En la mitosis los microtbulos ensamblan el aparato

mittico, estructura que es esencial para distribuir el

material gentico a las clulas de la siguiente generacin.

El aparato mittico consiste de tres tipos de microtbulos,

astrales, del cinetocoro y polares
Los MTs astrales irradian desde el centrosoma (en amarillo). Contribuyen a la separacin de los polos y al
posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro (en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro) que se
unen a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares (en azul) se interdigitan en el ecuador del huso
y permiten generar fuerzas que regulan la separacin entre los polos.

Lodish et al., 2004

Microtbulos
dinmicos

molculas
motoras

formacin del huso

captura y alineamiento de cromosomas
transporte de cromtides hacia los polos

En las clulas animales el aparato mittico se ensambla

a partir de MTs nucleados en los centrosomas
Los centrosomas se duplican antes de comenzar la mitosis, al final de la fase G1.
Se requiere de la actividad de Cdk2 y de las ciclinas A y E (activas durante G1/S y S).

Lodish et al., 2004

En interfase el centrosoma ocupa una posicin perinuclear

ncleo

El centrosoma consiste en un par de centrolos

inmersos en una pericentriolar matriz fibrosa

centrosomas duplicados

La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias del

complejo -TuRC (gamma-tubulin ring complex)

El complejo -TuRC consiste de protenas que estabilizan un anillo

de subunidades de tubulina a partir del cual se ensamblan los
heterodmeros /. Los microtbulos ensamblados a partir del
centrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo de
rpido crecimiento (+) distal.

En profase, los microtbulos incrementan el dinamismo e

invaden el centro de la clula
Los complejos Cdk-ciclinas mitticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtbulos durante
profase mediante la fosforilacin y activacin de catastrofinas y la inactivacin de MAPs estabilizadoras.
Los MTs de metafase son mas
dinmicos que los de interfase (FRAP)

Las catastrofinas son protenas que se unen a los extremos (+) de los MTs (ej. miembros de la familia de
kinesinas 13 como MCAK=XKMC1) e incrementan los eventos de catstrofe. Las MAPs (ej. MAP2, tau) se
asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinmica. En general la fosforilacin de las
MAPs por Cdks provoca su disociacin del MT.

Kinesinas-C contribuyen a alinear los MTs polares y traccionan

sobre los centrosomas
Las kinesinas-C poseen las cabezas motoras en el terminal
carboxilo y se translocan hacia el extremo (-) de los microtbulos.

La actividad de kinesinas-C
contribuye a alinear los MTs
polares y adems tracciona
sobre los polos.

Lodish et al., 2004

Kinesinas bipolares (tetramricas) y dinenas contribuyen a

la separacin de los centrosomas
BimC, Eg5 son kinesinas bipolares que se unen a MTs polares
antiparalelos y se translocan hacia el extremo + de los MTs.

Junto a las las dinenas

corticales las kinesinas
bipolares separan los
polos en prometafase
y forman el huso bipolar.
dinena
cortical

Lodish et al., 2004

El rol de kinesinas en el ensamble del huso mittico ha sido examinado

in vitro a partir de extractos de huevos de Xenopus
La inactivacin de la kinesina bipolar Eg5 con la droga monastrol produce un huso
monopolar. Los microtbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (en
rojo). El DNA se marc con Hoechst (azul).
+ monastrol

huso normal

huso monopolar

T. Mitchison lab

La estructura y dinmica del aparato mittico depende de la actividad

coordinada y combinatorial de diferentes motores
Dinenas corticales que actan sobre los MTs astrales y kinesinas-C (-) que actan sobre los MTs polares
antiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso.

interfase/profase

La asociacin de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona media

contribuye a una nueva elongacin del huso hasta alcanzar un estado estacionario.

prometafase/metafase

Sharp et al, Nature 2000

La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distinta

polaridad altera la longitud del huso
En las figuras se muestran los husos mitticos de clulas de
levadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde)

normal spindles

overexpression
of kinesin-C

overexpression
of bipolar kinesin

(B) clulas de levaduras normales

(C) clulas que sobreexpresan la kinesina-C Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso.
(D) clulas que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.

captura de cinetocoros por microtbulos del huso

transporte y alineamiento de cromosomas en la
placa ecuatorial

Prometafase: la inestabilidad dinmica de los microtbulos y la actividad

de motores (+) son esenciales para la captura de los cinetocoros

dinmica de los microtbulos

rol de motores de polaridad (+)

CENP-E

CENP-E: centromeric protein-E

Lodish et al., 2004

Prometafase: los cromosomas transportados a la placa ecuatorial

exhiben un movimiento oscilatorio
Los movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a centrosomas,
que al actuar sobre los MTs del cinetocoro traccionan los cromosomas hacia los polos; b) motores unidos a la
cromatina que se translocan hacia el extremo (+) de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas
hacia la placa de metafase; c) eventos de polimerizacin y depolimerizacin de los MTs del cinetocoro.

(c)

(b)

Lodish et al., 2004

El cinetocoro es un complejo proteico ensamblado

sobre la regin centromrica de los cromosomas

MCAK es una kinesina-M asociada

a la capa externa del cinetocoro y
que depolimeriza el MT.
CENP-E es una kinesina (+) asociada
a la corona fibrosa del cinetocoro.
Protenas de control o
checkpoint mittico
tambin se localizan
en el cinetocoro.

(MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin)

Lodish et al., 2004

DNA centromrico. Levaduras

Alberts et al., 2002

En metafase el cinetocoro de cada cromtide ancla

microtbulos del correspondiente polo
microscopa electrnica de
barrido de cromosoma de metafase
Inmunolocalizacin de cinetocoros (rojo)

centrmeros

MTs

cromosomas

cromtides

Metafase: los microtbulos de los cinetocoros exhiben

un estado dinmico de "treadmilling"
Demostracin experimental del treadmilling. Se muestra un huso mittico ensamblado in vitro.
Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). La
marca verde representa una fraccin de tubulina-fluorescena activable por un pulso de luz.
Note que la fluorescena activada se desplaza hacia el polo izquierdo.
DNA
microtbulos

fotoactivacin de la
fluorescena unida a la
tubulina mediante
un pulso de UV
suministrado dentro de
la regin marcada (verde)
1.5min

En el "treadmilling" la adicin de subunidades de

tubulina en el extremo (+) es balanceado por el
desensamble de subunidades en el extremo (-).

2.5min

Visualizacin del treadmilling de MTs de metafase

empleando trazasde tubulina fluorescente
La tcnica consiste en agregar a la preparacin de tubulina trazas de tubulina
fluorescente (rojo), de modo que sta se incorpora a los microtbulos con baja
frecuencia, generando un patrn de trazas o speckles fluorescentes.

pendiente de la lnea formada

por la posicin de las trazas a
distintos tiempos.

distancia

En (A) se esquematiza un microtbulo marcado con trazas(speckles) de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra
una fotografa del huso marcado marcado con las trazas de tubulina fluorescente. La posicin de las marcas fluorescentes
individuales en funcin del tiempo se visualizan en franjas (slices) alineadas del huso, registradas por videomicroscopa
(asterisco) (C). La velocidad calculada de translocacin de la tubulina en los microtbulos es de 0.75 m/min.

Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001

traccin de los cinetocoros hacia los polos

Anafase A: acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTs
Anafase B: separacin de los polos por accin de kinesinas bipolares

Transicin metafase
anafase
separacin de las cromtides

metafase

anafase

Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomas

durante la anafase
ANAFASE A: Depolimerizacin de los
MTs de los cinetocoros
en los cinetocoros y en los polos.

ANAFASE B: Deslizamiento entre MTs antiparalelos

polares en el plano ecuatorial mediado por kinesinas
(+). Tambin fuerzas de traccin ejercidas por
dinenas corticales.

Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de los

cinetocoros en el extremo (+).
Experimentos de fotodestruccin (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerizacin
de los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora.

regin
fotodestruda

Gorbsky et al JCB 1988

El acortamiento de los MTs del cinetocoro tambin es demostrado

empleando protenas fluorescentes fotoactivables
Tubulina conjugada a fluorescena fotoactivable es microinyectada en clulas e incorporada al huso.
Al comienzo de la anafase, la fluorescena es activada (zona verde). Note el avance de los cromosomas
sobre la marca y tambin el movimiento hacia el polo (indicado con una flecha).

MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro que

promueve la depolimerizacin del extremo (+) de los
MTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidos
los cromosomas a los MTs durante su acortamiento.

Zhai et al JCB 1995

Identificacin de kinesinas que

inducen el desensamble de los
MTs en el cinetocoro y los polos

En este experimento, se demuestra que la kinesina KLP10A

es requerida para el flujo de tubulina hacia los polos.
La inhibicin de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo.

Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK,

XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen a
los extremos de los MTs e inducen su
desensamble.
pole

En estas kimografas de MTs con trazas de tubulina-rodamina

se demuestra que la kinesina KLP59C es requerida para el
movimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibicin de
KLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de pac-man.

pole

disassembly
disassembly

Rogers et al, Nature 2004

En la anafase B el huso es elongado por la accin

coordinada de kinesinas y dinenas

La inactivacin de las kinesinas-C (-), y la accin de las kinesinas bipolares (+) en conjunto
con dinenas corticales contribuyen a la separacin de los polos en la anafase B.

anafase B

Sharp et al, Nature 2000

Deslizamiento entre microtbulos antiparalelos

en la zona media del huso

Sntesis de las distintas funciones de las protenas motoras en la mitosis

Motores (+) unidos a los brazos de los cromosomas
(cromokinesinas) transportan a los cromosomas
hacia la placa ecuatorial.

Motores (-) anclados a la

corteza celular (dinenas)
contribuyen a elongar
el huso.

La movilidad del cinetocoro

involucra dos tipos de motores:
1) motores (-) asociados a
la corona fibrosa traccionan
los cromosomas hacia los polos;
2) motores en el interior del
cinetocoro promueven el
desensamble de los MTs y el
anclaje de los cromosomas
al extremo (+).

(1)
(2)
(2)

(Divisin del citoplasma)

Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis:
1. La inactivacin de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1.
2. La asociacin de MTs antiparalelos en la regin central del huso que es
requerida para el ensamble del anillo contrctil.

La citoquinesis comienza durante la anafase

El primer cambio morfolgico visible de la citoquinesis en una clula

animal es la aparicin de un surco en la superficie

Microscopa electrnica de barrido mostrando el surco de clivado en

la superficie de una clula huevo de anfibio

La estructura molecular que subyace el surco superficial

de clivado es un anillo contrctil de actina y miosina

actina

miosina II

Dos modelos proponen roles opuestos de los microtbulos

en la formacin del anillo contrctil
El modelo de relajacin astral propone que los microtbulos astrales inhiben la contractilidad en la
regin adyacente a la corteza de los polos. Esto, sin embargo, permitira la contraccin en la corteza
ecuatorial de la clula. El modelo alternativo de la estimulacin astral propone que los microtbulos
astrales suministran una seal positiva que induce la contraccin en la corteza ecuatorial.

La asociacin de microtbulos polares antiparalelos en la zona media

es esencial para la citoquinesis
La asociacin de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) es mediada por la kinesina ZEN-4.
La unin de ZEN-4 a los MTs es inhibida por fosforilacin mediada por Cdk-ciclinas M. Posterior a la anafase,
las Cdks-ciclinas M son degradadas y ZEN-4 es defosforilada por la fosfatasa Cdc14.

APC

Cdk-M

Cdh1

ZEN-4 Cdc14

MLC

microscopa electrnica de barrido mostrando

dos clulas a punto de finalizar la citocinesis

microscopa electrnica de transmisin mostrando

el cuerpo medio

matriz
densa

MTs de la
zona media

Experimento que demuestra el rol de la miosina II en la citocinesis

La miosina II es inhibida por fosforilacin mediada por CDK-ciclinas M. Durante telofase, la activacin
de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 y promueven la defosforilacin de la miosina y su
asociacin con el anillo de actina. La contraccin del anillo forma el surco de clivado.