi
comparada bioatenuao.
Os resultados da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas e do teor de
HTP apresentaram diferenas notrias em relao condio de umidade e
concentrao de nutrientes. Porm, o percentual de etanol adicionado gasolina
no pareceu ter efeito na sua biodegradao.
Os melhores resultados para a remoo da gasolina foram obtidos com a
adio de 50 ppm de fsforo, sendo que os ensaios que aplicaram solo saturado
(aproximadamente 40% de umidade) apresentaram concentraes residuais de HTP
menores que s detectadas nos ensaios com solo mido (aproximadamente 20% de
umidade). Possivelmente, a solubilizao dos hidrocarbonetos em gua aumentou a
sua biodisponibilidade favorecendo o seu consumo pelos microrganismos.
Em ambas as condies de umidade, o sucesso na remoo da gasolina do
solo foi dependente da concentrao de fsforo a ele adicionada. Os ensaios
bioestimulados, seja com 25 ou 50 ppm de fsforo, apresentaram concentraes
prximas ou inferiores 5000 ppm de HTP.
A legislao ambiental brasileira no detm valores de referncia e de
interveno sobre a concentrao de contaminantes no solo. Por isso, em geral, so
adotados parmetros de legislaes estrangeiras, principalmente, as da Holanda e
da Alemanha (CETESB, 1999; CETESB, 2001; Environmental Statement, 2005;
Ministrio do Meio Ambiente, 2007). Obviamente, a adoo de legislaes
estrangeiras pode ser utilizada somente como um indicativo da qualidade dos
ecossistemas j que as condies ambientais desses paises so diferentes das
encontradas no territrio nacional.
75
Ferreira, D.G.
8.00E+04
100
90
7.00E+04
80
6.00E+04
2.00E+04
PercentualdeRemoo
1.00E+04
70
0.00E+00
60
50
40
1.00E+04
30
20
10
0
CPFVII
CPFVIII
CPFV
CPFVI
CPFIII
CPFI
CPFII
PF12
VariaodapopulaodeBHC
PF11
PF10
PF9
Ensaios
PF8
PF1
CPFIV
10
PF7
20
PF6
30
3.00E+04
PF5
40
VariaodapopulaodeBHC
4.00E+04
PF4
50
5.00E+04
PF3
60
PF2
70
Variaodapopulao deBHC(NMP/g)
PercentualdeRemoodoContaminante(%)
PercentualdeRemoo
*O desvio padro dos resultados desse grfico so os mesmos mostrados nas Figuras 15, 15 e 16
Figura 18 Comparao entre o percentual de remoo de HTP e a variao da

concentrao de BHC nos ensaios do planejamento fatorial (Quadros 5 e 6). Condies do
ensaio (%etanol; [P]; % de umidade):: PF-1 (0%;0ppm;20%); PF-2 (25%;0ppm;20%); PF-3
(0%;50ppm;40%); PF-8 (25%;50ppm;40%); PF-9 (12,5%;25ppm;20%); PF-10 (12,5%;25ppm;20%);
PF-11 (12,5%;25ppm;40%); PF-12
(12,5%;25ppm;40%); CPF-I (Solo;Inculo;20%); CPF-II
(Solo;Gasolina;20%); CPF-III (Solo;Gasolina(25%);20%); CPF-IV (Solo;Gasolina(12,5%);20%); CPF-V

(Solo;Inculo;40%);
CPF-VI
CPF-VII
CPF-VIII
(Solo;Gasolina(12,5%);40%).
No caso de contaminaes por petrleo e seus derivados, so utilizados como

base os padres holandeses, o qual determina que um solo pode ser dado como
no contaminado quando o teor de HTP inferior 50 ppm. Ainda com base na
legislao holandesa, a interveno de uma rea, ou seja, a sua remediao feita
76
Ferreira, D.G.
quando so detectadas concentraes iguais ou superiores a 5000 ppm de HTP no

solo (CETESB, 1999; CETESB, 2001).
Com base no valor limtrofe da legislao holandesa, tem-se que os ensaios
PF-1 e PF-2 necessitariam ainda de interveno. J os pontos centrais (ensaios PF5, PF-6, PF-11 e PF-12), que apresentaram concentraes prximas ao valor
limtrofe, possivelmente, s dependeriam de um tempo maior de tratamento. Mas, os
ensaios PF-3, PF-4, PF-7 e PF-8, para os quais as concentraes de HTP foram
bem inferiores concentrao limite, os tratamentos poderiam ser considerados
como concludos. No caso de contaminao por gasolina alm dosagem de HTP,
tambm deve ser avaliado a concentrao de BTEX no solo antes da concluso do
tratamento, contudo nesse trabalho no foi utilizada nenhuma metodologia para a
dosagem desses hidrocarbonetos.
Dessa forma, pode-se aferir que o processo de biorremediao foi mais eficaz
quando
aplicada
bioestimulao,
dentro
dos
parmetro
monitorados,
independentemente do solo estar mido ou saturado, uma vez que, mesmo a adio
mnima de fsforo (25 ppm), permitiu que os microrganismos promovessem a
degradao do contaminante at um valor igual ou inferior ao de interveno,
segundo a legislao holandesa.
A deteco de valores inferiores a 5000 ppm deve apenas servir como
parmetro para sinalizao de finalizao do tratamento, j que os compostos
residuais podem ser to, ou at mesmo mais txicos que os compostos originais
(Yerushalmi & Guiot, 1998). Por isso, importante analisar os hidrocarbonetos
residuais quanto a sua toxicidade antes de dar o tratamento por encerrado tentando
restabelecer as condies naturais do ecossistema (Riser-Roberts, 1998; Phillips et
al., 2000; Niven, 2005).
Dentre as diferentes metodologias empregadas para avaliao da toxicidade de
compostos residuais no ambiente, destaca-se o teste de mortalidade de minhocas,
que so aneldeos altamente sensveis. De fato, esse teste se destaca por ser cerca
de 80% mais sensvel do que aqueles realizados com sementes de vegetais e algas
(Dorn et al., 1998).
77
Ferreira, D.G.
Os aneldeos nutrem-se atravs da ingesto dos constituintes presentes em

solos, e a respirao ocorre atravs de trocas gasosas pela superfcie cutnea. Por
isso, mesmo que os compostos txicos estejam presentes em baixas concentraes
no solo, essas substncias podem ser letais ou vir a causar leses a esses
invertebrados (Contreras-Ramos, Alvarez-Bernal & Dendooven, 2009).
Logo, as minhocas podem ser usadas para avaliar os efeitos txicos letais ou
subletais de contaminantes num curto perodo de tempo. Os efeitos subletais podem
interferir em seu crescimento, comportamento, reproduo ou, ainda, nos processos
fisiolgicos. A durao do teste de toxicidade aguda varia de 7 a 14 dias e o teste de
reproduo em torno de 9 semanas (Kapanen & Itavaara, 2001; Harmon & Wyatt,
2008; Contreras-Ramos, Alvarez-Bernal & Dendooven, 2009).
Como mostra a Figura 19, no presente estudo, os percentuais de mortalidade
variaram de acordo com as condies dos ensaios. Nos controles abiticos (CPF-II,
CPF-III, CPFIV, CPF-VI, CPF-VII e CPF-VIII), mesmo ao final do tratamento, houve
morte da totalidade das minhocas, indicando a toxicidade do solo. Em contrapartida,
nos controles biticos (CPF-I e CPF-V) no foi evidenciada morte dos aneldeos, o
que representa que os compostos residuais, carreados do bioaumento, eram
atxicos ou se encontravam em concentraes no txicas.
De
um
modo
geral,
os
ensaios
realizados
com
solo
saturado
(aproximadamente 40% de umidade) apresentaram menor mortalidade das

minhocas
em
comparao
com
aqueles
conduzidos
com
solos
midos
(aproximadamente 20% de umidade). Nesse caso, destacam-se os ensaios PF-7 e

PF-8, para os quais no observada toxicidade para a espcie Eisenia fetida. Por
outro lado, nos ensaios com o solo mido (20% de umidade), no houve nenhuma
condio que resultasse em solo completamente atxico para as minhocas, sendo o
percentual de mortalidade mais baixo de 50% correspondente ao ensaio PF-3.
Considerando que os resultados referentes s concentraes de BHC e aos
teores de HTP no solo foram similares para ambos os percentuais de umidade
testados, embora a toxicidade dos solos aps tratamento tenha variado em funo
do teor de gua no solo pode-se presumir que, nos solos com 20 e 40% de umidade,
a degradao dos hidrocarbonetos ocorreu atravs de rotas metablicas distintas,
78
Ferreira, D.G.
com gerao de produtos qualitativa ou quantitativamente diversos, o que resultou

em diferentes nveis de toxicidade.
A Figura 18 mostra que a maior concentrao de microrganismos culmina na
maior remoo do contaminante, e que por sua vez resulta em menor toxicidade do
solo. Contudo, importante ressaltar que a toxicidade observada em alguns ensaios,
possivelmente, est relacionada mais com a gerao de produtos intermedirios
txicos do que com altas concentraes de HTP.
100
Mortalidade deMinhocas (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ensaios
Percentualdemortalidadedeminhocasaps30diasdetratamento
Figura 19 Percentual de mortalidade de minhocas nos ensaios do planejamento fatorial.
Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): PF-1 (0%;0ppm;20%); PF-2 (25%;0ppm;20%);
PF-3 (0%;50ppm;20%); PF-4 (25%;50ppm;20%); PF-5 (0%;0ppm;40%); PF-6 (25%;0ppm;40%); PF-7
(0%;50ppm;40%); PF-8 (25%;50ppm;40%); PF-9 (12,5%;25ppm;20%); PF-10 (12,5%;25ppm;20%);
PF-11 (12,5%;25ppm;40%); PF-12
(12,5%;25ppm;40%); CPF-I (Solo;Inculo;20%); CPF-II
(Solo;Gasolina;20%); CPF-III (Solo;Gasolina(25%);20%); CPF-IV (Solo;Gasolina(12,5%);20%); CPF-V

(Solo;Inculo;40%);
CPF-VI
CPF-VII
CPF-VIII
(Solo;Gasolina(12,5%);40%).
79
Ferreira, D.G.
Diferentemente da condio nutricional e da condio de umidade, o contedo

de etanol na gasolina novamente no teve qualquer efeito na toxicidade do solo
aps seu tratamento, o que sugere que o biocombustvel no interfere na toxicidade
do metabolismo de degradao da gasolina. Porm apenas uma anlise estatstica
pode revelar a significncia desse parmetro e seu efeito a partir das possveis
interaes.
4.2.1. Anlise Estatstica do Planejamento Fatorial

Em tratamentos de biorremediao, diversos fatores podem interferir, tanto
positiva quanto negativamente, na degradao dos contaminantes. O presente
trabalho se restringiu a avaliar apenas a condio de umidade, o percentual de
etanol adicionado gasolina e a concentrao de fsforo no solo atravs de trs
variveis de resposta que foram: teor residual de HTP no solo, a concentrao das
bactrias com potencial degradador; e toxicidade do solo minhoca vermelha
Eisenia fetida.
Os resultados obtidos para as variveis foram tratados estatisticamente com o
software Statistica 6.0, que permite a determinao da significncia dos fatores
estudados, bem como os seus efeitos e possveis interaes. E ainda, em alguns
casos, torna possvel a construo de um modelo matemtico para a estimao de
resultados dentro da faixa estudada (Calado & Montgomery, 2003). Mas, em geral, a
construo de modelos matemticos para estimar parmetros em processos
biolgicos pode no ser representativa, pois esses processos so sensveis a
variaes sutis nas condies ambientais, o que reduz a representatividade da
estimao de resultados a partir de uma base matemtica (Calado & Montgomery,
2003; Rodrigues & Iemma, 2005). Portanto, embora o software possa fornecer um
grande volume de informao, a anlise estatstica desse estudo ser restrita s
informaes inerentes a significncia e aos efeitos dos fatores. A significncia dos
fatores est diretamente atrelada ao intervalo de confiana usado. Nesse caso foi
escolhido um intervalo de confiana de 95%, que corresponde ao menor nvel em
que os dados so significativos em um teste de hiptese utilizando o teste t de
Student.
80
Ferreira, D.G.
A disposio dos dados estatsticos pode ser feita de inmeras formas, sendo o
diagrama de Pareto uma das representaes grficas mais completas, pois permite
a visualizao da significncia dos fatores e suas interaes, bem como os efeitos
desses fatores sobre as variveis de resposta. J a anlise das interaes entre os
fatores pode ser melhor analisada atravs do grfico das mdias, que permite
identificar o ponto em que a interao ocorre ou tende a ocorrer.
O diagrama de Pareto mostrando os efeitos da umidade, do percentual de
etanol adicionado gasolina e da concentrao de fsforo no solo, para a
biodegradao do contaminante em funo das variveis de resposta teor de HTP,
concentrao de BHC e toxicidade s minhocas pode ser observada nas Figuras 20,
21 e 22, respectivamente.
Nos grficos, uma linha pontilhada baseada no intervalo de confiana prdeterminado, indica o valor limite para a aceitao ou rejeio da hiptese nula, isto
, separa os fatores de acordo com a sua significncia estatstica. O valor positivo ou
negativo indica a significncia e o efeito do parmetro na varivel analisada, ou seja,
interfere no aumento ou na reduo, respectivamente.
Nota-se, na Figura 20, que a varivel que mais influenciou na remoo de HTP
foi a concentrao de fsforo, seguida pela umidade. Ambos os fatores atuaram
reduzindo a concentrao de HTP no solo e por isso, o valor atribudo a esses
fatores apresentado no grfico com o sinal negativo.
Em relao concentrao das bactrias hidrocarbonoclsticas, como mostra a
Figura 21, apenas a concentrao de fsforo no solo foi considerada significativa, e
inclusive o valor positivo atribudo a esse fator preconiza que a adio de nutrientes
estimula a atividade microbiana.
Diferentemente da anlise para o teor de HTP e para a populao de BHC, a
Figura 22 apresenta que para o teste de toxicidade com minhocas, alm da umidade
e da concentrao de fsforo, a interao desses dois fatores tambm foi
significativa. O sinal negativo das variveis, como anteriormente mencionado,
significa que para maiores valores dessas variveis h menor formao de
compostos txicos a partir da degradao da gasolina.
81
Ferreira, D.G.
Figura 20 Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas na remoo de HTP.
Figura 21 Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para o crescimento das
bactrias hidrocarbonoclsticas.
82
Ferreira, D.G.
Figura 22 Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas na mortalidade de

minhocas (Eisenia fetida).
O fator de interao entre a concentrao de fsforo e a condio de umidade

pode ser melhor analisado na Figura 23, que apresenta o grfico das mdias. Esse
tipo de grfico dispe os dados combinando os resultados dos pontos mnimos e
mximos de cada fator e traa uma reta interligando os pontos. A tendncia das
duas retas formadas permite estabelecer a existncia ou no de interao entre os
fatores. Assim, se as retas esto dispostas em paralelo indicativo que no haver
um ponto de congruncia, isto , no h interao entre os fatores. Por outro lado,
se as retas tendem a interseccionar em algum ponto, esse ponto determina uma
interao entre os fatores. Cabe ainda ressaltar que esse tipo de grfico indica a
tendncia a uma interao, porm a sua significncia determinada com base no
teste de hiptese do teste t de Student representado no diagrama de Pareto.
83
Ferreira, D.G.
Figura 23 Grfico das Mdias relacionando a mortalidade de minhocas e a concentrao

de fsforo, com base na umidade (mido-20%; saturado-40%).
Conforme ilustrado na Figura 23, as retas que representam os fatores tendem a

se encontrar no valor mnimo da concentrao de fsforo. Isso indica que a interao
entre esses fatores interfere de modo significativo na reduo do percentual de
mortalidade de minhocas nos ensaios onde o solo no sofreu bioestimulao.
Como previsto, o etanol no foi relevante do ponto de vista estatstico para
nenhuma das variveis de resposta, assim como a sua interao com os demais
fatores. Alm disso, a bioestimulao foi considerada a varivel mais significante
para o processo de biorremediao. J a significncia da umidade foi dependente da
resposta utilizada.
O
tratamento
estatstico
dos
resultados
obtidos
corrobora
valida
matematicamente os efeitos dos parmetros estudados sobre as variveis de

resposta no processo de biorremediao.
84
Ferreira, D.G.
4.3. Ensaio de Biorremediao em Colunas

Em geral, os estudos realizados apenas em laboratrio permitem avaliar a
viabilidade tcnica de um determinado tratamento biolgico. Nessa fase so
determinados, ajustados e controlados os parmetros significativos de modo a definir
as condies ideais de processo (Lima et al., 2002). Contudo, ao ser aplicado em
campo, nem sempre possvel alcanar os mesmos resultados visto que difcil
reproduzir as condies reais no laboratrio.
Por isso, algumas das condies definidas no item anterior (umidade e
concentrao de fsforo) com base na anlise estatstica, para a biorremediao de
Latossolo contaminado com gasolina, foram ensaiadas em condies mais prximas
as de campo. Nesses ensaios tambm foi testada a presena de etanol, embora no
tenha sido comprovado qualquer efeito do etanol no consumo microbiano dos
hidrocarbonetos da gasolina, uma vez que esse composto qumico j foi descrito
pela sua atuao como facilitador na solubilizao de hidrocarbonetos em gua, o
que pode vir a agravar a contaminao do ambiente (Corseuil & Moreno, 2001;
Lovanh, Hunt & Alvarez, 2002; Corseuil, Kaipper & Fernandes, 2004; Malamud et al.,
2005; Silva & Alvarez, 2004; Mackay, et al., 2006; Gusmo et al., 2006).
Para a conduo dos experimentos, o solo foi umedecido com 20% de gua,
embora a anlise estatstica tenha indicado que a biodegradao da gasolina mais
eficiente em solo saturado. Tal procedimento justificado pela baixa permeabilidade
do solo quando na coluna, conforme ilustrado na Figura 9. Portanto, nos ensaios
conduzidos em colunas de 60 cm de altura foram reproduzidas as condies
descritas no Quadro 7.
Nesses ensaios, a contaminao foi feia na mesma concentrao usada nos
ensaios de biorremediao em microcosmos (10% m/m). E, assim como nos ensaios
anteriores, a perda abitica do combustvel foi determinada pela anlise da
concentrao de HTP no incio e ao final de 60 dias nos ensaios controle. Nessa
etapa dos ensaios a perda abitica foi menor que nos ensaios anteriores
(aproximadamente 50%), provavelmente por volatilizao. Esse percentual foi
inferior ao determinado nos ensaios preliminares, tal fato provavelmente est
85
Ferreira, D.G.
relacionado percolao e ao acmulo do contaminante ao no fundo do sistema o

que reduziu a volatilizao dos hidrocarbonetos da gasolina.
As Figuras 24 a 27 apresentam o perfil de distribuio do contaminante ao
longo do tempo e da clula de ensaio em 4 diferentes profundidades para os ensaios
EB-1, EB-2, EB-3 e EB-4.
Analisando a Figura 24, nota-se que nos primeiros 7 dias do ensaio EB-1 a
maior concentrao de HTP se encontrava na superfcie. Mas, com o decorrer do
tempo, houve migrao dos hidrocarbonetos, resultando no seu acumulo na parte
mais inferior da coluna. A anlise da concentrao total de HTP ao longo do tempo
indica que a remoo biolgica do contaminante foi muito pequena.
De modo distinto, o ensaio EB-2 apresentou outro perfil de distribuio (Figura
25), que sugere que o contaminante tenha percolado mais rapidamente, j que com
7 dias foi detectada a maior concentrao de HTP na profundidade de 35 cm. Mas,
analogamente ao ensaio EB-1, nessa condio a taxa de biodegradao foi baixa.
Note-se que embora as concentraes residuais de HTP nos solos desses dois
ensaios (EB-1 e EB-2) tenham sido inferiores a 50.000 mg/kg, a concentrao final
detectada no ensaio EB-2 superou em mais de 4.000 mg/kg a verificada no ensaio
EB-1. As altas concentraes de HTP detectadas nesse ensaio podem estar
relacionadas limitao nutricional do solo, dificultando a biodegradao.
Os ensaios EB-3 e EB-4 apresentaram o mesmo perfil de degradao do
contaminante, havendo acmulo de hidrocarbonetos na parte mais profunda da
coluna desde os primeiros 7 dias (Figuras 26 e 27). Alm disso, nessas condies
houve um consumo de mais de 30.000 mg/kg de HTP, o que sugere que, nesses
ensaios (EB-3 e EB-4) o consumo do contaminante pelos microrganismos tenha sido
mais rpido, quando comparado aos ensaios EB-1 e EB-2.
Diferentemente dos ensaios EB-1 e EB-2, os ensaios EB-3 e EB-4 foram
bioestimulados, e possivelmente essa foi a causa do maior consumo de HTP, j que
nos ensaios EB-3 e EB-4 detectou-se, ao final, cerca de 15.000 mg/kg, contra uma
mdia de 46.000 mg/kg nos ensaios EB-1 e EB-2.
86
Ferreira, D.G.
As Figuras 24, 25, 26 e 27 apresentam diferenas grandes entre as ordens de

grandeza dos valores reais obtidos nas anlises, por isso seus resultados foram
plotados na forma de logaritmo de base 10. Entretanto, a fim de facilitar a anlise, os
valores reais, respectivamente, esto expressos em mg/kg em cada barra presente
nos grficos.
Figura 24 Teor de HTP no ensaio EB-1 em diferentes profundidades ao longo de 60 dias.

Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): 0%;0ppm;20%.

Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): 25%;0ppm;20%.
87
Ferreira, D.G.
Figura 26 Teor de HTP no ensaio EB-3 diferentes profundidades ao longo de 60 dias.

Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): 0%;50ppm;20%

Condies do ensaio (%etanol; [P]; % de umidade): 25%;50ppm;20%
88
Ferreira, D.G.
Aparentemente, a presena de etanol no contaminante (ensaios EB-2 e EB-4)

no interferiu na degradao de hidrocarbonetos da gasolina, mas acelerou sua
percolao atravs da coluna de solo. Ao passo que, a variao da concentrao de
HTP, evidenciada ao longo da coluna, pode estar relacionada tanto percolao do
contaminante, quanto sua degradao pelos microrganismos.
As Figuras 28 a 33 apresentam os perfis de distribuio das bactrias
hidrocarbonoclsticas pra os controles CEB-I e CEB-II, e ensaios EB-1, EB-2, EB-3 e
EB-4, respectivamente. Nos diferentes ensaios, inicialmente, foi detectado um valor
mdio inicial de 104 NMP/g de solo, porm ao longo do ensaio a concentrao
celular variou em funo tanto da condio e quanto do ponto de amostragem,
inclusive podendo atingir concentraes iguais ou superiores a 1012 NMP/g de solo.
importante ressaltar que a tcnica do NMP um mtodo estatstico, baseado
em clculos de probabilidade, que estima a populao de bactrias cultivveis
dentro do um intervalo de confiana (ISSC, 2008). Sendo assim so feitas no
mximo 10 diluies, podendo expressar o resultado em at 1012 NMP/g, os valores
superiores a esse limite so expressos como >1012 NMP/g, evitando a extrapolao
dos resultados o que pode resultar no fornecimento de resultados errneos (ISSC,
2008).
Na Figura 28 pode-se observar que a populao de BHC, em solo livre de
contaminao e sem a adio de nutrientes, aumentou ao longo do tempo, com
variaes em funo da profundidade, atingindo valores superiores a 1012NMP/g de
solo a partir do 21 dia. Esse aumento pode ser atribudo ao consumo da matria
orgnica advinda do bioaumento e aos ajustes de pH e umidade.
Nesse ensaio a atividade dessa populao microbiana foi similar na faixa de
profundidade entre 15 e 45 cm durante os 28 primeiros dias. No entanto, nos sete
dias subseqentes, as populaes das zonas mais superficiais foram mais ativas, e
atingiram a concentrao mxima detectada.
89
Ferreira, D.G.
Figura 28 Variao da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas no controle CEB-I em

diferentes profundidades de solo ao longo do tempo. Condies de ensaio: solo+ inculo.
No caso do controle CEB-II (Figura 29), a populao de BHC rapidamente

atinge seu valor mximo, que permanece inalterada at o fim do perodo de ensaio.
Logo, a adio de fertilizante incentivou o metabolismo microbiano intensificando o
crescimento dos microrganismos. Tal evidencia consolida a importncia da adio
de nutrientes nesse caso.
A evoluo da populao de BHC para os ensaios EB-1 e EB-2 variou de
acordo com a profundidade e o contaminante, isto , gasolina sem e com adio de
25% de etanol, respectivamente (Figuras 30 e 31). A anlise comparativa das figuras
mostra que a adio de etanol gasolina resultou em alteraes na atividade das
bactrias hidrocarbonoclsticas.
90
Ferreira, D.G.
Figura 29 Variao da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas no controle CEB-II em diferentes

profundidades de solo ao longo do tempo. Condies de ensaio: solo + inculo + fertilizante
Figura 30 Variao da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas no ensaio EB-1 em diferentes

profundidades de solo ao longo do tempo. Condies de ensaio: solo + inculo + gasolina.
91
Ferreira, D.G.
No caso do ensaio EB-1 (Figura 30), o contaminante interferiu de modo

diferenciado ao longo da coluna. possvel que esse efeito seja devido ao acmulo
de hidrocarbonetos volteis em diferentes regies, provocando a reduo da
populao de bactrias hidrocarbonoclsticas. A atividade de BHC foi mais intensa
na superfcie e em 25 e 35 cm de profundidade, onde atingiu o limite de deteco
aos 42, 49 e 56 dias, respectivamente. Todavia, para 15, 45 e 55 cm de
profundidade, no foi excedido o limite de deteco em nenhum momento. Pelo
contrrio, as populaes nessas zonas aps aumentar de 3 a 4 ordens de grandeza,
mantiveram-se nesse patamar durante todo o tempo.
Quando o solo foi contaminado com a gasolina adicionada de 25% de etanol
(ensaio EB-2), conforme ilustrado na Figura 31 foi observado um perfil bem diferente
ao do EB-1.
Figura 31 Variao da populao de bactrias hidrocarbonoclsticas no ensaio EB-2 em

diferentes profundidades de solo ao longo do tempo. Condies de ensaio: solo + inculo +
gasolina (25% de etanol).
92
Ferreira, D.G.
Na primeira metade do tempo, se evidencia claramente dois grupos distintos.

Nas zonas mais superficiais, at 25 cm, as BHC sofreram mais efeitos txicos que
nos pontos de maior profundidade. Esse comportamento, possivelmente, se deve ao
aumento da solubilidade dos hidrocarbonetos em gua, cuja degradao criou uma
atmosfera com mais hidrocarbonetos volteis que atuaram negativamente sobre a
populao bacteriana (Corseuil et al., 1996; Corseuil & Fernades, 1999). Por outro
lado, a presena do etanol permitiu que nos pontos de coleta mais profundos a
populao
de
BHC
se
desenvolvesse
mais,
provavelmente
pela
maior
disponibilidade de fontes de carbono.

A partir do 28 dia, no foi mais possvel distinguir variao no comportamento
das BHC nas diferentes regies da coluna. Inclusive, h um aumento das
populaes de BHC nos pontos de coleta que no perodo anterior foram mais
afetadas, atingindo o limite de deteco a partir do 49 dia de ensaio.
J para os pontos de profundidade de 15 cm em diante, a exceo da zona de
maior profundidade, houve uma queda da concentrao de BHC. No caso da
amostragem feita em 35 cm, o decaimento foi de aproximadamente 3 ordens de
grandeza e, posteriormente, a populao se manteve nesse patamar.
Em relao ao ensaio EB-3, a Figura 32 mostra que a atividade microbiana no
solo contaminado, quando aplicado o bioestmulo, provocou uma ligeira queda da
populao de BHC nos perodos iniciais. Esse efeito indica que, diferentemente dos
ensaios no bioestimulados, a fase de adaptao dos microrganismos ao
contaminante foi mais extensa, perdurando por cerca de 20 dias. Nesse ponto, o
crescimento da populao de BHC retomado, ultrapassando o limite de deteco a
partir do 42 dia, em funo do local de amostragem.
Exceto na zona superficial do solo, a evoluo do crescimento das BHC foi
semelhante nas vrias profundidades quando feito o bioestmulo. Na superfcie, a
populao de BHC atingiu o seu mximo mais rapidamente, embora logo aps tenha
se seguido uma queda. Essa variao pode estar relacionada maior
disponibilidade de um determinado composto que, uma vez consumido, permite que
a populao volte ao equilbrio.
93
Ferreira, D.G.

gasolina + fertilizante.
Pela anlise da Figura 33, pode-se observar que o perfil da variao

populacional referente ao ensaio EB-4 foi semelhante ao do ensaio EB-3 (Figura 32).
No entanto, a presena de etanol acentuou a queda populacional que ocorre nos
primeiros 15 dias. E, dessa vez, a atividade na superfcie no foi diferenciada.
Ademais, o etanol tambm retardou a biodegradao da gasolina nos pontos de
maior profundidade.
A anlise comparativa dos resultados de concentrao de HTP sugere que a
biorremediao foi mais efetiva nos ensaios bioestimulados, uma vez que esses
apresentaram as menores concentraes de HTP residual. Por outro lado, o etanol
teve efeitos diferenciados, dependendo do caso. Sem o bioestmulo, a adio de
etanol gasolina incentivou o crescimento das BHC que atingiu o valor mximo em
94
Ferreira, D.G.
um menor intervalo de tempo (ensaio EB-2), enquanto em associao ao

bioestmulo acentuou a reduo populacional na fase de adaptao (ensaio EB-4).

gasolina (25% etanol) + fertilizante.
A presena do etanol na gasolina no afetou a biodegradao da gasolina,

uma vez que os valores de HTP residuais foram muito semelhantes entre os ensaios
EB-1/EB-2 e EB-3/EB-4. Entretanto, o etanol intensificou a difuso do contaminante
verticalmente no solo.
Outros trabalhos na literatura verificaram que a gasolina adicionada de lcool
tem uma maior velocidade de difuso, criando uma maior pluma de contaminao
(Corseuil & Fernandes, 1999; Corseuil, Kaipper & Fernandes, 2004; Mackay, et al.,
2006).
95
Ferreira, D.G.
Na presena de etanol, no houve variao da concentrao de BHC em

funo da profundidade, desde a superfcie at 60 cm abaixo. Em geral, ao final de
60 dias, foram atingidos os valores mximos de deteco pela tcnica NMP nos
diferentes nveis. Ao contrrio, Fierrer e colaboradores (2003) verificaram uma
reduo superior a 50% na concentrao de bactrias em nveis de mais de 50 cm
de profundidade em solo natural. Essa discordncia pode ser explicada pela
homogeneidade do solo nas colunas, diferentemente do que ocorre em solos
naturais.
Destaca-se a distino para a remoo do contaminante entre o processo de
biorremediao realizado nos ensaios preliminares daqueles conduzido em colunas.
J os efeitos do etanol e do bioestmulo foram os mesmos, apesar da interferncia
negativa do lcool no crescimento inicial das bactrias hidrocarbonoclsticas no
ensaio bioestimulado.
sterreicher-Cunha e colaboradores (2004) corroboram que a contaminao
do solo com gasolina aditivada tem efeito inibitrio, reduzindo a populao de
bactrias em duas ordens de grandeza, enquanto que pela contaminao apenas
com gasolina, a populao se mantm inalterada.
Embora nos ensaios tenha ocorrido a reduo da concentrao de HTP,
principalmente nos ensaios EB-3 e EB-4, em nenhum deles essa concentrao
atingiu nveis inferiores a 5000 ppm. Logo, no pode-se considerar o tratamento
concludo, com base na legislao holandesa (CETESB, 1999; CETESB, 2001), o
que implicaria em prolongamento do tempo de tratamento ou a adoo de outras
medidas a serem estudadas. Deve ainda ser considerado os valores de BTEX no
determinados nesse estudo.
4.4. Isolamento e Identificao de Microrganismos

A presena de microrganismos em solos, como discutido anteriormente,
ampla e diversa. Todavia, o isolamento de microrganismos provenientes dessas
amostras nem sempre pode ser realizado. Um dos maiores desafios no isolamento
microbiano o cultivo das espcies in vitro, quer pela incompatibilidade metablica,
96
Ferreira, D.G.
quer pela diferena entre as condies ambientais do cultivo em laboratrio e as do

ecossistema natural, que envolvem vrias interaes entre os microrganismos (Hill
et al., 2000; Okamoto, Izawa & Yanase, 2003).
Adicionalmente,
contaminao
no
ambiente
provoca
alteraes na
microbiota, inativando ou inibindo algumas espcies, ou estimulando mutaes ou o

crescimento de outras. Logo, atua na biodiversidade microbiana do ecossistema,
restrito apenas as espcies tolerantes ao contaminante (Thompson et al., 1998).
Nesse estudo foram isoladas cinco espcies das quais trs a partir de amostras
do solo in natura e duas a partir dos ensaios de biorremediao em coluna,
independente da condio estudada. Ao longo do perodo de ensaios foram feitas
diversas tentativas de isolar mais espcies, no entanto, com o meio de cultura
utilizado s foi possvel o isolamento dessas cinco culturas microbianas.
Cabe ressaltar que apesar de s ter sido possvel cultivar e isolar trs culturas
microbianas a partir do solo in natura no significa que essas sejam as nicas
espcies presentes. Uma alternativa para o conhecimento dos microrganismos
desse ecossistema seria a aplicao de mtodos moleculares de estudo da
diversidade (Hill et al., 2000; Kirk et al., 2004; Leckie, 2005; Liu et al., 2006).
As trs diferentes espcies isoladas a partir de vrias amostragens do solo
argiloso, cujas morfologias macroscpicas so mostradas no Quadro 12, foram:
Staphylococcus saprophyticus, Bacillus megaterium, e Arthrobacter sp., o qual s foi
possvel classificar at o nvel de gnero. Normalmente, as espcies do gnero
Arthrobacter so de difcil identificao, devido semelhana gentica e
versatilidade seja metablica seja estrutural. Portanto, a sua identificao por
sequenciamento envolve procedimentos mais especficos, os quais no foram
possveis de realizar nesse trabalho (Comi, Cantoni & Cocolin, 2004; Hanbo et al.,
2004).
As trs espcies isoladas do solo utilizado nesse estudo so comumente
encontradas em amostras de solo e, inclusive j foram descritas pelo seu potencial
para a degradao de compostos xenobiticos (Ilhan et al., 2004; Getenga et al.,
2009; Lian et al., 2010; Oyeyola, 2010).
97
Ferreira, D.G.
Quadro 12 Bactrias isoladas do solo in natura e de amostras dos ensaios de

biorremediao
Origem
Solo
Solo
Ilustrao da Colnia
Identificao
Arthrobacter sp.
(99% de similaridade)
Staphylococcus saprophyticus
Solo
Bacillus megaterium
Ensaio
Pseudomonas aeruginosa
Ensaio
Pseudomonas putida
98
Ferreira, D.G.
O gnero Arthrobacter engloba grande parte das espcies bacterianas

cultivveis obtidas do solo. Essas bactrias caracterizam-se pela capacidade de
modificar sua composio e estrutura celular em resposta aos estmulos ambientais.
Como j mencionado, as espcies desse gnero possuem grande versatilidade
metablica, atuando na decomposio de fontes de carbono complexas, inclusive
compostos xenobiticos como, por exemplo, os pesticidas p-nitrofenol (PNP) e
antrazina. Alm da degradao de compostos recalcitrantes, algumas espcies
desse gnero so capazes de reduzir os ons de cromo at formas menos txicas
(Labana et al., 2005; Getenga et al., 2009).
Assim como as espcies do gnero Arthrobacter, a espcie Bacillus
megaterium tambm apresenta uma srie de genes importantes para a
biorremediao (Vary et al., 2007). Dentre as habilidades dessa espcie esto a
degradao de hidrocarbonetos poliaromticos (HPA), reduo de ons cromo at
formas menos txicas e resistncia a metais pesados (Huang et al., 1999; McGrath
& Singleton, 2000; Carmichael & Wong, 2001; Cheung & Gu, 2005; Cheung, Lai &
Gu, 2006). No entanto, o maior destaque atribudo a essa espcie est relacionado
ao seu potencial como promotor de crescimento vegetal. Nesse caso, o estmulo se
d pela simbiose com outras espcies microbianas, atravs da solubilizao de ons,
e no controle biolgico (Pereira et al., 2008; Oyeyola, 2010).
A espcie Staphylococcus saprophyticus tambm uma integrante tpica da
microbiota do solo e possui potencial para a degradao de contaminantes qumicos
(Ilhan et al., 2004; Carvalho et al., 2009; Oyeyola, 2010). Essa espcie bacteriana j
foi descrita pela sua capacidade de degradao de derivados do petrleo, com
reduo considervel da concentrao de leo diesel no solo, bem como pela
reduo do efeito txico do contaminante no solo (Carvalho et al., 2009). Alm disso,
Carvalho (2006) descreve a ao de S. saprophyticus, associado quitosana, como
uma excelente combinao para a remoo de metais trao e petrleo a partir de
efluentes.
Embora essas espcies apresentem potencial para a biorremediao de solos
contaminados com hidrocarbonetos de petrleo, nenhuma delas foi isolada dos solos
dos ensaios submetidos s diferentes condies de tratamento. Possivelmente isso
se deve a uma alterao na dinmica da comunidade microbiana provocada pela
99
Ferreira, D.G.
contaminao, o que favoreceu o desenvolvimento de outras espcies mais

adaptadas e mais tolerantes ao contaminante.
As modificaes na comunidade microbiana so comuns sempre que h
alguma alterao nas condies ambientais (Kozdrj & Elsas, 2001-A; Moreira &
Siqueira, 2006). Nesse caso, as duas espcies cultivveis, isoladas das amostras
coletadas dos ensaios, pertenciam ao gnero Pseudomonas.
Esse gnero amplamente descrito no que concerne a degradao de petrleo
e seus derivados (Raghavan & Vivekanandan, 1999; Iwamoto & Nasu, 2001;
Rahman et al., 2002; Ron & Rosenberg, 2002; Chaerun et al., 2004; Das &
Mukherjee, 2007; Cameotra & Singh, 2008; Miguel et al., 2009; Karamalidis et al.,
2010; Singh & Fulekar, 2010). Sendo as espcies P. aeruginosa e a P. putida,
isoladas a partir dos ensaios, as mais descritas para essa finalidade.
A habilidade dessas espcies em degradar esses compostos est relacionada,
principalmente, versatilidade metablica para o uso de diferentes fontes de
carbono. Embora a produo de molculas biossurfatantes e bioemulsificantes
tambm induza a degradao qumica desses hidrocarbonetos (Mattick, Whitchunch
& Alm, 1996; Loh & Cao, 2008). As caractersticas de catabolismo e anabolismo que
permitem a degradao desses compostos xenobiticos, permitem que essas
espcies degradem at mesmo os hidrocarbonetos volteis (BTEX), que so
considerados os mais txicos tanto para espcies microbianas quanto para animais
(Shim & Yang, 1999; Lin, Cheng & Tsai, 2007).
As espcies de Pseudomonas tambm so comuns em solos no
contaminados, no entanto, nesse estudo, elas s foram detectadas depois de
ocorrida a contaminao. A introduo da gasolina, provavelmente reduziu as
demais populaes, e dada as suas habilidades, essas espcies puderam se
desenvolver at se tornarem predominantes e serem as nicas espcies cultivveis
a serem detectadas.
O isolamento de apenas duas espcies no significa que apenas elas tenham
sido as responsveis pela degradao. Outras bactrias com capacidade de
degradar hidrocarbonetos da gasolina sejam elas cultivveis ou no tambm deviam
estar presentes, contudo em funo da sua concentrao no momento da
amostragem no foi possvel a sua deteco.
100
Ferreira, D.G.
Concluses
5. CONCLUSES
Neste estudo foi demonstrada a presena de microrganismos reconhecidamente
degradadores de hidrocarbonetos de petrleo (HTP) em solo sem histrico de
contaminao. Contudo, a remoo da gasolina s foi efetiva quando realizado o
bioaumento com microrganismos, oriundos do prprio solo, metabolicamente
ativos e previamente adaptados ao contaminante;
O melhoramento das condies nutricionais do solo, pela bioestimulao com
fonte de fsforo, foi fundamental para a obteno de maiores ndices de remoo
do contaminante;
As concentraes de bactrias heterotrficas totais cultivveis e bactrias
hidrocarbonoclsticas, bem como a concentrao residual de hidrocarbonetos no
solo variou de acordo com o teor de umidade (20 e 40%) e com a condio
nutricional do solo (sem e com fertilizante), independentemente do teor de etanol
(0 a 25%);
A anlise estatstica do processo de biorremediao indica que a concentrao de
nutrientes um fator significativo pra a realizao do processo, enquanto que o
etanol no pode ser considerado como um fator significativo, embora possa afetar
a degradao microbiana dos hidrocarbonetos da gasolina;
A anlise ecotxica do solo tratado, atravs de ensaios com aneldeos da espcie
Eisenia fetida, foi importante para estabelecer a toxicidade dos compostos
residuais no solo, mesmo quando a concentrao de hidrocarbonetos totais de
petrleo (HTP) estava abaixo do limite aceitvel pela legislao;
A anlise comparativa da biorremediao da gasolina em solo em diferentes
escalas demonstrou a importncia de se avaliar o processo simulando as
condies mais prximas das de campo;
101
Ferreira, D.G.
Concluses
Independente da escala, o bioaumento foi fundamental para obter a reduo da

concentrao de gasolina no solo. Em maior escala, mesmo na presena
qualitativa e quantitativa de microrganismos degradadores, a reduo do teor de
hidrocarbonetos do petrleo at nveis aceitveis depende de um maior perodo de
tratamento;
A umidade um fator que influencia na percolao da gasolina pelo solo; sem
ajuste de umidade, o Latossolo absorve superficialmente todo o contaminante
impedindo a sua percolao;
O Latossolo saturado (40% de umidade) tem a sua permeabilidade reduzida,
impedindo que o contaminante penetre atravs do solo;
O solo com cerca de 20% de umidade permite a percolao da gasolina por 60
cm, o que, possivelmente, no meio ambiente, resultaria em uma contaminao
mais profunda podendo atingir as guas subterrneas;
O etanol interfere na distribuio vertical da gasolina no solo, uma vez que permite
que o contaminante aditivado atinja maiores profundidades em um intervalo de
tempo menor comparativamente a gasolina no aditivada;
A avaliao da biorremediao em diferentes profundidades mostrou que a
bioestimulao
promove
um
crescimento
constante
das
bactrias
hidrocarbonoclsticas ao longo do tempo, com um perfil bem delineado. Enquanto

que na condio nutricional natural do solo a concentrao celular varia de acordo
com a profundidade e com o tempo;
Independente da escala em que a biorremediao foi estudada, os melhores
resultados foram obtidos quando o solo foi bioestimulado com 50 mg/kg de
fertilizante N:P:K (4:14:8), independente da concentrao de etanol (0 a 25%)
presente na gasolina;
O processo de biorremediao pode ser utilizado como uma alternativa para o
tratamento de reas contaminadas com gasolina. No entanto, o tempo necessrio
102
Ferreira, D.G.
Concluses
para reduzir a concentrao do contaminante at nveis aceitveis determinado

pela proporo da contaminao no ecossistema e das condies ambientais do
mesmo;
O solo sem histrico de contaminao por combustveis fsseis e derivados
podem apresentar bactrias com potencial de degradao de hidrocarbonetos de
petrleo, como Arthrobacter sp., Staphylococcus saprophyticus e Bacillus
megaterium;
A introduo, artificial, do contaminante reduz a concentrao de microrganismos
no solo e seleciona as populaes com mecanismos de sobrevivncia eficientes e
com potencial de degradao do contaminante;
Os microrganismos, aps a contaminao, se adaptam a nova condio e iniciam
a fase desenvolvimento tendendo a aumentar o tamanho da populao de
bactrias potencialmente degradadoras;
103
Ferreira, D.G.
Referncias Bibliogrficas
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Acosta-Martnez, V.; Cruz, L.; Sotomayor-Ramirez, D.; Prez-Alegra. 2007. Enzyme activities as affected by soil
properties and land use in a tropical watershed. Applied Soil Ecology, 35(1):35-45.
Adesina, M.F.; Lembke, A.; Costa, R.; Speksnijder, A.; Smalla, K. 2007. Screening of bacterial isolates from
various European soils for in vitro antagonistic activity towards Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum: Sitedependent composition and diversity revealed. Soil Biology and Biochemistry, 39(11): 2818-2828.
Alexander, M. 1999. Biodegradation and Bioremediation. Califrnia Academic Press Inc. 543p.
Alvarez, H.M. 2003. Relationship between -oxidation pathway and hydrocarbon-degrading profile in
actinomycetes bacteria. International Biodeterioration and Biodegradation, 52(1):35-42.
Amadi, A., Dickson, A.; Maate, G.O. 1993. Remediation of oil polluted soils: 1.Effect of organic and inorganic
nutrient supplements on the performance of maize (Zea may L.). Water Air Soil Pollution, 66:5976.
Altschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E. W. & Lipman, D. 1990. Basic Local Alignment Search Tool. Journal
of Molecular Biology, 215:403-410.
Amaral, S.; Leinz, V. 2001. Geologia Geral. 14 ed. Ed. Nacional, SP. 397p.
Agncia Nacional e Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis. 2008. Anurio Estatstico Brasileiro de Petrleo,
Gs Natural e Biocombustveis de 2008. Disponvel em: http://www.anp.gov.br/conheca/anuario_2008.asp.
Arajo, T.A.; Aguiar, C.R. Cardoso, V.L.; Camporese, E.F.S. 2005. Avaliao de uma cultura mista enriquecida
com bactrias redutoras de sulfato em efluente contendo leo diesel. Anais do VI Congresso Brasileiro de
Engenharia Qumica em Iniciao Cientfica.
ASTM. 1995. Standard Guide for riskbased corrective action applied at petroleum release sites. E173995.
Atlas, R.M. 1981. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: na environmental perspective. Microbial
Reviews, 45(1): 180-209.
Azambuja, M.A.E. DE. 1970. Intemperismo, Origem e Formao dos Solos. Ed CEUE, RS. 96p.
Balba, M.T.; Al-Awadhi, N. & Al-Daher, R. 1998. Biorremediation of oil-contamined soil: microbiological methods
for feasibility assessment and filde evaluation. Journal of Microbiological Methods, 32:155-164.
Baldwin, B.R.; Nakatsu, C.H.; Nies, L. 2007. Enumeration of aromatic oxygenase genes evaluate monitored
natural attenuation at gasoline-contamined sites. Water Research, article in press.
Banerjee, S.; Yalkowsky, S.H. 1988. Cosolvent-induced solubilization of hydrophobic compounds into water.
Analitical Chemistry, 60:2153-2155.
Banerji, S.K.; Zappi, M.E.; Teeter, C.L.; Gunninson, D.; Cullinane, M.J. & Morgan, R.T. 1995.
BANERJI, S. K.; ZAPPI, M. E.; TEETER, GUNNISON, D.; CULLINANE, M. Bioremediation of soils
contaminated with petroleum hydrocarbons using bioslurry rectors. U.S. Army Corps of Engineers,
Washington, DC, 61p.
Baptista, S.J. 2003. Seleo das Melhores Condies de Biodegradao de Petrleo em Solo Argiloso.
Dissertao (Processamento, Gesto e Meio Ambiente na Indstria do Petrleo e Gs Natural). Escola de
Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
104
Ferreira, D.G.
Baptista, S.J.; Camporese, E.F.S.; Freire, D.D. 2006. Evaluation of Biostimulation, Bioaugmentation and Use of
Biosurfactant as treatment Tecnique of Clay Soil Contamined with Diesel Oil. Environmental Engineering and
Management Journal, 6(6): 1325-1332.
Baptista, S.J. 2007. Avaliao do emprego de biossurfactante na biorremediao de solos contaminados com
leo diesel. Tese (Doutorado em Tecnologia dos Processos Qumicos e Bioqumicos). Escola de Qumica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Barbaro, J.R.; Barker, J.F. 2000. Controled field study on the use of nitrate and oxygen for bioremediation of
gasoline source zone. Bioremediation Journal, 4(4):259-270.
Barros-Neto, B.; Scarminio, I.S.; Burns, R.E. 2007. Como fazer experimentos. Editora Unicamp. 3 ed. Campinas,
SP. 480p.
Bardi, L.; Mattei, A. Scarminio, I.S.; Steffan, S. & Marzona, M. 2000. Hydrocarbon degradation by a soil microbial
population with b-cyclodextrin as surfactant to enhance bioavailability. Enzyme and Microbial Technology, 27: 709713
Bento, F.M.; Camargo, F.A.O.; Okeke, B.C.; Frankenberger, W.T. 2005. Diversity of biosurfactant producing
microrganisms isolated from soils contamined with diesel oil. Microbiological Research, 160(3): 249-255.
Biotton, G. & Koopman, B. 1991. Bacterial and enzymatic bioassays for toxicity testing in the environment.
Environment, Contamination and Toxicology, 125:1-22.
Brunkem, G.S.; Szarfac, S.C. 1999. Ferro: Metabolismo, Excesso, Toxicidade e Recomendaes. Cadernos de
Nutrio, 18:23-34.
Calado, V.; Montgomery, D.C. 2003. Planejamento de Experimentos utilizando o Statistica. E-papers Servios
Editoriais LTDA.
Caldwell, B.A. 2005. Enzyme Activities as a Component of Soil Biodiversity: A Review. Pedobiologia, 49: 637-644.
Carmichael, A.B. & Wong, L.L. 2001. Protein engineering of Bacillus megaterium CYP102. European Jurnal of
Biochemistry, 268(10): 3117-3125.
Carvalho, I.; Villela, A.; Gomes, G.; Maciel, J.; Melo, B. & Sousa, M.F. 2009. Avaliao da toxicidade do leo
diesel degradado por Staphylococcus saprophyticus e Candida albicans. IX Jornada de Ensino, Pesquisa e
Extenso (JEPEX-2009). Recife, UFRPE.
Carvalho, T.V. 2006. Biomateriais a base de quitosana de camaro e bactrias para a remoo de metais trao e
petrleo. Dissertao (Mestrado em Cincias Marinhas Tropicais). Instituto de Cincias do Mar, Universidade
Federal do Cear. 98 f.
Centro Nacional de Pesquisa de Solos EMBRAPA. 1999. Sistema Brasileiro de Pesquisa de Solos. EMBRAPA
Solos, 412p.
Chaineau, C.H., Morel, J.L.; Outdot, J. 1997. Phytotoxicity and plant uptake of fuel oil hydrocarbons. Journal of
Environmental Quality, 6: 1478-1483.
Chen, J.; Blume, H.P.; Beyer, L. 2000. Weathering of rocks induced by lichen colonization a review. Catena, 39:
121-146.
Cheung, K.H. & Gu, J.D. 2005. Chromate reduction by Bacillus megaterium TKW3 isolated from marine
sediments. World Journal of Microbiologicy and Biotechnology, 21(3): 213-219.
Cheung, K.H.; Lai, H.Y. & Gu, J.D. 2006. Membrane-Associated Hexavalent Chromium Reductase of Bacillus
megaterium TKW3 with Induced Expression. Journal of Microbiology and Biotechnology, 16(6): 855-862.
105
Ferreira, D.G.
Chew, I.; Obbard, J.P.; Stanforth, R.R. 2001. Microbial cellulose decomposition in soils from a rifle range
contaminated with heavy metals. Environmental Pollution, 111(3): 367-375.
Christopher, J.; Patel, M.B.; Basu, S.A. 2001. Determination of sulphur in trace levels in petroleum products by
wavelength-dispersive X-ray fluorescence spectroscopy. Fuel, 80(13):1975-1979.
CIMA - Conselho Interministerial do Acar e do lcool n. 37, de 27 de junho de 2007, publicada no Dirio Oficial
da Unio em 28 de junho de 2007. Consulta: 22/12/2009. Disponvel em: http://extranet.agricultura.gov.br.
Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental CETESB (So Paulo-SP). 1999. Lista holandesa de
valores de qualidade do solo e da gua subterrnea Valores STI. Disponvel em:
http://www.cetesb.sp.gov.br/Solo. Acessado em: 05/02/2010.
Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental CETESB (So Paulo-SP). 2001. Relatrio de

estabelecimento de valores orientadores para solos e guas subterrneas no estado de So Paulo. Disponvel
em: www.relasc.org. Acessado em: 05/02/2010.
Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental CETESB (So Paulo-SP). 2005. Relatrio de atendimento
a acidentes ambientais em postos e sistemas retalhistas de combustveis 1984 a 2004. Disponvel em:
http://www.cetesb.sp.gov.br/emergencia. Acessado em: 20/12/2009.
Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental CETESB (So Paulo-SP). 2006. Relao de reas
contaminadas no estado de So Paulo. Disponvel em: http://www.cetesb.sp.gov.br/solo. Acessado em:
20/12/2009.
Comi, G.; Cantoni, C. & Cocolin, L. 2004. Artobacter spp. Ecyclopedia of Dairy Science, 111-116p.
Conselho Nacional do Meio Ambiente CONAMA. Resoluo n 237 de 19 de dezembro de 1997. Disponvel on
line: http://www.mma.gov.br/port/conama. Acessado em: 28/01/2010.
Conselho Nacional do Meio Ambiente CONAMA. Resoluo n 357 de 17 de maro de 2005. Disponvel on line:
http://www.mma.gov.br/port/conama. Acessado em: 28/01/2010.
Conselho Nacional do Meio Ambiente CONAMA. Resoluo n 314 de 29 de outubro de 2002. Disponvel on
line: http://www.mma.gov.br/port/conama. Acessado em: 28/01/2010.
Contreras-Ramos, S.M.; lvarez-Bernal, D.; Dendooven, L. 2009. Characteristics of earthworms (Eisenia fetida) in
PAHs contaminated soil amended with sewage sludge or vermicompost. Applied Soil Ecology, 41(3):269-276.
Corra, O.L.S. 2003. Petrleo: Noes sobre Explorao, Perfurao, Produo e Microbiologia. Intercincia. 90p.
Corseuil, H.X.; Fernandes, G. 1999. Efeito do Etanol no Aumento da Solubilidade de Compostos Aromticos
Presentes na Gasolina Brasileira. Revista de engenharia Sanitria e Ambiental, 4:71-75.
Corseuil, H.X.; Hunt, C.S.; Santos, R.C.F.; Alvarez, P.J.J. 1996. The influence of gasoline oxygenate ethanol on
aerobic and anaerobic BTX biodegradation. Water Research, 32(7):2065-2072.
Corseuil, H.X.; Kaipper, B.I.A.; Fernandes, M. 2004. Cosolvency effect in subsurface systems contamined with
petroleum hydrocarbons and ethanol. Water Research, 38:1449-1456.
Corseuil, H.X.; Moreno, F.N. 2001. Phytoremediation potential of willow trees for aquifers contamined wuth
ethanol-blended gasoline. Water Research, 12(35):3013-3017.
Crecchio, C.; Gelsomino, A.; Ambrosoli, R.; Minati, J.L.; Ruggiero, P. 2004. Funtional and molecular responses of
soil microbial communities under differing soil management practices. Soil Biology; Biochemistry, 36:1873-1883.
Cruz, J.F.M. 2003. Caracterizao de Gasolinas por Espectrometria FT-Raman. Dissertao (Doutorado em
Qumica). Pontifcia Universidade Catlica do Rio de Janeiro, RJ.
106
Ferreira, D.G.
Cunha, C.D. 1996. Avaliao da biodegradao de gasolina em solo. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos). Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Czajka, D.R.; Lion, l.W.; Shuler, M.L.; Ghiorse, W.C. 1997. Evaluation of the utility of bacterial extracellular
polymers for treatment of metal-contaminated soils: Polymer persistence, mobility, and the influence of lead. Water
Research, 31(11): 2827-2839.
Daniel, S.L.; Pilsl, C.; Drake, H.L. 2007. Anaerobic oxalate consumption by microorganisms in forest soils.
Research in Microbiology, 158:303-309.
Degens, B.P.; Schipper, L.A.; Sparling, G.P.; Duncan, L.C. 2001. Is the microbial community in a soil with reduced
catabolic diversity less resistant to stress or disturbance? Soil Biology and Biochemistry, 33:1143-1153.
DelArco, B.P. 1999. Degradao de hidrocarbonetos por bactrias e fungos em sedimento arenoso. Tese
(Doutorado em Tecnologia dos Processos Qumicos e Bioqumicos). Escola de Qumica, Universidade Federal do
Rio de Janeiro.
Departamento de Agricultura do Estados Unidos da Amrica (EUA). 1993. Soil Survey Manual. Washington, DC.
315p. Disponvel on line em: http://soils.usda.gov/technical/manual/
DEsposito, M. 1999. Cognitive aging: new answers to old questions. Current Biology, 9(24):R939-R941.
Dias, L.E.; Mello, J.W.V. 1998. Recuperao de reas Degradadas. Ed Folha de Viosa Ltda, Viosa-MG. 251p.
Dorn, P.B.; Vipond, T.E.; Salanitro, J.P.; Wisniewski, H.L. 1998. Assessment of the acute toxicity of crude oils in
soils using earthworms, microtox, and plants. Chemosphere, 70(10):1857-1864.
Dou, J.; Liu, X.Hu, Z.; Deng, D. 2007. Anaerobic BTEX biodegradation linked to nitrate and sulfate reduction.
Journal of Hazardous Materials: in press.
Dupain, X.; Makkee, M.; Moulijn, J.A. 2006. Optimal conditions in fluid catalytic cracking: A mechanism approach.
Applied Catalysis A: General, 297:198-219.
Duraipadiyan, V.; Sasi, A.H.; Islam, V.I.H.; Valanarasu, M.; Ignacimuthu, S. 2009. Antimicrobial properties of
actinomycetes from the soil of Himalaya. Journal of Medical Mycology (Article in press).
Durmusoglu, E.; Taspinar, F. & Karademir, A. 2010. Health risk assessment of BTEX emissions in the landfill
environment. Journal of Hazardous Materials, 176(1-3): 870-877.
Ebrahimi, S.; Moghaddas, J.S.Aghjeh, M.K.R. 2008. Study on thermal cracking behavior of petroleum residue.
Fuel 87:1623-1627.
Edenborn, S.L.; Sextone, A.J. 2007. DGGE Fingerprinting of Culturable Soil Bacterial Communities Complements
Culture-Independent Analyses. Soil Biology; Biochemistry, 39:1570-1579.
ElSawy, A.; Gray, D. 1991. A critical review of biodesulphurization systems for removal of organic sulphur from
coal. Fuel, 70(5):591-594.
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria EMBRAPA. 1988. Definio e Notao de horizontes e camadas
do solo. Servio Nacional de Levantamento e Conservao do Solo, 2 ed., Rio de Janeiro RJ, 54p.
Environmental Statement. 2005. Bristol Temple Gate: Soils, Geology and Contamination. Bristol Exeter House
Limited, S12-12p.
EPA
Environmental
Protection
Agency.
1994.
Biosparging.
http://www.epa.gov/oust/pubs/tum_ch8.pdf. Acessado em: 07/09/2010.
Disponvel
on
line
em:
107
Ferreira, D.G.
EPA - Environmental Protection Agency. 1997. Expedited Site Assessment Tools For Underground Storage Tank
Sites: A Guide For Regulators. EPA 510-B-97-001.
EPA - Environmental Protection Agency. 2001. Inovative Technology Verification Report for TPH in Soil. Horiba
Instruments Incorporated OCMA-350 oil content analyzer. EPA 600-R-01-089.
Falcn, M.A.; Rodrguez, A.; Carnicero, A.; Regalado, V.; Perestelo, F.; Milstein, O.; De la Fuente, G. 1995.
Isolation of Microorganisms with Lignin Transformation potential from Soil of Tenerife Island. Soil Biology and
Biochemistry, 27(2): 121-126.
Gaivizzo, L.H.B. 2001.Fracionamento e mobilidade de metais pesados em solo com descarte de lodo industrial.
Tese (Doutorado em Cincia do Solo). Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 123p.
Gallego, J.R.; Gonzlez-Rojas, E.; Pelaz, A.I.; Sanchz, J.; Garca-Martnez, M.J.; Ortiz, J.E.; Torres, T.; Llamas,
J.F. 2006. Natural attenuation and bioremediation of Pretige fuel oil along the Atlantic coast of Galicia (Spain).
Organic Geochemistry, 37(12):1869-1884.
Galdolfi, I.; Sicolo, M.; Franzetti, A.; Fontanarosa, E.; Santagostino, A.; Bestetti, G. 2010. Influence of compost
amendment on microbial community and ecotoxicity of hydrocarbon-contmined soils. Bioresource Technology,
101(2):568-575.
Getenga, Z.; Drfler, U.; Iwobi, A.; Schmid, M. & Schroll, R. 2009. Atrazine and terbuthylazine mineralization by an
Arthrobacter sp. isolated from a sugarcane-cultivated soil in Kenya. Chemosphere, 77(4):534-539.
Ghazali, F.M.; Zaliha, A.R.; Salleh, A.B.; Basri, M. 2004. Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial
consortium. International Biodeterioration; Biodegradation, 54:61-67.
Gianfreda, L.; Rao, M.A. 2004. Potential of extra cellular enzymes in remediation of polluted soils: A Review.
Enzyme and Microbial Technology, 35: 339-354.
Godoy-Fandez, A.; Antizar-Ladislao, B.; Reyes-Bozo, L.; Camao, A.; Sez-Navarrete, C. 2008. Bioremediation
of contaminated mixtures of desert mining soil and sawdust with fuel oil by aerated in-vessel composting in the
Atacama Region (Chile). Journal of Hazardous Materials, 151: 649-657.
Gomes, N.M. 2005. Variabilidade espacial de atributos fsico-hdricos do solo da sub-bacia hidrogrfica do
Ribeiro Marcela na regio do Alto Rio Grande, MG. Dissertao (Mestrado). Universidade Federal de Lavras.
124p.
Gomes, M.E.P. 2006. Produtos Geolgicos e Sade Humana. Boletim Cultural, 11:85-97.
Gong, M.; Chen, S.Z.; Song, Y.Q. & Li, Z.G. 1997. Effecto of calcium and calmodulin on intrinsic heat tolerance in
relation to antioxidants systems in maize seedlings. Australian Journal of Plant Physiology, 24: 371-379.
Gordon, S.J.; Dorn, R.I. 2005. In situ weathering rind erosion. Goemorphology, 67 (1-2): 97-113.
Guanghua, W.; Junjie, L.; Xiaoning, Q.; Jian, J.; Yang, W.; Xiaobing, L. 2008. Effects of fertilization on bacterial
community structure and function in a black soil of Dehui region estimated by Biolog and PCR methods. Acta
Ecologica Sinica, 28(1):220-226.
Gundersson, C.A.; Kostuk, J.M.; Mitcell, H.G.; Napolitano, G.E.; Wicker, L.F.; Richmond, J.E. & Stewart, A.J.
1997. Multispecies toxicity assessment of compost produced in bioremediation of an explosives-contaminated
sediment. Environmental Toxicology and Chemistry, 16: 2529-2537.
Gusmo, V.R.; Martins, T.H.; Chinalia, F.A.; Sakamoto, I.K.; Thiemann, O.H.; Varesche, M.B.A. 2006. BTEX an
ethanol removal in horizontal-flow anaerobic immobilized biomass reactor, under denitrifying condition. Process
Biochemistry, 41:1391-1400.
Hamilton, B. 1995. Automotive gasoline. Disponvel em: http://www.faqs.org. Acessado em: 03/12/2009.
108
Ferreira, D.G.
Hamme, J.D.V.; Singh, A.; Ward, O.P. 2003. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiology and
Molecular Biology Reviews, 67(4):503-549.
Hanbo, Z.; Changqun, D.; Qiyong, S.; Weimin, R.; Tao, S.; Lizhong, C.; Zhiwei, Z. & Bin, H. 2004. Genetic and
physiological diversity of phylogenetically and geographically distinct groups of Arthrobacter isolated from lead
zinc mine tailings. FEMS Microbiology Ecology, 49(2):333-341.
Harmon, S.M.; Wyatt, D.E. 2008. Evaluation of post-Katrina flooded soils for contaminants and toxicity to the soil
invertebrates Eisenia fetida and Caenorhabditis elegans. Chemosphere, 70:1857-5864.
Harris, S.A.; Whiticar, M.J.; Eek, M.K. 1999. Molecular and Isotopic Analysis of Oils by Solid Phase
Microextractionof Gasoline Range Hydrocarbons. Organic Geochemistry, 30:721-737.
Hedrick, D.B.; Peacock, A.; Stephen, J.R.Macnaughton, S.J. Brggermann, J.; White, D.C. 2000. Measuring soil
microbial community diversity using polar lipid fatty acid and denaturing gradient gel electrophoresis data. Journal
of Microbiological Methods, 41:235-248.
Helfrich, P.; Chefetz, B.; Hadar, Y.; Chen, y. & Schnabl, H. 1998. A novel method for determining phytotoxicity in
compost. Compost Science and Utilization, 6: 6-13.
Hill, G.T.; Mitkowski, N.A.; Aldrich-Wolfe, L.; Emele, L.R.; Jurkonie, D.D.; Ficke, A.; Maldonado-Ramirez, S.;
Lynch, S.T.; Nelson, E.B. 2000. Methods for assessing the composition and biodiversity of soil microbial
communities. Applied Soil Ecology, 15:25-36.
Horiba. 1995. Instruction manual of oil content analyzer, OCMA-350. Horiba Ltda., 64p.
Hu, C.; Liu, Y; Paulsen, B.S. Petersen, D.; Klaveness. 2003. Extracellular carbohydrate polymers from five desert
soil algae with different cohesion in the stabilization of fine sand grain. Carbohydrate Polymers, 54(1): 32-42.
Huang, C.C.; Narita, M.; Yamagata, T.Y.; Itoh, Y. & Endo, G. 1999. Structure analysis of a class II transposon
encoding the mercury resistance of the Gram-positive Bacterium bacillus megaterium MB1, a strain isolated from
minamata bay, Japan. Gene, 234(2): 361-369.
Huang, W.; Li, G.; Lerner, D.N. & Zhang, X. 2000. Enrichment of degrading microbes and bioremediation of
petrochemical contaminants in polluted soil. Water Research, 34(15): 3845-3853.
Ilhan, S.; Nourbakhsh, M.N.; Kiliarslan, S. & Ozdag, H. 2004. Removal of chromium, lead and cooper ions from
industrial waste waters by Staphylococcus saprophyticus. Turkish Eletronic Journal of Biotechnology, 2:50-57.
Insam, H. 2001. Developments in soil microbiology since mid 1960s. Geoderma, 100:389-402.
Interstate Shellfish Sanitation Conference (ISSC). 2008. MPN Based microbiological methods SOP linear range,
limit of detection, limit of quantitation/sensitivity. Single Lab Validation for Laboratory Methods, Table of Contents,
VI # 5. Disponvel em: http://www.issc.org/lmrforms.aspx. Acessado em 15/02/2010.
Iwamoto, T.; Nasu, M. 2001. Current bioremediation practice and perspective. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 92(1):1-8.
Jacques, R.J.S.; Bento, F.M.; Antoniolli, Z.I. & Camargo, F.A.O. 2007. Biorremediao de hidrocarbonetos
policclicos aromticos. Cincia Rural, 37(4): 1192-1201.
Jacques, R. J. S.; Silva, K.J.; Bento, F. M.; Antoniolli, Z. I.; Camargo, F. A. O. 2010. Biorremediao de um solo
contaminado com antraceno sob diferentes condies fsicas e qumicas. Cincia Rural, 40(2): 310-317.
Jaramillo, I.R. 1996. Fundamentos teorico-practicos de temas selectos de la ciencia del suelo. Parte 1.
Universidad Autonoma Metropolitana, Mexico. 115 p.
109
Ferreira, D.G.
Jenny, H. 1994. Factors of Soil Formation A System of quantitative Pedology. New York, Dover publications.
281p.
Jessop, P.G. 2006. Homogenous catalysis using supercritical fluids: Recent trends and systems studied. The
Journal of Supercritial Fluids 38(2):211-231.
Juwarkar, A.A.; Nair, A.; Dubey, K.V.; Singh, S.K.; Devotta, S. 2007. Biosurfactanttechonolgy for remediation of
cadmium an lead contaminated soils. Chemosphere, 68(10):1996-2002.
Kaernbach, W.; Kisielow, W.Warzecha, L.; Miga, K.; Klecan, R. 1990. Influence of petroleum nitrogen compounds
on hydrodesulphurization. Fuel, 69(2):221-224.
Kao, C.M.; Wang, C.C. 2000. Control of BTEX migration by intrinsic bioremediation at a gasoline spill site. Water
research, 34(13):3413-3423.
Kapanen, A. & Itavaara, M. 2001. Ecotoxicity tests for compost applications. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 49: 1-16.
Kelemen, S.R.; George, G.N.; Gorbaty, M.L. 1990. Direct determination and quantification of sulphur forms in
heavy petroleum and coals: 1. The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) approach. Fuel, 69(8):945-949.
Khan,F.I.; Husain, T.; Ramzi,H. 2004. An overview and analysis of site remediation technologies. Journal of
Environmental Management, 71:95-122.
Kirk, J.L.; Beaudette, L.A.; Hart, M.; moutoglis, P.; Klironomos, J.L.; Lee, H.; Trevors, J.T. 2004. Methods of
Studying Soil Microbial Diversity. Journal of Microbiological Methods, 58: 169-188.
Knoke, K.L.; Marwood, T.M.; Cassidy, M.B.; Lee, H; Trevors, J.T.; Liu, D. & Seech, A.G. A Comparison of Five
Bioassays to Monitor Toxicity During Bioremediation of Pentachlorophenol-Contaminated Soil. Water, Air and Soil
Pollution, 110(1-2): 157-169.
Kozdrj, J.; Elsas, J.D. 2001-A. Structural Diversity of Microbial Communities in Arable Soils of a Heavily
Industrialized Area Determined by PCR-DGGE fingerprinting and FAME Profiling.Applied Soil Ecology, 17:31-42.
Kozdrj, J.; Elsas, J.D. 2001-B. Structural diversity of microorganisms in chemically perturbed soil assessed by
molecular and cytochemical approaches. Journal of Microbiological Methods, 43:197-212.
Labana, S.; Singh, O.V.; Basu, A.; Pandey, G.; Jain, R.K. 2005. A microcosm study on bioremediation of pnitrophenol-contamined soil using Arthorbacter protophormiae RKJ100. Applied Microbiologu and Biotechnology,
68(3): 417-424.
Labud, V. Garcia, C.; Hernandez, T. 2007. Effect of hydrocarbon pollution on microbial properties of sandy and
clay soil. Chemosphere, 66:1863-1871.
Landmeyer, J.E.; Bradley, P.M. 2003. effect of hydrologic and geochemical conditions on oxygen-enhanced
bioremediation in gasoline-contamined aquifer. Bioremediation Journal, 7(3-4):165-177.
Lay, C.; Huang, Y.; Wei, Y.; Chang, J. 2009. Bosurfactant-enhanced removal of total petroleum hydrocarbons from
contamined soi. Journal of Hazardous Materials, 167(1-3): 609-614.
Leckie, S.E. 2005. Methods of microbial community profiling and their application to forest soils. Forest Ecology
and Management, 220(85-106).
Lei 10.203/2001, art. 9, pargrafo 2. Disponvel em: http://www.receita.fazenda.gov.br/Legislacao. Acessado em

15/02/2010.
Lian, B.; Hu, Q.; Chen, J.; Ji, J. & Teng, J.H. 2010. Carbonate biomineralization induced by soil bacterium Bacillus
megaterium. Geochimica et Cosmochimica Acta, 70(22): 5522-5535.
110
Ferreira, D.G.
Liang, Z.; Drijber, R.A.; Lee, D.J.; Dwiekat, I.M.; Harris, S.; Wedin, D.A. 2008. A DGGE-cloning method to
characterize arbuscular mycorrhizal community structure in soil. Soil Biology; Biochemistry, 40:956-966.
Lima, D.; Viana, P.; Andr, S.; Chelinho, S.; Costa, C.; Ribeiro, R.; Souza, J.P.; Fialho, A.M.; Viegas, C.A. 2009.
Evaluating a bioremediation tool for atrazine contaminated soils in open soil microcosms: The effectiveness of
bioaugmentation and biostimulation approaches. Chemosphere, 74: 187-192.
Lima, U.A.; Aquarone, E.; Borzani, W. & Schmidell, W. 2002. Biotecnologia industrial processos fermentativos e
enzimticos. Ed. Edgard Bluncher, vol. 3, 616p.
Lin, L. ; Zang, Y.; Kong, Y. 2009. Recent advances in sulfur removal from gasoline by pervaporation. Fuel,
88(10):1799-1809.
Liu, B.; Jia, G., Chen, J.; Wang, G. 2006. A review of methods for studying microbial diversity in soils. Pedosphere,
16(1): 18-24.
Lodi, P. C. 2007. Mecnica dos Solos, vol 1, 3 ed, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira UNESP, SP. 48p.
Lodish, H.; Berk, A.; Zipursky, S.L.; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell, J.E. 2002. Biologia Celular e Molecular.
Editora Revinter Ltda, 1084 p.
Lopes, A.S.; Silva, M.C.; Guilherme, L.R.G. 1990. Boletim tcnico n 1 Acidez e calagem do solo. Associao
Nacional para a Difuso de Adubos ANDA, 3 ed, 22p.
Lopes, I.S. 2003. Estudo de catalisadores Pt-In/Nb2O5 na converso de hidrocarbonetos. Dissertao (Mestrado
em Qumica). Universidade Federal Fluminense/UFF, Rio de Janeiro. 87p.
Lovanh, N.; Hunt, C.S.; Alvarez, P.J.J. 2002. Effect of ethanol on BTEX biodegradation kinetics: aerobic continous
culture experiments. Water Research, 36:3739-3746.
Ma, W.K.; Siciliano, S.D.; Germida, J.J. 2005. A PCR-DGGE method for detecting arbuscular mycorrhizal fungi in
cultivated soils. Soil Biology; Biochemistry, 37:1589-1597.
Mackay, D.M.; Sieyes, N.R. Einarson, M.D.; Feris, K.P.; Papas, A.A.; Wood, I.A.; Jacobinson, L.; Justice, L.G.;
Noske, M.N.; Scow, K.M.; Wilson, J.T. 2006. Impact of ethanol on attenuation of benzene, toluene an o-xilene in a
normally sulfate reducing aquifer. Environmental Science Technology, 40:6123-6130.
McGrath, R. & Singleton, I. 2000. Pentachlorophenol transformation in soil: a toxicological assessment. Soil
Biology and Biochemistry, 32(8-9): 1311-1314.
Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Parker,J. 2004. Microbiologia. 10 ed. Editora Pearson/Prentice Hall. 624 p.
Maila, M.P.; Randinma, P.; Dronen, K.; Cloete, T.E. 2006. Soil microbial communities: Influence of geographic
location and hydrocarbon pollutants. Soil Biology and Biochemistry, 38(2):303-310.
Malamud, E.S.T.; Junior, C.J.A.; Rosrio, M.; Coresuil, H.X. 2005. Avaliao da atenuao natural dos
contaminates BTEX e etanol em um derramamento controlado de gasolina atravs do balano de massa. Anais
do 23 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental.
Mancera-Lpez, M.E.; Esparza-Garca, F.; Chavz-Gmez, B.; Rodrguez-Vzquez, R.; Saucedo-Castaeda, G.;
Barrera-Cortz, J. 2007. Bioremediation of na aged hydrocarbon-contamined soil by a combined system of
biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration; Biodegradation: in press.
Marin, J.A.; Hernandez, T.& Garcia, C. 2005. Bioremediation of oil refinery sludge by landfarming in semiarid
conditions: Influence on soil microbial activity. Environmental Research, 98:185-195.
Miliolli, V.S.; Sobral, L.G.S.; Servulo, E.F.C. & Carvalho, D.D. 2008. Biorremediao de solo impactado com leo
cru: avaliao da potencialidade da utilizao surfatantes. Serie Tecnologia Amiental, 50, 95p.
111
Ferreira, D.G.
Ministrio do Meio Ambiente. 2007. Plano nacional de preveno, preparao e resposta rpida a emergncias
ambientais com produtos qumicos perigosos. Braslia, P2R2. 46p.
Moreira, F.M.S.; Siqueira, J.O. 2006. Microbiologia e Bioqumica do Solo. 2 ed. Editora UFLA. 729p.
Muyzer G., Waal E.C.; Uitterlinden A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient
gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied
Environmental Microbiology 59: 695-700.
Nardi, I.R.; Ribeiro, R.; Zaiat, M.; Foresti, E. 2005. Anaerobic packed-bed reactor for bioremediation of gasolinecontamined aquifers. Process Biochemistry, 40(2): 587-592.
Nass, D.P. 2002. Conceito de Poluio. Revista Eletrnica de Cincias, artigo 13.
Nedwell, D.B. & Gray, T.R.G. 1987. Soil and sediment as matrices for microbial growth. Ecological of Microbial
Comunities, Cambridge press, 21-24p.
Neto,C.J.F.; Figueirdo, R.M.F.; Queiroz, A.J.M. 2005. Avaliao sensorial e da atividade de gua em farinhas de
mandioca temperadas. Cincia Agrotcnica, 29(4):795-802.
Niven, R.K. 2005. Etanol in Gasoline: Environmental Impacts and Sustainability Review Article. Renewable;
Sustainable Energy Reviews, 9:535-555.
Odum, E.P. 1988. Ecologia. 1ed. Guanabara Koogan. 434p.
Ogbochodo, I.A.; Iruaga, E.K.;Osemwota, I.O.; Chokor, J.U. 2004. An assessment of the effects of crude oil
pollution on soil properties, germination and growth of maize (Zea mays L.) using two types forcado light and
escravos light. Environment Monitor Assessment, 96:143-152.
Okamoto, K.; Izawa, M. & Yanase, H. 2003. Isolation and application of a styrene-degrading strain of
Pseudomonas putida to biofiltration. Journal of Bioscience and Bioengineering, 95(6): 633-636.
Olaniram,A.O.; Pillay, D.; Pillay,D. 2006. Biostimulation and bioaugmentation enhances aerobic biodegradation of
dichloroethenes. Chemosphere, 63:600-608.
Oliveira, J.B. DE. 2008. Pedologia Aplicada. 3 ed. FEALQ, SP. 592p.
Ollivier, B.; Magot, M. 2005. Petroleum Microbiology. Ed ASM press, Washington, DC.
Onifade, A.A.; Al-Sane, N.A.; Al-Musallam, A.A.; Al-Zarban, S. 1998. A review: Potentials for biotechnological
applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and
other keratins as livestock feed resources. Biosource Technology, 66(1):1-11.
Organization for economic Cooperation and Development - OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals n
207.
sterreicher-Cunha, P.; Vargas, E.A.V.J.; Guimares, J.R.D.; Campos, T.M.P.; Nunes, C.M.F.; Costa, A.;
Antunes, F.S.; Silva, M.I.P.; Mano, D.M. 2004. Evaluation of bioventing on a gasoline-ethanol contamined
undisturbed residual soil. Journal of Hazardous Materialas, 110:63-76.
sterreicher-Cunha, P.; Guimares, J.R.D.; Vargas Jr, E.A.; Silva, M.I.P. 2007. Study of biodegradation processo f
BTEX-ethanol mixture in tropical soil. Water, Air and Soil Pollution, 181:303-317.
sterreicher-Cunha, P.; Vargas, E.A.V.J.; Guimares, J.R.D.; Lago, G.P.; Antunes, F.S.; Silva, M.I.P. 2009. Effect
of ethanol on the biodegradation of gasoline in an unsaturated tropical soil. International Biodegradation;
Biodeterioration, 63:208-216.
112
Ferreira, D.G.
Oyeyola, G.P. 2010. Rhizosphere bacterial flora of Amaranthus hybridus. Research Journal of Microbiology,
5:137-143.
Pala, D.M. 2003. Avaliao de aspectos relevantes para a biorremdiao de solos impactados por petrleo.
Exame de qualificao (Doutorado). Programa de Engenharia Qumica/COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro. 84p.
Pala, D.M.; Carvalho, D.D.; Santanna, G.L. 2004. Efeito do tipo e do teor de aditivos estruturantes na
biodegradao de leo diesel em diferentes solos. Colquio Anual de Engenharia Qumica/ Programa de
Engenharia Qumica/COPPE/UFRJ.
Paradelo, R.; Barral, M.T. 2009. Effect of moisture and disaggregation on microbial activity of soil. Soil and Tillage
Research, 104:317-319.
Pereira, R.M.; Silveira, E.L.; Carareto-Alves, L.M.; Lemos, E.G.M. 2008. Avaliao de populaes de possveis
rizobactrias em solos sob espcies florestais. Revista Brasileira de Cincia do Solo, 32(5):1921-1927.
Phelps, C.D.; Young, L.Y. 1999. Anaerobic biodegradation of BTEX and Gasoline in various aquatic sediments.
Biodegradation, 10:15-25.
Phillips, T.M., Liu, D., Seech, A.G., Lee, H., Trevors, J.T. 2000. Monitoring bioremediation in creosotecontaminated soils using chemical analysis and toxicity tests. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,
24:132139.
Portal PETROBRAS. Disponvel em: http://www.petrobras.com.br. Acessado em 15/02/2010.
Prevedello, C.L. 1996. Fisica do solo. Salesward-Discovery, Curitiba-PR. 446 p.
Rahman, K.S.M.; Banat, I.M.; Thahira, J.; Thayumanavan, T.; Lakshmanaperumalsamy, P. 2002. Bioremediation
of gasoline contamined soil by a bacterial consortium amended with poultry litter, coir pith and rhamnolipid
biosurfactant. Bioresource Technology, 81(1): 25-32.
Raij, B.V.; Andrade, J.C.; Cantarella, H. & Quaggio, J.A. 2001. Anlise qumica para avaliao da fertilidade de
solos tropicais. Instituto Agronmico, Campinas. 285 p.
Ratsep, R. 1991. Biological variables for monitoring the effects of pollution in a small catchments area.
Environmental Monitory, 8:6-21.
Ratte, H.T.; Hammers-Wirtz, M.; Cleuvers, M. 2003. Chapter 7 - Ecotoxicity testing. Trace Metals and oher
Contaminants in the Environment, 6:221-256.
Reddy, C.A. 1995. The potential for white hot fungi in the treatment of pollutants, Current Opinion in
Biotechnology, 6(3):320-328.
Resende, M.; Curi, N.; Resende, S.B. & Corra, G.F. 2002. Pedologia-Base para distino de Ambientes. Neput,
Viosa. 338p.
Riser-Roberts, E. 1998. Remediation of petroleum contamined soil: Biological, Physical and Chemical processes.
Lewis Publishers, Boca Raton. 542p.
Robaina, L.E.; Berger, M.G.; Cristo, S.S.V. & Paula, P.M. Anlise dos ambientes urbanos de risco do municpio de
Santa Maria RS. Cincia Natural, 23: 139-152.
Rodrigues, M.I.; Iemma, A.F. 2005. Planejamento de Experimentos e Otimizao de Processos. Editora Casa do
Po, Campinas-SP. 326p.
Rodriguez, C.P.M. 2006. A influncia das caractersticas dos solos na remediao de solos contaminados atravs
de processos oxidativos avanados com persulfato e reagente de Fenton. Dissertao (Ps Graduao em
Cincia Ambiental). Instituto de Geocincias da Universidade de So Paulo, Universidade de So Paulo, SP.
113
Ferreira, D.G.
Rogers, S.O.; Yan, Z.H.; Shinohara, M.; Lobuglio, K.F. Wang, C.J. 1993. Messenger RNA intron in the nuclear
18S ribosomal RNA gene of deuteromycetes. Current Genetics, 23(4):338-342.
Roy, R.N.; Laskar, S.; Sem, S.K. 2006. Dibutyl phthalate, the bioactive compound produced by Streptomyces
albidoflavus 321.2. Microbiological Research, 161(2): 121-126.
Smalla, K.; Oros-Sichler, M.; Milling, A.; Heuer, H.; Baumgarte, S.; Becker, R.; Neuber, G.; Kropf, S.; Ulrich, A.;
Tebbe, C.C. 2007. Bacterial Diversity of Soils Assessed by DGGE, T-RFLP and SSCP Fingerprints of PCRamplified 16S rRNA Gene Fragments: Do the different methods provide similar results?. Journal of Microbiological
Methods, 69:470-479.
Samoulian, A.; Cornu, S. 2008 Modelling the formation and evolution of soil, towards an initial synthesis.
Geoderma, 145: 401-409.
Santos, A.C.; Peixoto, R.A. 2008. Efeito da Adio de Etanol Gasolina na Emisso de Gases do Efeito Estufa.
Cincia; Engenharia, 17(1/2):33-41.
Santos, H.G.; Oliveira, J.B.; Lumbrelas, J.F.; Anjos, L.H.C.; Coelho, M.R.; Jacomine, P.K.T.; Cunha, T.J.F.;
Oliveira, V.A. 2006. Sistema Brasileiro de Classificao de Solos. 2 Ed. EMBRAPA. 306 p.
Semple, K.T.; Reid, B.J.; Fermor, T.R. 2000. Impact of composting strategies on treatment fo soils contamined
with organic pollutants. Environmental Pollution, 112:269-283.
Serrano, A.; Gallego, M.; Gonzlez, J.L.; Tejada, M. 2007. Natural Atenuation of diesel aliphatic hydrocarbons in
contaminated agricultural soil. Environment Pollution: in press.
Sharma, Y.K.; Majhi, A.; Kukreti, V.S.; Garg, M.O. 2009. Stock loss studies on breathing loss of gasoline. Fuel: in
press.
Silva, A., Figueiredo, S.A.; Sales, M.G.; Delarue-Matos, C. 2009. Ecotoxicity tests using the Green algae Chlorella
vulgaris A useful tool in hazardous effluents management. Journal of Hazardous Materials, 167(1-3): 179-185.
Silva, M.L.B.; Alvarez, P.J.J. 2002. Effects of Ethanol versus MTBE on benzene, toluene, ethylbenzene, xilene,
ethanolmixtures bioaugmented aquifer columms. Journal of Environmental Engenieering-ASCE, 128(9): 862-867.
Silva, M.L.B.; Alvarez, P.J.J. 2004. Enhanced anaerobic bic biodegradation of benzene-toluene-ethylbenzenexilene-ethanol mixtures in bioaugmented aquifer columns. Applied and Environmental Microbiology, 70(8):47204726.
Singh, A.; Ward, A.P. 2004. Applied bioremediation and phytoremediation. Soil Biology, Ed. Springer, vol. 1, cap 1
e 2, 1-29p. Disponvel on line em: http://books.google.com. Acessado em: 28/01/2010.
Sipes, K.N.; Mendelsohn, R. 2001. The efectiveness of gasoline taxation to manage the air pollution. Ecological
Economics, 36:299-309.
Solano-Serena, F.; Marchal, R.; Huet, T.; Lebeault, J.M.; Vandecasteele, J.P. 2000. Biodegradability of volatile
hydrocarbons of gasoline. Applied Microbiology and Biotechnology, 54:121-125.
Stucki, J.W.; Lee, K.; Goodman, B.A.; Kostka, J.E. 2007. Effects of in situ biostimulation on iron mineral speciation
in a sub-surface soil. Geochimica et Cosmochimica Acta, 71:835-843.
Takahashi, J.A.; Castro, M.C.M.; Souza, G.G.; Lucas, E.M.F.; Bracarense, A.A.P.; Abreu, L.M.; Marriel, I.E.;
Oliveira, M.S.; Floreano, M.B.; Oliveira, T.S. 2008. Isolation and screening of fungal species isolated from Brazilian
cerrado soil for antibacterial activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Streptococcus pyogenes and Listeria monocytogenes. Journal of Medical Mycology, 18(4): 198-204.
114
Ferreira, D.G.
Teixeira, M.L.; Cladera-Oliveira, F.; Santos, J.; Brandelli, A. 2009. Purification and characterization of a peptide
from Bacillus lichenformis showing dual antimicrobial and emulsifying activities. Food Research International,
42(1):63-68.
Tenturier, S.; Elie, M.; Pironon, J. 2003. Oil-cracking processes evidence from syntetic petroleum inclusions.
Journal of Geochemical Exploration 78/79:421-425.
Tiburtius, E.R.L.; Peralta-Zamora, P.; Emmel, A. 2005. Treatment of gasoline-contamined Waters by advanced
oxydation process, Journal of Hazardous Materials, 126:86-90.
Thomas, J.E. 2004. Fundamentos da Engenharia do Petrleo. 2 ed. Intercincia. 272p.
Thompson, K.F.M. 1994. A classification of petroleum on the basis of the ratio of sulfur to nitrogen. Organic
Geochemistry, 21(8-9):877-890.
Thompson, I.P.; Bailey, M.J.; Ellis, R.J.; Maguire, N. & Meharg, A.A. 1998. Response of soil microbial communities
to single and multiple doses of an organic pollutant. Soil Biology and Biochemistry, 31(1): 95-105.
Trasar-Cepeda, C.; Leirs, M.C.; Seoane, S.; Sotres, G. 2000. Limitations of soil enzymes as indicators of soil
pollution. Soil Biology and Biochemistry, 32(13): 1867-1875.
Trasar-Cepeda, C.; Sotres, G.; Leirs, M.C. 2007. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from
Galcia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry, 39(1): 311-319.
Turkington, A.V.; Phillips, J.D.; Campbell, S.W. 2005. Weathering and Landscape Evolution. Geomorphology, 67:
1-6.
U.S.EPA, 1990. Handbook on in situ treatment of hazardous waste-contaminated soils. EPA/540/2-90/002.

Washington D.C.
Van Hamme, J.D.; Singh, A. & Ward, O.P. 2003. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiology and
Molecular Biotechnology Reviews, 67: 503-549.
Vary, P.S.; Biedendieck, R.; Fuerch, T.; Meinhardt, F.; Rohde, M.; Deckwer W.D. & Jahn, D. 2007. Bacillus
megaterium from simple soil bacterium to industrial protein production host. Applied Microbiology and
Biotechnology, 76(5):957-967.
Vepslinen, M.; Kukkonen, S.; Vestberg, m. Sirvi, H.; Niemi, R.M. 2001. Application of soil enzyme activity test
kit in a field experiment. Soil Biology and Biochemistry, 33:1665-1672.
Vermelho, A.V.; Pereira, A.F.; Coelho, R.R.R. 2006. Prticas de Microbiologia. 1 ed. Guanabara Koogan. 256p.
Vidali, M. 2001. Bioremediation: An Overview. Pure Applied Chemistry, 73(7):1163-1172.
Wang, T.G.; Li, S.M.; Zhang, S.C. 2004. Oil migration in the Lunnan region, Tarim Basin, China based on the
pyrrolic nitrogen compound distribution. Journal of Petroleum Science and Engineering, 41(1-3):123-134.
Wenhui, Z.; Zucong, C.; Lichu, Y.; He, Z. 2007. Effects of the long-term application of inorganic fertilizers on
microbial community diversity in rice-planting red soil as studied by using PCR-DGGE. Acta Eclogica Sinica,
27:4011-4018.
Wolk, D.; Mitchell, S.; Patel, R. 2001. Principles of molecular microbiology testing methods. Infectious Diseases
Clinics of North America, 15(4): 1157-1204.
Wongwise, S.; Rattanaprayura, I.; Chanchaona, S. 1997. An evaluation of evaporative emissions of gasoline from
storage sites and service stations. Thammasat International Journal of Science Technology, 2(2):1-17. Disponvel
em: http://www.tijsat.tu.ac.th/issues/1997/no2/1997_V2_No2_1.PDF. Acessado em: 19/02/2010.
115
Ferreira, D.G.
Xu, J.G.; Johnson, R.L. 1995. Root growth, microbial activity and fosfatase activity in oil-contamined, remediated
and uncontamined soils planted to barely and field pea. Plant Soil, 173:3-10.
Yerushalmi, L. & Guiot, S.R. 1998. Kinetics of biodegradation of gasoline and its hydrocarbon constituents.
Applied Microbiology and Biotechnology, 49:475-481.
Yerushalmi, L.; Manuel, M.F.; Guiot, S.R. 1999. Biodegradation of Gasoline and BTEX in microaerophilic
biobarrier. Biodegradation, 10:341-352.
116

Biorremediacao de Solo Argiloso Contaminado

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

DOUGLAS GUEDES FERREIRA

Biorremediao de Solo Argiloso Contaminado com Gasolina Aditivada

DOUGLAS GUEDES FERREIRA

Biorremediao de Solo Argiloso Contaminado com Gasolina Aditivada

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Orientao: Prof. Dra. Eliana Flvia Camporese Srvulo

Ferreira, Douglas Guedes

Qualquer coisa que voc fizer na

O solo um ecossistema rico em biodiversidade, entretanto as atividades

Soil is an ecosystem rich in biodiversity, however human activities threaten the

Figura 2 Classificao textural dos solos segundo departamento de

agricultura dos Estados Unidos da Amrica, 1993

dos produtos da destilao

Figura 6 Causas da poluio por postos de combustveis na cidade de

Figura 9 Ilustrao do reator usado no ensaio de diversidade

(mido: 20% de umidade; saturado: 40%)

bactrias hidrocarbonoclsticas pela tcnica do nmero mais provvel

para a identificao de culturas isoladas

Figura 14 - Constituio granulomtrica do solo argiloso utilizado

Figura 15 Teores finais de hdrocarbonetos totais do petrleo, expressos

em valores mdios, para a biorremediao de latossolo contaminado com

hidrocarbonoclsticas para biorremediao de solo contaminado com

hidrocarbonoclsticas para biorremediao de solo contaminado com

Figura 18 Comparao entre o percentual de remoo de HTP e a

variao da concentrao de BHC nos ensaios do planejamento fatorial

estudadas na remoo de hidrocarbonetos totais do petrleo

estudadas para o crescimento das bactrias hidrocarbonoclsticas

estudadas na mortalidade de minhocas (Eisenia fetida)

e a concentrao de fsforo, com base na umidade (mido-20%;

em diferentes profundidades ao longo de 60 dias

em diferentes profundidades ao longo de 60 dias

diferentes profundidades ao longo de 60 dias

em diferentes profundidades ao longo de 60 dias

controle CEB-I em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

controle CEB-II em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo

ensaio EB-1 em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

ensaio EB-2 em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

ensaio EB-3 em diferentes profundidades de solo ao longo do tempo.

Quadro 3 - Componentes da gasolina identificados por Solid Phase

Quadro 5 Quadro 5 Matriz do Planejamento Fatorial 22 em Solo com

Quadro 8 Matriz do Ensaio de Biorremediao em Coluna

Quadro 9 Concentrao final dos reagentes na reao de PCR

Quadro 10 Caractersticas fsico-qumicas do solo

Quadro 11 Caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas do solo

2.1.1. Formao do Solo

2.1.2. Caractersticas do Solo

2.1.3. Solo Brasileiro

2.1.4. Microbiologia do Solo

2.1.4.1. Fatores que Afetam a Microbiota do Solo

2.2. Petrleo e Derivados

2.2.2. Mistura Gasolina/lcool

2.3. Contaminao dos Solos

2.4. Tratamento de Solos Contaminados

2.4.1.1. Fatores que Afetam a Biorremediao

2.4.1.2. Avaliao da toxicidade do solo

2.5. Ferramentas Estatsticas

3.4. Ajuste do pH do Solo

3.5. Preparo do Inculo

3.6. Detalhamento dos Ensaios de Biorremediao

3.6.1. Caracterizao do Solo

3.6.2. Ensaios de Biorremediao em Mocrocosmos

3.6.3. Avaliao da Biorremediao em Colunas

3.7. Anlises Quantitativas