Salvador Domingo Felipe Jacinto Dal i Domnech

(1904-1989)

-Aislamiento de genes(Clonado molecular)

2015

Clulas procariotas
(cultivo)

Animales

GENES
AISLADOS
Clulas eucariotas
(cultivo)

Vegetales
2

GENES
AISLADOS
VECTOR
Clulas procariotas
(cultivo)

Clulas eucariotas
(cultivo)

Vegetales

Animales

GENES
AISLADOS
VECTOR
Clulas procariotas
(cultivo)
Plasmido
Virus

Clulas eucariotas
(cultivo)

Vegetales

Animales
----SISTEMA BIOLGICO----

COMO SE OBTIENE UN
GEN AISLADO ???

Clonado
Molecular
~1973
Reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR)
1983
Sntesis Qumica
~ 1980

COMO SE OBTIENE UN
GEN AISLADO ???

Clonado
Molecular
~1973
Reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR)
1983
Sntesis Qumica
~ 1980

Gen

vector
Cromosoma
Proteina

Clula
Deteccin,
qu sonda usamos
???

LIBRERAS GENMICAS
Cromosoma
Digerir cromosoma
A

Clonar en un vector

Eucariota
Intrones ?
Procariota

SISTEMA
BIOLOGICO ?

Cmo detecto
??
el gen
( el DNA)

Introducir el vector en E. coli

Librerias en colonias (o fagos)

Cpsula de Petri

LIBRERAS DE cDNA
Clula
Aislar mRNA
Transcripcin reversa
mRNA
cDNA
Clonar en un vector
A

Eucariota

Intrones ?
Procariota

Introducir el vector en E. coli

SISTEMA
BIOLOGICO ?

Libreria en colonias

Cmo detecto
??
el cDNA

Cpsula de Petri

LIBRERIAS DE EXPRESION

Transcripcin Reversa region codificante sin intrones,

mayoritariamente bacterias
mRNA
cDNA

Promotor
A

Fragmento de cDNA
C

Introducir el vector en E. coli

Cada colonia produce
una proteina diferente
Cpsula de Petri

Paul Berg (1926)

Paul Berg, es considerado el padre de la rama de la bioqumica
conocida como: ingeniera gentica
Bioqumico estadounidense. Recibi el premio Nobel de
Qumica en 1980 por sus estudios sobre los cidos nucleicos, en
especial por el cido desoxirribonucleico (ADN) recombinado,
galardn que comparti con Walter Gilbert y Frederick Sanger.
Paul Berg fue testigo de primera mano en la historia de la
investigacin sobre el ADN recombinado, de la que ha sido uno
de sus protagonistas desde joven. Se granje muy pronto el
Premio Nobel en Qumica, 1980 reconocimiento de la comunidad cientfica al describir los pasos
clave en los que el ADN produce las protenas.
A mediados de la dcada de los 70 la Academia Nacional de las Ciencias de USA le encomend
revisar la seguridad de la tecnologa del ADN recombinado. La respuesta fue la denominada
"Carta Berg", donde se peda una moratoria en la investigacin sobre el ADN recombinado hasta
que se consiguiese resolver los problemas de seguridad.
Fue uno de los organizadores de la Conferencia Asilomar (foro internacional sobre la tecnologa
del ADN recombinado, celebrada en febrero de 1975) que reuni a cien cientficos relevantes para
discutir los riesgos potenciales de los experimentos para ensamblar genes. Como resultado de
estas discusiones se public, un ao ms tarde, la Directiva de los Institutos Nacionales de Salud,
un hito en la autorregulacin de los investigadores cientficos. No obstante, el grupo de
investigacin de Berg sigui trabajando con las tcnicas de ADN recombinado
11

Pasos para el clonado molecular de genes:

Cortar el DNA
Separar los fragmentos de DNA
Producir cantidad de c/u de ellos
Identificar el fragmento que contiene el gen

12

ENZIMAS DE RESTRICCIN TIPO II

Cortan en sitios especficos dentro de secuencias palindrmicas
EcoRI

EcoRI: gives sticky ends

EcoRIV

EcoRV: gives blunt ends

Sitios de reconocimiento y corte de algunas

enzimas de restriccin Tipo II
Enzima
AluI
BamHI
BglI
BglII
EcoRI
EcoRII
EcoRV
HaeII
HaeIII
HindIII
PstI
PvuII
SalI
Ta q I
XhoI

Secuencia de reconocimiento
AGC*T
GGATC*C
GCCNNNNNNGGC
A GATCT
G AA*TTC
CC*(TA )GG
GA*T ATC
RGCGC Y
GG C*C
A* AGCTT
C* CGG
CTGCA* G
CAG C*TG
G TCGAC
T CGA*
C TCGAG

Microorganismo
Arthrobacter luteus
Bacillus amyloliquefaciens H
Bacillus globigii
Bacillus globigii
Escherichia coli RY13
Escherichia coli R245
Escherichia coli J62P4G74
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Haemophilus influenzae MspI
Moraxella species
Providencia stuartii 164
Proteus vulgaris
Streptomyces albus G
Thermus aquaticus
Xanthomonas holcicola

(A* is N 6 -methyladenine and C* is 5-methylcytosine). R, Y, and N

represent a purine nucleotide, a pyrimidine nucleotide, and any nucleotide,
respectively.

DNA ligasa

VECTORES DE CLONADO
DNA

Cunto DNA puede llevar ?

Cmo ingresa a la clula?

DNA
Qu destino intracelular ?
Cmo se selecciona ?
Qu cantidad (Nro de copias) ?

Vector

Max. tamao del inserto (kb)

Plsmido
Fago l
Csmido
Fago P1
BAC
YAC

10 - 15
25
35 - 45
80 - 100
50 - 300
300 - >1500

PLASMIDOS

Enz
Ampicilina
E. Coli
Plsmido
Amp
Ampicilina

10

BACTERIFAGO LAMBDA

11

BACTERIOFAGO LAMBDA (l)

El DNA puede ser empaquetado in vitro para formar partculas virales

secuencias cos

PLASMIDOS

FAGOS

Fcil manipulacin

Manipulacin complicada

Acomoda hasta 10 Kb

Acomoda 20-40 Kb

Transformacin
relativamente eficiente

Transfeccin muy eficiente

Placas

Colonias

12

CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES

(GENOMICO)
(a)

25

CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES

(b)

26

13

RASTREO DEL
BANCO PARA
DETECTAR EL GEN DE
INTERES

27

OBTENCION DEL FRAGMENTO CLONADO

Membrana
Aislar el clon
deseado

Aislar DNA del fago

Cpsula original

Enz. restriccin
Infectar bacterias
frescas

Anlisis del
DNA
28

14

CUANTOS CLONES HAY QUE RASTREAR????

El nmero de clones requeridos para tener 99% de probabilidad de encontrar un
detrminado fragmento de DNA en el banco de clones depende del tamao de los insertos
y del tamao del genoma.
El # de clones necesarios para tener una dada probabibilidad de encontrar un
fragmento de DNA es:
N = ln(1-P) / ln(1-f)

N = # de clones,
P es la probabilidad de obtener un dado fragmento.
f es la fraccin del genoma en cada clon.
Ej. Genoma humano = 3 x 106 kb DNA
Tamao promedio de insertos en el vector = 17 kb
Probabilidad = 0.99
Se calcula que 8 x 105 fagos son requeridos para tener el
29
99% de probabilidad de obtener un fragmento determinado.

30

15

DNA genmico y cDNA

31

Sntesis de cDNA

32

16

CONSTRUCCIN DE
UN BANCO
DE CLONES (cDNA)

33

RASTREO

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17

BANCO DE CLONES DE EXPRESIN (cDNA)

Fago l

35

36

18

RASTREO

37

NO EXPRESION

PROMOTOR

EXPRESION

38

19

39

Banco de clones

DNA (homologo)

Ac
(requiere cantidad)

Oligonucletido

Secuencia aa (parcial)
Peptido

Ac

Funcin
Si la protena posee capacidad de unirse especficamente a otra protena celular o
unir un ligando o unir DNA se puede utilizar alguna de estas propiedades para utilizar
identificar un clon que contenga el cDNA o gen.
40

20

CLONADO POR COMPLEMENTACIN

-galactosidasa

lactosa

E. coli -gal (-)

glucosa

CLONADO POR COMPLEMENTACION

DNA library
(E. coli)

E. Coli mutantes
(gal-)

Transformacin de la cepa
mutante con la libreria de DNA

Seleccin en lactosa como

nica fuente de carbono

Crecimiento de la cepa complementada y

asilamiento del plsmido para el anlisis del gen clonado
42

21