13-05-2013

UNIDAD3:
HERRAMIENTAS DE BIOTECNOLOGA E
INGENIERA GENTICA Y SU APLICACIN

Unidad3
A. Tcnicas
a.1 Bsicas
Extraccin cidos Nucleicos
Electroforesis
Cuantificacin cidos Nucleicos
Enzimas de Restriccin
SouthernBlot, NorthenBloth, WesternBlot
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Reverse Transcription PCR (RTPCR)
Clonamiento
a.2 Avanzadas
Secuenciacin (tradicional, capilar, Next Generation
Sequencing NGS)
PCR en tiempo real
Microarreglos

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A.3 ENZIMAS DE
RESTRICCIN

ENDONUCLEASASDERESTRICCION
En 1968 se purific la primera endonucleasa de restriccin, la
K12 en E. coli.
Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se pens
que reconoca secuencias especficas del ADN.
Aunque reconoca una zona determinada del ADN, cortaba al
ADN a varias Kb de distancia.

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En 1970 se aisla otra endonucleasa de restriccin en

Haemophilus influenzae, que reconoce una secuencia en un
doble hebra de ADN y la corta en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.

QusonlasEnzimasdeRestriccin?
Son endonucleasas (enzimas) que cortan la hebra
de ADN en una secuencia especfica. El sitio de
reconocimientos es, generalmente, de 46 pb.

Arber, Nathans y Smith

ganan el premio Nobel
de Medicina en 1978.

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Fenmeno de restriccin: reconocimiento por parte de una

bacteria de un ADN extrao y lisis del mismo en pequeos
fragmentos.

El fenmeno de restriccin se descubri en E coli, cuando se

hizo crecer el bacterifago lambda ().
En la cepa C de E. coli creca bien el bacterifago , pero si
este se creca en la cepa K o la R, la eficiencia de crecimiento era
mucho menor o nula. El fago
g era restringido
g p
por esta cepa.
p

Explicacin:
El ADN del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la
endonucleasa responsable de esta degradacin se le llama
endonucleasa de restriccin o enzima de restriccin.
El husped restrictivo debe proteger a su propio ADN de la
accin de las enzimas de restriccin y para ello modifica a su
propio ADN.

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SISTEMASDERESTRICCIONYMODIFICACION
Se conocen cuatro tipos de sistemas de restriccin y
modificacin (RM):
Tipo I:
En la misma enzima tienen 2 subunidades para la
restriccin, 2 subunidades para la modificacin (metilacin) y una
subunidad para el reconocimiento.
Tanto la metilacin como el corte requieren de ATP.
El corte se da a alguna distancia del lugar de
reconocimiento.
i i
Poco valor para manipulacin gentica.

Tipo II:
La restriccin (divisin) y modificacin las provocan
diferentes enzimas de la bacteria, por lo que puede haber
divisin del ADN en ausencia de modificacin.
No requieren de cofactores como ATP o S
adenosilmetionina por lo que su uso es ms sencillo.
El lugar de reconocimiento generalmente es simtrico y
cortan al ADN en el lugar
g de reconocimiento.

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Nomenclatura:
Tres letras:
1 letra de gnero de la bacteria donde se encontr
2 y 3 letras especie de la bacteria donde se encontr
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restriccin (si
es alguna cepa especial)
Si en la misma bacteria hayy varios sistemas de restriccin,, se
especifica por nmeros romanos.

Ejemplos:
HindII : Haemophilus influenzae, cepa d, 2 enzima
descrita.
HindIII : Haemophilus influenzae, cepa d, 3 enzima
descrita.
SmaI

: Serratia marcescens, 1 enzima descrita

BamHI : Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1

enzima descrita.
Losnombresdelasenzimasderestriccinseescribeenitlica.

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SISTEMASDERESTRICCIONYMODIFICACION

Ejemplo: (especfico para las de Tipo II)

1) Ambas cadenas metiladas

no hay ni metilacin ni restriccin

CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
3
5

M.EcoRI
R.EcoRI

CH3

2) Slo una cadena metilada

CH3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
3
5
CH3

hay metilacin y no restriccin

CH3

5---- GAATTC ---- 3

3---- CTTAAG ---- 5

M.EcoRI
R.EcoRI

CH3

3) Ninguna cadena metilada

5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5

5---- GAATTC ---- 3

3---- CTTAAG ---- 5
CH3

no hay metilacin,
metilacin s restriccin

M.EcoRI
R.EcoRI

5---- G
AATTC ---- 3
3---- CTTAA
G ---- 5

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El sistema RM funciona como un sistema inmune

Mecanismo para resistir el ataque viral
Permite a la bacteria distinguir entre ADN propio y ADN
f
forneo:
9 las ER digieren al ADN forneo no metilado
9 y protegen ADN propio por metilacin

ENDONUCLEASASDERESTRICCION
Endonucleasas de tipo II
Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucletidos,,
que tienen un eje rotacional de simetra: Secuencias palndrome
Se marca con / : lugar donde acta la endonucleasa de
restriccin.
Se marca con * : lugar donde se metilan las bases por
modificacin.

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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Para EcoRI:
5- GAATTC- 3
3- CTTAAG-5
5- G/AA*TTC- 3
3- CTT A*A/G-5
Generalmente solo se escribe la secuencia desde el 5
5
G/AATTC

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Cuando la enzima de restriccin acta deja dos extremos
q son complementarios
p
entre s:
5que
5 G
5 AATTC 3
3 CTTAA 5
G 5
A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II
se les denomina extremos cohesisos o pegajosos.
pegajosos
No todas las enzimas de restriccin tipo II dejan as los
extremos.

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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Extremoscohesivos

Extremosromos

Extremosromos
Sma I

Extremoscohesivos
EcoR I
5protruyente
5
protruyente

Pst I
3protruyente

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La ligacin de extremos cohesivos

complementariedad de secuencia.

requiere

La ligacin de extremos romos no requiere de

secuencias complementarias: dos extremos romos
cualquiera pueden ser unidos por la ADN ligasa.
La eficiencia de ligacin de extremos cohesivos es
mayor que la de extremos romos.

ClasificacindeER
ER
Estructura
proteica

TipoI
TipoII
Bifuncional,3 Unifuncional,
subunidades
endonucleasay
metilasaen
enzimas
enzimas
separadas

TipoIIs
TipoIII
Unifuncional,
Bifuncional,2
endonucleasay subunidades
metilasaen
distintas
enzimas
enzimas
separadas

Sitiode
reconocimiento
(SR)

Asimtricoy
bipartito

Secuencia
palindrmica
(simtrica),
46pb(tbde
8pb)

Asimtricoy
continuo

Sitiodeclivaje

Noespecfico
1000pbdel
SR

EnelmismoSR
oadyacentea
este

Adistancias
fijasdelSR
(fueradel
mismo)

Asimtrico,
57pb.
R:secuencia
duplicadaen
direcciones
opuestos
2426pb ro
abajoSR

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ER
RequertOs

Ejemplo

TipoI
ATPpara
moversedel
sitiode
reconocimient
oaldeclivaje,
l d li j
Mg2+,SAM
EcoKI

TipoII
NoATP
Mg2+,(laM
requiereSAM)

TipoIIs
Mg2+,(laM
requiereSAM)
NoATP

EcoRI

AwlI

CAGCAG(N)CTGCTG
GTCGTC(N)GACGAC

AACN6GTGC
TTGN6CACG
Usoen
biologa
biologa
molecular

Nogeneran
fragmentos de
fragmentosde
tamao
definido

TipoIII
ATPpara
moversedel
sitiode
reconocimiento
aldeclivaje,
l d li j
Mg2+,SAM
EcoP15

Generan
fragmentos de
fragmentosde
tamao
definido,se
usanenel
laboratorio!!!

Generan
fragmentos de
fragmentosde
tamao
definido

Nogeneran
fragmentos de
fragmentosde
tamao
definido

TipoII (lasqueseempleanenellaboratorio)
Lassecuenciasdereconocimientopuedenser:
palindrmicas y continuas (reconocidas por homodmeros)
Ejemplo:EcoRI

simtricas y discontinuas (reconocidas por homodmeros)

Ejemplo:BglI
Cdigodeunaletra
N =AorCorGorT

asimtricas y continuas (reconocidas por heterodmeros)

Ejemplo:BbvCI

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Isoesquizmeros:
SondistintasERquereconocenlamismasecuencia,generalmente
condistintasespecificidadesypuedengenerar:
losmismosextremos:Acc65IyKpnI
5GGTACC 3
3CCATG
G 5

5GGTACC 3
3CCATGG 5

distintosextremos:
5CCCGGG 3
3
GGGCCC 5
3GGGCCC
5
5CCCGGG 3
3GGGCCC 5

SmaI

XmaI

5CCCGGG 3
3
GGGCCC
3GGG
CCC 5
5
5CCCGGG 3
3GGGCC
C 5

ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos

extremos:
5----GGATCC ---- 3
3----CCTAGG ---- 5

5----AGATCT ---- 3
3----TCTAGA ---- 5

BamH I

Bgl II

5----G
GATCC ---- 3
3----CCTAG
G ---- 5

5----A
GATCT ---- 3
3----TCTAG
A ---- 5

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Se han estudiado ~10.000 bacterias

para encontrar enzimas de restriccin.
Se han encontrado 3.000 enzimas de
Restriccin
R
t i i
especficas
fi
para
~200
secuencias de ADN.
Las enzimas diferentes que tienen
especificidad por la misma secuencia de
ADN y que cortan en el mismo sitio se les
llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia, pero
cortan en diferente lugar al ADN se les
denomina neoeschizomeros.

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