HIDRLISIS ENZIMATICA DE UN POLISACARIDO VEGETAL (ALMIDON)

INTRODUCCIN
Almidn.
Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5), inodoro e inspido, en forma de grano o polvo.
El almidn es el principal carbohidrato de reserva en la mayora de las plantas. En las hojas el
almidn se acumula en los cloroplastos, donde es un producto directo de la fotosntesis. En
los rganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos, en los cuales se forma
despus de la translocacin de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas.
En los vegetales, el almidn se encuentra en uno o ms granos amilceos en un plastidio. La
cantidad de almidn en diversos tejidos depende de muchos factores genticos y ambientales.
El almidn se acumula a la luz del da cuando la fotosntesis excede las tasas combinadas de
respiracin y translocacin, despus parte de l desaparece por la noche.
Se presentan dos tipos de almidn en la mayora de los granos
amilceos: amilosa yamilopectina, ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por
enlaces -1, 4. Las uniones -1, 4 hacen que las cadenas de almidn se enrollen en forma de
hlices. La amilopectina consta de molculas muy ramificadas, cuyas ramas se localizan entre
el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que
forma la rama (enlaces -1, 6). Las amilosas son ms pequeas y contienen de cientos a
miles de unidades de glucosa, numero que depende de la especie y las condiciones
ambientales.
La formacin de almidn ocurre sobre todo por un proceso que implica la donacin repetida de
unidades de glucosa provenientes de un azcar nucleotidico similar al UDPG y que se
denomina difosfoglucosa de adenosina, ADPG.
Hidrlisis del almidn.
La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los
elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a
monosacridos.
La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por
tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las
tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -amilasa
y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la
-amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y
amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando
productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido
por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin
embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de
ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun
quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son
activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial.
La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo sobre los
extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por mutarrotacin, para formar las

mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi

completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los
enlaces de los puntos de ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la
incorporacin de una molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas
hidrolasas. Las reacciones hidrolticas no son reversibles, de modo que no se pueden detectar
sntesis de almidn por amilasas. Las amilasas estn diseminadas en diversos tejidos pero
son mas activas en las semillas que estn germinando, ricas en almidn. Es probable que la
-amilasa tenga ms importancia que la -amilasa para la hidrlisis de almidn. Gran parte de
la -amilasa se localiza dentro de los cloroplastos, muchas veces unida a los granos de
almidn que atacara. Acta tanto en el da como por la noche aunque, por supuesto, durante
la luz de da hay produccin neta de almidn por la fotosntesis.
La amilopectina solo es degradada parcialmente por la accin del almidn fosforilasa. La
reaccin procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena
principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones -1,6 de las
ramificaciones, por lo que de nuevo que dan dextrinas. La amilosa, que tiene pocas
ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminacin repetida de unidades de
glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La almidn fosforilasa esta
ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difcil determinar que enzima digiere la
mayor parte del almidn en las clulas de inters.
OBJETIVO
Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maz hidrolizan al almidn, dando
como producto final unidades de maltosa siendo este uno de los mecanismos que la semilla
utiliza para obtener energa necesaria para germinar.
El alumno estudiara las diferencias en la actividad amiloltica, dependiendo de los estados de
germinacin en las semillas y de sus requerimientos energticos.
Se aplicara el mtodo de Nelson-Simogy para la determinacin de reductores totales.
Determinaremos la actividad enzimtica de las semillas de maz, dependiendo de su tiempo
de germinacin.
MATERIAL
1 mortero
1 bistur
1 bao de agua hirviendo
6 tubos de centrifuga
5 pipetas graduadas de 10 ml
1 embudo de filtracin de 5 cm de dimetro
1 caja de Petri de 9 cm
1 tripi con tela de asbesto
1 mechero
25 tubos de ensayo de 15X150
1 centrifuga
1 espectrofotmetro
1 gasa
30 semillas de maz

METODOLOGA

La preparacin de las semillas de maz, se llevara a cabo cinco das anteriores a la

prctica. Se desinfectaran 10 semillas de maz en cloro (hipoclorito de sodio)
durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida;
posteriormente las semillas las pondremos a germinar en un frasco limpio, en el
frasco se pondr una capa de algodn, las semillas, y se humedecer el algodn.
Despus el mismo procedimiento de germinacin se aplicara a otras cuantas
semillas limpias pero tres das antes de la prctica.

Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maz de ningn

da de germinacin; despus se seleccionaron un par de semillas de 5, de 3 y 0
das de germinacin, entonces se les quita el embrin y el escueto, para que solo
nos quede el endospermo almidonoso. Una vez limpios los maces prepararemos
un extracto enzimtico de los respectivos das de germinacin; lo anterior se har
macerando el endospermo de 2 semillas de 5 das de germinacin, en un mortero
de con 5 ml de succinato con pH 5. Se hizo el mismo procedimiento con las
semillas de 3 y 0 das de germinacin, los productos obtenidos de los macerados
se colocaran en tubos de centrfuga, lavando el mortero con el amortiguador en
cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos.
Despus de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo; para ser
colocadas en los tubos numerados del 7 al 12, segn la relacin del formato
siguiente.

tub
o#

dias de
germinacion

ml extracto
diluido

0.25

0.25

0.25

10

0.25

11

0.25

12

0.25

El ultimo paso de la practica ser la determinacin de los reductores totales, que

se llevara a cabo con las diluciones de los extractos enzimticos de la semilla de
diferentes tiempos de germinacin; aqu se realizan las reacciones con los
diferentes reactivos (I y II) y la determinacin de azucares reductores totales que
obtuvimos con la hidrlisis enzimtica del almidn; tambin realizaremos la curva
patrn. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla.

RESULTADOS

Anotaremos las lecturas espectrofotomtricas de cada tubo en la tabla

siguiente.

DENSIDAD OPTICA (nm)

TU
BO

MUES DUPLI
TRA
CADO

0.

0.
0
8
6

0.090 0.088

0.
3
7
7

0.212 0.2945

0.
2
9
7

0.292 0.2945

0.
3
3
9

0.259 0.299

0.
4
6
4

0.505 0.4845

ME
DIA

Determinaremos la concentracin de maltosa en los tubos 1 al 6

correspondientes a la curva patrn, de acuerdo con la ecuacin:

(Volumen inicial)(Concentracin inicial) = (Volumen final)(Concentracin final)

(Tubo x)(500 g/ml) = (Patrn maltosa + Agua)( X )

Se anota la concentracin en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan

las lecturas espectrofotomtricas obtenidas en los tubos 1 a 6.
Tabla 1. VALORES PARA CURVA
PATRON
X

TUB
O#

[Maltosa
g/mL]

125

0.088

333.
33

0.2945

750

0.2945

200
0

0.299

0.4845

Densida
d ptica
(520
nm)

Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y. Debido a que los datos se
presentan como una recta, se ajustan de ser necesario.

En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de

densidad ptica de los tubos problema (7-12).
TUBO
S

DENSIDAD OPTICA (nm)

DI
A PROB
S LEMA

MUE DUPLI
STRA CADO

1.
2
2
9

0.
8
3 1.03
3 1

0.
9
9
0

1.
2
1 1.10
8 4

1. 0. 1.12
2 9

ME
DI
A

5
2

8
9

10

0.
8
4
4

1.
1
0 0.97
6 5

11

1.
0
7
1

1.
2
0 1.13
0 55

12

1.
1
1
4

1.
1
6 1.13
4 9

Tomando en consideracin los datos de la curva patrn donde Y ha sido corregida Y y

recordando nuevamente que y=0.0873x-0.0621; se calcula la concentracin de maltosa de los
diferentes das de germinacin.
Los datos se registran en la siguiente tabla.
TUBO #

DIAS

[MALTOSAg]

0.0279

0.0342

0.0356

10

0.0230

11

0.0370

12

0.0373

En la siguiente grafica se encuentra la concentracin de maltosa por los das de germinacin

de las semillas.

DISCUSIN
En esta prctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados. Creemos que
nuestros resultados hubieran estado ms precisos si la extraccin del almidn no hubiera
presentado algunas dificultades para obtener el endospermo. Esto lo pensamos ya que en las

semillas de 0 y 3 das el endospermo presentaba partes ms duras, que hacan ms difcil la

extraccin total.
Otra cuestin a destacar, es la parte en que hacemos la segunda incubacin (reactivo 1), pues
por un descuido el agua hirvi y se derramo un poco, provocando que a algn tubo le entrase
agua y alterara una absorbancia; esto se nota pues el mismo nmero de tubo pero del
duplicado da una lectura ms coherente.
Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad
enzimtica en la semilla es mayor si el tiempo de germinacin es mayor.
CONCLUSIN
En esta prctica se esperaba y se observo la actividad enzimtica de la amilasa sobre el
almidn. Observamos que al tener ms tiempo de germinacin una semilla, mayor es la
actividad enzimtica de la amilasa. En los granos de cero das se manifest una actividad de
la enzima muy baja, despus existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres
das y por supuesto que la mayor actividad se registro en las semillas de 5 das. Todas estas
reacciones nos dejan una produccin de maltosa, por accin de la hidrlisis enzimtica de la
amilasa sobre el almidn; esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho, sera porque haba
mucho almidn para hidrolizar y poder producir maltosa.
En resumen y conclusin, la actividad enzimtica es directamente proporcional a la produccin
de maltosa, todo esto con respecto a los das de germinacin que tengan las semillas (entre
mas das de germinacin tenga las semillas, mas almidn habr, entonces, la actividad
enzimtica ser mucho mayor.)
CUESTIONARIO
1.- CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMIDON?

3
2.- QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR?
Cuando en una determinacin cuantitativa de los monosacridos se realiza frecuentemente,
basndose en su observacin en disoluciones alcalinas mediante Cu2+, Ag+ o ferricianuros,

se origina una mezcla de azucares -cidos. Los azucares son capaces de reducir, a tales
oxidantes se les denomina azucares reductores.
Se puede definir tambin a un azcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un
grupo carbonio y es susceptible de participar en otra oxidacin.
3.- QUE TIPO DE ENLACES HIDROLIZAN LAS AMILASAS?
-Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa
-Amilasa, (14) glucan maltodeshidrogenasa
4.- QUE AMILASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANISMOS ANIMALES?
-D-glucopiranosa
-Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa

BIBLIOGRAFA
SALISBURY, B. FRANK
Fisiologa Vegetal, Ed. Iberoamericana, 1994.
MATHEWS, C. K. Y VAN HOLDE, K. E.
Bioqumica, McGraw Hill Interamericana, 2. Ed., Espaa, 1998.
BRITNNICA CD 2000 DELUXE
Encyclopdia Britannica, Inc.
WHITE, A., HANDLER, P., SMITH, E., HILL, R., LEHMAN, R.
Principios de Bioqumica, McGraw Hill, 1989.
MICROSOFT EXCEL 2002 (10.2614.2625)