UNIVERSIDAD DE CRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

PROGRAMA DE BIOLOGA
PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN DE MOSQUITOS CON UN
MTODO SIN FENOL
CRISTIAN MORENO C, ESTER GUERRA S, MARIA J PATERNINA, MARIA P
VARGAS.

RESUMEN
El procedimiento de extraccin del ADN geonmico sigue ciertas pautas para su
correcta purificacin que son muy diferentes a los empleados en la purificacin de
protenas. Existen varias tcnicas que se utilizan para la extraccin de ADN; en
esta prctica se trabaj con el mtodo de extraccin de ADN sin fenol, en donde lo
primero en hacerse fue quitar la cabeza a los mosquitos debido a que esta puede
contaminar la muestra dado que posee parsitos.
Luego de ya tener 3 mosquitos en el tubo de Eppendorf lo siguiente es el
rompimiento de membranas con solucin de lisis y ayudar con el maceramiento,
posteriormente precipitacin de protenas por medio de las altas concentraciones
de sales como acetato de potasio para la precipitacin de estas y posteriormente
precipitar ADN con etanol absoluto frio ya que este ayuda a purificar la muestra de
ADN eliminando las protenas presentes al solubilizarlas en la misma solucin de
etanol, adems elimina impurezas orgnicas al solubilizarse en el mismo por ser
un compuesto orgnico el etanol el etanol hace que el ADN se deshidrate, es
decir, pierda contacto con las molculas de agua que lo rodean y por eso al final lo
que hacemos es rehidratarlo con el buffer TE.
Palabras claves: Extraccin de ADN, fenol, mosquito, DNA.

INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico o ADN
(DNA) es la molcula que guarda el
cdigo gentico de todas las clulas.
Sin importar que el organismo sea
multicelular o unicelular, eucariota o
procariota, todos tienen el DNA como
vehculo de su cdigo gentico.
La extraccin del ADN es el primer
paso
de
muchas
tcnicas

moleculares. A pesar de su aparente

sencillez,
a
menudo
existen
problemas con el rendimiento de los
mtodos, la calidad del ADN obtenido
encontrndose
posibles
contaminantes,
degradaciones
parciales. As como el tiempo de
duracin de los protocolos. El empleo
del nitrgeno liquido como variante en
los protocolos de extraccin de ADN

de diferentes especies ha permitido

aumentar el rendimiento y la calidad
del material gentico obtenido (Mann
et al. 1989; Kang et al. 2004; Nichols
et al. 2004). En varias familias de
insectos esta variante ha sido
empleada, demostrndose adems
del aumento del rendimiento su
posible
empleo
en
tcnicas
moleculares
comprobndose
la
calidad del ADN resultantes.
La extraccin de ADN de una
muestra celular se basa en el hecho
de que los iones salinos son atrados
hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolucin y posterior
extraccin
de
la
clula.
Se empieza por lisar (romper) las
clulas mediante un detergente o un
buffer
de
lisis, vacindose su
contenido
molecular en una
disolucin
tampn
en la que se
disuelve el ADN. En ese momento, el
tampn contiene ADN y todo un
surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, protenas y otras
sustancias en menor proporcin.
Las protenas asociadas al ADN, de
gran longitud, se habrn fraccionado
en
cadenas ms pequeas y
separadas de l por accin del
buffer de lisis. Slo queda, por tanto,
extraer el ADN de esa mezcla tampn
y detergente, para lo cual se utiliza
etanol frio, quien actua en la
purificacin del ADN.

OBJETIVOS

Extraer DNA de mosquito sin el

uso del fenol.
Aprender las pautas para la
extraccin de DNA en insectos.

MATERIALES Y REACTIVOS

2 Mosquitos
Pinza
Bistur
EstereoscopiO
Tubo eppendorf 1.5ml
Buffer de lisis
Incubadora
Acetato de potasio
Macerador pequeo
Hielo
Etanol absoluto
Etanol frio al 70%
Buffer TE
Nevera
METODOLOGIA

1. Realizacin de la diseccin de las

patas alas y la cabeza de un
mosquito.
2. Se colocar la zona abdominal, las
patas y las alas del mosquito en un
tubo eppendorf de 1.5 ml.
3. Adicionamos 50 ul de buffer de lisis
para homogenizar la muestra.
4. Maceramos bien, hasta que la
muestra homogenice.
5. Incubamos a 65 por 30 minutos.

6. Agregar 15 ul de acetato de potasio

y mezclar suavemente por inversin.
7. Incubar durante 30 minutos en
hielo.
8. Centrifugar a 13000 r. p. m. por 15
minutos, a 4C.
9. Pasar el SND a un tubo nuevo.
10. Adicionar 100Ul de etanol
absoluto, mezclar suavemente por
inversin y
dejar a temperatura ambiente de 5 a
6 minutos, descartar el SND y lavar el
botn con 100ul de etanol frio al 70%.
11. Centrifugar a 13000 r. p. m. por 5
minutos, a 4C y descartar el SND.
12. Dejar secar el pellet 20 min y
resuspenderlo en 150 ul de buffer TE
por 10 minutos y almacenar a -20C.
ANALISIS DE RESULTADOS
En un procedimiento de laboratorio
los materiales son muy importantes y
cada uno cumple un papel especfico
en nuestros procedimientos. En esta
prctica se realizar un mtodo en el
cual no usaremos fenol ya que si lo
utilizramos
necesitaramos
compuestos orgnicos txicos para la
salud de los seres humanos y para el
ambiente.
Para realizar la extraccin de ADN de
moquito en este caso se utilizaron 3
de ellos , a los cuales se en primera
instancia
a cortarles la cabeza ya
que esta posee parsitos los cuales

pueden contaminar la muestra; se

obtuvo
ADN de mosquito
mediante el mtodo
de altas
concentraciones de sales. Se utiliz
buffer de lisis, cuya funcin
es
romper
la membrana celular y
nuclear, permitiendo esto la
liberacin del ADN.
Posteriormente se le adiciono acetato
de potasio (AcK) el cual precipita las
protenas, y su eficiencia aumenta al
incubarlo en hielo. El AcK es una sal
neutra;
se
aade una sal para
disminuir la solubilidad de las
protenas por
incremento
de la
fuerza
inica
del
solvente.
Despus de la adicin
de cierta cantidad de sal, se
establece una competencia entre los
grupos cargados y polares de la
protena y los iones de la sal (en
mayor cantidad) por las molculas de
agua que disminuye la capa de
solvatacin alrededor de la molcula
proteica, sus grupos hidrofbicos
superficiales se
exponen y se
favorece el establecimiento de
interacciones intermoleculares, la
agregacin y por tanto, la
precipitacin. Luego se centrifugo y
se obtuvo un precipitado blanco.
Posteriormente
en
otro
tubo
eppendorf que contena etanol
absoluto
se
le
adiciono
el
sobrenadante del tubo que se haba
centrifugado; luego se centrifugo el
tubo que contena el ADN con alcohol
absoluto esto con el fin de precipitar
el

ADN. Posteriormente la muestra es

lavada y precipitada con etanol frio al
70% del cual el 40% es etanol y el 30
% es agua. El etanol se encarga de
precipitar el ADN, pues este, es
soluble en
agua
(y, por tanto, invisible a nuestros
ojos, pues cada
molcula est
rodeada de agua y nuestra vista no
percibe molculas individuales
de
ADN) pero insoluble en etanol, lo
cual origina que en presencia de ste
se aglutine o "se precipite". Al
aglutinarse, el ADN forma partculas
macroscpicas y se hace visible.
Finalmente el ADN es resuspendido
en buffer TE, el cual es una solucin
amortiguadora del pH, con el fin de
proteger el DNA. La capacidad
amortiguadora del
buffer depende del Tris, mientras que
el EDTA es el responsable de
proteger
a los cidos nucleicos
inactivando a las DNAsas.
El
EDTA logra esta
inactivacin actuando como
quelante de cationes divalentes como
el Ca2+ y el Mg2+ los cuales
son indispensables para el
funcionamiento de estas enzimas.
Por ltimo se almaceno a -200C para
su conservacin.
CONCLUSION
Durante este procedimiento se ha
logrado familiarizarse un poco con los
procesos de extraccin de ADN, y
entendemos que como en todo
proceso se siguen una serie de pasos
o protocolos los cuales ayudan a un
eficiente resultado. Este proceso tuvo

unos puntos claves rompimiento de

membranas,
precipitacin
y
purificacin. La solucin de lisis
rompe las membranas celulares,en la
presipitacion actuando el acetato de
potasio debido a que es una sal
neutra y la purificacin por medio del
etanol y rehidratacin por el buffer
TE.

BIBLIOGRAFIA

ALBERTS B., JOHNSON A.,

LEWIS
J.,
RAFF
M.,
ROBERTS K., WALTER P.
Biologa molecular de la
clula. Omega.
4Edicin
(2004)
Miller, S.A., Dykes, D.D. and
Polesky, H.F. (1988) A simple
salting out procedure for
extracting DNA from human
nucleated cells. Nucl. Acids
Res. 16, 1215.

Gerald karp. Biologa celular y

molecular. ED McGrawHill
1998.Pg. 727-730.

Biologa Molecular y Herencia.

Robert A. Wallace, Jack L.
King,Gerald P. Sanders., 1a
edicin.
Editorial
Trillas.
Mxico 1991: pgina97, 98.