EXTRACCIN DE ADN EN FRESA

INTRODUCCIN
La extraccin del ADN de cualquier organismo, a un bajo costo y con el mnimo trabajo en el
laboratorio, con una suficiente concentracin y pureza en poco tiempo, es importante para
muchos investigadores interesados en el estudio de la clasificacin y filogenia de organismos.
(Osorio-Cadavid et al., 2009).
Uno de los problemas al trabajar con vegetales es la composicin de la pared celular, la cual
dificulta el acceso al interior para la extraccin del contenido celular, incluyendo el ADN
(Dellaporta et al., 1983).
El ADN constituye el material gentico de los organismos, es el componente qumico primario de
los cromosomas y el material del que los genes estn formados.

Dicha pared se debe romper por accin mecnica, en seguida, se deben destruir las membranas
celulares de manera que el ADN, acompanado de otros compuestos (protenas, enzimas,
carbohidratos), quede disponible.
La muestra de tejido obtenida se agrega a una solucin buffer o tampn de extraccin, en
presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o alta fuerza inica (para que sea soluble el
ADN) y de altas concentraciones de NaCl.
Los agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la accin de enzimas
nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que actuen como cofactores de las
nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl se emplean para prevenir la contaminacin
de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN, pu- diendo inhibir la actividad de
algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restriccin; la base para la
separacin de los polisacridos de los cidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacridos precipitan bajo la accin de fuerzas

centrifugas. A la mezcla anterior se agrega un detergente aninico como el SDS (sodio dedecil
sulfato), que solubiliza protenas, tejidos y membranas, evitando que una cantidad significativa de
ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extrado
presente coloracin gris o parda, la cual se debe a la actividad de polifenoloxidadas presentes en
algunos tejidos, se incluye en el buffer de extraccin P.V.P (polivinil pirrolidona) (Porebski et al.
1997)
Para separar las protenas, se lleva la mezcla de tejido con el tampn a incubacin a 65C con lo
cual se desnaturalizan las protenas. Para retirar las protenas denaturadas y la mayora de los
polisacridos, se agrega una sal como el acetato de potasio fro. Por centrifugacin se separan
tejidos, membranas, polisacridos y protenas de los cidos nucleicos, los cuales quedan en el
sobrenadante.
Finalmente hay que separar el ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe precipitar el mismo,
usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la precipitacin del ADN en
presencia de ARN. El ARN se remueve adicionando enzima RNAasa a la solucin (Velasco,
2005).
El objetivo de esta prctica fue aislar el ADN del fruto de fresa mediante la utilizacin de una
tcnica rpida y econmica.
MATERIALES Y MTODOS
La extraccin de ADN de una manera econmica y muy simple se llev a cabo en el laboratorio,
se realiz de una manera preliminar en tres frutos: fresa, guayaba y manzana, se maceraron en
una bolsa de platico con las manos, por otro lado se prepar la solucin de extraccin, con una
cucharadita de sal, una de detergente lquido lavatrastos, y medio vaso de agua. En esta solucin
se agreg la fruta macerada y se agito durante 5 minutos y finalmente se adiciono un volumen
equivalente de alcohol frio para precipitar el ADN y con un gancho de vidrio se tom el ADN
para visualizarlo.
Este mtodo fue emprico de ah la tarea de estandarizar un

protocolo de extraccin con

cantidades y tiempos para hacerlo ms eficaz y eficiente. Se describe a continuacin.

Para la extraccin de ADN se utilizaron seis muestras de 30 g de fresa previamente macerada en

un mortero con pistilo durante 5 min. Se prepar una solucin buffer para la extraccin de ADN
utilizando 60 g de cloruro de sodio (NaCl), 60 ml de detergente lquido y 880 ml de agua
destilada. En un vaso de plstico se colocaron los 30 g de la fruta molida y se adicionaron 50 ml
de solucin buffer. Las muestras se dividieron en dos grupos con tres repeticiones para cada uno.
En el primer grupo las muestras se agitaron durante 5 minutos y se procedi a filtrar utilizando
filtros de cafetera y vasos de plstico. El segundo grupo de muestras se coloc en bano Mara a
una temperatura de 60 C durante 20 minutos con agitaciones cada 5 minutos una vez trascurrido
el tiempo procedi a filtrarse de la misma manera que el primer grupo de muestras. Al filtrado
(50 ml aprox.) se le adicionaron 50 ml de alcohol frio al 70% para precipitar el ADN, se dej que
actuara 5 minutos y con un gancho de vidrio previamente esterilizado se tom el ADN para
visualizarlo y hacer las comparaciones correspondientes.
RESULTADOS Y DISCUSION
En la primera etapa de la prctica se corroboro que de manera fcil, sencilla y econmica puede
realizarse la extraccin de ADN, y que adems puede realizarse con cualquier fruto como se
realiz.
La segunda parte es estandarizar esta manera sencilla y convertirla en un protocolo para que sea
reproducible y confiable, solo se trabaj con un tipo de fruta, por que anteriormente
comprobamos que se extrae de la misma manera en cualquier fruto. Ahora lo que segua es
estandarizar el procedimiento y las cantidades exactas de reactivos (Sal de mesa o cloruro de
sodio y detergente liquido), de las muestras, de agua y de alcohol, adems de los tiempos que son
muy importantes en todo procedimiento.
Al macerar las fresas, se rompieron las paredes celulares que contena el fruto de la fresa,
liberando el contenido celular. La pared de los nucleos de las clulas est formada por lpidos la
cual se rompi por accin del detergente lquido utilizado. El incubacin d las muestras a 60 C
hacen que el proceso de separacin de ADN y oros compuestos sea ms eficiente, potencializan
la accin de la sal y el detergente. La sal permiti que el ADN precipitara en la solucin fra de
alcohol y que las cadenas de ADN no se cortaran. El alcohol se utiliz para que el ADN ya no

estuviera disuelto en el agua y pudiramos sacarlo de la disolucin. Este proceso se le conoce

como precipitacin el ADN.
En la figura 1 ADN obtenido del fruto de la fresa precipit y present una apariencia blanquecina
y fibrosa.
En esta prctica se realiz una extraccion simple de ADN de varios frutos. La extraccin de ADN
requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la
membrana plasmtica para poder acceder al nucleo de la clula. A continuacin debe romperse
tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ultimo hay que proteger el ADN de
enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. La
solucin de lavavajillas y sal es capaz de romper la pared celular y las membranas plasmtica y
nuclear. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se
encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. A
continuacin se muestran las fotografas donde se observa el ADN total extrado en la prctica.

Figura 1. ADN de fresa, la imagen de

la izquierda son las muestras cuando se aplica

calor y la imagen de la derecha es la muestra si calor.

La obtencin de ADN integro y puro es una parte fundamental para el buen desempeno de las
tcnicas utilizadas en biologa molecular (Tang et al. 2005, Wang et al. 2005). Una de las ventajas
de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as como un alto rendimiento. Sin embargo, en

ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos mtodos son susceptibles de

contaminacin, variacin y errores por los multiples pasos de manipulacin (Strmer et al. 2007).
El rendimiento de los kits depende del tipo de tejido y la cantidad de muestra inicial, as como de
la capacidad de unin de la membrana. En los ultimos anos ha aumentado el uso de los de
mtodos de extraccin comerciales debido a que la matriz permite capturar selectivamente al
ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con molculas ntegras; al tiempo que
se reduce el numero de pasos en la extraccin y se disminuye la posibilidad de contaminacin
con ADN o ARN exgeno. Extractos con estas caractersticas aumentan la sensibilidad y
reproducibilidad de las tcnicas moleculares, con lo que se garantiza la obtencin de resultados
confiables. Aunque se sacrifique el rendimiento en algunas ocasiones, las tcnicas actuales de
biologa molecular no requieren de grandes cantidades de material gentico. Independientemente
del mtodo de extraccin que se utilice, lo importante es realizar cada paso con cuidado para
obtener ADN integro y puro que permita llevar a cabo las tcnicas posteriores.
CONCLUSIN
De una manera sencilla y rpida se logr obtener DNA de material vegetal, y as
comprobar la existencia del mismo y los reactivos mnimos necesarios para su extraccin.
Adems que se observ que el hecho de emplear temperatura durante el proceso de
extraccin como se realiz, el rendimiento en ADN es mayor con respecto al que no se emplea
temperatura. Esto de manera visual, para corroborar todo este es necesaria una cuantificacin en
un espectrmetro y tambin es necesario hacer pruebas en la pureza del ADN con geles de
agarosa y de amplificacin por PCR para evaluar si el ADN extrado de esta manera es util en
trabajos posteriores.

LITERATURA CITADA
Velasco M. R. 2005. Marcadores moleculares y la extraccin de adn molecular markers and the
dna extraction. Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol3 No.1
Dellaporta, S. L., J. Wood and J. B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II.
Plant Molecular Biology Reporter. 1(4):19-21.

Porebski, S., Bailey L. G., Baum B. R. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction
protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant
Molecular Biology Reporter. 15(1): 8-15.
Osorio-Cadavid, E., M. Ramrez, W. A. Lpez, L. A. Mambuscay. 2009. Estandarizacin de un
protocolo sencillo para la extraccin de ADN genmico de levaduras. Revista Colombiana
de Biotecnologa. 11 (1):125-131.