Desarrollo de las proyecciones retinianas y respuesta a la entrada fotica en el ncleo

supraquiasmatico en conejos blancos de Nueva Zelanda.

Abstract
En las cras de conejo, el amamantamiento por la madre es la seal de arrastre que prevalece
por su ritmo circadiano durante al menos las dos primeras semanas de vida. Por lo tanto, se
considera un modelo natural de alimento con actividad anticipatoria. Sin embargo, el arrastre
ftico del sistema circadiano en cras de conejo durante esta etapa de desarrollo no est bien
entendido. El presente estudio examin las proyecciones de la retina al ncleo supraquiasmtico
(SCN) y las respuestas funcionales del SCN a la exposicin de luz. Usando como trazador el
antergrado clera toxina-b, se analizaron las proyecciones de la retina a la SCN en los das
postnatales (PD) 1, 9, 19 y en los animales adultos. Los resultados revelaron que las
proyecciones de la retina estaban presentes en PD1 con una simetra bilateral y con tendencia
contralateral en PD19 y adultos. Tambin un estudio de la respuesta del SCN a un pulso de luz
mediante la evaluacin de la induccin de la protena FOS, un marcador de la activacin
neuronal, en PD1, 12, 19 y adultos. Inducida por la luz, FOS se observ durante el da y la noche
en PD1, pero sobre todo durante la noche en PD12, 19 y adultos. Llegamos a la conclusin de
que el SCN no es una "compuerta" mecanismo para la induccin de FOS por la luz, que se
desarrolla varios das despus de su nacimiento, al igual que en otros mamferos, y en el conejo
ya est presente en el PD12. Por otra parte, en contraste con otros mamferos altriciales, el
sistema visual circadiano, aunque no es esencial para arrastrar el ritmo durante las dos primeras
semanas de vida, est presente y funcional en cras de conejo desde el nacimiento.
Introduccin
En los mamferos, el ncleo supraquiasmtico (SCN) gobierna mltiples ritmos circadianos en el
cuerpo y este ncleo recibe informacin ftica por una proyeccin de la retina directa a travs
del tracto retinohipotalamico (RTH; Klein et al ., 1991) . La informacin transmitida por la luz del
RTH es la seal de arrastre principal para el reloj principal en los mamferos adultos. Los conejos
se utilizan en la investigacin de ritmo circadiano porque esta especie tiene un ritmo inusual de
la lactancia circadiano que es nico entre los mamferos. El amamantamiento diario de la madre
se produce slo unos pocos minutos cada da, pero con un patrn circadiano preciso (Hudson and
Distel, 1989; Jilge, 1993, 1995; Meza et al., 2011). Como consecuencia, metablicas, hormonales
(Escobar etal.,2000; Morgadoetal.,2008, 2010), parmetros de comportamiento y neuronales
(Allingham et al., 1998; Caba et al., 2003b, 2008) de las cras son arrastradas por el
amamantamiento circadiano y se consideran un modelo natural de la actividad anticipatoria en
alimentos (Caba andGonzalez-Mariscal,2009; Morgadoetal.,2011). Dada la importancia de los
conejos como modelo circadiano, es sorprendente que se sabe muy poco acerca de la fisiologa
del SCN y las proyecciones de la retina en esta especie.
Estudios previos en esta especie describen una proyeccin de la retina contralateral al SCN por
autorradiografa de aminocidos tritiados (Cooper et al., 1989; Hendrickson et al., 1972) en los
animales adultos, pero no se sabe nada acerca de la ontogenia del RHT en esta especie. En otros
mamferos altrcial, por ejemplo, ratas o hmster, muy pocos o ninguno con las proyecciones de
la retina se detectan en el da postnatal (PD) 1, y el patrn adulto se alcanza hasta PD10 o
PD15 , respectivamente, (Speh and Moore, 1993) poco despus de que abran los ojos. Cras de
conejo viven en una madriguera oscura con prpados cerrados y no reciben seales de luz hasta
que abran sus ojos alrededor de PD9-11 (Rapisardi et., 1975). Basado en esto, y teniendo en

cuenta los datos de las ratas y hmsters, predijimos que las proyecciones de la retina a la SCN
estn ausentes desde el nacimiento.

Como se seal anteriormente, nada se sabe sobre el desarrollo de la proyeccin de la retina a la

SCN y su respuesta a la luz de las cras de conejo. En el presente estudio, hemos explorado las
proyecciones de la retina a la SCN en las cras de conejo a PD1, PD9, PD19 y la edad adulta. La
proyeccin retinofugal se investigaron utilizando el trazador antergrado de la toxina del clera
subunidad B (CT-B), un trazador antergrado muy sensible comnmente utilizado para rastrear
eferentes de la retina. En adiccin, tambin se analiz la respuesta del SCN a un pulso de luz
mediante la evaluacin de la induccin de la protena FOS en PD1, PD12, PD19 y adultos, con el
fin de volver ideal las propiedades funcionales del sistema visual circadiano de esta especie.
Resultados
2.1 proyecciones Retinofugal
Todos de los 16 cerebros de los animales inyectados mostraron transporte antergrado de la CTB. Microfotografas representativas de la fig. 1 Mostraron proyecciones retinianas en el nivel
medio rostral-caudal del SCN en PD1, PD9, PD19 y adultos. (IR) fibras CTB-immnunoreactivity
salen de la parte dorsal del quiasma ptico para entrar en la parte ventral del SCN formando un
plexo denso en el ncleo. Es de destacar que las fibras estn presentes en el SNC desde PD1, y
las proyecciones se distribuye en todo el SCN en PD1 (fig1A), as como en PD9 (Figura: 1b), Sin
embargo, en PD19 (fig. 1C) y adultos (fig. 1S) grupos de distribucin de proyecciones se localiza
en la regin ventro lateral del SCN. En PD1 y PD9, las proyecciones de la retina inervan
relativamente simtricamente ambos lados de la SCN, mientras que en PD19 y adultos, las
proyecciones son principalmente contralateral, el anlisis cuantitativo confirma lateralizacin de
la proyeccin de la retina en PD19 y en sujetos adultos (p <0,001; Fig. 1E), mientras que a Pd1 y
PD9 no hay diferencias entre ipsilateral y contralateral
2.2 efectos pulso de luz
Las fotomicrografas de la fig. 2 muestran FOS-IR en el nivel medio del SCN en el control (CTR) y
el pulso de luz (LP) en grupos de PD1, PD12, PD 19 y conejos adultos durante la noche subjetiva
(01:00; 0500h) y el da subjetivo (13: 00,17:00 h), (L / D) del ciclo, 12/12; luces a las 07:00 h. En
los grupos de CTR, se observaron ncleos las FOS-IR en el SCN de las cras en PD1 comparacin
con los de PD12, PD19 y adultos. Pulsos de luz inducida FOS-IR, tanto durante el da y en la
noche PD1, pero slo durante la noche en PD12, PD19 y adultos. La Figura 3 muestra el anlisis
cuantitativo de los FOS-IR en los cuatro grupos de edad.
2.2.1 PD1
de dos vas anlisis de ANOVA indic que en PD1 hay una interaccin significativa de las
condiciones de luz y el tiempo en la induccin de FOS en el SCN (F3, 31 = 9,57, P <0,001).
Anlisis cuantitativo indic que en PD1 un pulso de luz induce significativamente FOS en SCN en
todo momento la prueba (f1, 31 = 198, p <0,001; fig 0.3). Adems, anlisis revela que la
respuesta al pulso de luz para cada regin del SCN como un factor adicional, mostr un efecto
patrn similar a la luz el VL (f3, 24 = 3.38, P = 0.034) y DM (F3, 24 = 7.36, P <0,01).

2.2.2 PD12
De dos vas anlisis de ANOVA indic que en PD12 hay una interaccin significativa de las
condiciones de luz y el tiempo en la induccin de FOS en el SCN (F3, 31 = 99, P <0,001). El
anlisis cuantitativo indic que en PD12 un pulso de luz induce significativamente FOS en SCN a
0:01 y 05:00 h (F1, 31 = 32,73, P <0,001), que fueron significativamente superiores a los valores
de grupo CTR (p <0,001 en el ambos casos; la figura 3). Adems, el anlisis revela que la
respuesta al pulso de luz para cada regin del SCN como un factor adicional, mostr un efecto
patrn similar en VL (f3, 24 = 3.38, P = 0,034) pero no en DM (F3, 24 = 7.36, P = 0,13).

2.2.3 PD19
De dos vas anlisis de ANOVA indic que en PD19 hay una interaccin significativa de las
condiciones de luz y el tiempo en FOS induccin en el SCN (F3, 31 = 11,87, P <0,001). El anlisis
cuantitativo indica que al PD19 una luz, pulso induce significativamente FOS en SCN en 1.00 y
las 05:00 h (f3, 31 = 16.88, P <0,001), que eran significativamente superiores a los valores de
grupo CTR (p <0,001 en ambos casos ; la figura 3). Adems, el anlisis revela que la respuesta al
pulso de luz para cada regin del SCN como un factor adicional, mostr un efecto patrn similar
en VL (f3, 24 = 12:03, P <0,001), pero no en la DM; (f3, 24 = 2,78 , P = 0,06)
2.2.4 Adultos
Dos vas de anlisis de ANOVA indic que en los adultos hay una interaccin significativa o
condiciones de luz y el tiempo en FOS induccin en el SCN (F3, 31 = 27.96, P <0,001). Anlisis
cuantitativo indic que en los adultos un pulso de luz induce significativamente FOS en SCN a las
0:00 y 05:00 h (F3, 31 = 04:13, P <0,001), que fueron significativamente superiores a los valores
de grupo CTR (P <0,01 ). Adems, el anlisis revela que la respuesta al pulso de luz para cada
regin del SCN como un factor adicional, mostr un patrn de efecto similar a la luz de la VL (F3
= 66.16, P <0,001) y DM (f3, 24 = 23.06, P <0,001)
3 discusiones
Este es el primer estudio exhaustivo de las proyecciones de la retina a la SCN y un examen de la
respuesta funcional a un pulso de luz desde el nacimiento hasta la edad adulta en el conejo.
Contrariamente a nuestra hiptesis, el resultado muestra que las fibras retinofugal estn
presentes en el SCN en PD1, y el patrn adulto de la proyeccin de la retina en no archivado el
PD9 cuando cerca de la abertura del ojo, pero hasta PD19. En contraste, estas proyecciones son
funcionales desde PD1. Sin embargo, a esta edad FOS induccin es ms fuerte durante el da,
mientras que a PD12, PD19 y adultos, la induccin FOS es ms fuerte durante la noche. nuestros
resultados sugieren que existe una "compuerta" mecanismo de la sensibilidad al FOS de
induccin durante la noche se desarroll alrededor de PD12 a los adultos, pero est ausente PD1.
Nuestro estudio confirma que en los conejos adultos, las proyecciones de la retina inervan ambos
lados de la SCN en un predominantemente patrn contralateral (Cooper et al, 1989;..
Hendrickson et al, 1972), similar al de otros mamferos adultos, incluyendo ratas (Johnson et al.,
1988), los ratones (Youngstrom y Nez, 1986), gatos (Murakami et al., 1989), y la diurna
discpulo Roden Arvicanthis niloticus (Smale y Boverhof, 1999). En contraste, la retina inerva
ambos lados de la SCN relativamente igual en PD1 y PD9 conejos como se muestra en la figura.
1. Esta diferencia entre los recin nacidos y personas adultas en conejos es similar a que se

observa en los hmsters, en el que prepuberal, pero no los animales adultos, tiene una simetra
bilateral de las proyecciones de la retina a SCN (Yellon et al., 1993).
Es de destacar que los conejos recin nacidos tambin presentan un regional nica inervacin de
las fibras de la retina a SCN al nacer en comparacin con otras especies de mamferos. Como se
muestra en el presente trabajo, en PD1 el SCN tiene densas fibras CTB-IR en todo el ncleo, un
patrn distinto de otros mamferos investigados. En ratas, a PD1, el SCN ha dispersado
varicosidades slo en la ventral frontera del ncleo, el aumento en la densidad en PD4 y
alcanzando el patrn adulto en PD10 (Speh y Moore, 1993). En hamsters, proyecciones retinianas
estn ausentes en el SCN en el nacimiento y no aparecen hasta PD4 en el ventrolateral SCN, a
continuacin, aumentar gradualmente el patrn adulto por PD15 (Speh y Moore, 1993). En
conejos, despus PD9, la alta densidad de la retina proyecciones en el SCN se podan, alejndose
de la regin dorsal del ncleo, y las fibras se encuentran principalmente en la regin
ventrolateral del SCN en sujetos PD19 y adultos.

Proyecciones de la retina son necesarios para la induccin de FOS en el SCN en respuesta a un

pulso de luz . En ratas, la luz induce c-fos la expresin de genes en PD1 ( Weaver y Reppert ,
1995 ) . en hmsters , la luz induce FOS en el SCN en PD4 (Kaufman y Menaker , 1994 ) . En
ambas especies , la RHT est presente en la momento de la aplicacin del estmulo , como ya se
ha mencionado . en ratones, la luz induce FOS en PD4 ( Muoz - Llamosas et al. , 2000 ) , ~
Aunque no hay datos disponibles sobre el desarrollo de la RHT , sin embargo , es probable que
las proyecciones de la retina no son presente en el nacimiento de esta especie , como un pulso
de luz en PD2 es incapaz de inducir FOS ( Muoz - Llamosas et al . , 2000 ) . Es ~ importante
mencionar que las diferencias en la respuesta de la SCN a la luz se ven afectados por el mtodo
utilizado , ya que el sensibilidad para la deteccin del gen c-fos es probablemente mayor que la
sensibilidad para la protena FOS . Tomando en conjunto , resulta en varias especies confirman
que incluso un par de proyecciones de la retina en el SCN , como en la rata neonatal , son
suficientes para inducir la expresin de genes tempranos inmediatos y protenas en el SCN en
respuesta a un pulso de luz , incluso pens que el ncleo es inmaduro. En contraste , cuando el
SCN est desprovisto de RHT proyecciones como en el hmster antes PD4 ( Kaufman y Menaker ,
1994 ) , y tal vez en los ratones a PD2 ( Muoz - ~ Llamosas et al. , 2000 ) , un pulso de luz es
incapaz de inducir FOS expresin . Nuestros resultados en el conejo en PD1 sugieren que
presencia de proyecciones de la retina en el SCN es necesario inducir FOS en respuesta a un
pulso de luz .
La distribucin de los RHT inervacin en los cambios SCN con la edad . En fibras PD1 y PD12
se distribuyen en todo el ncleo. Tambin la induccin FOS en las subregiones del SCN cambia
con la edad . Un pulso de luz en PD1 induce FOS con mayor expresin a las 13:00 h y las 17:00
h , y la induccin a estas horas se produce en todo el ncleo. Sin embargo , en este ltimo
edades el patrn de FOS inducida en los momentos de mayor expresin se limita principalmente
a la regin ventrolateral , como anteriormente establecido para conejos adultos ( Toledo et al . ,
2005 ) , as como en otros mamferos adultos incluyendo rata ( Rusak et al. , 1990 ) , ratn
( Coldwell y Foster , 1992 ) y el hmster ( Kornhauser et al , 1990 ; . . Rusak et al , 1990 ) . Esta
induccin de FOS en el regin ventral coincide con el predominio de la retina proyecciones en
esta rea en contraste con la regin dorsal .
La luz es el principal sincronizador de los ritmos circadianos en mamferos adultos y cras
gradualmente se vuelven ms sensibles a los luz ( Sladek et al. , 2004 ) . Una de las estrategias

para explorar cuando los sujetos comienzan a ser sincronizado por la luz es determinante cuando
los pulsos de luz inducir selectivamente la expresin de FOS protena slo durante la noche ,
pero no durante el da , como se ve en mamferos adultos ( Toledo et al . , 2005 ) . Presentar los
resultados indicar que , en el nacimiento y durante la primera semana de vida , el SCN de las
cras de conejo responde a la luz durante el da y subjetiva noche con una induccin ms alta
durante el da . En PD19 , la falta de sensibilidad a la luz durante el da, ya se ha establecido ,
como el patrn de FOS inducida por la luz, sobre todo durante la noche, es similar a sujetos
adultos . Este patrn en la respuesta de el SCN a la luz se considera un mecanismo (Weaver '' ''
gating y Reppert , 1995 ) en el que la luz induce inmediatamente temprano genes y protenas
slo durante la noche o de la noche subjetiva pero no durante el da o das subjetiva .
Dependiendo en la que horas de la noche o de la noche subjetiva del estmulo se entrega, el
estmulo induce ftica fase retrasos o adelantos de fase de la ritmicidad circadiana ( Rusak et al .
, 1990 ) . De acuerdo con nuestra resultados en el conejo , la puerta para la insensibilidad
durante el da no se establece en PD1 , similar a otros mamferos como la rata ( Weaver y
Reppert , 1995 ) , hmster ( Kaufman y Menaker , 1994 ) y ratones ( Muoz - Llamosas et al. ,
2000 ) , sino que se desarrolla varios das despus del nacimiento. Adems , nuestros resultados
sugieren tambin que en PD1 tambin hay un mecanismo de puerta diferente, como una luz
pulso inducido FOS principalmente durante el da . En PD12 , despus de los ojos apertura , cras
de conejos pueden ser arrastradas por el medio ambiente condiciones de iluminacin y al PD19
la respuesta de este sistema es similar a sujetos adultos como lo demuestra tanto por la
inervacin patrn cin de las proyecciones retinianas a la SCN y la la respuesta de este ncleo de
un pulso de luz slo durante la noche

Encontramos una expresin FOS en PD1 , en los sujetos de control que alcanza un pico al final
del da . Como ya se ha mencionado que , y otros, han demostrado que la lactancia de la madre
es un fuerte sincronizador de los ritmos de las cras y tal vez afectada Expresin FOS en el SCN .
Sin embargo, es importante sealar que esta sincronizacin afecta a ritmos principalmente
perifricos como la de la hormona corticosterona y metabolitos ( Rovirosa et al, 2005 ; . Morgado
et al, 2010 ) . . Ritmo FOS en SCN es principalmente afectada , independientemente de tiempo
de enfermera ( Caba et al. , 2008 ) . Sobre esta base, consideramos que las cras de conejo a
PD1 tienen un FOS ritmo endgeno , similar a los resultados previos ( Caba et al. , 2008 ) .
Finalmente, es importante mencionar que un pulso de luz durante el da redujo FOS en adultos
similares como se informa en otra especie que los degus roedores diurnos (Krajnak et al., 1997)
que sugieren una flexibilidad en el patrn de actividad del conejo como se inform anteriormente
(Jilge, 1991). Otros estudios, como una fase curva de respuesta en condiciones controladas, son
necesarios para explorar en detalle esta cuestin.
Llegamos a la conclusin de que en los conejos proyecciones retinales densos son presentar
en el SCN desde su nacimiento con una distribucin bilateral, que alcanza un patrn contralateral
en PD19 y adultos sujetos. Sin embargo, durante este proceso de desarrollo, SCN es funcional
desde el nacimiento, como se indica por la induccin de FOS por una pulso de luz. Finalmente,
postulamos que hay una compuerta mecanismo de la sensibilidad a un pulso de luz durante la
noche, que alcanza el patrn adulto entre los das postnatales 12 y 19.
4-Los procedimientos experimentales

4.1Animales y vivienda
Nueva Zelandia conejos blancos hembra criados en nuestra colonia en Xalapa, Veracruz, Mxico,
fueron alojados bajo un entorno controlado (L / D) ciclo de luz / oscuridad (12/12; luces a las
07:00 h), estable condiciones de temperatura (2372 1C) y provisto con conejo pastillas (Purina) y
agua ad libitum. Las hembras se aparearon y alojados individualmente en jaulas que tenan tres
compartimentos, uno para el nido y uno para la madre con un tnel entre ellos (Caba et al.,
2008). El compartimiento de la madre estuvo expuesta al ciclo de L / D, mientras que los
cachorros estaban en la oscuridad constante en el compartimento del nido. Las hembras se
monitoriza diariamente desde el da 28 de gestacin hasta el parto (PD0) y despus de las cras
de paricin se alimentaban una vez al da.
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comit de tica de la
Universidad Veracruzana, de conformidad con los procedimientos de la Gua Nacional para la
Produccin, Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO1999), que cumple con las normas internacionales de la Sociedad para la Neurociencia en el uso
tico de los animales.
4.2 Los grupos experimentales
4.2.1 toxina del clera subunidad B-

Los sujetos fueron asignados a uno de los cuatro grupos experimentales: PD1, PD9, PD19 y
adultos (8-10 meses de edad; n = 4 cada grupo). Los sujetos fueron anestesiados por va
intramuscular (im) con una mezcla de ketamina-xilazina (35-5 mg / Kg) antes de recibir un
unilateral intraocular 0,5% de CT-B (Lista Laboratories Inc., Camp-bell, CA) de inyeccin diluida
en 0,1% dimetylsulphoxide (DMSO) en la cmara posterior de su ojo izquierdo. PD1 sujetos
recibieron 3 ml, 5 ml, PD9 PD19 11 ml y adultos 24 ml de 1:1 de CT-B y DMSO solucin con una
jeringa Hamilton. La administra-cin fue lento, 2 ml/30 s, lavado con solucin salina de forma
continua, y la aguja se deja en su lugar durante 2 minutos con el fin de evitar derrames y el
reflujo de la solucin. Despus de este procedimiento, los sujetos fueron devueltos a sus jaulas y
se perfundieron 48 h ms tarde.

4.2.2. pulso de luz

Se explor el efecto de un pulso de luz en cuatro edades diferentes: PD1, PD12, PD19 y conejos
machos adultos (8-10 meses de edad). Pulso de luz (LP) los grupos se estimularon con un pulso
de luz brillante (900 lux) durante 60 minutos a cuatro veces diferentes, dos durante la noche a
las 01:00 h y las 05:00 h (n = 4 cada punto de tiempo) y dos durante el da en 13:00 h y de
17:00 h (n = 4 cada punto de tiempo). Los animales fueron perfundidos 30 min despus de la
conclusin del pulso de luz. Sujetos PD19 y adultos fueron liberados en la oscuridad 30, 34, 42 y
46 h antes de la estimulacin por el pulso de luz (Kaufman y Menaker, 1994; Sumova et al,
1998.). Para el control (CTR) grupos (n = 4 cada punto de tiempo), los sujetos de la misma edad
que el anterior fueron manipulados como LP grupos, pero que no recibieron el impulso de luz.
4.3.

perfusin

Los sujetos recibieron una sobredosis parenteral de pentobarbital sdico (100 mg / kg) y fueron
perfundidos transcardialmente con solucin salina (0,9%), seguido de 4% de paraformaldehdo
en tampn fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4). Los cerebros se retiraron inmediatamente despus de la
perfusin, secuencialmente crioprotegidas en 10%, 20% y 30% de sacarosa en PB. Los cerebros
fueron seccionados coronal a 50 mm con un criostato (Microm) en A23 1C. Las secciones
seriadas se recogieron en PB 0,1 M desde el nivel de los nervios pticos, antes de que el quiasma
ptico, a la zona hipotalmica anterior.

4.4.Immunohistochemistry
4.4.1.Cholera inmunohistoqumica toxina - B
Los cerebros fueron perforados en el lado de la inyeccin para mantener la orientacin . Una de
las cuatro secciones en serie se utiliz para el etiquetado de CT- B siguiendo protocolos similares
previamente establecido en nuestro laboratorio ( Caba et al. , 2003b , 2008 ) . El tejido se avado
en 0,1 M PB cuatro veces, 5 minutos cada uno , para eliminar el exceso y aldehdos luego se
expusieron durante 10 minutos en 0,5 % de hidrgeno solucin de perxido para eliminar la
actividad de peroxidasa endgena -dad . Reacciones inespecficas de anticuerpos tejido fueron
bloqueados por la colocacin de las secciones en 3 % de suero normal de caballo ( Vector
Laboratories) durante 1 h a temperatura ambiente . Las secciones fueron se incubaron durante
48 h con anticuerpo anti - CTB hechas en cabra diluido a 1:5000 ( Lista Laboratories Inc. ,
Campbell , CA . ) en 3 % de suero de caballo normal con 0,3 % de Triton X - 100 ( Sigma) a 4 1C .
El tejido se coloca con un caballo anti- biotina de cabra anticuerpos ( 1:200 , Vector Laboratories)
durante 1 hora a temperatura , y despus de tres lavados en PB se incub en complejo avidina biotina - HRP ( 1:250 , Vector Laboratories ) . CT B complejo anticuerpo- peroxidasa se revel
con una solucin de 0,05 % 3 , 30 - diaminobencidina (DAB , Polysciences , Warrington, PA ) en
presencia de sulfato de nquel ( 10 mg / ml , Fisher , Pittsburgh , PA ) , cloruro de cobalto
Cientfico ( 10 mg / ml , Fisher Cientfico , Pittsburgh , PA) y perxido de hidrgeno al 0,01 % , que
produjo un precipitado negro prpura. Despus de 10 min , el tejido se transfiri a PB para
detener la reaccin . Secciones se montaron en portaobjetos de gelatina - subbed , deshidratado
y entonces coverslipped con Permount . En todos los casos , el tejido de temas de los cuatro
grupos fueron procesados juntos. Control secciones se procesaron tal como anteriormente, pero
el anticuerpo primariose omiti .

4.2.2 FOS immunohistochemistry

Seguimos un procedimiento inmunohistoqumico similar a la anterior, con las siguientes
modificaciones. Las secciones se incubaron durante 48 h a 4 1C en el FOS policlonales
anticuerpo primario SC-52-G (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en 3% de suero
de caballo normal con 0,3% de Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), siguiendo un
protocolo similar establecido previamente en nuestro laboratorio (Caba et al., 2003b, 2008). Las
secciones de control se procesaron tal como el anterior pero el principal anticuerpo fue omitido.

En todos los casos, los tejidos de los sujetos de los cuatro grupos se proces juntos. El anticuerpo
sc-52-G ha sido bien caracterizado y probado en nuestro laboratorio previamente (Caba et al.,
2008).
4.5Anlisis de tejido
4.5.1 Grupos toxina del clera-B
CT-B-IR fue identificado como un precipitado negro prpura. El tejido se analiza con un
microscopio ptico (Olympus BX41) y las reas seleccionadas fueron capturados con una cmara
de fro a presin con el programa Image-Pro Plus, v 5 (medios de comunicacin ciberntica, Silver
Spring, MD, EE.UU.). Para determinar bilateralmente del patrn de inervacin SCN, una plantilla
de los lmites de SCN en el nivel medio del ncleo, como se determina por tincin de Nissl, se
gener y superpuesta a las imgenes capturadas de ambos lados de la SCN de cada sujeto.
Luego se realiz un anlisis de densidad ptica con el programa Image-Pro Plus, v 5 (medios de
comunicacin ciberntica, Silver Spring, MD, EE.UU.). Cada medicin se corrigi para un fondo no
especfica restando los valores de densidad ptica de las reas adyacentes libres de la etiqueta
de CT-B. Los datos expresados en la densidad ptica relativa fueron analizados por un t-student
(SigmaStat 3.5 para Windows) la comparacin de las diferencias entre ipsilateral y contralateral
de la inyeccin para cada edad.

4.5.2 . Grupos pulso de luz

FOS -IR fue identificado como un precipitado negro prpura de la DAB-nickel/cobalt reaccin en
el ncleo de la clula . La inmunotincin fue completamente ausente en el tejido procesado sin
anticuerpos primarios . Un ncleo inmunorreactivas fue considerado por la determinacin de la
densidad ptica de fondo en una regin cercana carente FOS -IR con el programa Image-Pro
Plus , v 5 ( medios de comunicacin ciberntica , Silver Spring, MD, EE.UU. ) . Clulas
inmunorreactivas que llegaron a cinco veces la densidad ptica de nivel de fondo se
consideraron positivas , y las clulas por debajo de este nivel de tincin se consideraron

negativos , similar a los protocolos establecidos previamente en nuestro laboratorio (CABA et

al . , 2008 ) . En todos los casos se analiz una seccin en el plano medio de la SCN . Dos
observadores ciegos a las condiciones experimentales contaron el nmero de clulas FOS positivos unilateralmente con un microscopio Olympus BX41 en el nivel medio de la SCN . Otro
grupo estaba manchada de Nissl para delinear la extensin del SCN . Un ANOVA de dos vas para
los principales efectos del pulso de luz y el tiempo se llev a cabo , en el que las variables
dependientes fueron el nmero de clulas expressingFOS mientras que el factor de agrupacin
independiente fue el momento en el que los PUP recibi o no un pulso de luz . Para analizar el
efecto del tiempo y el pulso de luz por cada subdivisin SCN , DM y VL , una de dos vas ANOVA
se realiz , en la que las variables dependientes fueron la subdivisin mientras que las variables
independientes fueron el tiempo de pulso de luz . Publicar Tukey hoc se utiliza 2 2 comparacin
de tiempo equivalente en ambos anlisis . Las comparaciones entre el grupo PT y el grupo CTR
se llevaron a cabo usando un t-test. Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el software
estadstico Sigma Stat versin 3.5. Los datos se expresan como la mean7SE , y la significacin
estadstica se fij en Po0.05 .
La localizacin anatmica de las estructuras del cerebro se determin utilizando el atlas del
cerebro de Gerhard (1968) y Girgis y Shi -Chang ( 1981 ) , y nuestra experiencia en la anatoma
cerebral de conejo ( Caba et al. , 2003a ) y los informes anteriores sobre el sistema visual en el
conejo ( Cooper et al , 1989 ; . . Hendrickson et al , 1972 ) .

Agradecimientos
Esta investigacin fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de la Salud / Fogarty
concesin no. R01TW006636 (M Caba). Damos las gracias a la Dra. Lily Yan para correcciones y
comentarios tiles sobre este manuscrito, el doctor Armando Martnez Chacn de estadstica
asesoramiento y Biol. Mercedes Acosta por su inestimable ayuda en el mantenimiento y el
cuidado de la colonia de conejos.