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CITOTOXICIDADE DE BIOPOLMERO DE CANA-DE-ACAR*

Clia Maria Machado Barbosa de Castro 1
Jos Lamartine de Andrade Aguiar 2
Francisco de Assis Dutra Melo3
Wylla Tatiana Ferreira e Silva 4
Esdras Marques 5
Dinalva Barros da Silva 5

Cartro CMMB, Aguiar JLA, Melo FAD, Silva WTF, Marques E, Silva DB. Citotoxicidade de biopolmero de
cana-de-acar. An. Fac. Med. Univ. Fed. Pernamb. Recife, 49(2), p.119-123, 2004.
RESUMO: A citotoxicidade in vitro de exopolissacardeo produzido por sntese de Zoogloea sp a partir
de melao de cana-de-acar foi avaliada por meio do ndice de adeso, produo de xido ntrico e viabilidade celular de macrfagos alveolares de ratos. Em poos de cultura Baxter(R), macrgagos alveolares de
ratos foram expostos a membranas de exopolissacarideo (biopolmero), pilitetrafluoretileno (PTFE), e telas
de polipropileno em meio de cultura RPMI 1640. As mdias das respostas citotoxicas dos macrfagos em
oito ensaios, para cada material, foram avaliadas e comparadas entre os trs materiais testados e um controle
com meio de cultura apenas. O ndice de adeso foi de 92% no controle, e nas membranas de PTFE 88%,
polipropileno 93% e biopolmero 87%. A concentrao de xido ntrico produzida foi de 40,2mMol para
PTFE, 46,3mMol para polipropileno e 40,0mMol para biopolmero contra 52,0mMol para controle com o meio
de cultura, e de 73,3mMol em um meio adicionado de LPS. O percentual de viabilidade celular determinado
atravs do ensaio do MTT no controle foi de 100%, no PTFE de 91,2%, no polipropileno 43,6% e no
biopolmero de 95,3%. As membranas de biopolmero e de PTFE no apresentaram resposta txica para as
clulas em cultura. O biopolmero de cana-de-acar apresentou alta biocompatibilidade frente aos trs
ensaios de citotoxicidade utilizados.
UNITERMOS: Biopolmero de cana-de-acar; Citotoxicidade.

INTRODUO
O biopolmero de cana-de-acar um exopolissacarideo
obtido por sntese bacteriana, Zoogloea sp, a partir de melao de cana-de-acar. O biopolmero foi sintetizado
inicialmente na Estao Experimental de Cana de Acar de
Carpina, da Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, a partir de 1990. O processo de produo foi
otimizado, obtendo-se no presente uma taxa de converso
de 50%.
A partir de 2001 foi desenvolvida, no Ncleo de Cirurgia
Experimental da UFPE, uma srie de ensaios qumicos com
o objetivo de adequar o biopolmero, em estado de pureza,
para diversas aplicaes cirrgicas. A estrutura qumica do
biopolmero puro foi determinada, e est constituda por
diferentes monossacardeos: glicose 87,57%, xilose 8,58%,
ribose 1,68%, cido glicurnico 0,83%, manose 0,82%,
*

Apoio CNPq. Processo 62.0131/2004-7 ACT

Profa. Dra. Adjunto do Depto. de Medicina Tropical, CCS - UFPE
Prof. Dr. Adjunto do Departamento de Cirurgia, CCS - UFPE
3
Pesquisador da Estao Experimental da Cana-de-Acar - UFRPE
4
Pesquisadora do Depto. de Nutrio - UFPE
5
Alunos do Programa de Ps-Graduao em Cirurgia, CCS - UFPE
1
2

arabinose 0,37%, galactose 0,13%, ramnose 0,01% e fucose

0,01%.
A apresentao do biopolmero, em forma de membranas, vem sendo utilizada em diferentes projetos de pesquisa e em curativos cirrgicos e slins, para o tratamento da
incontinncia urinria3,4.
Os testes de citotoxicidade so os primeiros ensaios
para a avaliao da potencialidade de aplicao clnica de
um novo material.
Com o objetivo de definir a citotoxicidade do biopolmero
de cana-de-acar, aps o seu tratamento de purificao,
foi avaliada a resposta citotoxica de macrfagos alveolares
de ratos ao biopolmero e a dois materiais de uso corrente
em cirurgia, membranas de PTFE e telas de Polipropileno.
Os testes empregados foram a determinao do ndice de
adesividade, concentrao de xido ntrico e o percentual
de viabilidade celular atravs do ensaio do MTT.
Correspondncia: Clia M.M. Barbosa de Castro
Laboratrio Imunopatologia Keizo Asami
Universidade Federal de Pernambuco
50670-901 - Recife-PE
E-mail:ccastro@lika.ufpe.br

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MTODOS
Obteno de macrfagos do lavado broncoalveolar
(LBA).
Animais foram anestesiados e colocados em superfcie
plana de parafina, em decbito dorsal. Objetivou-se com
isso, realizar o procedimento cirrgico de traqueostomia.
Inicialmente, fez-se assepsia da rea com lcool etlico a
70%, em seguida, cortou-se os plos e a pele na poro
mdia do pescoo, abrindo-se e afastando-se as camadas
musculares at obter acesso traquia. Com pina, isolouse a traquia e, com uma tesoura, fez-se pequeno orifcio
entre dois anis traqueais na poro ventral da mesma. Inseriu-se uma cnula plstica acoplada a uma seringa com
3mL de soluo de NaCl a 0,9%, temperatura ambiente.
Vrias alquotas foram injetadas e aspiradas. O LBA recolhido, mais ou menos 30mL foi depositado em tubo de centrfuga tipo Falcon de 50mL. Em seguida, do precipitado
obteve-se as clulas, que foram contadas utilizando-se cmara de Neubauer.
Para os ensaios, os macrfagos provenientes do LBA, e
aps contagem, foram transferidos para poos de 35mm de
dimetro, em placas de culturas de tecidos com 6 poos
cada, com uma densidade de 1X106clulas/mL em um total
de 2mL de meio de cultura RPMI 1640 completo (com penicilina e estreptomicina em doses habituais) para cada poo.
As placas foram mantidas em estufa a 37C, sob atmosfera
mida, 5% CO2 por 60 minutos.
Foram formados os diferentes grupos. O grupo controle
formado pelas clulas no expostas s diferentes membranas e outros 3 grupos formados com clulas expostas s
diferentes membranas. O grupo da membrana de
pilitetrafluoretileno (PTF); O grupo da membrana de
polipropileno e o grupo da membrana do biopolmero. Foram realizadas 8 repeties por grupo.
ndice de aderncia: Para os ensaios, macrfagos provenientes do LBA foram transferidos para poos de 35 mm
de dimetro, em placas de culturas com densidade de 1X106
clulas/mL no total de 2mL de meio de cultura RPMI 1640
completo por poo. As placas foram mantidas em estufa a
37C, atmosfera mida e 5% CO2 por 60 minutos. Em seguida, alquotas de 10mL da amostra foram levadas para cmara de Neubauer para contagem das clulas no aderidas em
uma diluio de 1/10 em azul tripan. O clculo do ndice de
aderncia foi realizado, empregando-se a frmula de Segura
et al, 19975.

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IA=100- clulas no aderidas/mL X 100.

n inicial de clulas/mL
Anlise da liberao de xido ntrico (NO): A produo de xido ntrico foi determinada a partir do sobrenadante
das clulas em cultura. A concentrao de nitrito uma
medida indireta da sntese de NO.
As clulas foram deixadas em uma concentrao de
2X106 clulas/ml em estufa incubadora. Aps 24 horas, 500ml
do sobrenadante das culturas celulares foram removidos e
colocados em tubos de ensaio. Foram acrescentados 500ml
do reagente de Griess (1,5% de sulfanilamida em 5% de
H3PO4, 0,1% em H20 de naftiletilene diamine diidrocloride).
Um volume de 500ml do reagente foi misturado com 500ml
do sobrenadante e incubado a temperatura de 37 C por 10
minutos. Aps repouso de 10 minutos temperatura ambiente, realizou-se a leitura em espectrofotmetro, com filtro
de 550nm. A concentrao de nitrito foi calculada pela mdia de uma curva padro de NaNO2 e os dados foram expressos em mMol de nitrito.
Ensaio do MTT: O MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) o sal
tetrazolium que, aps clivagem por desidrogenases
mitocondriais de clulas, torna-se insolvel em gua pela
formao de cristais de formazan e solveis em solventes
orgnicos. Em meio de cultura com clulas, aps adio de
Dimetil Sulfxido (DMSO-solvente orgnico), o MTT convertido em formanzan solubilizado e pode ser lido por
espectrofotometria em funo desta converso. Esta reao pode ser expressa em percentual de clulas vivas de
acordo com a absorvncia obtendo-se, o percentual da viabilidade celular. Para isso, aps completar o perodo de 18
horas, a placa de cultura de clulas foi retirada da estufa e o
sobrenadante de cada poo foi desprezado. Em seguida, a
monocamada de clulas foi lavada com 1mL de tampo
fosfato temperatura ambiente (PBS a 0,01M, pH 7,02) e
colocou-se na camada 550mL de PBS e 55mL da soluo de
MTT (5mg/mL). O contedo dos poos foi homogeneizado
e a placa foi envolvida com papel alumnio (para proteger da
luz). A placa foi incubada pelo perodo de 4 horas em estufa,
nas mesmas condies e, decorrido o tempo, foram acrescentados 200mL de PBS e 200mL de DMSO (SIGMA). Em
seguida, a camada de clulas foi raspada de cada poo da
placa por um scrape. Terminada esta etapa, o material foi
transferido para tubos Eppendorfs, envoltos em papel alumnio e agitados em vrtex para, em seguida, serem efetuadas

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as leituras do material de cada poo, em espectrofotmetro,

utilizando-se um comprimento de onda de 570nm. Os resultados foram expressos em percentuais de viabilidade dos
poos controles, estimuladas com LPS e dos poos de clulas expostas s diferentes membranas.

RESULTADOS
Realizou-se 8 repeties para cada material e para o grupo
controle. No houve alterao do ndice de aderncia nos
grupos das clulas expostas s membranas de PTF 8813%,
polipropileno 939% e biopolmero 8713% quando comparados ao grupo controle (9213%). Teste de Mann-Whitney,
valores de p=0,271; p=1,00; e p=0,404 (fig. 1).

O percentual de viabilidade celular foi calculado atravs

do ensaio do MTT. No grupo controle a viabilidade foi de
100% enquanto que nos grupos das clulas expostas as
membranas PTF foi de 91,2% e de biopolmero foi de 95,3%.
Esses grupos apresentaram alta viabilidade sendo semelhante viabilidade das clulas do grupo controle. Apenas
as clulas expostas membrana de polipropileno apresentaram baixa viabilidade quando comparadas as do grupo
controle (43,6%). Teste-t de Student, p=0.003 (fig. 3).

100
90
80
70

Controle

60
50

PTF
Polipropileno

40

Biopolmero

30
100

20

90
80
70
60
50
40
30
20
10

Controle
PTFE
Polipropileno
Biopolmero

10
0

Fig. 3. Percentual de viabilidade celular po rmeio do

ensaio de MTT

Fig. 1. ndice de adesividade

Para a determinao do xido ntrico produzido, utilizou-se um controle negativo (clulas em cultura) e um controle positivo (clulas em cultura estimuladas por LPS). As
clulas expostas s diferentes membranas tiveram ento a
produo de xido ntrico comparada a do grupo controle,
em 8 repeties. Assim, a concentrao de xido ntrico em
sobrenadante de cultura foi de 40,239,0mMoL para o PTF,
46,315,6mMoL para o polipropileno e 40,09,5mMoL para
o biopolmero contra 52,02,7mMoL do controle negativo e
73,3mMoL do controle positivo. Houve aumento da produo de xido ntrico apenas para as clulas do controle
positivo, ou seja, as clulas em cultura estimuladas com o
LPS. Teste-t de Student, p0,001 (fig. 2).

Quanto s absorvncias, encontrou-se os valores de

0,07730,0423 para o grupo controle, 0,06400,0501 para o
PTF, 0,1990,0863 para o polipropileno e 0,06990,0290 para
o biopolmero. Encontrando-se, assim, elevada absorvncia
para o grupo polipropileno (0,1990,0863) quando comparado ao grupo controle e os demais grupos (fig. 4).

0,3
0,25
0,2
0,15
0,1

Controle
PTF
Polipropileno
Biopolmero

0,05
0

Fig. 4. Absorvncia de sal de formalau formado aps a

morte celular

DISCUSSO
90
80
70
60
50
40
30

Controle
LPS
PTF
Polipropileno
Biopolmero

20
10
0

Fig. 2. Produo de xido ntrico em mMoL

A utilizao de cultura de clulas em pesquisas para

estudo de biocompatibilidade de materiais tem avanado
bastante nos ltimos anos. Experimentos celulares
laboratoriais possibilitam reproduzir condies e at reaes semelhantes s ocorridas no organismo podendo, dessa forma, observar e quantificar alteraes sofridas pelas
clulas frente a um determinado produto ou medicamento,
bem como o comportamento de cada componente celular

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isoladamente, restringindo o nmero de variveis6.

Macrfagos so clulas que, aps o contato com
um agente agressor, agem liberando citocinas e mediadores
pr-inflamatrios que iniciam e amplificam o processo inflamatrio5. Estas clulas participam diretamente de toda a
resposta do organismo frente a qualquer estmulo agressor
fsico, qumico ou bacteriano7-9. Desta forma, as alteraes
morfolgicas e funcionais dos macrfagos podem ser avaliadas in vitro10.
A aderncia a primeira etapa necessria para o desenvolvimento da reao inflamatria e da fagocitose11.
Tcnica de avaliao do IA de macrfagos, aps tratamento com drogas, materiais e medicamentos tm sido preconizadas12. Assim, os macrfagos, quando esto em RPMI,
meio rico em nutrientes e fatores de crescimento celular,
apresentam sua adesividade normal, constatada atravs do
clculo do ndice de aderncia ao plstico (IA). A ativao
ou no, do macrfago, proporcionada por uma substncia
adicionada ao meio de cultura, pode alterar o ndice de aderncia, indicando seu potencial citotxico9.
No presente estudo, o exopolissacarideo utilizado para
os ensaios de citotoxicidade correspondia a um produto
acabado, esterilizado e acondicionado em envelopes de
polietileno em meio a uma soluo de preservao de lcool
isoproplico a 86%, pronto para a aplicao cirrgica.
O ndice de adesividade de macrfagos expostos a dois
produtos comerciais de aplicao cirrgica (membranas de
PTFE e telas de polipropileno) e ao biopolmero, no foi

alterado, quando se comparou as clulas no expostas s

diferentes membranas com o ndice de aderncia das clulas do grupo controle. Para este parmetro os macrfagos
no mostraram alterao.
O xido ntrico um mediador de inflamao e pode ser
produzido por macrfagos, clulas endotliais e outras clulas, quando estimuladas11. Nesta pesquisa, a determinao de xido ntrico produzido pelos macrfagos expostos
aos trs materiais, PTFE, Polipropileno e o Biopolmero comparada a um controle negativo e a um positivo pela adio
de lipopolissacarideo, LPS de E. coli, resultou em uma produo de xido ntrico pelos macrfagos expostos ao
biopolmero semelhante do grupo controle e bastante reduzida quando comparada ao controle positivo.
Outro aspecto da resposta de citotoxicidade avaliado
no presente estudo, foi a viabilidade celular. Para isto, utilizou-se o ensaio do MTT. A avaliao da viabilidade celular
frente aos produtos testados, PTFE, polipropileno e
biopolmero, contra o controle, foi encontrado uma viabilidade mdia de 95,3% para o biopolmero e de 100% para o
controle com apenas o meio de cultura.
Os trs testes de citotoxicidade empregados demonstraram que o biopolmero de cana-de-acar apresentou
toxicidade semelhante ao PTFE e ao controle negativo ao
teste de MTT. O biopolmero de cana-de-acar apresentou uma baixa citotoxicidade a um nvel que permite a sua
aplicao experimental com segurana.

Cartro CMMB, Aguiar JLA, Melo FAD, Silva WTF. Sugar cane biopolymer cytotoxicity . An. Fac. Med.
Univ. Fed. Pernamb. Recife, 49(2), p.119-123, 2004.
ABSTRACT: The in vitro cytotoxicity of expolysaccharide produced by synthesis of Zoogloea sp from
sugarcane molasses was evaluated by the adhesion index, nitric oxid production and rat alveolar macrophage
cells. In a Baxter(R) culture cell plates, rat alveolar macrophages were exposed to exopolyssacharide membranes
(biopolimer), polytetrafluoretilene PTFE and polypropilene mesh in a RPMI 1640 culture medium. The
cytotoxicity mean response of the macrophage in eight asays for each material was evaluated and compared
with three studyed and, also with three test materials and one control with culture medium only. The adehsion
index was 92% in the control and in the PTFE membranes 88%, polypropilene mesh 93% and byopolimer 87%.
The nitric oxide concentration was 40.2mMoLfor the PTFE, 46.3mMoL for the poly propilene mesh and 40.0mMoL
for the biopolymer, against 52.0mMoL fot the control with culture medium only and 73.3mMoL when LPS was
additioneted. The cell viability determinated by the MTT assay in the control was 100%, in the PTFE was 91.2%,
in the polypropilene mesh was 43.6% and in the biopolymer was 95.3%. The PTFE and the biomembrane did not
demonstrate cytotoxicity response to the cells in culture medium. The sugarcane biopolymer membrane presented
a high biocompatibility in the three cytotoxicities assays.
KEYWORDS: Sugar cane biopolymer; Cytotoxicity.

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