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6, 991-995, 2005
Mariana C. Cafu, Geraldo H. Silva, Helder L. Teles, Vanderlan da S. Bolzani e ngela R. Arajo*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP
Maria Cludia M. Young
Seo de Fisiologia e Bioqumica de Plantas, Instituto de Botnica, CP 4005, 01061-970 So Paulo - SP
Ludwig H. Pfenning
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, 37200-000 Lavras - MG
Artigo
ANTIFUNGAL COMPOUNDS OF Xylaria sp., AN ENDOPHYTIC FUNGUS ISOLATED FROM Palicourea marcgravii
(RUBIACEAE). Five compounds, 2-hexyl-3-methyl-butanodioic acid (1), cytochalasin D (2), 7-dechlorogriseofulvin (3), cytochalasin
B (4) and griseofulvin (5), have been isolated from the endophytic fungus Xylaria sp., and their structures were elucidated on the
basis of spectroscopic data. In the bioautography assay against Cladosporium cladosporioides and Cladosporium sphaerospermum,
compounds 1 and 2 were found to be active while compounds 3, 4 and 5 did not show antifungal activity.
Keywords: endophytic fungus; Xylaria sp.; antifungal compounds.
INTRODUO
Vrios produtos naturais com propriedades teraputicas foram
isolados de espcies de fungos, especialmente agentes quimioterpicos, como penicilinas e cefalosporinas usadas at hoje como
antibiticos; mevinolina, um agente redutor de colesterol; bleomicinas, daunorubicinas e anlogos, como agentes antitumorais;
avermectina B, um anti-helmntico de largo espectro, entre outros1,2.
Recentemente, o aumento de infeces fngicas causadas por fungos oportunistas, como Candida e Aspergillus, e a resistncia
microbiana a uma srie de antibiticos disponvel no mercado esto motivando, novamente, as companhias farmacuticas a investirem na busca por substncias antifngicas de fontes naturais2.
Dentre os microrganismos que acumulam substncias
antifngicas, fungos e leveduras destacam-se pela quantidade de
produtos farmacuticos de uso corrente na medicina com tais propriedades.
Os fungos filamentosos, onde os endofticos esto includos,
constituem um grupo de microrganismos que biossintetizam uma
quantidade fantstica de metablitos secundrios, chegando, em
casos especiais, a uma produo 73% superior a de outras classes
de microrganismos3. Fungos endofticos so microrganismos que
habitam o interior de plantas e constituem-se em uma fonte valiosa
de produtos bioativos4. Este nicho de fungos associados a espcies
vegetais de Cerrado e da Mata Atlntica permanece praticamente
sem qualquer estudo qumico e biolgico sendo, portanto, uma fonte
potencial de substncias de interesse farmacolgico.
Dando continuidade s nossas pesquisas de bioprospeco, vrias espcies vegetais de Cerrado e Mata Atlntica foram selecionadas
para isolamento e cultivo de fungos endofticos. De Palicourea
marcgravii St. Hil., uma Rubiaceae de larga ocorrncia no Cerrado,
e conhecida popularmente como erva de rato ou caf bravo, foram isolados vrios fungos endofticos. Dentre os j identificados,
Xylaria sp. foi selecionado para estudo devido a atividade apresentada por seu extrato bruto frente aos fungos fitopatognicos
*e-mail: araujoar@iq.unesp.br
992
Cafu et al.
Quim. Nova
Material vegetal
A espcie vegetal Palicourea marcgravii St. Hil. (Rubiaceae)
foi coletada, em junho de 2001, na Estao Ecolgica Experimental de Mogi-Gua (SP). Uma exsicata do material vegetal identificado encontra-se depositada no Herbrio do Instituto de Botnica
da Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo (SP).
Isolamento da cepa fngica
O fungo endoftico foi isolado de folhas saudveis de Palicourea
marcgravii. As folhas foram lavadas com gua e sabo e esterilizadas por imerso em NaClO 1% (5 min) e em etanol 70% (1 min),
seguidas de lavagem com gua estril (10 min) e secagem5. Aps o
processo de esterilizao, as folhas foram cortadas e incubadas em
placas de Petri contendo PDA, s quais foi adicionado o antibiti-
Bioensaio
Os extratos brutos (PDB-AcOEt e milho-MeOH) e as substncias isoladas foram submetidos tcnica de Bioautografia para
deteco de atividade antifngica. Este bioensaio consiste na
nebulizao de suspenses dos fungos Cladosporium
cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (concentrao
5 x 107 esporos/mL em soluo de glicose e sais) em placas de
CCDC contendo 400 g dos extratos brutos e 100 g das substncias puras, previamente eludas com solvente adequado. Em seguida, as placas foram incubadas em cmara mida a 25 oC por 48 h.
O aparecimento de zonas de inibio na placa nebulizada com C.
sphaerospermum e/ou C. cladosporioides indica a presena de
substncia(s) com potencial antifngico6. A nistatina foi a substncia utilizada como antifngico padro.
As substncias puras que se mostraram potencialmente bioativas
foram submetidas a bioensaio, para determinao do limite de
deteco. Os resultados so expressos como valores de concentrao da amostra (g/mL) requeridos para produzir um halo de inibio comparvel com o produzido pelo padro nistatina. Os ensaios
foram realizados em diferentes concentraes (100, 50, 25, 10, 5 e
1 g/mL) para as substncias puras e para o padro.
RESULTADOS E DISCUSSO
O estudo qumico dos extratos brutos PDB-AcOEt e milhoMeOH, produzidos pelo fungo endoftico Xylaria sp., resultou no
isolamento do cido 2-hexilideno-3-metilbutanodiico (1),
citocalasina D (2), 7-declorogriseofulvina (3), citocalasina B (4) e
griseofulvina (5). A identificao destas substncias foi realizada
com base na comparao de seus dados espectroscpicos (RMN
1
H e 13C, gCOSY, gHMQC, gHMBC e EM) com valores disponveis na literatura. Os metablitos 1-5 j haviam sido produzidos
por fungos da famlia Xylariaceae, entretanto, este o primeiro
relato da produo de 3, 4 e 5 por um fungo endoftico.
A anlise detalhada dos espectros de massas, RMN de 1H e 13C
(uni e bidimensionais), alm da comparao com dados da literatura7, permitiu a identificao de 1 como cido 2-hexilideno-3metilbutanodiico.
A substncia 2 foi identificada como citocalasina D (C30H37NO6)
atravs da anlise dos dados de RMN de 1H e 13C e EM-ES (+120
V) e evidenciou 13 graus de insaturao. A anlise dos dados de
RMN de 1H e 13C indicou a presena de trs carbonilas, um anel
benznico monossubstitudo e seis carbonos olefnicos, o que resultou no grau de insaturao 10. Os 3 graus de insaturaes remanescentes sugeriram que a molcula fosse constituda por 3 anis,
alm do anel aromtico. O espectro de hidrognio apresentou sinais em H 3,57 e 5,26 caractersticos de hidrognios carbinlicos,
que foram atribudos H-7 e H-21. A geometria das ligaes duplas 13-14 e 19-20 foi determinada como E, devido s constantes de
acoplamento (J = 15,0 Hz) entre os hidrognios. Os sinais H 1,38,
1,05, 0,39 e 2,27 foram atribudos s metilas H3C-23, H3C-22, H3C11 e H3C-25, respectivamente. O sinal referente a uma metila em
H 2,27 tpico de citocalasina com um grupo acetato na forma de
radical. Estas informaes aliadas anlise dos dados
espectromtricos de RMN de 1H, 13C, gHMQC, gHMBC, gCOSY,
EM e comparao com os dados da literatura8 confirmaram a substncia 2 como sendo uma citocalasina do tipo D. A configurao
relativa de 2 foi determinada por comparao dos valores de deslocamentos qumicos de RMN 1H e 13C, constantes de acoplamentos
e comparao com os dados da literatura. Experimento de rotao
tica forneceu []D25 +15,4 (c. 0,25 EtOH), condizente com a literatura9, permitindo identific-la como (+)-citocalasina D. Os valo-
993
1H
1
2
8,03
3
3,11 (tl)
4
1,98 (dd, 5,5; 2,5)
5
2,49
6
7
3,57 (d, 10,0)
8
2,69 (dd, 10,0; 10,0)
9
10 2,55 (dd, 13,0; 8,5) /
2,81 (dd 13,0; 5,0)
11
0,39 (d, 6,5)
12
4,81 (s) / 5,03 (s)
13 5,42 (dd, 15,0; 10,0)
14
5,08 (ddd, 15,0;
6,0; 10,0)
15 1,89 (ddl, 12,5; 4,5) /
2,15 (m)
16
2,75 (m)
17
18
19 5,12 (dd, 15,0; 2,0)
20 5,86 (dd, 15,0; 2,0)
21
5,26 (t, 2,0)
22
1,05 (d, 7,0)
23
1,38 (s)
24
25
2,27 (s)
1
2e 6 7,15 (d, 7,0)
3e 5 7,30 (t, 7,5)
4
7,22 (t, 7,5)
4
13C
1H
173,6
8,20
52,5
3,20
47,5
2,68 (dd, 2,0; 5,5)
31,5
3,00 (m)
150,7
70,1
3,61 (d, 10,5)
46,1
3,20
53,1
43,6 2,61 (dd, 13,5; 7,0) /
2,76 (dd, 13,5; 5,0)
12,8
0,62 (d, 7,0)
111,5
4,89 (s) / 5,11 (s)
130,8 5,81 (dd, 15,0; 10,0)
131,6
5,03 (ddd, 15,0;
10,0; 3,5)
37,9
1,52 (m) /
2,01 (m)
41,4
1,16 (m)
209,9 0,49 (m) / 1,64 (m)
77,4 1,34 (m) / 1,20 (m)
126,9 1,43 (m) / 1,77 (m)
132,1
4,36 (m)
76,4 6,76 (dd, 15,5; 4,0)
19,2 5,70 (dd, 15,5; 1,5)
24,5
169,9
0,82 (d, 6,5)
21,8
137,1
129,6
7,09 (d, 7,0)
128,3
7,26 (t, 7,5)
126,4
7,17 (t, 7,5)
13C
170,7
52,3
46,6
31,0
150,9
69,4
47,5
83,3
42,8
13,2
112,3
128,5
41,6
x
41,6
32,9
34,9
20,0
34,4
68,6
153,3
118,1
164,1
20,3
137,0
129,6
128,2
126,4
994
Cafu et al.
Quim. Nova
Os extratos brutos (PDB e milho) e as substncias isoladas foram submetidas a um ensaio preliminar para avaliao da atividade antifngica atravs da tcnica de Bioautografia. O extrato bruto
obtido em milho, assim como as substncias isoladas deste extrato
(3, 4 e 5) no se mostraram ativas frente s linhagens Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum. Entretanto a griseofulvina
(5) atualmente utilizada como um poderoso antimictico, sendo
comercializada em medicamentos como Fulcin (Zeneca) e
Sporostatin (Shering Plough) com atividade contra vrias espcies de Microsporum, Epidermophyton e Trychophyton. O extrato
bruto obtido aps cultivo de Xylaria sp. em PDB e os compostos
cido 2-hexilideno-3-metilbutanodiico (1) e citocalasina D (2)
mostraram-se ativos frente s linhagens C. cladosporioides e C.
spahaerospermum. Os resultados dos limites de deteco das substncias 1 e 2 esto apresentados na Tabela 3, e este o primeiro
relato do potencial antifngico demonstrado por estas substncias.
Tabela 2. Dados de RMN de 1H* (500 MHz) e 13C (125 MHz) da 7declorogriseofulvina (3) e griseofulvina (5) em CDCl3, (ppm)
3
Posio
1H
5
13C
4
5
6,15 (d, 1,5)
6
7
5,97 (d, 1,5)
3a
7a
4-OCH3 3,83 (s)
6-OCH3 3,82 (s)
2-OCH3 3,55 (s)
3
1
2
3
5,47 (s)
4
5 2,33 (dd, 17,0; 5,0) /
2,99 (dd, 17,0; 13,0)
6
2,68 (m)
6-CH3 0,89 (d, 6,5)
1H
13C
159,1
88,6
6,07 (s)
170,4
93,3
104,4
176,1
56,1
3,97 (s)
56,1
3,92 (s)
56,6
3,56 (s)
192,4
89,9
171,3
104,8
5,48 (s)
197,3
40,1 2,37 9dd, 16,5; 5,0) /
2,97 (dd, 16,5; 13,0)
36,6
2,68 (m)
14,2
0,89 (d, 7,0)
164,8
89,8
158,0
97,6
105,4
169,8
57,2
56,6
56,9
192,6
91,0
171,0
105,1
197,2
40,3
36,7
14,4
C. cladosporioides
C. sphaerospermum
1
2
Nistatina
25
10
1
10
25
1
CONCLUSO
O estudo qumico dos extratos produzidos por Xylaria sp. permitiu o isolamento de substncias com atividade antifngica em
potencial e de interesse comercial, evidenciando os fungos
endofticos como promissores na busca por metablitos bioativos.
Este o primeiro relato das substncias 3, 4 e 5 serem produzidas
por um fungo endoftico do gnero Xylaria. As substncias 1 e 2
j foram relatadas como metablitos de Xylaria sp., porm esta
995
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