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29111
Octubre de 2004
revisado y las partes que realicen acuerdos basados en esta norma se deben esforzar para buscar
la posibilidad de aplicar sus ediciones ms recientes.
Los organismos internacionales de normalizacin y el IRAM mantienen registros actualizados de
sus normas.
IRAM 29012-16:2003 Calidad ambiental. Calidad del agua. Muestreo. Parte 16: Gua para el
bioensayo de muestras.
ISO 14442:1999 Water quality. Guidelines for algal growth inhibition test with poorly soluble
materials, volatile compounds, metals and waste water.
3 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Para los fines de esta norma se aplican las definiciones siguientes:
3.1 densidad celular. Nmero de clulas por unidad de volumen.
3.2 crecimiento. Incremento de la densidad celular.
3.3 tasa de crecimiento. ndice de crecimiento de la densidad celular en funcin del tiempo como
se indica en el apartado 9.2.2.
3.4 lote de ensayo. Agua de dilucin, medio nutritivo y muestra de ensayo en la cual se incuban
las clulas algales.
3.5 lote control. Agua de dilucin, medio nutritivo y clulas algales sin muestra de ensayo.
3.6 concentracin efectiva 50 (CE5o). Concentracin de la muestra de ensayo que da lugar a una
disminucin del 50 % del crecimiento o de la tasa de crecimiento con respecto a los lotes control en
un tiempo dado.
NOTA : Con el objetivo de distinguir estas concentraciones efectivas, determinadas a partir de variables mtricas, de
aquellas mencionadas anteriormente, algunos autores sugieren conveniente denominarlas como CI x (Concentracin
Inhibitoria correspondiente a un x % de efecto).
5 MATERIALE
5.1 Organismos de ensayo
2
ATCC2 22662:
CCAP 278/4:
Coleccin de Cultivos de Microalgas de los Laboratorios de Ficologa
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires (UBA)
Ciudad Autnoma de Buenos Aires
Ciudad Universitaria-Pabelln2
CP: 1428
Argentina
Culture Centre of Algae and Protozoa
Freshwater Biological Association
The Ferry House
Ambleside
Cumbria LA22 OLP, UK
UK
Algothque du Laboratoire de Cryptogamie
Museum d'histoire naturelle
12. rue Buffon
F- 75005 Paris, France
NOTA: Se pueden mantener los cultivos de reservaen el medio descripto en los apartados 5.3 y 7.4. Sin embargo, es
necesario un frecuente subcultivo (una vez por semana) para prevenir problemas en el crecimiento. Se puede mantener el
cultivo de reserva por periodos extensos en medios ricos en algas tal como aquellos recomendados por la coleccin de
cultivos.
Alternativamente, se pueden almacenar las algas por varios meses en perlas de alginatos, sin
perder su viabilidad 1. Cuando se necesite utilizar las algas para efectuar ensayos de toxicidad las
mismas pueden liberarse fcilmente de las perlas de algas.
5.2 Agua
El agua utilizada para la preparacin del medio nutritivo y para las diluciones de las muestras de
ensayo debe ser deionizada o de calidad equivalente (menor a 10S/cm). Se debe tomar especial
cuidado en evitar cualquier contaminacin del agua por sustancias inorgnicas u orgnicas durante
el tratamiento y el almacenamiento de la misma. No debe utilizarse ningn material de cobre.
5.3 Medio nutritivo
Se prepararan cuatro soluciones madre en agua, de acuerdo con las composiciones dadas en la
tabla 1.
Estas soluciones deben ser diluidas (ver 7.1 y 7.4) para obtener las concentraciones finales en
nutrientes de las soluciones de ensayo. No obstante, los macronutrientes, en cambio, se pueden
agregar directamente al agua.
Todos los reactivos utilizados deben ser de calidad analtica.
Se esterilizan las soluciones madre por filtracin en membrana (dimetro promedio de poro de 0,2
m) o en autoclave (120 C, 15 min). Se conservan las soluciones en oscuridad a 4 C.
La solucin madre 4 (NaHCO3) no debe esterilizarse en autoclave, solamente se esterilizar por
filtracin en membran.
Tabla 1
Compuesto
Concentracin en
la solucin madre
1,5 g.l-1
15 mg.l-1
MgCI2.6H2O
1,2 g.l-1
12 mg.l-1
CaCI2.2H2O
1,8 g.l-1
18 mg.l-1
MgSO4.7H2O
1,5 g.l-1
15 mg.l-1
KH2PO4
Solucin madre 2: Fe-EDTA
FeCI3.6H2O
0,16 g.l-1
1,6 mg.l-1
80 mg.l-1
80 g.l-1
Na2EDTA.2H2O
100 mg.l-1
100 g.l-1
185 mg.l-1
185 g.l-1
MnCI2.4H2O
415 mg.l-1
415 g.l-1
3 mg.l-1
3 g.l-1
CoCI2.6H2O
1,5 mg.l-1
1,5 g.l-1
CuCI2.2H2O
0,01 mg.l-1
0,01 g.l-1
7 mg.l-1
7 g.l-1
ZnCI2
Na2MoO4.2H2O
Solucin madre 4: NaHCO3
NaHCO3 I
(a)
Concentracin final en
la solucin de ensayo
50
g.l-1
50
mg.l-1
Se preparan tres rplicas de cada concentracin de sustancia a ensayar y seis rplicas de una
muestra control.
Se mide el pH de una muestra de las soluciones de ensayo a cada concentracin y de una muestra
control.
7.6 Incubacin
Se deja incubar los recipientes de ensayo tapados, permeables al aire, a 23 C 2 C bajo luz
blanca continua. La intensidad luminosa en el nivel medio de las soluciones de ensayo debe estar
comprendida en el intervalo de 60 E/M2/s a 120 pE/M2/s (35x10 18 fotones/m2/s a 70x10 8
fotones/m2/s) cuando se mide en el intervalo de longitud de onda de 400 nm a 700 nm utilizando un
detector apropiado.
NOTA: Es importante tener en cuenta que el mtodo de medida, en particular el tipo de detector (colector), influye en el
valor medido. Los detectores esfricos (que responden a la luz incidente y reflejada de todos los ngulos por debajo y por
encima del plano de medicin) son preferibles a los receptores unidireccionales (que responden a la luz de todos los
ngulos por encima del plano de medicin) y dan resultados ms elevados para una fuente luminosa no puntual del tipo
descripto a continuacin.
Se calcula el rea, A, situada bajo la doble curva de crecimiento lineal, para cada cultivo de ensayo,
mediante la ecuacin:
N1 N 0
N N 2 2N 0
N N n 2N 0
t1 1
(t 2 t1 ) ... n 1
(t n t n 1 )
2
2
2
siendo:
t1
tn
No
N1
Nn
Se calcula los valores medios de A para cada concentracin de ensayo y cada solucin control. A
partir de estos valores, se calcula el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de ensayo,
mediante la ecuacin:
I Ai
AC Ai
100
AC
siendo:
IAi
Ai
Ac
9.2.2 Tasa de crecimiento. Se calcula la tasa de crecimiento, , para cada cultivo de ensayo,
mediante la ecuacin:
ln N n ln N 0
tn
siendo:
tn
No
Nn
I i
C i
C
100
siendo:
li
Media
Intervalo
Desviacin
Estndar
CIr50 (O a 72h)
0,84
0,60 a 1,03
0,13
CIb50 (O a 72h)
0,53
0,20 a 0,75
0,20
Punto final
Tabla 2
13 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe hacer referencia a esta norma IRAM y debe incluir en particular la
informacin siguiente:
a) Sustancia de ensayo: datos de identificacin qumica.
b)
concentraciones ensayadas;
10
temperatura;
d) Resultados:
e)
densidad celular media para cada concentracin de ensayo (y cada solucin control) a cada
tiempo de medicin;
11
Anexo A
(Informativo)
12
Se requieren diluciones de aguas residuales sin algas para determinar las interferencias posibles
para mediciones de densidad algal (A.9), con el fin de permitir correcciones de fondo (de ltimo
momento) o seleccionar un mtodo de medicin conveniente.
No debe haber interferencia en el crecimiento algal en el control de fondo al final del ensayo.
A.7 Sustancia de referencia
Se recomienda el ensayo con una sustancia de referencia (ver Captulo 12)a intervalos regulares
para el aseguramiento de la calidad y verificar la sensibilidad de las algas. Si se realiza el ensayo
de inhibicin del crecimiento con dos mediciones solamente (al comienzo y al final del ensayo), o, si
se usa la densidad celular nominal, solamente una medicin al final del ensayo, se puede conducir
el ensayo de referencia con este procedimiento simplificado.
A.8 Organismos de ensayo
Se usan Desmodesmus subspicatus o Pseudokirchneriella subcapitata (ver 5.1).
A.9 Medicin de la densidad celular algal
Los mtodos de referencia son el recuento electrnico o el recuento microscpico. Sin embargo, se
pueden usar mtodos indirectos tales como turbidimetra, fotometra o fluorimetra cuando son
suficientemente sensitivos y si demuestran ser lo suficientemente bien correlacionados con la
densidad celular. Se recomienda la fluorometra, si la muestra de ensayo es turbia, para mantener la
interferencia provocada por la turbiedad tan bajo como sea posible.
A.10 Duracin de ensayo
La duracin del ensayo debe ser al menos de 48 h, pero puede ser extendida a 72h.
A.11 Frecuencia de mediciones
Generalmente, se recomienda una medicin diaria de la densidad celular algal. Con muestras de
agua, la densidad celular se puede medir solamente al comienzo y al final del ensayo.
Alternativamente, se pude utilizar la densidad celular nominal como densidad celular inicial. En ese
caso, solamennte se requiere una medicin al final del ensayo.
A.12 Medicin del pH
Se puede medir el pH en un recipiente control al final del ensayo. En un ensayo de microplaca, se
puede necesitar un pooling de replicados control para la medicin del pH.
A.13 Clculo del porcentaje de inhibicin
Se recomienda como punto final para este evaluacin rpida la inhibicin de la tasa de crecimiento
(ver 9.2) debido a que esto es bastante independiente de los niveles de biomasa, las condiciones
de crecimiento y la duracin del ensayo.
A.14 Determinacin de CEX y de valores de MID
Se puede determinar los valores de CE X como se describe en el apartado 9.3. Tambin, se puede
determinar el CEX a travs de una interpolacin grfica straight-line. Los valores de CE X se pueden
expresar, como por ejemplo mL/L o porcentaje de aguas residuales en el medio de ensayo
(Fraccin volumen).
Tambin, se pueden expresar los resultados en MID (Mnima Dilucin Inefectiva, ver IRAM 2901216, Anexo A), la cual es la ms baja dilucin con un efecto menor a 5%.
13
Anexo B
(Informativo)
14
Bibliografa
En el estudio de este esquema se han tenido en cuenta los antecedentes siguientes:
ISO INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ISO 8692:2004 Water quality. Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green
algae
ISO 8692: 1989 Water quality. Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus
subspicatus y Selenastrum capricornutum
Bibliografa de la ISO 8692:2004
[1]
BOZEMAN, J., KOOPMAN, K. and BITTON, G. Toxicity using immobilized algae, Aquatic
Toxicity, 14, 1989, pp. 345-352.
[2]
MAYER, P., CUHEL, R.L. and NYHOLM, N. A simple in vitro fluorescence method for biomass
measurements in algal growth inhibition tests, Water Research, 31, 1997, pp. 2525-2531.
[3] SLOVACECK, R.E. and HANNAN, P.J. In vivo fluorescence determinations of phytoplankton
chlorophyll, Limnology & Oceanography, 22 (5), 1997, pp. 919-925.
[4] IEC 60081, Double-capped fluorescent lamps. Performance specifications.
[5] OECD: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.
OECD Environmental Health and Safety Publications. Series of Testing and Assessment N 23,
2000, 53 pp.
[6] KOOIJMAN, S.A.L.M., HANSTVEIT, A.O. and OLDERSMA, H. Parametric analysis of population
growth in bioassays, Water Research, 17, 1983, pp. 527-538
[7] NYHOLM, N, SRENSEN, P.S., KUSK, K.O. and Christensen, E.R. Statistical treatment of data
from microbiological toxicity test, Environmental. Tox. Chem., 11, 1992, pp. 157-167
[8] BRAIN, P. and COUSENS, R. An equation to describe dose-response where there is stimulation
of growth at low doses, Weed Research, 29, 1989, pp. 93-96
[9] HANSTVEIT, A. and OLDERSMA, H. Evaluation of the results of the second ISO interlaboratory
study with an algal toxicity test. ISO/TC 147/SC 5/WG 5, N. 43. Prepared for the International
Standards Organization by Nederlands Normalisatie Instituut, Delft, Netherlands, 1981.
[10] HANSTVEIT, A. O. Evaluation of the results of the third ISO-interlaboratory study with an algal
toxicity test. ISO/TC 147/SC 5/WG 5 64. Prepared for the International Standards Organization
by Nederlands Normalisatie Instituut, Delft, Netherlands, 1982.
[11] ISO/TS 20281, Water quality. Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data
15
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