Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metabólica: Produção Bacteriana de Hidrogênio e de Violaceína

Universidade Federal de Santa Catarina
Centro Tecnolgico
Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos
Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica
Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica:

Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena
ERLON MENDES
Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Engenharia Qumica da

Universidade Federal de Santa Catarina como
requisito parcial para obteno do grau de
Mestre em Engenharia Qumica
Orientador: Prof. Dr. Luismar Marques Porto (EQA/UFSC)
Florianpolis, SC
2006
Erlon Mendes
Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena
Esta dissertao foi julgada e aprovada para obteno do grau de Mestre em
Engenharia Qumica no Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica
da Universidade Federal de Santa Catarina
rea de Concentrao
Processos Qumicos e Biotecnolgicos
________________________________________
Prof. Dr. Luismar Marques Porto
Orientador
________________________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica
Banca Examinadora:
______________________________
Prof. Dr. Luismar Marques Porto
Orientador
______________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Membro Interno
______________________________
Profa Dra Cntia Soares
Membro Externo
Florianpolis, SC, Maro de 2006
Mendes, Erlon
Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena.
Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de Santa
Catarina. Programa de Ps-Graduao em Engenharia
Qumica.
1. Ferramentas de Engenharia Metablica 2. Hidrognio 3.
Violacena 4. MFA 5. MCA
Este trabalho parte integrante das pesquisas

realizadas pelo Grupo de Engenharia Genmica
e foi desenvolvido no Laboratrio de
Tecnologias
Integradas
(InteLAB)
do
Departamento de Engenharia Qumica e
Engenharia de Alimentos, Universidade Federal
de Santa Catarina.
Dedico este trabalho aos meus pais, Ausemir e

Acionir, ao meu irmo Elton e minha
namorada Zenair por todo o apoio,
compreenso e amor dedicados neste momento
to importante da minha vida.
Muito Obrigado!
AGRADECIMENTOS
Agradeo ao Professor Luismar Marques Porto pela oportunidade de
estudar uma rea super interessante e absolutamente nova para mim, pelos
conhecimentos prestados, pela orientao, apoio e amizade.
Agradecimento especial aos colegas Gisele Serpa, Daniela Muccillo,
Julia Vasconcellos Castro e Itamar Leite de Oliveira por todo o apoio,
companheirismo, e grandes idias que me ajudaram muito na realizao deste
trabalho.
A todos os colegas do InteLAB, por contriburem de alguma forma para
a realizao deste trabalho.
Coordenadoria de Ps-Graduao em Engenharia Qumica.
Agradecimento muito especial aos meus pais Ausemir e Acionir, meu
irmo Elton e minha namorada Zenair por toda a compreenso, apoio, amor e
carinho dedicados durante toda a minha vida, e que me fizeram chegar at
aqui.
SUMRIO
NDICE DAS FIGURAS________________________________________________ 9
NDICE DAS TABELAS ______________________________________________ 12
NOMENCLATURA___________________________________________________ 13
LISTA DE ABREVIATURAS___________________________________________ 14
RESUMO ___________________________________________________________ 17
ABSTRACT _________________________________________________________ 18
CAPTULO I ________________________________________________________ 19
Introduo, Motivao e Justificativa ________________________________________ 19
CAPTULO II _______________________________________________________ 22
Reviso Bibliogrfica______________________________________________________ 22
2.1.
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.2.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
A anlise e o controle de fluxos metablicos___________________________________22

A anlise de fluxo metablico ______________________________________________22
A teoria _____________________________________________________________23
A anlise de controle metablico____________________________________________25
A abordagem tradicional, pela maximizao da biomassa ________________________27
A minimizao da energia livre como alternativa biolgica _______________________29
A produo biolgica de hidrognio _________________________________________30
A produo de violacena _________________________________________________36
CAPTULO III ______________________________________________________ 39

Materiais e Mtodos_______________________________________________________ 39
3.1.
Toolbox de Engenharia Metablica para o MATLAB, ME Toolbox _______________39
3.1.1. Mtodos Computacionais _________________________________________________42
3.1.1.1.
Estimativa dos fluxos no medidos________________________________________42
3.1.1.2.
Reconciliao estatstica das medidas______________________________________42
3.1.1.3.
Anlise de sensibilidade ________________________________________________43
3.1.1.4.
Criando a matriz estequiomtrica G ______________________________________44
3.1.2. Utilizando o ME Toolbox para anlise de fluxo metablico (MFA) _________________45
3.1.3. Utilizando o ME Toolbox para MFA com mtodos de istopos marcados (MFAIL) ____46
3.1.4. Utilizando o ME Toolbox para MFA de sistemas subdeterminados utilizando programao
linear (MFAOP)________________________________________________________________49
3.1.5. Utilizando o ME Toolbox para MCA de vias metablicas lineares (MCA) ___________51
3.1.6. Utilizando o ME Toolbox para MCA de pontos de bifurcao (MCAB) _____________53
3.2.
Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por
Clostridium butyricum ___________________________________________________________54
3.3.
Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por
Chromobacterium violaceum______________________________________________________60
3.4.
Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo simplificado do
metabolismo central de uma clula animal ___________________________________________65
CAPTULO IV _______________________________________________________ 69
Resultados e Discusso ____________________________________________________ 69
4.1.
Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por
Clostridium butyricum ___________________________________________________________69
4.1.1. Classificao do sistema __________________________________________________69
4.1.2. Estimativa dos fluxos no medidos da rede metablica no regime estacionrio ________69
4.1.3. Melhoramento estatstico das medidas _______________________________________71
4.1.4. Anlise de sensibilidade __________________________________________________74
4.1.5. Validao da hiptese de minimizao do gasto energtico. Anlise de fluxo metablico

para produo de hidrognio usando a funo MFAOP _________________________________78
4.2.
Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por
Chromobacterium violaceum______________________________________________________80
4.3.
Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo simplificado do
metabolismo central de uma clula animal ___________________________________________84
4.4.
Exemplos hipotticos do uso das funes MCA e MCAB ________________________87
CAPTULO V _______________________________________________________ 94
Concluses e Sugestes ____________________________________________________ 94
5.1.
5.2.
Concluses_____________________________________________________________94
Sugestes para trabalhos futuros ____________________________________________95
CAPTULO VI _______________________________________________________ 97
Referncias Bibliogrficas__________________________________________________ 97
CAPTULO VII _____________________________________________________ 100

Apndice _______________________________________________________________ 100
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
Funo MFA do ME Toolbox _____________________________________________100

Funo MFAIL do ME Toolbox ___________________________________________103
Funo AMM do ME Toolbox ____________________________________________107
Funo MFAOP do ME Toolbox __________________________________________108
Funo MCA do ME Toolbox_____________________________________________110
Funo KINETICS do ME Toolbox ________________________________________112
Funo ELASTICITY do ME Toolbox ______________________________________114
Funo MCAB do ME Toolbox ___________________________________________115
Funo KINETICSB do ME Toolbox _______________________________________118
Funo ELASTICITYB do ME Toolbox ____________________________________119
NDICE DAS FIGURAS

Figura 1 Ilustrao da programao linear. A soluo tima est contida na linha AB
no quadrante no negativo do espao soluo. A funo objetivo consiste numa famlia
de linhas (das quais trs so mostradas). A linha que maximiza a funo objetivo
intercepta a linha AB em (x,y) = (0,4), que representa a soluo para este problema de
otimizao. ________________________________________________________________ 28
Figura 2 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise direta. Fd
representa a enzima ferrodoxina, e H2ase a enzima hidrogenase. _________________ 31
Figura 3 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise indireta. _ 32
Figura 4 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via foto-fermentao. N2ase
representa a enzima nitrogenase. _____________________________________________ 33
Figura 5 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via fermentao escura._ 34
Figura 6 Biossntese de violacena, conforme proposta por August et al. (2000). Vio A,
Vio B, Vio C e Vio D so genes que formam o operon de produo da violacena. Os
metablitos so: a) Triptofano, b) 5-Hidroxitriptofano, c) cido indol pirvido, d)
cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico, e) Pr-desoxiviolacena, f) Oxindol violacena,
g) Violacena, h) Oxi-violacena, i) Desoxiviolacena. ____________________________ 37
Figura 7 Via metablica linear generalizada. __________________________________ 51
Figura 8 Exemplo de um ponto de bifurcao em uma via metablica. ___________ 53
Figura 9 Esquema mostrando o modelo para o metabolismo do hidrognio. O modelo
metablico apresenta dois substratos, glicose e glicerol, formando gliceraldedo-3fosfato e gerando etanol, butirato e acetato. A partir do glicerol ainda formado o 1,3propanodiol. O hidrognio formado pelo sistema lateral onde a ferrodoxina (Fd)
oxidada formando H2, sendo novamente reduzida pelo piruvato fechando o ciclo. __ 55
Figura 10 Esquema de vias metablicas mostrando o modelo para a biossntese de
violacena por Chromobacterium violaceum. O esquema est simplificado, no
mostrando todas as etapas intermedirias que geraram as 95 reaes usadas na matriz
estequiomtrica. O modelo utiliza dois substratos, glicose e glicerol. Foram
consideradas as reaes de formao de biomassa, aminocidos, nucleotdeos, a via das
pentoses e a via de produo da violacena. ____________________________________ 61
Figura 11 Esquema mostrando o modelo simplificado para o metabolismo central de
uma clula animal. _________________________________________________________ 65
Figura 12 Fluxos obtidos por balano de massa simples para a rede de reaes em
estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME Toolbox. _______________ 70
estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME Toolbox. ______________ 71
Figura 14 Novos fluxos obtidos por balano de massa e melhoramento estatstico
para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME
Toolbox. __________________________________________________________________ 73
para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME
Toolbox. __________________________________________________________________ 74
Figura 16 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos medidos. Grfico de sada do
ME Toolbox. _______________________________________________________________ 76
Figura 17 Sensibilidade do fluxo de H2 a variaes nos fluxos medidos. Grfico de
sada do ME Toolbox. _______________________________________________________ 77
Figura 18 Comparao entre os fluxos obtidos pela funo MFA (a) e os estimados
pela funo MFAOP (b). Grficos de sada do ME Toolbox. ______________________ 78
Figura 19 Comparao entre as sensibilidades acumuladas (a e b), e do H2 (c e d),
obtidas pela funo MFA (a e c) e as obtidas pela funo MFAOP (b e d). Grficos de
Figura 20 Fluxos da Chromobacterium violaceum obtidos por otimizao linear
usando a minimizao do gasto energtico como funo objetivo. Os fluxos esto
classificados de acordo com a Tabela (12). Grfico de sada do ME Toolbox. ________ 81
Figura 21 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos extracelulares. Grfico de
Figura 22 Sensibilidade do fluxo de violacena a variaes nos fluxos extracelulares.
Grfico de sada do ME Toolbox. _____________________________________________ 83
Figura 23 Taxas dos fluxos medidos e no medidos. Grfico de sada do ME Toolbox.
__________________________________________________________________________ 84
Figura 24 Fraes de distribuio dos carbonos marcados como resposta a molculas
de piruvato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato, b) isocitrato, c) -cetoglutarato,
d) succinato, e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME Toolbox. _________ 85
de -cetoglutarato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato; b) isocitrato; c) cetoglutarato; d) succinato; e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME
Toolbox. __________________________________________________________________ 86
Figura 26 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas com inibio
do metablito 3 sobre a enzima 2. O grfico mostra as concentraes de cada
metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico no estado estacionrio (J) e os coeficientes
10
de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de
Figura 27 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas sem inibio.
O grfico mostra as concentraes de cada metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico
no estado estacionrio (J) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via
metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. __________________ 89
Figura 28 Esquema de uma via bifurcada composta por quatro reaes, uma de
consumo do substrato e trs de produo de produtos. __________________________ 90
Figura 29 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, uma
reao de produo e trs de consumo do metablito. O grfico mostra a concentrao
do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio (J1, J2, J3 e
J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2,
C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. ____________________________________ 91
Figura 30 Esquema de uma via bifurcada composta por quatro reaes, duas de
consumo de substratos e duas de produo de produtos. ________________________ 92
Figura 31 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, duas
reaes de produo e duas de consumo do metablito. O grfico mostra a
concentrao do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio
(J1, J2, J3 e J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica
(C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox. ____________________________ 93
11
NDICE DAS TABELAS

Tabela 1 Descrio do ME Toolbox.__________________________________________ 40
Tabela 2 Utilizao das funes do ME Toolbox. ______________________________ 41
Tabela 3 Parmetros da funo MFA. ________________________________________ 46
Tabela 4 Parmetros da funo MFAIL. ______________________________________ 47
Tabela 5 Parmetros da funo MFAOP. _____________________________________ 49
Tabela 6 Parmetros da funo MCA.________________________________________ 52
Tabela 7 Parmetros da funo MCAB. ______________________________________ 54
Tabela 8 Modelo de reaes metablicas para produo de hidrognio por
Clostridium butyricum. _____________________________________________________ 56
Tabela 9 Matriz estequiomtrica (G) para a via metablica proposta. _____________ 57
Tabela 10 Fluxos medidos para as condies de alimentao com glicose e glicerol
(Sait-Amans et al., 2000). ____________________________________________________ 58
Tabela 11 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C (Metzler, 1977).____________ 60
Tabela 12 Modelo de reaes metablicas para produo de violacena em
Chromobacterium violaceum. ________________________________________________ 62
Tabela 13 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C (Metzler, 1977).____________ 64
Tabela 14 Modelo de reaes metablicas para o metabolismo central simplificado. 66
(Sait-Amans et al., 2000) e as novas estimativas obtidas pelo melhoramento estatstico.
__________________________________________________________________________ 72
Tabela 16 Sensibilidade dos fluxos calculados em relao a variaes nos fluxos
medidos. __________________________________________________________________ 75
12
NOMENCLATURA
C nmero condicional.
CiJ coeficiente de controle de fluxo da enzima i sobre o fluxo J.
resduo das medidas (mmol h 1 g 1 [clula seca ]) .

Ei variao na atividade da enzima i.
Xi coeficiente de elasticidade da i-sima taxa de reao, vi, em relao

j
concentrao do metablito j, Xj.

G matriz estequiomtrica.
Gc matriz estequiomtrica dos fluxos calculados.
Gm matriz estequiomtrica dos fluxos medidos.
h funo teste.
J fluxo da via no estado estacionrio mmol h 1 g 1 [clula seca ] .
rmet taxas de sntese dos intermedirios nas reaes da via metablica
mmol h 1 g 1 [clula seca ] .
velocidade especfica de crescimento (h 1 ) .

v vetor dos fluxos de cada reao (mmol h 1 g 1 [clula seca ]) .
vc vetor dos fluxos calculados (mmol h 1 g 1 [clula seca ]) .
v c,new novo vetor dos fluxos calculados, obtido aps a reconciliao estatstica
das medidas mmol h 1 g 1 [clula seca ] .
[clula seca ]) .
vm vetor dos fluxos medidos (mmol h 1 g 1 [clula seca ]) .
1
vi taxa da reao i mmol h g
v m,new novo vetor dos fluxos medidos, obtido aps a reconciliao estatstica
das medidas mmol h 1 g 1 [clula seca ] .
Xj concentrao do metablito j mmol g 1 [clula seca ] .
Xmet vetor das concentraes dos metablitos mmol g 1 [clula seca ] .
13
LISTA DE ABREVIATURAS
3DDAH7P 3-Desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato
3HBCOA 3-Hidroxibutiril-CoA
3HPRAL 3-Hidroxi-propionaldedo
3PDGL 3-P-D-glicerato
3PSME o-(1-Carboxivinil)-3-D-shiquimato
5HTRP 5-Hidroxitriptofano
5MTA 5-Metiltioadenosina
AACOA Acetoacetil-CoA
AC Acetato
ACCOA Acetil-CoA
ACP Acetil-fosfato
ACTAL Acetaldedo
ADP Adenosina difosfato
AICAR 5-Fosforibosil-5-amino-4-imidazol carboxamida
AIPRO cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico
AKG -Cetoglutarato
ALA Alanina
AMP Adenosina monofosfato
AN Antranilate
ARG Arginina
ASER o-Acetilserina
ASN Asparagina
ASP Aspartato
ASPSA Aspartato -semialdedo
ATP Adenosine trifosfato
BUCOA Butiril-CoA
BUTP Butiril-fosfato
CAP Carbamoil fosfato
CHOR Corismato
CIT Citrulina
COA Coenzima A-SH
CRCOA Crotonil-CoA
CYS Cistena
D23PIC 2,3-Dihidrodipicolinato
D26PIM l,l-2,6-Diaminopimelato
D6PGC D-6-Fosfoglucano--lactona
DHAC Dihidroxiacetona
DHAP Dihidroxiacetona-fosfato
DIMGP D-Eritromidazoleglicerol-fosfato
DQT 3-Dehidroquinato
DSAM SAM Descarboxilado
E4P Eritrose-4-fosfato
F1,6P Frutose-1,6-bifosfato
14
F6P Frutose-6-fosfato
FAD Flavina adenina dinucleotdeo oxidada
FADH2 Flavina adenina dinucleotdeo reduzida
FCC Coeficiente de controle de fluxo
Fd(ox) Ferrodoxina em seu estado oxidado
Fd(red) Ferrodoxina em seu estado reduzido
FUM Fumarato
G1P Glicose-1-fosfato
G3P Gliceraldedo-3-fosfato
G6P Glicose-6-fosfato
GDP Guanosina difosfato
GL Glicerol
GL3P Glicerol-3-fosfato
GLC Glicose
GLN Glutamina
GLU Glutamato
GLUP Glutamil fosfato
GLX Glioxilato
GLY Glicina
GTP Guanosina trifosfato
H2ase Hidrogenase
HCYS Homocistena
HIS Histidina
HISOLP 1-Histidinol-fosfato
HPHPYR p-Hidroxi fenilpiruvato
HSER Homocerina
ICIT Isocitrato
ILE Isoleucina
IMACP Imidazol acetil-fosfato
IPYR cido indol pirvido
LYS L-Lysine
MAL Malato
MCA Anlise de controle metablico (do ingls metabolic control analysis)
MET Metionina
METTHF 5,10-Metileno tetrahidrofolato
MFA Anlise de fluxo metablico (do ingls metabolic flux analysis)
MTHF 5,10-Metil tetrahidrofolato
N2ase Nitrogenase
NAD Nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada
NADH Nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida
NADP Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato oxidada
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato reduzida
NAGLU N-Acetil glutamato
NPRAN N-5-Fosforibosil-antranilato
OA Oxaloacetato
OBUT Oxobutirato
15
OIVAL Oxoisovalerato
OIVIO Oxiviolacena
ORN Ornitina
PEMFC Clulas de combustvel de membrana trocadora de prtons (do ingls
proton exchange membrane fuel cells).
PEP Fosfoenolpiruvato
PFL Piruvato formato liase
PFOR Piruvato ferrodoxina (flavodoxina) oxiredutase
PHE Fenilalanina
PHEN Prefenato
PHPYR Fenilpiruvato
PI Fosfato inorgnico
PIP26DX -Piperidina-2,6-dicarboxilato
PPI Pirofosfato
PRBATP Fosforibosil-ATP
PRO Prolina
PRPP Fosforibosil pirofosfato
PTRSC Putrecina
PVIO Prodesoxiviolacena
PYR Piruvato
R5P Ribose-5-fosfato
RL5P D-Ribulose-5-fosfato
S7P D-Sedoheptulose-7-fosfato
SER Serina
SME Shiquimato
SME5P Shiquimato-5-fosfato
SPRMD Spermidina
SUCC Succinato
SUCCOA Succinil-CoA
T3P1 Gliceraldedo-3-fosfato
T3P2 Dihidroxiacetona-fosfato
THF Tetrahidrofolato
THR Treonina
TRP Triptofano
TYR Tirosina
VAL Valina
VIO Violacena
X5P Xilulose-5-fosfato
16
RESUMO
MENDES, Erlon. Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica:
Produo Bacteriana de Hidrognio e de Violacena. 2006. 117p. Dissertao
(Mestrado em Engenharia Qumica) Programa de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica, UFSC, Florianpolis, SC.
A quantificao da magnitude de cada um dos fluxos celulares sempre foi um
importante objetivo na engenharia metablica, principalmente com relao
produo de metablitos de interesse comercial ou cientfico. Uma ferramenta
poderosa para determinao das taxas dos fluxos em vias metablicas a
anlise de fluxo metablico (MFA), onde taxas de fluxos intracelulares so
calculadas usando modelos estequiomtricos de uma gama de reaes
intracelulares e aplicao de balanos de massa. No entanto, MFA por si s no
fornece qualquer medida quantitativa do controle de fluxo, que importante
para manter as taxas de sntese e converso diante de uma grande gama de
condies externas. Alm disso, o entendimento dos controles de fluxo
importante para modificao racional dos fluxos metablicos, que um dos
objetivos centrais da engenharia metablica. Tal informao fornecida pela
anlise de controle metablico (MCA). O MATLAB apresenta uma famlia de
funes que servem a aplicaes especficas, chamadas toolboxes. Toolboxes so
colees de funes do MATLAB (arquivos .M) que estendem o ambiente do
MATLAB para resolver classes particulares de problemas. O presente trabalho
tem como objetivo principal a apresentao de um toolbox para o MATLAB
que integra a maioria das ferramentas e clculos em anlise de fluxo metablico
(MFA) e anlise de controle metablico (MCA), o ME Toolbox. A verso atual
do ME Toolbox permite a obteno de fluxos intracelulares, melhoria dos fluxos
por reconciliao estatstica, anlise de sensibilidade, anlise de fluxo
metablico usando mtodos de marcadores isotpicos, e anlise de controle
metablico para redes lineares e bifurcadas, abrangendo assim uma grande
gama de possibilidades em engenharia metablica. O ME Toolbox foi aplicado
para produo de hidrognio por Clostridium butyricum, um potencial substituto
para combustveis base de carbono, e para produo de violacena por
Chromobacterium violaceum, pigmento de cor violeta que apresenta atividade
antimicrobiana, antiviral, e antitumoral.
Palavras Chave: Ferramentas
Violacena, MFA e MCA.
de
Engenharia
17
Metablica,
Hidrognio,
ABSTRACT
MENDES, Erlon. Rational Use of Metabolic Engineering Tools: Hydrogen and
Violacein Bacterial Production. 2006. 117p. Dissertation (Masters Degree in
Chemical Engineering) Post-Graduation Program in Chemical Engineering,
UFSC, Florianpolis, SC.
Quantification of the magnitude of each cellular flux was always an important
objective in metabolic engineering, mostly concerned with commercial and
scientific metabolite production. A powerful tool for flux rate determinations in
metabolic pathways is the metabolic flux analysis (MFA). Using MFA one may
calculate intracellular flux rates, starting from a stoichiometric model for the
various intracellular reactions and mass balance. However, MFA by itself does
not supply any quantitative information on the control of fluxes, an important
goal for keeping the rates of synthesis and conversion over a great range of
external conditions. Besides, the understanding of the flux controls is important
for the rational modification of metabolic fluxes, which is one of the main
objectives of metabolic engineering. Such information is supplied by the
metabolic control analysis (MCA). A family of MATLAB add-on applicationspecific solutions for solving metabolic engineering problems was used in this
study. MATLAB toolboxes are comprehensive collections of MATLAB M-files
that extend the MATLAB environment. The present work has as main
objective the presentation of a toolbox for MATLAB that integrates most of the
tools and calculations in metabolic flux analysis (MFA) and metabolic control
analysis (MCA), the ME Toolbox. The current version of the ME Toolbox allows
calculation of intracellular fluxes, improvement of fluxes by statistical
reconciliation, and to perform sensitivity analysis, metabolic flux analysis using
isotope labeling methods, and metabolic control analysis for linear and
branched pathways. Those techniques embrace a great range of possibilities in
metabolic engineering. The ME Toolbox was applied for hydrogen production
by Clostridium butyricum, an interesting substitute for carbon based fuel, and for
violacein production by Chromobacterium violaceum, a violet pigment that
presents antimicrobial, antiviral and anticancer activities.
Keywords: Metabolic Engineering Tools, Hydrogen, Violacein, MFA and MCA.
18
CAPTULO I
Introduo, Motivao e Justificativa
A manipulao de vias metablicas com o objetivo de favorecer
microrganismos com propriedades desejveis um desejo muito antigo
(Stephanopoulos et al., 1998). Existem vrios exemplos bem sucedidos dessas
estratgias na produo de aminocidos, antibiticos, solventes e vitaminas. O
desenvolvimento de tcnicas de biologia molecular para recombinao do DNA
introduziu uma nova dimenso para a manipulao de vias metablicas. A
engenharia gentica permitiu a modificao precisa de reaes enzimticas
especficas em vias metablicas e, portanto, a construo de conhecimentos
genticos bem definidos, que permitem o desenvolvimento de organismos
metabolicamente engenheirados.
A engenharia metablica define-se como
o melhoramento dirigido de formao de produtos ou propriedades
celulares atravs da modificao de reaes bioqumicas especficas ou a
introduo de novas com o uso da tecnologia de DNA recombinante
(Stephanopoulos et al., 1998).
A obteno do alvo da modificao ou introduo de uma reao
especfica uma caracterstica essencial da engenharia metablica. A
quantificao da magnitude de cada um dos fluxos intracelulares sempre foi
um importante objetivo na engenharia metablica, principalmente com relao
produo de metablitos de interesse comercial. Uma ferramenta poderosa
para determinao das taxas dos fluxos em vias metablicas a anlise de fluxo
metablico (MFA, do ingls metabolic flux analysis), onde taxas de fluxos
intracelulares so calculadas usando modelos estequiomtricos de uma gama
de reaes intracelulares e a aplicao de balanos de massa.
No entanto, MFA por si s no fornece qualquer medida quantitativa
do controle de fluxo, que importante para manter as taxas de sntese e
converso diante de uma grande gama de condies externas. Alm disso, o
19
entendimento dos controles de fluxo importante para a modificao racional

dos fluxos metablicos, que um dos objetivos centrais da engenharia
metablica. Tal informao fornecida pela anlise de controle metablico
(MCA, do ingls, metabolic control analysis), que auxilia na descoberta da
resposta do fluxo metablico a uma pequena variao na atividade de uma
enzima.
Neste trabalho, esses conceitos foram testados em dois estudos de caso:
a produo de hidrognio por Clostridium butyricum, e a produo de violacena
por Chromobacterium violaceum.
A maior parte da necessidade global de energia dependente de
combustveis fsseis que, alm de serem fontes no renovveis e cada vez mais
escassas, ainda causam srias variaes climticas devido emisso dos gases
poluentes gerados como resultado de suas combustes. Com o objetivo de
remediar a escassez de combustveis fsseis e seus graves problemas
ambientais, o hidrognio tem sido sugerido como carreador de energia do
futuro. O hidrognio considerado o combustvel do futuro devido a sua alta
eficincia na converso, reciclabilidade e natureza no poluente. A produo
biolgica de hidrognio apresenta menor impacto ambiental e menor
necessidade energtica se comparada com os processos termoqumicos e
eletroqumicos (Debabrata e Nejat, 2001).
A produo biolgica de hidrognio por via bacteriana constitui-se,
pois, em um interessante modelo para o estudo de engenharia metablica,
sobretudo quando se considera a possibilidade de maximizar as principais
fontes energticas que, no futuro, podero ser substitudas.
Um outro modelo metablico interessante, e que vem sendo
amplamente estudado pelo Grupo de Engenharia Genmica, a produo de
violacena por Chromobacterium violaceum. O estudo para a sua produo em
larga escala pode se beneficiar do conhecimento dos fluxos intracelulares que
fazem parte da sua via de biossntese, e a sensibilidade do fluxo em estudo a
20
variaes nos fluxos extracelulares pode indicar as rotas mais eficientes de

mutao gentica para obteno de uma bactria superprodutora de violacena.
Para tornar a metodologia desenvolvida para estudos de engenharia
metablica um conjunto de ferramentas teis para a anlise da produo de
metablitos secundrios, foram estabelecidos os seguintes objetivos especficos:
Desenvolvimento da tcnica de minimizao de energia livre para a

anlise de vias metablicas;
Anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por

Clostridium butyricum;
Anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por

Chromobacterium violaceum;
Integrao de tcnicas computacionais de engenharia metablica em um

toolbox para o MATLAB.
Como parte deste trabalho, criou-se o ME Toolbox (Metabolic
Engineering Toolbox), que permite a realizao semi-automtica de anlises de

fluxo metablico, o estudo de controle de fluxos atravs de parmetros de
controle, e a distribuio de isotopmeros. Neste ltimo caso, o toolbox foi
testado para o metabolismo central de uma clula animal.
21
CAPTULO II
Reviso Bibliogrfica
2.1.
A anlise e o controle de fluxos metablicos
2.1.1. A anlise de fluxo metablico

A quantificao da magnitude dos fluxos metablicos in vivo um
importante
objetivo
em
fisiologia
celular
engenharia
metablica,
principalmente no que diz respeito produo de produtos teis

comercialmente e cientificamente. A anlise de fluxo metablico uma
metodologia eficiente para a obteno dos fluxos metablicos, onde as reaes
intracelulares so quantificadas a partir de fluxos extracelulares utilizando
modelos estequiomtricos e tcnicas de balano de massa.
A anlise de fluxo metablico no s permite a quantificao de fluxos
intracelulares, como tambm indica as rotas mais eficientes para o melhor
aproveitamento do substrato na produo de um metablito de interesse, como,
por exemplo, a obteno de mutantes super-produtores do metablito desejado.
A anlise de fluxo metablico ainda fornece vrias informaes
adicionais (Stephanopoulos et al., 1998):
Identificao dos controles dos pontos de bifurcao possvel, atravs da

separao de fluxos em diferentes condies e com diferentes mutantes,
saber a flexibilidade ou a rigidez de pontos de bifurcao.
Identificao
de
vias metablicas
alternativas A
formulao
da
estequiometria das reaes, que a base do MFA, requer conhecimento

detalhado da rota bioqumica atual, pela qual os substratos so
convertidos em produtos. Isso, no entanto, pode no ser claro para
muitos microorganismos e muitas vias metablicas alternativas podem
ser identificadas.
22
Clculo de fluxos extracelulares no medidos Em alguns casos, o nmero de

fluxos extracelulares que podem ser medidos menor do que o
necessrio para o clculo de fluxos intracelulares desconhecidos. Nesses
casos, possvel obter tais fluxos usando programao linear.
Clculo de rendimentos tericos mximos A separao dos fluxos pode ser

ajustada de forma a maximizar a quantidade do produto formado e
ainda identificar os metablitos limitantes.
2.1.1.1.
A teoria
A forma geral da equao do balano de massa para um estado varivel
dada pela seguinte equao diferencial (Stephanopoulos et al., 1998):

dX met
= rmet X met .
dt
(1)
O primeiro termo do lado direito representa a rede de taxas de sntese

dos intermedirios nas reaes da via metablica. O segundo termo descreve a
diluio do conjunto de metablitos devido ao crescimento da biomassa. No
entanto, devido ao baixo nvel intracelular da maioria dos metablitos, tais
efeitos de diluio so considerados muito pequenos se comparados com os
fluxos que afetam os mesmos metablitos. Isso faz com que o segundo termo do
lado direito da Equao (1) seja usualmente considerado zero. Admitindo que
exista uma alta regenerao da maioria dos metablitos, suas concentraes
rapidamente se ajustam aos novos nveis, fazendo com que a hiptese de estado
pseudo-estacionrio seja aplicvel. Isso faz com que o primeiro termo da
Equao (1) seja igualado zero. As taxas de sntese de cada reao podem ser
decompostas como o produto da transposta da matriz estequiomtrica e o vetor
de todas as taxas de reao. Logo, chega-se ao seguinte balano simplificado:
0 = rmet = G'v ,
(2)
23
onde G representa a matriz dos coeficientes estequiomtricos, chamada matriz

estequiomtrica, e v representa o vetor dos fluxos de cada reao. A linha na
Equao (2) representa a transposta da matriz estequiomtrica G. A Equao (2)
a base para anlise de fluxo metablico e representa K balanos algbricos
lineares para K metablitos com J fluxos desconhecidos. Como o nmero de
reaes (J) sempre maior que o nmero de metablitos da via (K), existe
sempre um certo grau de liberdade no conjunto de equaes algbricas dado
por F = J K . Portanto, para soluo do sistema, alguns elementos de v
devem ser medidos ou conhecidos para que o sistema seja determinado. Se
exatamente F fluxos so medidos, o sistema torna-se determinado e a soluo
nica. Caso o nmero de fluxos medidos seja superior a F, o sistema
superdeterminado, significando que existem equaes extras que podem ser
usadas para testar a consistncia dos balanos globais. No entanto, se o nmero
de fluxos medidos inferior a F, o sistema subdeterminado, e os fluxos
desconhecidos podem ser determinados apenas se restries adicionais forem
induzidas ou se um critrio de otimizao global for imposto aos balanos
metablicos. Em um sistema determinado, podemos obter os fluxos
desconhecidos particionando a Equao (2) da seguinte forma:
0 = G'v = G'm v m + G'c v c ,
(3)
onde os ndices m e c representam os fluxos medidos e os que se deseja calcular

respectivamente. Uma vez que F exatamente igual ao nmero de fluxos
medidos (sistema determinado), G c uma matriz quadrada (dimenses K K)
e, portanto, inversvel. Os elementos de v c podem ento ser obtidos pela
Equao (4):
v c = (G'c ) G 'm v m .
1
(4)
Para os sistemas superdeterminados, G c no inversvel e a soluo

para a Equao (4) pode ser obtida pelo uso da pseudo-inversa de MoorePenrose.
(G ) = (G G )
' #
c
' 1
c
(5)
Gc .
24
Desta forma, a Equao (4) passa a ser:

v c = (G 'c ) G 'm v m .
#
(6)
Observe que, se G c uma matriz quadrada, sua pseudo-inversa ser a

prpria inversa.
A Equao (6) muito til quando o nvel de rudo nas medidas
pequeno. Baixo nvel de rudo representa que os resduos das medidas so
distribudos uniformemente entre os fluxos. No entanto, se um rudo
significante apresenta-se apenas em alguns fluxos medidos, a soluo pode no
satisfazer a conservao dos fluxos e, portanto, ao balano de massa em alguns
ns. Uma forma tradicional de resolver o problema fazer uma reconciliao
estatstica das medidas. A reconciliao estatstica das medidas usa ferramentas
de estatstica para que os valores experimentais se adaptem melhor aos
balanos de massa propostos, isto , os dados experimentais so melhorados.
Maiores detalhes sobre a reconciliao estatstica sero apresentados em
materiais e mtodos.
2.1.2. A anlise de controle metablico

A anlise de fluxo metablico (MFA) pode ser utilizada para o estudo
das interaes entre diferentes vias metablicas e quantificao da distribuio
dos fluxos ao redor dos pontos de bifurcao. No entanto, a anlise de fluxo
metablico por si s no fornece qualquer medida quantitativa do controle de
fluxo, que o responsvel por manter as taxas de sntese e converso de
metablitos balanceada, diante de uma grande variedade de condies
externas, sem aumento ou queda significativa nas concentraes intracelulares
dos metablitos. Com o conhecimento do controle de fluxo possvel saber, a
partir de modelos cinticos em pontos isolados da via, o que aconteceria com o
fluxo metablico se alterssemos o nvel de expresso de uma determinada
25
enzima. Tal informao permite uma modificao racional dos fluxos

metablicos, que o principal objetivo da engenharia metablica.
Os aspectos fundamentais da rede so obtidos atravs da sensibilidade
das variveis do sistema, que so os fluxos ou nveis de metablitos, a variaes
nos parmetros do sistema, que so as atividades enzimticas ou nveis de
substrato e produto. Estas sensibilidades so tambm chamadas de coeficientes
de controle.
Sendo J o fluxo no estado estacionrio e Ei a atividade da enzima i, o
coeficiente de controle de fluxo (FCC), CiJ , definido como a taxa da variao
relativa no fluxo (dJ/J) sobre a variao relativa na atividade da enzima i (dEi/Ei)
(Stephanopoulos et al., 1998).
CiJ =
dJ J
E dJ
d ln J
= i
=
dEi Ei J dEi d ln Ei
(7)
Pela definio dos FCCs, a enzima com o maior coeficiente de controle

de fluxo exerce maior influncia sobre o controle de fluxo em um determinado
regime estacionrio.
Como os FCCs so definidos em termos de fluxos relativos e atividades
relativas, eles so adimensionais e suas magnitudes so independentes das
unidades utilizadas nos fluxos e nas atividades enzimticas. Uma conseqncia
importante da normalizao dos FCCs que, relativo a cada fluxo, a soma de
todos os FCCs deve ser um. Isso conhecido como o teorema da soma dos
controles de fluxo:
L
C
i =1
JK
i
=1
k {1,2,..., L} .
(8)
Outro conceito importante em MCA o coeficiente de elasticidade.

Diferentemente dos coeficientes de controle, que so propriedades sistmicas de
todo o sistema metablico, elasticidades so propriedades locais de enzimas
individuais na rede metablica. A elasticidade da i-sima taxa de reao, vi, em
relao concentrao do metablito j, Xj, definida como a taxa da variao
26
relativa na taxa de reao com relao a uma variao infinitesimal na

concentrao do metablito, assumindo que todas as outras variveis do
sistema no variam de seus valores do regime estacionrio, isto :
Xi =
j
X j vi
vi vi
ln vi
.
=
=
X j X j
vi X j ln X j
(9)
Se a reduo na atividade de uma enzima tem um efeito pequeno no

fluxo geral, significa que o coeficiente de controle da enzima perturbada
pequeno. De forma similar, a perturbao de uma enzima com pequena
elasticidade relacionada a seu metablito intermedirio pode causar uma
variao significativa no fluxo. Esta relao entre coeficientes de controle de
fluxo e elasticidades expressa segundo o teorema da conectividade dos controles
de fluxo, expresso por:
L
C
i =1
JK
i
Xi = 0 i {1,2,..., L} , j {1,2,..., K }.
j
(10)
Este teorema diz como a cintica de uma enzima afeta localmente o

fluxo global. Em geral, pode-se concluir que enzimas com grandes FCCs
possuem pequenos coeficientes de elasticidade, e vice-versa. Portanto,
improvvel que enzimas que respondem rapidamente variaes nos nveis
dos metablitos, isto , possuem grande elasticidade, exeram maior controle
no fluxo global do que enzimas que respondem lentamente a variaes nos
nveis de metablitos.
2.2.
A abordagem tradicional, pela maximizao da biomassa

Quando o nmero de fluxos medidos inferior ao grau de liberdade do
sistema, existe um nmero infinito de solues para os fluxos metablicos

(sistema subdeterminado). Nesses casos, a programao linear pode ser usada
para determinar a distribuio dos fluxos. Para tanto, torna-se necessrio o uso
de uma funo que fora a soluo do sistema para satisfazer determinado
objetivo, a chamada funo objetivo.
27
Uma descrio bsica da programao linear apresentada por

Stephanopoulos et al. (1998).
Considerando o sistema de duas variveis, x e y, relacionadas atravs
da seguinte equao:
2 x + y = 4
(11)
Uma restrio comum a todos os problemas de programao linear

que todas as variveis devem ser no-negativas. Essa limitao restringe o
espao de solues ao primeiro quadrante, mesmo assim existem infinitas
solues para o sistema. No entanto, se uma funo objetivo for aplicada ao
sistema, por exemplo, maximizar 2 x + 3 y , o sistema passa a ter uma nica
soluo, x = 0 e y = 4 , conforme ilustrado na Figura (1).
4 A
2x+y=4
2x+3y=12
2x+3y=3
0
0
2x+3y=6
3
Fonte: Stephanopoulos et al., 1998.

Figura 1 Ilustrao da programao linear. A soluo tima est contida
na linha AB no quadrante no negativo do espao soluo. A funo
objetivo consiste numa famlia de linhas (das quais trs so mostradas). A
linha que maximiza a funo objetivo intercepta a linha AB em (x,y) =
(0,4), que representa a soluo para este problema de otimizao.
Varma (1993) usaram MFA por programao linear para interpretar o

catabolismo da glicose por Escherichia coli sob vrios nveis de oxigenao.
Neste trabalho foi possvel prever as mudanas no metabolismo celular quando
o consumo de oxignio vai ficando debilitado. A seqncia de produtos que
obtida na passagem de um sistema aerbico para anaerbico (acetato, formato e
28
etanol), foi reproduzida com programao linear usando a maximizao da taxa

de formao de biomassa como funo objetivo.
Ozkan (2005) fizeram mutantes de Escherichia coli para superproduo
da protena de ligao glicose isomerase-maltose (Gl-malE). O estudo do
metabolismo da bactria mutante foi feito usando MFA por programao linear
em um sistema de 411 reaes, tambm usando a taxa de formao de
biomassa.
Bell e Palsson (2005) introduziram a teoria da anlise do plano fase, cuja
principal diferena da anlise de fluxo metablico convencional a definio de
um campo de comportamentos fenotpicos timos quando duas condies
variam. Suas aplicaes incluem a comparao do crescimento de uma
linhagem em diferentes substratos, anlise das conseqncias de delees no
gene, e experimentos de design.
2.3.
A minimizao da energia livre como alternativa biolgica

A minimizao do gasto energtico outra estratgia utilizada para a
anlise de fluxo metablico por otimizao linear. Cortassa et al. (2002) sugerem
dois tipos de funo objetivo: (i) a maximizao do crescimento de biomassa,
metodologia amplamente utilizada quando o modelo metablico complexo
demais para a obteno dos dados experimentais necessrios a um sistema
determinado, e (ii) a minimizao do gasto energtico, que pode ser obtida pela
minimizao das taxas das reaes em que ocorre produo de ATP. A funo
objetivo utilizada para os sistemas subdeterminados do presente trabalho
tambm se baseia na minimizao do gasto energtico, mas de uma forma mais
complexa, utilizando um balano energtico entre produtos e substratos da via
metablica.
29
2.4.
A produo biolgica de hidrognio

A utilizao de combustveis fsseis vem sendo apontada como fator de
agravo que est causando aquecimento global, degradao do meio ambiente e

problemas de sade. Alm disso, os recursos de combustveis fsseis so
limitados, no renovveis e o uso indiscriminado eventualmente levar ao fim
dos mesmos nas prximas dcadas.
Devido a sua alta converso, reciclabilidade e natureza no poluente, o
hidrognio considerado o combustvel do futuro (Debabrata e Nejat, 2001).
O hidrognio pode ser produzido por inmeros processos, incluindo a
eletrlise da gua, a reforma termocataltica de compostos orgnicos ricos em
hidrognio, e processos biolgicos. Atualmente o hidrognio produzido quase
que exclusivamente por eletrlise da gua ou por reforma a vapor do metano. A
produo biolgica de hidrognio usando microrganismos uma rea nova do
desenvolvimento tecnolgico que oferece potencial de produo de hidrognio
a partir de uma grande variedade de recursos renovveis (Levin et al., 2004).
A produo biolgica de hidrognio possui vrias abordagens. Dentre
elas, destacam-se: biofotlise direta, biofotlise indireta, foto-fermentao e
fermentao escura (Hallenbeck e Benemann, 2002; Levin et al., 2004).
A biofotlise direta um processo em que microalgas verdes capturam
luz e a energia recuperada usada para juntar duas molculas de gua para a
gerao de um redutor de baixo potencial, que pode ser usado para reduzir
uma enzima hidrogenase que produz hidrognio (Figura 2), seguindo a
seguinte reao geral:
2 H2O
energia
luminosa
hidrogenase
(12)
2 H2 + O2 .
As microalgas verdes utilizam energia luminosa para gerar eltrons que

so transferidos para uma molcula de ferrodoxina, tomando a sua forma
30
reduzida. A enzima hidrogenase combina os prtons (H+) do meio com eltrons

doados pela ferrodoxina reduzida, para formar e liberar H2.
H2
Fotossntese I, II
2 H2O
2eFd
H2ase
O2
2 H+
Fonte: Hallenbeck e Benemann, 2002.

Figura 2 Modelo esquemtico de produo de
hidrognio via biofotlise direta. Fd representa a
enzima ferrodoxina, e H2ase a enzima
hidrogenase.
Infelizmente, como a etapa escura a etapa limitante, a eficincia na

converso da luz solar de apenas 10%, apresentando maior eficincia em
menor fluxo solar. Alm disso, a atividade enzimtica da hidrogenase, principal
enzima para a produo de hidrognio, extremamente sensvel ao oxignio,
sendo necessrias condies especiais para o sistema, cujas baixas presses
parciais seriam impossveis de se manter em qualquer processo prtico de
biofotlise direta (Hallenbeck e Benemann, 2002).
O uso de mutagnese clssica tem proporcionado um sucesso limitado
na obteno de mutantes com tolerncia ao oxignio (Hallenbeck e Benemann,
2002), mas estes apresentam apenas aumento na atividade respiratria e,
portanto, provendo um melhoramento aparente na resistncia ao oxignio.
Mesmo se o problema da inibio pelo oxignio fosse superado, a biofotlise
31
direta requer grandes fotobiorreatores e separao do H2 e O2, que tornaria o

processo impraticvel.
A biofotlise indireta tenta resolver o problema da sensibilidade ao
oxignio separando a evoluo do oxignio e do hidrognio em dois estgios,
atravs da fixao de CO2 (Figura 3).
Estgio 1 (+O2)
Estgio 2 (-O2)
Material
Celular
CO2
Fotossntese I, II
2 H2O
2eFd
Material
Celular
Fermentao
H2
2eFd
H2ase
O2
2 H+

Figura 3 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via biofotlise indireta.
Uma elaborao deste conceito envolve quatro passos distintos

(Hallenbeck e Benemann, 2002):
1. Produo de alta concentrao de biomassa e armazenamento de
carboidratos em tanques a 10% de eficincia solar;
2. Concentrao da biomassa dos tanques em um tanque de
decantao;
3. Fermentao escura anaerbica para produzir 4 mol de H2/mol
de glicose armazenada nas clulas das algas, mais 2 mols de
acetato;
32
4. Um fotobiorreator no qual as clulas das algas converteriam os

dois moles de acetato para 8 moles de H2.
Infelizmente os processos de biofotlise indireta ainda esto em estgio
conceitual. Seus aspectos econmicos ainda precisam ser demonstrados mesmo
em nvel experimental.
Nas
foto-fermentaes,
bactrias
prpuras
produzem
hidrognio
molecular catalisado pela nitrogenase sob condies de deficincia em

nitrognio, usando energia luminosa e cidos orgnicos reduzidos (Figura 4).
H2
Fd
2e-
Fotossntese
Bacteriana
N2ase
4 ATP
2 H+
cidos orgnicos
contendo dejetos
Figura 4 Modelo esquemtico de produo de
hidrognio via foto-fermentao. N2ase
representa a enzima nitrogenase.
Assim como nos demais processos fotossintetizantes, as fotofermentaes
apresentam
eficincias
cada
vez
mais
baixas
sob
alta
luminosidade. As taxas e eficincias na produo de hidrognio nesse e em

todos os outros sistemas envolvendo diretamente a fotossntese para produo
de H2 esto longe de qualquer viabilidade econmica plausvel.
33
A fermentao escura o processo onde bactrias anaerbicas produzem

hidrognio principalmente pelo metabolismo anaerbico do piruvato, formado
durante o catabolismo de vrios substratos (Figura 5).
Bactrias conhecidas produtoras de hidrognio so das espcies
Enterobacter, Bacillus e Clostridium.
H2
Biomassa
CO2
Separao
gasosa
Produtos
agrcolas
Pr-tratamento
Fermentao
(organismos
geneticamente
modificados)
Rejeitos
orgnicos

Figura 5 Modelo esquemtico de produo de hidrognio via fermentao
escura.
A quebra do piruvato catalisada por um dos dois sistemas

enzimticos:
1) Piruvato formato liase (PFL):
Piruvato + CoA
PFL
Acetil-CoA + Formato
(13)
2) Piruvato ferrodoxina (flavodoxina) oxidoredutase (PFOR):

Piruvato + CoA + 2 Fd(ox)
PFOR
Acetil-CoA + CO2 + 2 Fd(red)
34
(14)
Nas duas reaes, o piruvato gerado pela gliclise usado, na ausncia

de oxignio, para produzir acetil-CoA, que pode gerar ATP, e ainda formato ou
ferrodoxina reduzida (Fd(red)), que pode gerar hidrognio.
Certas bactrias fotoheterotrficas da superfamlia Rhodospirillaceae
podem crescer na ausncia de luz usando CO como nica fonte de carbono para
gerar ATP com liberao de H2 e CO2. A oxidao de CO para CO2 com
liberao de H2 ocorre via reao de deslocamento gs-gua (CO-gua):
CO(g) + H2O(l)
CO2(g) + H2(g) .
(15)
Utilizando resultados de outros trabalhos de diversas produes

biolgicas de hidrognio, Levin et al. (2004) fizeram um estudo de viabilidade
na produo de biorreatores que pudessem suprir hidrognio suficiente para
uso em clulas de combustvel de membrana trocadora de prtons (proton
exchange membrane fuel cells - PEMFC). Trs capacidades diferentes 1,5; 2,5 e 5
kW foram tidas como suficientes para gerar eletricidade a fim de suprir a
demanda energtica de uma casa tpica norte americana sem aquecimento
interno, com aquecimento interno e armazenamento de energia, e com
aquecimento interno sem sistema de armazenamento, respectivamente. O
resultado das anlises mostrou que sistemas baseados em fotossntese no
possuem taxas de produo de hidrognio suficientes para carregar clulas de
combustvel, mesmo de 1 kW. No entanto, alguns sistemas de fermentao
escura e reao de deslocamento CO-gua de R. gelatinosus CBS apresentaram
resultados promissores.
Biorreatores de tamanhos razoveis seriam suficientes para carregar
clulas de energia de 5 kW usando um grupo de bactrias mesoflicas,
enriquecido para a espcie Clostridium. Um biorreator de aproximadamente 500
L forneceria hidrognio suficiente para carregar uma PEMFC de 2,5 kW,
enquanto 1.000 L forneceriam hidrognio suficiente para uma PEMFC de 5 kW.
A reao de deslocamento CO-gua de R. gelatinosus CBS intrigante
uma vez que oferece potencial para captura e reforma de CO para produo de
35
H2. Um reator de aproximadamente 624 L seria necessrio para fornecer

hidrognio suficiente para uma PEMFC de 2,5 kW e um reator de 1.250 L para
uma PEMFC de 5 kW (Levin et al., 2004).
Biorreatores de 1.000 a 1.500 L na base de uma casa no so
impensveis visto que tanques de aquecimento de leo com aproximadamente
este tamanho so usados em algumas casas norte-americanas.
Cabe ressaltar que os volumes dos reatores foram baseados em taxas
obtidas por experimentos de laboratrio, sendo necessrias mais pesquisas para
determinar se o aumento da escala influenciaria na produo de H2.
2.5.
A produo de violacena
Chromobacterium violaceum uma -proteobactria Gram-negativa,
predominante em uma variedade de ecossistemas nas regies tropicais e

subtropicais. Esta bactria tem sido encontrada em maior abundncia nas guas
as margens do Rio Negro. A trs dcadas a C. violaceum tem sido fonte de
estudos no Brasil. Em geral, tais estudos tm sido focados num pigmento
violeta chamado violacena, que vem sendo usado como composto teraputico
para fins dermatolgicos. A violacena apresenta atividades antipatognicas,
bactericidas, antivirais e antitumorais (Vasconcelos et al. 2003).
O seqenciamento desta bactria pelo Consrcio Nacional Brasileiro do
Projeto Genoma revelou detalhes de sua complexidade que explicam sua
versatilidade e abriu fronteiras para o estudo do seu potencial biotecnolgico.
August et al. (2000) seqenciou e clonou o operon vioABCD, sendo
seus resultados posteriormente confirmados pelo seqenciamento completo da
C. violaceum. No mesmo trabalho sugerido um mecanismo de biossntese da
violacena, mostrado na Figura (6).
36
Adaptado de August et al., 2000.

Figura 6 Biossntese de violacena, conforme proposta por August et al. (2000). Vio
A, Vio B, Vio C e Vio D so genes que formam o operon de produo da violacena. Os
metablitos so: a) Triptofano, b) 5-Hidroxitriptofano, c) cido indol pirvido, d)
cido D-2-amino-2-(3-indol) propinico, e) Pr-desoxiviolacena, f) Oxindol
violacena, g) Violacena, h) Oxi-violacena, i) Desoxiviolacena.
37
A via de biossntese mostrada na Figura (6) foi a pea chave para a

anlise de fluxo metablico para produo de violacena.
38
CAPTULO III
Materiais e Mtodos
3.1.
Toolbox de Engenharia Metablica para o MATLAB, ME Toolbox

A anlise de fluxo metablico (MFA) e anlise de controle metablico
(MCA) so ferramentas bem estabelecidas e largamente utilizadas para

quantificao de fluxos celulares (Vallino e Stephanopoulos, 1993; Chatziiannou
et al., 2003; Nadeau et al., 2000; Shimizu et al., 2003; Shirai et al., 2005), no
estudo da sensibilidade dos fluxos em relao a pequenas perturbaes nas
medidas (Chatziiannou et al., 2003), no uso de marcadores isotpicos para
estudar o metabolismo (McCabe e Previs, 2004) e anlise dos coeficientes de
controle de fluxos em pontos de bifurcao chaves da via metablica (Shimizu
et al., 2003; Heijnen et al., 2004).
MFA e MCA so ferramentas muito importantes na engenharia
metablica, apresentam suas limitaes e vantagens quando analisadas
separadamente mas, se combinadas sabiamente, fornecem informaes do
funcionamento celular com um alto nvel de detalhamento.
Um dos objetivos deste trabalho a apresentao de um toolbox para o
MATLAB que integra a maioria das ferramentas e clculos em anlise de fluxo
metablico e anlise de controle metablico, o ME Toolbox (Tabela 1).
39
Tabela 1 Descrio do ME Toolbox.

Funo
Descrio
Parmetros
de entrada
MFA
Executa a anlise de
fluxo metablico para
um sistema
determinado ou
superdeterminado.
G, vm, p, pcs.
MFAIL
AMM
MFAOP
Executa a anlise de
fluxo metablico
utilizando mtodos de
carbono marcado.
Funo auxiliar do
MFAIL. Constri as
matrizes de
mapeamento atmico.
Executa a anlise de
fluxo metablico para
um sistema
subdeterminado.
MCA
Executa a anlise de
controle metablico
para uma via linear.
KINETICS
Funo auxiliar do
MCA. Constri as
equaes cinticas
automaticamente.
Usada para a obteno
das variveis do sistema
(concentraes e o
fluxo) no estado
estacionrio.
ELASTICITY
Funo auxiliar do
MCA. Calcula os
coeficientes de
elasticidade
automaticamente.
MCAB
Executa a anlise de
controle metablico
para um ponto de
bifurcao.
Parmetros
de sada
vc, R, rk,
vmnew,
vcnew, h, e,
answ, C,
accum, spec.
G, vm, p
vc, R, rk,
answ, xpyr,
xicit, xakg,
xsuc, xmal,
xoaa.
m, n
mn
f, SP, EF, G,
pcs.
x, fval,
exitflag,
output,
lambda, C.
o, lev.
Necessita da
interatividade do usurio
para adaptar
a funo a
novos
problemas.
xin, Ein, Cin,

x, E, C, Xstore,
Cstore, fcst,
fcct.
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km,
answ, inhib,
Ki.
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km,
answ, inhib,
Ki.
J, dep, lev.
xin, Ein, Cin,

x, E, C, Jstore,
Xstore,
Cstore,
XJstore.
40
Observaes
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km,
answ, inhib,
Ki.
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km, k.
KINETICSB
Funo auxiliar do
MCAB. Constri as
equaes cinticas
automaticamente.
ELASTICITYB
Funo auxiliar do
MCAB. Calcula os
coeficientes de
elasticidade
automaticamente.
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km, k.
Necessita das
variveis
globais: s, p,
Em, kcat,
Keq, km.
Para explicar a utilizao do ME Toolbox, sero apresentados trs

estudos de casos: a MFA para a produo biolgica de hidrognio por
Clostridium butyricum, a MFAIL para um modelo metablico simplificado do
metabolismo central com o uso de marcadores isotpicos, e a MFAOP para
estimativas dos fluxos em Chromobacterium violaceum, sob a hiptese de
minimizao do gasto energtico. Alm dos estudos de casos, sero avaliados
exemplos hipotticos do uso das funes MCA e MCAB (Tabela 2).
Tabela 2 Utilizao das funes do ME Toolbox.
Funo
MFA
MFAIL
AMM
MFAOP
MCA
KINETICS
ELASTICITY
MCAB
KINETICSB
ELASTICITYB
Produo de
hidrognio
Produo de
violacena
Metabolismo
central
Exemplos
hipotticos
A verso atual do ME Toolbox permite a obteno de todos os fluxos

intracelulares por balano de massa, melhoria dos dados experimentais por
reconciliao estatstica, anlise de sensibilidade, anlise de fluxo metablico
usando mtodos de marcadores isotpicos, anlise de fluxo metablico de
sistemas subdeterminados por programao linear, anlise de controle
metablico de vias no bifurcadas, e anlise de controle metablico de pontos
de bifurcao.
41
3.1.1. Mtodos Computacionais

Todos os mtodos computacionais mostrados a seguir foram
implementados usando o pacote de programao computacional MATLAB
(The Math Works Inc., MA, USA) e baseados nas equaes apresentadas por
Stephanopoulos et al. (1998).
3.1.1.1.
Estimativa dos fluxos no medidos

Todos os fluxos no medidos experimentalmente so obtidos, em
primeira anlise, utilizando a Equao (6).
3.1.1.2.
Reconciliao estatstica das medidas

Com o objetivo de obterem-se melhores estimativas para ambos, fluxos
medidos e no medidos, uma reconciliao estatstica das medidas

implementada, como descrita por Stephanopoulos et al. (1998). Como foi dito
anteriormente, a reconciliao estatstica usa ferramentas de estatstica para que
os dados experimentais sejam melhorados, adaptando-os melhor aos balanos
de massa e reduzindo os erros experimentais.
Para a obteno das relaes estequiomtricas de uma rede metablica
em formato matricial, devem-se identificar as reaes linearmente dependentes.
Para isso, primeiramente obtm-se a matriz de redundncia R , cujo rank
indica quais equaes do sistema so linearmente independentes.
R = G 'm G 'c (G'c ) G'm

#
(16)
Conforme descrito na reviso bibliogrfica, a linha sobre as matrizes

representa suas transpostas, G m e G c so o resultado do particionamento da
matriz estequiomtrica G onde os ndices, m e c, representam os fluxos
42
medidos e os que se deseja calcular, respectivamente. (G 'c ) # representa a

pseudo-inversa da matriz G'c .
De posse do nmero de equaes linearmente independentes, obtm-se
a matriz de redundncia reduzida, R r :
Rr = K R ,
(17)
onde K um vetor de dimenses (1 j), sendo j o nmero de colunas da matriz

G , com uns nas posies referentes s linhas linearmente dependentes, obtidas
aps a anlise do rank da matriz de redundncia, e zeros nas demais

posies. A partir da matriz de redundncia reduzida, o resduo obtido:
= Rr vm .
(18)
O resduo , ento, usado para o clculo da funo teste h, definida

como:
h = ' R r R 'r
(19)
2
Assume-se que a funo teste h segue distribuio e indica se os
rudos das medidas esto ou no correlacionados entre si. Os graus de

2
liberdade da distribuio so iguais ao rank da matriz de redundncia R.
Novas estimativas para os fluxos medidos so, ento, obtidas:
v m,new = I R 'r R r R 'r
(20)
Rr vm .
E a partir dos novos fluxos medidos, melhorados estatisticamente,

novos fluxos calculados so estimados a partir da Equao (6).
3.1.1.3.
Anlise de sensibilidade
A medida da sensibilidade de uma matriz tambm chamada de
nmero condicional, C, cuja magnitude fornece informaes importantes sobre

os requisitos de preciso nos fluxos medidos:
43
( )
C = G' G'
(21)
Para uma matriz estequiomtrica ser considerada bem condicionada, o

nmero condicional deve estar entre 1 e 100. Como o nmero condicional no
fornece nenhuma informao sobre a sensibilidade dos clculos no que diz
respeito variaes nos fluxos medidos, tal informao obtida pelos
elementos da matriz soluo.
( )
dv c
#
= G 'c G 'm .
dv m
(22)
A Equao (22) mostra a sensibilidade dos fluxos calculados a pequenas

perturbaes nas medidas (Stephanopoulos et al., 1998).
O ME Toolbox desenvolvido neste trabalho gera as sensibilidades
acumuladas em toda a rede metablica, mostrando quais fluxos medidos tm
maior importncia em toda a rede, e as sensibilidades com relao a um fluxo
calculado (no medido) de interesse, selecionado por um escalar pcs que indica
a posio do mesmo na matriz estequiomtrica G .
interessante observar que a anlise de sensibilidade no depende de
dados experimentais e est presente nas funes MFA e MFAOP.
De posse das equaes das atividades enzimticas das vias lineares ou
dos pontos de bifurcao de maior interesse, ainda possvel usar as funes
MCA e MCAB para fazer a anlise de controle metablico dessas regies chave
para a produo de um metablito de interesse.
3.1.1.4.
Criando a matriz estequiomtrica G

A matriz estequiomtrica reconhecida pelo ME Toolbox uma matriz (i
j) onde i o nmero de reaes (fluxos) e j o nmero de metablitos, isto ,

cada linha representa uma reao da rede metablica e cada coluna representa
um dos metablitos presente nesta rede.
44
Primeiramente, deve-se identificar todos os metablitos presentes na

rede e coloc-los, sem repeties, na primeira linha de uma planilha eletrnica,
deixando a primeira coluna em branco para identificar as reaes. Identificar os
metablitos ordenadamente resulta em menor esforo computacional e,
conseqentemente, maior velocidade. Cria-se, na primeira coluna, um
indicador para cada reao.
Para finalizar a estrutura matricial, devem-se dividir os metablitos em
trs grupos: substratos, produtos e metablitos internos, movendo suas colunas
conforme necessrio.
Construda a estrutura matricial, parti-se para a representao da rede
metablica.
Cada
reao
deve
ser
criada
colocando-se
os
ndices
estequiomtricos abaixo de cada metablito e zeros nas demais posies. Os

ndices estequiomtricos devem ser positivos para os produtos e negativos
quando para os reagentes.
Das trs matrizes obtidas, apenas a matriz dos metablitos internos
utilizada, e dever ser exportada no formato de texto separado por espaos. O
contedo do texto precisar ser copiado e colado em um arquivo de entrada de
dados para o ME Toolbox.
3.1.2. Utilizando o ME Toolbox para anlise de fluxo metablico (MFA)

A funo MFA do ME Toolbox possui a seguinte forma cannica:
[vc,R,rk,vmnew,vcnew,h,e,answ,C,accum,spec] = MFA (G,vm,p,pcs).
(23)
Os parmetros de entrada e sada, bem como suas descries, esto

mostrados na Tabela (3).
45
Tabela 3 Parmetros da funo MFA.

Parmetros de entrada
Parmetro Descrio
G
Matriz estequiomtrica.
vm
Vetor contendo os fluxos extracelulares medidos.
Vetor contendo as posies relativas aos fluxos do vetor vm na matriz
p
estequiomtrica G.
pcs
Posio relativa ao fluxo de interesse para anlise de sensibilidade.
Parmetros de sada
Parmetro Descrio
vc
Vetor contendo os fluxos intracelulares calculados.
R
Matriz de redundncia.
rk
Rank da matriz de redundncia.
vmnew
Vetor contendo os fluxos extracelulares melhorados estatisticamente.
vcnew
Vetor contendo os fluxos intracelulares recalculados a partir de vmnew.
h
Valor da funo teste h.
e
Valor do resduo .
answ
Resposta se a soluo nica ou no.
C
Valor do nmero condicional.
Matriz contendo o somatrio do mdulo das sensibilidades para cada fluxo
accum
extracelular.
Matriz contendo a sensibilidade do fluxo indicado em pcs a variaes nos
spec
fluxos extracelulares.
3.1.3. Utilizando o ME Toolbox para MFA com mtodos de istopos

marcados (MFAIL)
Outra anlise muito importante que pode ser feita com o ME Toolbox
a anlise de fluxo metablico usando mtodos de istopos marcados, atravs da
funo MFAIL.
(24)
[vc,R,rk,answ,x] = MFAIL (G,vm,p).

46
Tabela 4 Parmetros da funo MFAIL.

Parmetro Descrio
G
vm
Vetor contendo os fluxos extracelulares medidos.
Vetor contendo as posies relativas aos fluxos do vetor vm na matriz
p
estequiomtrica G.
Parmetros de sada
Parmetro Descrio
vc
answ
Resposta se a soluo nica ou no.
Matriz contendo todas as fraes de carbonos marcados em cada um dos
x
produtos.
Atravs do MFAIL possvel prever a frao de carbonos marcados

para cada produto, como resposta a substratos marcados em um dos carbonos.
Inicialmente, o MFAIL calcula os fluxos intracelulares usando a
Equao (6). Depois disso, utilizando as configuraes de carbonos conhecidos
para cada uma das reaes da via, so construdas as matrizes de mapeamento
atmico. As matrizes de mapeamento atmico so matrizes de dimenses (i j),
onde i o nmero carbonos do produto e j o nmero de carbonos do reagente.
As posies onde o reagente passou um carbono para o produto recebem o
nmero 1. Veja, por exemplo, a seguinte reao:
PYR
#ABC
OA
#abcd
ICIT
#dcbaCB
CO2
#A
(25)
Para a construo da matriz de mapeamento atmico que relaciona piruvato

(PYR) com isocitrato (ICIT), deve-se primeiramente construir uma matriz nula
de dimenses (6 3), que so o nmero de carbonos do isocitrato e piruvato,
respectivamente.
0
0
PYR > ICIT =
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.
0
0
(26)
47
A partir da configurao dos carbonos, presente abaixo dos metablitos, sabe-se

que o carbono B do piruvato o ltimo carbono do isocitrato, e que o carbono C
do piruvato o penltimo carbono do isocitrato. Dessa forma, chega-se matriz
de mapeamento atmico (Equao 27):
0
0
PYR > ICIT =
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
.
0
1
(27)
A funo MFAIL usa a funo AMM para criar as matrizes de

mapeamento atmico de uma forma mais fcil. Para obter a matriz de
mapeamento atmico da Equao (27), bastaria executar a seguinte seqncia
de comandos:
pyr = ['A','B','C'];
icit = ['d','c','b','a','C','B'];
pyr_icit = AMM (pyr,icit)
(28)
A funo AMM executa uma comparao membro a membro de dois

vetores
de
caracteres,
criando
matriz
de
mapeamento
atmico
automaticamente. Pode-se observar que os vetores pyr e icit contm exatamente

os caracteres que esto abaixo da reao (Equao 25).
Construdas as matrizes de mapeamento atmico, a funo MFAIL
combina os vetores v m e v c em um nico vetor v contendo todos os fluxos em
suas respectivas posies. Por fim, o MFAIL resolve um sistema linear contendo
todos os balanos dos estados de marcao da via metablica.
A funo MFAIL a nica funo do ME Toolbox que precisa ser
adaptada ao problema do usurio. A enorme variedade de casos em engenharia
metablica tornou impossvel a obteno de um padro de consenso para
construo automtica do sistema linear.
48
Maiores detalhes sobre o uso do MFAIL esto presentes no estudo de

caso do modelo metablico simplificado para o metabolismo central com o uso
de marcadores isotpicos.
3.1.4. Utilizando o ME Toolbox para MFA de sistemas subdeterminados

utilizando programao linear (MFAOP)
A funo MFAOP faz uma estimativa de todos os fluxos utilizando
apenas um fluxo experimental, segundo uma funo objetivo.
[x,fval,exitflag,output,lambda,C] = MFAOP (f,SP,EF,G,pcs).
(29)

Tabela 5 Parmetros da funo MFAOP.
Parmetro Descrio
f
Funo objetivo.
Matriz de posies dos substratos. A primeira coluna composta de um
SP
escalar que representa o substrato (1, 2, ...), e a segunda coluna representa a
posio do respectivo substrato na matriz estequiomtrica.
Vetor contendo o fluxo experimental. O primeiro termo do vetor representa
EF
a posio do fluxo experimental, e o segundo termo representa o seu valor
(a taxa do fluxo).
G
pcs
Posio relativa ao fluxo de interesse para anlise de sensibilidade.
Parmetros de sada
Parmetro Descrio
x
fval
Valor da funo objetivo em x.
Descrio das condies de sada. > 0 quando a programao linear
convergiu para uma soluo em x, 0 quando a programao linear
exitflag
alcanou o nmero mximo de interaes sem convergir, e < 0 quando o
sistema linear no tiver soluo.
output
Indica o nmero de interaes.
lambda
Retorna o conjunto de multiplicadores de Lagrange.
C
Valor do nmero condicional.
O MFAOP encontra a soluo para o sistema linear da Equao (2) e

executa uma anlise de sensibilidade segundo as Equaes (21 e 22).
49
Para a determinao da funo objetivo, parte-se do pressuposto que o

objetivo de uma clula, em determinadas condies, minimizar o gasto
energtico para o seu metabolismo. Esta proposta est baseada na crena de que
a minimizao da energia utilizada por um microrganismo pelo menos to
importante, do ponto vista evolutivo, quanto a otimizao da produo celular
(biomassa). Nem sempre a maximizao da biomassa prioritria para o
microrganismo. Por exemplo, a C. violaceum, quando cultivada em glicerol no
lugar de glicose, diminui sua multiplicao celular e produz mais violacena
(provavelmente associada a mecanismos de defesa); por outro lado, quando h
deficincia de nitrognio, a produo de biopolmeros (no caso da C. violaceum,
poli-hidroxialcanoatos) maximizada, claramente como mecanismo de
acmulo de energia de reserva.
Dessa forma, props-se a construo da seguinte funo objetivo f:
min f =
n G
'
ox
reagentes
n G
'
ox
(30)
produtos
Diferentemente de qualquer teoria proposta at ento, a funo objetivo

mostrada na Equao (30) prope um balano energtico, tipo black box, a ser
minimizado. Na Equao (30), n representa o nmero de moles, obtidos atravs
dos fluxos das reaes de consumo de substrato e formao de produtos, e Gox'
a variao da energia livre de Gibbs a pH 7 para oxidao por NAD+. Como se
trata de um balano black box, apenas os substratos e os produtos finais da via
metablica foram postos na funo objetivo.
Maiores detalhes sobre o uso do MFAOP esto presentes nos estudos
de casos da anlise de fluxo metablico para produo de hidrognio por
Clostridium butyricum e tambm na anlise de fluxo metablico para produo
de violacena por Chromobacterium violaceum.
50
3.1.5. Utilizando o ME Toolbox para MCA de vias metablicas lineares

(MCA)
A funo MCA do toolbox foi projetada para fazer a anlise de controle
metablico para vias lineares com a seguinte linha de comando:
[xin,Ein,Cin,x,E,C,Xstore,Cstore,fcst,fcct] = MCA (o,lev).
(31)
Uma via metablica linear uma via composta por um nmero

qualquer de metablitos mas que no possui pontos de bifurcao (Figura 7).
E1
E2
En
En +1
s X 1 ... X n p
Figura 7 Via metablica linear generalizada.
Para uma via metablica linear, os teoremas descritos nas Equaes (8)
e (10) podem ser resumidos em forma de matriz:
1
1
X1
.
1
X
K
X2
X2
1 C1J
... XL1 C2J

... . .
... XL K C LJ
...
C1X1
C2X1
.
C LX1
... C1X L 1 1 0 ... 0

... C2X L 1 0 1 ... 0

.
=
...
. . . ... .
... C LX L 1 0 0 ... 1
(32)
Por convenincia, as equaes cinticas partem de uma expresso

padro, sendo necessrio apenas fornecer seus coeficientes, incluindo inibies
se houver. A expresso adotada do tipo:
X
k cat (i ) X (i 1) (i )
K eq (i )
1
v(i ) = En(i )
.
X (i )
X (inhib )
X (i 1) + k m (i ) +
1+
K eq (i )
Ki
(33)
Com essa forma fixa foi possvel manter o programa com o clculo
automtico das elasticidades, sem que o usurio precise fornecer as derivadas
das equaes cinticas segundo a Equao (9).
51
Tabela 6 Parmetros da funo MCA.

Parmetro Descrio
o
Escalar que indica qual enzima ser superexpressa.
lev
Escalar que indica o nvel de superexpresso da enzima.
Parmetros globais
Parmetro Descrio
s
Nvel de substrato.
p
Nvel de produto.
En
Vetor contendo todas as constantes cinticas En.
kcat
Vetor contendo todas as constantes cinticas kcat.
Keq
Vetor contendo todas as constantes cinticas Keq.
Parmetro que recebe os valores 'y' ou 'n', ativando ou desativando os
answ
clculos de inibio.
Matriz de dimenses (i 2) onde i o nmero de inibies. A primeira
inhib
coluna representa o metablito que exerce inibio, e a segunda coluna
representa a enzima inibida.
Ki
Vetor de dimenso i contendo as constantes de inibio Ki.
Parmetros de sada
Parmetro Descrio
Vetor contendo as concentraes de cada metablito antes de qualquer
xin
superexpresso da enzima. O ltimo termo do vetor representa o fluxo no
estado estacionrio J, tambm antes de qualquer superexpresso.
Ein
Matriz contendo as elasticidades antes da superexpresso.
Cin
Matriz contendo os coeficientes de controle antes da superexpresso.
Vetor contendo as concentraes de cada metablito aps a superexpresso
x
da enzima. O ltimo termo do vetor representa o fluxo no estado
estacionrio J.
E
Matriz contendo as elasticidades aps a superexpresso.
C
Matriz contendo os coeficientes de controle aps a superexpresso.
uma matriz que armazena todos os valores de x durante o aumento da
Xstore
expresso.
uma matriz que armazena todos os valores de C durante o aumento da
Cstore
expresso.
fcst
Confirmao do teorema da soma dos controles de fluxo.
fcct
Confirmao do teorema da conectividade dos controles de fluxo.
Alm das matrizes dos FCCs e das elasticidades, o programa ainda

fornece grficos de evoluo dos nveis de cada matablito, do fluxo no estado
estacionrio J e dos FCCs da via metablica.
52
3.1.6. Utilizando o ME Toolbox para MCA de pontos de bifurcao (MCAB)

A funo MCAB do toolbox faz a anlise de controle metablico de vias
bifurcadas como a exemplificada na Figura (8).
Figura 8 Exemplo de um ponto de

bifurcao em uma via metablica.
A linha de comando para o uso da funo MCAB a seguinte:

[xin,Ein,Cin,x,E,C,Jstore,Xstore,Cstore,XJstore] = MCAB (J,dep,lev).
(34)
A funo MCAB pode ser usada facilmente em pontos de bifurcao

com qualquer nmero de reaes de entrada e de sada.
Como os pontos de bifurcao so relacionados produo e consumo
de um nico metablito, no foi inserido nenhum efeito de inibio deste
metablito sobre qualquer enzima que catalise tais reaes. Dessa forma, o
modelo cintico utilizado foi a Equao (35), para as reaes de produo, e a
Equao (36), para as reaes de consumo, conforme dado abaixo:
X
kcat (i ) s(i )
K eq (i )
v(i ) = En(i )
,
X (i )
s( i ) + k m ( i ) +
K eq (i )
(35)
p
kcat (i ) X ( i )
K eq (i )
.
v(i ) = En(i )
p( i )
X + k m (i ) +
K eq (i )
(36)

53
Tabela 7 Parmetros da funo MCAB.

Parmetro Descrio
J
Vetor contendo as taxas de cada um dos fluxos do ponto de bifurcao.
dep
Escalar que indica o fluxo dependente. o fluxo que ser superexpresso.
lev
Escalar que indica o nvel de superexpresso da enzima.
Parmetros globais
Parmetro Descrio
s
Nvel de substrato.
p
Nvel de produto.
En
Vetor contendo todas as constantes cinticas En.
kcat
Vetor contendo todas as constantes cinticas kcat.
Keq
Vetor contendo todas as constantes cinticas Keq.
Parmetros de sada
Parmetro Descrio
Vetor contendo a concentrao do metablito e a taxa do fluxo dependente
xin
dep no estado estacionrio, antes de qualquer superexpresso.
Ein
Matriz contendo as elasticidades antes da superexpresso.
Cin
Matriz contendo os coeficientes de controle antes da superexpresso.
Vetor contendo a concentrao do metablito e a taxa do fluxo dependente
x
dep no estado estacionrio, aps a superexpresso.
E
Matriz contendo as elasticidades aps a superexpresso.
C
Matriz contendo os coeficientes de controle aps a superexpresso.
uma matriz que armazena todas as taxas dos fluxos durante o aumento
Jstore
da expresso.
uma matriz que armazena todos os valores de x durante o aumento da
Xstore
expresso.
uma matriz que armazena todos os valores de C durante o aumento da
Cstore
expresso.
uma matriz que combina Xstore com Jstore. Usada para facilitar a
XJstore
obteno de grficos.
O MCAB gera ainda uma figura com os fluxos do ponto de bifurcao,

o nvel do metablito e os FCCs.
3.2.
Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de

hidrognio por Clostridium butyricum
O diagrama de fluxos mostrado na Figura (9) mostra um esquema das
reaes pertinentes biossntese de hidrognio por Clostridium butyricum em

condies anaerbicas (Saint-Amans et al., 2001).
54
Adaptado de Saint-Amans et al., 2001.

Figura 9 Esquema mostrando o modelo para o metabolismo do hidrognio.
O modelo metablico apresenta dois substratos, glicose e glicerol, formando
gliceraldedo-3-fosfato e gerando etanol, butirato e acetato. A partir do
glicerol ainda formado o 1,3-propanodiol. O hidrognio formado pelo
sistema lateral onde a ferrodoxina (Fd) oxidada formando H2, sendo
novamente reduzida pelo piruvato fechando o ciclo.
Todas as reaes no modelo estequiomtrico so consideradas

reversveis. As setas na Figura (9) representam as direes que so geralmente
aceitas. As taxas apresentadas no modelo foram representadas como: taxa de
consumo de glicose (vCluc), taxa de produo de piruvato (vPyr), taxa de
produo de CO2 (vCO2), taxa de produo de acetoaceil-CoA (vAACoA), taxa
de produo de 3-hidroxibutiril-CoA (vHbCoA), taxa de produo de crotonil55
CoA (vCrCoA), taxa de produo de butiril-CoA (vBuCoA), taxa de produo

de butiril-fosfato (vButP), taxa de produo de butirato (vBut), taxa de
produo de acetaldedo (vActal), taxa de produo de etanol (vEtOH), taxa de
produo de acetil-fosfato (vAcP), taxa de produo de acetato (vAct), taxa de
consumo de glicerol para produo de dihidroxiacetona (vGlyc1), taxa de
produo de dihidroxiacetona-fosfato (vDHAP), taxa de produo de
gliceraldedo-3-fosfato pela via do glicerol (vG3P), taxa de consumo de glicerol
para produo de 3-Hidroxipropionaldedo (vGlyc2), taxa de produo de 1,3propanodiol (v1,3Prd), taxa de produo de lactato (vLac), e taxa de produo
de H2 (vH2). A partir da via metablica sugerida (Figura 9), tem-se o conjunto
de 20 reaes listadas na Tabela (8).
Tabela 8 Modelo de reaes metablicas para produo de hidrognio por
Clostridium butyricum.
#
r1
Fluxo
vGluc
r2
vPyr
r3
vCO2
r4
vAACoA
r5
vHbCoA
r6
r7
r8
r9
vCrCoA
vBuCoA
vButP
vBut
r10
vActal
r11
r12
r13
r14
vEtOH
vAcP
vAct
vGlyc1
r15
vDHAP
r16
r17
vG3P
vGlyc2
r18
v1,3Prd
Reao
Glicose + 2ATP 2ADP + 2Gliceraldedo-3-fosfato
Gliceraldedo-3-fosfato + 2ADP + NAD+ Piruvato +
2ATP + NADH + H+
Piruvato + HSCoA + NAD+ Acetil-CoA + NADH + H+ +
CO2
Acetil-CoA Acetoacetil-CoA + HSCoA
Acetoacetil-CoA + NADH + H+ 3-Hidroxibutiril-CoA +
NAD+
3-Hidroxibutiril-CoA Crotonil-CoA + H2O
Crotonil-CoA + NADH + H+ Butiril-CoA + NAD+
Butiril-CoA + ATP Butiril-fosfato + HSCoA + ADP
Butiril-fosfato + ADP Butirato + ATP
Acetil-CoA + NADH + H+ Acetaldedo + HSCoA +
NAD+
Acetaldedo + NADH + H+ Etanol + NAD+
Acetil-CoA + ATP Acetil-fosfato + HSCoA + ADP
Acetil-fosfato + ADP Acetato + ATP
Glicerol + NAD+ Dihidroxiacetona + NADH + H+
Dihidroxiacetona + ATP Dihidroxiacetona-fosfato +
ADP
Dihidroxiacetona-fosfato Gliceraldedo-3-fosfato
Glicerol 3-Hidroxi-propionaldedo
3-Hidroxi-propionaldedo + NADH + H+ 1,3Propanodiol + NAD+
56
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

NADH + H+ NAD+ + H2
vLac
vH2
r19
r20
A representao estequiomtrica das reaes dada na Tabela (9) pela

matriz G de dimenses (m n) onde m so as 20 reaes e n so os 19
metablitos envolvidos nas reaes.
Piruvato
HSCoA
Acetil-CoA
Acetoacetil-CoA
3-Hidroxibutiril-CoA
Crotonil-CoA
Butiril-CoA
Butiril-fosfato
Acetaldedo
Acetil-fosfato
Dihidroxiacetona
Dihidroxiacetona-fosfato
3-Hidroxi-propionaldedo
ATP
ADP
NAD+
NADH
H+
G=
Gliceraldedo-3-fosfato
Tabela 9 Matriz estequiomtrica (G) para a via metablica proposta.
2
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
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0
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0
0
1
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1
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1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
-1
0
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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1
-1
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
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0
0
0
0
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0
1
-1
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
-1
0
0
-2
2
0
0
0
0
0
-1
1
0
0
-1
1
0
-1
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0
0
0
0
2
-2
0
0
0
0
0
1
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1
-1
0
1
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0
0
0
0
-1
-1
0
1
0
1
0
0
1
1
0
0
-1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
-1
0
-1
0
0
-1
-1
0
0
1
0
0
0
-1
-1
-1
0
1
1
0
-1
0
-1
0
0
-1
-1
0
0
1
0
0
0
-1
-1
-1
r1
r2
r3
r4
r5
r6
r7
r8
r9
r10
r11
r12
r13
r14
r15
r16
r17
r18
r19
r20
No modelo estequiomtrico proposto, derivado da Figura (9), oito das

reaes foram classificadas como medidas. Essas foram a taxa de consumo de
glicose (vCluc), taxa de produo de CO2 (vCO2), taxa de produo de butirato
(vBut), taxa de produo de etanol (vEtOH), taxa de produo de acetato
(vAct), taxa de consumo de glicerol para produo de dihidroxiacetona
57
(vGlyc1), taxa de produo de 1,3-propanodiol (v1,3Prd), e taxa de produo de

lactato (vLac).
Os fluxos medidos foram obtidos dos experimentos conduzidos por
Saint-Amans et al. (2001) e geraram o vetor dos fluxos medidos, vm, mostrado
na Tabela (10).
Tabela 10 Fluxos medidos para as condies de alimentao com glicose e glicerol.
Taxa especfica de formao e consumo
(mmolh-1g-1[clula seca])
Glicose
Glicerol
vGluc
5,72
0,92
vCO2
10,2
6,1
vBut
4
2,87
vEtOH
0,29
0,1
vAct
1,8
0,34
vGlyc
0
15,7
v1,3Prd
0
10,8
vLac
0,81
0,08
Fonte: Saint-Amans et al., 2001.
A taxa de consumo de glicerol, vGlyc, a soma da taxa de consumo

de glicerol para produo de dihidroxiacetona (vGlyc1) com a taxa de consumo
de glicerol para a produo de 3-hidroxi-propionaldedo (vGlyc2).
Para a anlise de fluxo metablico para produo de hidrognio,
primeiramente foi usada a funo MFA do ME Toolbox e, posteriormente, a
anlise obtida foi usada como confirmao do mtodo usado na funo
MFAOP, onde o nico dado experimental utilizado foi a taxa de consumo de
glicerol utilizando glicerol como substrato, vGlyc1 (Tabela 10).
Alm da matriz estequiomtrica, G (Tabela 9), e do vetor dos fluxos
medidos, vm (Tabela 9), os parmetros de entrada usados na funo MFA
foram o vetor das posies relativas p (Equao 37), e o valor 20 para o
parmetro da posio relativa ao fluxo de maior importncia para anlise de
sensibilidade, pcs.
(37)
p = [1,3,9,11,13,14,18,19].
58
As posies indicadas no vetor p so exatamente os fluxos cujas taxas

esto mostradas na Tabela (10). O valor 20 para pcs significa que a anlise de
sensibilidade ser feita com relao ao fluxo de produo de hidrognio, vH2
(Tabela 8).
A funo MFAOP, usada para confirmao do mtodo e da funo
objetivo, teve como parmetros de entrada a mesma matriz estequiomtrica
G e o mesmo pcs usados na funo MFA. Foram usados ainda a matriz de
posio dos substratos, SP (Equao 38), o vetor do fluxo experimental, EF
(Equao 39), e a funo objetivo f (Equao 30).
SP = [1 1
2 14
2 17].
(38)
A matriz de posio dos substratos, SP, apenas indica quantos

substratos existem e de quais fluxos cada um deles participa. No caso da
Equao (38), existem dois substratos. O substrato 1, glicose, participa da
reao 1, e o substrato 2, glicerol, participa das reaes 14 e 17.
(39)
EF = [14, 4.9].
O vetor EF possui o nico dado experimental usado nesta funo, o

vGlyc1, que corresponde reao 14 na matriz estequiomtrica (Tabela 9).
'
Os dados de Gox
(pH7) foram obtidos de Metzler (1977). Os
'
estimados pela
metablitos que no tinham sua energia tiveram seus Gox
'
soma das energias de grupos que os formavam. O Gox
violacena, por
'
de duas molculas de Triptofano. Os
exemplo, foi estimado pela soma dos Gox
'
usados na funo objetivo para o caso da Clostridium butyricum
valores de Gox
esto na Tabela (11).
59
Tabela 11 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C.

Metablito
Gluc
CO2
AcCoA
H 2O
CrCoA
But
EtOH
Act
Glyc
1,3Prd
Lac
H2
'
Gox
(pH7)
[ kJ mol 1 ]
-243,8
0,0
-13,0
0,0
21,5
56,6
-4,6
22,1
-110,2
25,3
-23,9
-18,2
Fonte: Metzler, 1977.
3.3.
Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de

violacena por Chromobacterium violaceum
Para a anlise de fluxo metablico da violacena foi usada a funo
MFAOP do ME Toolbox. A via metablica modelada foi composta por noventa

e cinco reaes e noventa e um metablitos internos, como mostrado na Figura
(10) e na Tabela (12).
60
Figura 10 Esquema de vias metablicas mostrando o modelo para a

biossntese de violacena por Chromobacterium violaceum. O esquema est
simplificado, no mostrando todas as etapas intermedirias que geraram as 95
reaes usadas na matriz estequiomtrica. O modelo utiliza dois substratos,
glicose e glicerol. Foram consideradas as reaes de formao de biomassa,
aminocidos, nucleotdeos, a via das pentoses e a via de produo da
violacena.
O modelo foi obtido atravs das reaes fornecidas por zkan et al.
(2005) para E. coli, e as reaes selecionadas foram pesquisadas e confirmadas
no CvioCyc (http://cviocyc.intelab.ufsc.br) como reaes contidas no genoma
da C. violaceum.
61
Tabela 12 Modelo de reaes metablicas para produo de violacena em

Chromobacterium violaceum.
Reao
r1
r2
r3
r4
r5
r6
r7
r8
r9
r10
r11
r12
r13
r14
r15
r16
r17
r18
r19
r20
r21
r22
r23
r24
r25
r26
r27
r28
r29
r30
r31
r32
r33
r34
r35
r36
r37
r38
r39
r40
r41
r42
r43
r44
GLC + PEP PYR + G6P

G6P G1P
G1P + ATP ADP + PPI + Glicognio
G6P + NADP D6PGC + NADPH
D6PGC + NADP NADPH + CO2 + RL5P
RL5P R5P
RL5P X5P
R5P + X5P T3P1 + S7P
T3P1 + S7P E4P + F6P
X5P + E4P F6P + T3P1
R5P + ATP PRPP + AMP
PRPP + ATP PPI + PRBATP
PRBATP + GLN PPI + GLU + AICAR + DIMGP
DIMGP IMACP
IMACP + GLU AKG + HISOLP
HISOLP + 3 NAD PI + 3 NADH + HIS
R5P Nucleotdeos
E4P + PEP PI + 3DDAH7P
3DDAH7P DQT + PI
DQT + NADPH SME + NADP
SME + ATP ADP + SME5P
SME5P + PEP 3PSME + PI
3PSME PI + CHOR
CHOR PHEN
PHEN CO2 + PHPYR
PHPYR + GLU AKG + PHE
PHEN + NAD HPHPYR + CO2 + NADH
HPHPYR + GLU AKG + TYR
CHOR + GLN GLU + PYR + AN
AN + PRPP PPI + NPRAN
NPRAN + SER TRP + T3P1 + CO2
TRP + O2 IPYR + NH3
TRP + O2 5HTRP
5HTRP AIPRO
IPYR + AIPRO PVIO + 2 CO2
PVIO OIVIO
OIVIO VIO
1,1/6 G6P + PI 0,1 H2 + 0,1 CO2 + Clulas
G6P F6P
F6P + ATP ADP + F16P
F16P T3P1 + T3P2
GL + ATP GL3P + ADP
GL3P + FAD T3P2 + FADH2
T3P2 T3P1
62
r45
r46
r47
r48
r49
r50
r51
r52
r53
r54
r55
r56
r57
r58
r59
r60
r61
r62
r63
r64
r65
r66
r67
r68
r69
r70
r71
r72
r73
r74
r75
r76
r77
r78
r79
r80
r81
r82
r83
r84
r85
r86
r87
r88
r89
r90
r91
r92
r93
T3P1 + PI + NAD + ADP NADH + ATP + 3PDGL

3PDGL PEP
3PDGL + NAD + GLU NADH + AKG + PI + SER
THF + SER GLY + METTHF
SER + ACCOA COA + ASER
ASER + H2S AC + CYS
PEP + CO2 OA + PI
PEP + ADP ATP + PYR
PYR + GLU AKG + ALA
2 PYR + NADPH CO2 + NADP + OIVAL
OIVAL + GLU AKG + VAL
PYR + COA + NAD NADH + CO2 + ACCOA
ACCOA AC + COA
ACCOA + OA COA + CIT
CIT ICIT
ICIT + NAD CO2 + NADH + AKG
AKG + NH3 + NADPH GLU + NADP
AKG + GLN + NADPH NADP + 2 GLU
GLU + ATP ADP + GLUP
GLUP + 2 NADPH PRO + 2 NADP + PI
GLU + NH3 + ATP GLN + ADP + PI
GLN Nucleotdeos
GLU + ACCOA COA + NAGLU
NAGLU + ATP + NADPH + GLU ORN + ADP + NADP + PI + AKG + AC
ORN PTRSC + CO2
PTRSC + DSAM SPRMD + 5MTA
GLN + 2 ATP + CO2 GLU + CAP + 2 ADP + PI
ORN + CAP + ASP + ATP ARG + FUM + PI + AMP + PPI
AKG + NAD + COA CO2 + NADH + SUCCOA
SUCCOA + GDP + PI GTP + COA + SUCC
SUCC + FAD FADH2 + FUM
FUM MAL
MAL + NAD NADH + OA
OA + GLU ASP + AKG
ASP + ATP + NADPH ASPSA + ADP + PI + NADP
ASPSA + NADPH NADP + HSER
HSER + ATP THR + ADP + PI
THR NH3 + OBUT
OBUT + PYR + GLU + NADPH CO2 + NADP + AKG + ILE
HSER + SUCCOA + CYS COA + SUCC + HCYS + PYR + NH3
HCYS + MTHF MET + THF
ASPSA + PYR D23PIC
D23PIC + NADPH NADP + PIP26DX
PIP26DX + SUCCOA + GLU COA + AKG + SUCC + D26PIM
D26PIM CO2 + LYS
ASP + ATP + GLN GLU + ASN + AMP + PPI
ASP + ATP + NH3 ASN + AMP + PPI
MAL + NADP CO2 + NADPH + PYR
MAL + NAD CO2 + NADH + PYR
63
r94
r95
ICIT GLX + SUCC

ACCOA + GLX COA + MAL
Neste conjunto de reaes esto considerados no s o metabolismo

central como tambm a via das pentoses, formao de nucleotdeos, formao
de aminocidos e produo de violacena.
Diferente da anlise de fluxo metablico para a produo biolgica de
hidrognio, a anlise de fluxo metablico da violacena no continha dados
experimentais e teve de ser estimada com o uso de programao linear
mediante uma funo objetivo, para tanto, utilizou-se o valor 1 para a taxa de
consumo de glicose (Equao 41).
Os parmetros de estrada usados na funo MFAOP foram a matriz
estequiomtrica G, originria das reaes presentes na Tabela (12), o valor 37
para o parmetro pcs, que indica o fluxo de violacena para a anlise de
sensibilidade, a matriz das posies relativas dos substratos, SP (Equao 40),
o vetor do fluxo experimental, EF (Equao 41), e a funo objetivo f
(Equao 30).
SP = [1 1
2 42],
EF = [1, 1].
(40)
(41)
'
usados na funo objetivo para o caso da Chromobacterium
Os valores de Gox
violaceum esto na Tabela (13).

Tabela 13 Energia livre de oxidao por NAD+ a 25C (Metzler, 1977).
Metablito
Glc
Gl
Glicognio
His
Nucleotdeos
Phe
Tyr
Vio
H2
Cys
64
'
Gox
(pH7)
[ kJ mol 1 ]
-243,8
-110,2
-258,6
12,1
-301,65
23,4
23,4
-603,4
-18,2
121,5
continuao
Gly
Ac
Ala
Val
Pro
Sprmd
Ile
Met
Lys
Asn
-22,6
22,1
0,8
40,5
25,1
-289,1
62,3
123,45
-4,7
-28,4
Fonte: Metzler, 1977.
3.4.
Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo

simplificado do metabolismo central de uma clula animal
Para mostrar o funcionamento da funo MFAIL do ME Toolbox, foi
usado o exemplo apresentado por Nielsen (2001), uma via metablica

simplificada para o metabolismo central (Figura 11).
Adaptado de Nielsen (2001).

Figura 11 Esquema mostrando o modelo simplificado
para o metabolismo central de uma clula animal.
As reaes da via metablica, bem como a passagem dos carbonos em

cada reao, esto mostradas na Tabela (14).
65
Tabela 14 Modelo de reaes metablicas para o metabolismo central simplificado.

#
Reao
r1
Glicose
PYR
#ABC
PYR
#ABC
PYR
#ABC
ICIT
#ABCDEF
Glutamina
r2
r3
r4
r5
r6
r7
r8
r9
r10
r11
r12
r13
AKG
#ABCDE
SUCC
#ABCD
SUCC
#ABCD
MAL
#ABCD
MAL
#ABCD
OA
#ABCD
AKG
#ABCDE
PYR
#ABC
Alanina
#ABC
Lactato
#ABC
OA
#abcd
AKG
#ABCEF
AKG
#ABCDE
SUCC
#BCDE
MAL
#ABCD
MAL
#DCBA
OA
#ABCD
PYR
#ABC
Aspartato
#ABCD
GLU
#ABCDE
ICIT
#dcbaCB
CO2
#D
CO2
#A
CO2
#D
CO2
#A
No problema proposto por Nielsen (2001), as taxas dos fluxos 8 e 9 so

idnticos. As reaes da Tabela (14), mais a equao adicional v8 = v9 , geram a
seguinte matriz estequiomtrica:
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1 0
1 0
0
0
0
0
0
0
0
0 1 0
1 1
0
0
0
0
0 1 1
0
0
0
0
0
0 1
.
0 1 1
0
0
0
G= 0
0
0
0 1 1
0 1
0
0 1 1
0 1
0
0
0
0
0 1 1
0
1
0
0
0 1 0
0
0
0
0
0 1 0
0
0
0 1 0
0
0
0
(42)
66
Os parmetros de entrada usados na funo MFAIL foram a matriz

estequiomtrica G, o vetor dos fluxos medidos vm (Equao 43) e o vetor
das posies relativas dos fluxos p (Equao 40).
(43)
(44)
vm = [100;15;80;40;5;10],
p = [1,2,3,6,12,13].
A funo MFAIL a nica funo do ME Toolbox que precisa ser

ajustada ao problema do usurio. Alm das matrizes de mapeamento atmico,
geradas a partir da funo auxiliar AMM (ver seo 3.1), o usurio precisa
entender o sistema linear gerado pelo balano carbono a carbono, e modific-lo
para um novo problema mais complexo. Para o problema proposto, as equaes
dos balanos carbono a carbono so as seguintes (Equaes 45 a 52):
v1 [Glicose > Pyr ] x Glic + v11 [Mal > Pyr ] x Mal (v2 + v3 + v4 ) I 3x3 x Pyr = 0 ,
(v 2 + v3 + v4 ) I 3x3 x
v 4 [Pyr > ICit ] x
Pyr
+ v11 [Mal > Pyr ] x
+ [OA > ICit ] x
Pyr
OA
) v
Mal
) = v x
I 6x6 x
1
ICit
Pyr,in
=0,
(
) + v ([Glutamina > AKG] x ) (v + v ) I x
ICit
v5 ([ICit > AKG ] x ) (v7 + v13 ) I 5x5 x AKG = v6 x AKG,in ,
v7 ([ AKG > Suc ] x AKG ) (v8 + v9 ) I 4x4 x Suc = 0 ,
v8 ([Suc > Mal8 ] x Suc ) + v9 ([Suc > Mal 9] x Suc ) (v10 + v11 ) I 4x4 x Mal = 0 ,
v5 [ICit > AKG] x
ICit
Glut
13
AKG
5x5
=0,
v10 [Mal > OA] x Mal (v4 + v12 ) I 4x4 x OA = 0 .
(45)
(46)
(47)
(48)
(49)
(50)
(51)
(52)
Para serem usadas na funo MFAIL, as equaes dos balanos carbono

a carbono precisam estar na forma matricial (Equao 53).
v11 [Mal > Pyr ]
03x6
03x5
03x 4
03x 4
(v2 + v3 + v4 ) I 3x3
v5 I 6x6
v4 [OA > ICit ]
06x5
06x 4
06x4
v4 [Pyr > ICit ]
v5 [ICit > AKG ] (v7 + v13 ) I 5x5

05x3
05x4
05x4
05x4
(v8 + v9 ) I 4x4
v7 [AKG > Suc ]
04x3
04x6
04x4
04x4
v8 [Suc > Mal8] + v8 [Suc > Mal 9] (v10 + v11 ) I 4x4

04x3
04x6
04x5
04x4
[
]
(
)
>
v
Mal
OA
v
v
0
0
0
0
I
4x3
4x6
4x5
4x4
10
4
12
4x4
x Pyr v1 x Pyr,in
x ICit
0 6x1
AKG
AKG,in
x
x
v
= 6
.
x Suc
0 4x1
Mal
0 4x1
x

x OA
0
4 x1
(53)
x Pyr,in e x AKG,in so vetores que mostram qual dos carbonos est

marcado, proveniente dos substratos glicose e glutamina, respectivamente
(Equao 54).
67
xpyr_in = [0;0;1],
xakg_in = [0;0;0;0;0].
(54)
No exemplo mostrado na Equao (54), o piruvato possui seu terceiro

carbono marcado. Cada estado de marcao inicial gera uma resposta nos
estados de marcao dos produtos, que podem ser observados pelos vetores
x Pyr , x ICit , x AKG , x Suc , x Mal , x OA .
68
CAPTULO IV
Resultados e Discusso
4.1.
Estudo de caso I: anlise de fluxo metablico para a produo de

hidrognio por Clostridium butyricum
Utilizando os dados mencionados em materiais e mtodos, a anlise de

fluxo metablico objetivando a produo de hidrognio foi executada. As
funes utilizadas foram a MFA, para anlise de fluxo metablico convencional,
e a MFAOP, para validar o mtodo usado nesta funo.
4.1.1. Classificao do sistema

O rank da matriz de redundncia 4, que define o nmero de
equaes linearmente dependentes em R. Como o nmero de equaes de
balano de massa foi m = 20 , o nmero de fluxos no medidos c = 12 e
m c = 20 12 = 8 > rank da matriz de redundncia, tem-se mais fluxos do
que o necessrio para o sistema, caracterizando um sistema superdeterminado.
4.1.2. Estimativa dos fluxos no medidos da rede metablica no regime

estacionrio
O sistema de equaes obtido a partir das reaes foi resolvido
utilizando a Equao (6) para alimentao com glicose (Figura 12).
69
Measured and calculated rates

12
Measured rates
Unmeasured rates
Rates of fluxes (mmol/h/g [dry wt])
10
-2
10
15
20
25
Fluxes
estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME Toolbox.
A taxa de produo de H2 (vH2) foi de 8,9 mmolh-1g-1[clula seca], que

tm boa aproximao com o valor 11,3 mmolh-1g-1[clula seca] obtido por
Saint-Amans et al. (2001), visto que a rede de reaes modelada a principal via
de produo de hidrognio, mas no a nica (Hallenbeck e Benemann, 2002).
Fazendo os mesmos clculos para alimentao com glicerol, chega-se a
um novo conjunto de fluxos que mostram a forte tendncia da Clostridium
butyricum em usar o glicerol para produzir 1,3-propanodiol, em detrimento da
produo de hidrognio (Figura 13).
70

12
Measured rates
Unmeasured rates
10
-2
10
15
20
25
Fluxes
estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME Toolbox.
Novamente comparando com os dados experimentais obtidos pelo

grupo de Saint-Amans, o fluxo de hidrognio obtido no modelo foi -1,22
mmolh-1g-1[clula seca] contra 0,39 mmolh-1g-1[clula seca] do fluxo
experimental, mantendo uma diferena de aproximadamente 2 mmolh-1g1[clula
seca] para produo de hidrognio terica e experimental em ambas
condies de alimentao. Tal diferena provavelmente est relacionada a

simplicidade
do
modelo
utilizado,
gerando
alguns
dados
que
no
correspondem a realidade, como por exemplo, um fluxo negativo de

hidrognio.
4.1.3. Melhoramento estatstico das medidas

O resduo foi 3,18 para alimentao com glicose e 2,42 com glicerol,
gerando uma funo teste h de 5,02 e 2,91, respectivamente. Isso mostra que a
71
funo teste menor que o valor correspondente distribuio 2 com quatro

graus de liberdade, mesmo para baixos graus de confiana. Novas estimativas
para os fluxos medidos foram ento obtidas com o uso da Equao (16) (Tabela
15).
(Sait-Amans et al., 2000), e as novas estimativas obtidas pelo melhoramento
estatstico.
Taxa especfica de formao e consumo
(mmolh-1g-1[clula seca])
Glicose
Glicerol
Antigos Novos Antigos Novos
vGluc
5,72
4,13
0,92
-0,29
vCO2
10,2
10,82
6,1
6,57
vBut
4
3,16
2,87
2,23
vEtOH
0,29
0,49
0,1
0,26
vAct
1,8
2,00
0,34
0,50
vGlyc
0
-0,80
15,7
15,09
v1,3Prd
0
0
10,8
10,8
vLac
0,81
1,64
0,08
0,71
A partir dessas novas medidas, novos fluxos no medidos foram obtidos tanto
para alimentao com glicose quanto para glicerol (Figuras 14 e 15).
72
New measured and calculated rates

12
Measured rates
Unmeasured rates
10
-2
10
15
20
25
Fluxes

para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicose. Grfico de sada do ME
Toolbox.
73
New measured and calculated rates

12
Measured rates
Unmeasured rates
10
-2
-4
10
15
20
25
Fluxes

para a rede de reaes em estudo e alimentao com glicerol. Grfico de sada do ME
Toolbox.
A diferena entre o fluxo experimental da produo de hidrognio e o

terico obtido por anlise de fluxo metablico aumentou com o melhoramento
estatstico das medidas.
4.1.4. Anlise de sensibilidade

O nmero condicional C obtido a partir da Equao (17) foi 30. O
valor est entre 1 e 100, refletindo um sistema bem condicionado com pouca
propagao de erros. A Tabela (16) mostra os valores das sensibilidades dos
fluxos calculados em relao a variaes nos fluxos medidos, determinadas pela
Equao (18). Os valores que esto em Acumulado so os somatrios dos
mdulos das sensibilidades, que indicam os fluxos cuja variao tem maior
impacto sobre toda a via metablica.
74
Tabela 16 Sensibilidade dos fluxos calculados em relao a variaes nos fluxos

medidos.
vPyr
vAACoA
vHbCoA
vCrCoA
vBuCoA
vButP
vActal
vAcP
vDHAP
vG3P
vGlyc2
vH2
Acumulado
vGluc vCO2
vBut
vEtOH vAct
vGlyc1 v1,3Prd vLac
0,6415
0,467 -0,1651 -0,0708 -0,0708 0,3208
0 0,3962
0,066 0,4929 -0,0354
-0,658
-0,658
0,033
0 -0,1651
0,0377 0,4245 0,1226 -0,5189 -0,5189 0,0189
0 -0,0943
0,0094 0,3561 0,2807 -0,3797 -0,3797 0,0047
0 -0,0236
-0,0189 0,2877 0,4387 -0,2406 -0,2406 -0,0094
0 0,0472
-0,0472 0,2193 0,5967 -0,1014 -0,1014 -0,0236
0 0,1179
0,0283 0,0684
-0,158 0,8608 -0,1392 0,0142
0 -0,0708
-0,0849 0,2948 -0,0259 -0,0825 0,9175 -0,0425
0 0,2123
-0,5283 0,3066
0,033 0,0142 0,0142 0,7358
0 0,3208
-0,9434 0,3868
-0,066 -0,0283 -0,0283 0,5283
0 0,3585
0
0
0
0
0
0
1
0
0,5943 0,6863 -0,5684 -1,1722 0,8278 1,2972
-1 -0,4858
2,9999
3,9904
2,4905
4,1274
3,8964
3,0284
2,2925
Analisando a sensibilidade de todo o sistema, as variaes no fluxo de

produo de etanol, r11, so as que tm o maior impacto sobre os fluxos
calculados (Figura 16). Cabe ressaltar que apenas os fluxos medidos possuem
valores de sensibilidade na Figura (16), pois com relao a eles que tais
valores so calculados (Tabela 16).
75
Accumulated sensitivities
4.5
3.5
2.5
1.5
0.5
10
Fluxes
12
14
16
18
20
Figura 16 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos medidos. Grfico de sada do

ME Toolbox.
Como a reao de interesse a produo do hidrognio, analisou-se a

sensibilidade apenas para esse fluxo e concluiu-se que o fluxo medido de maior
impacto para produo de hidrognio o consumo de glicerol para produo
de dihidroxiacetona, r14 (Figura 17).
76
Specific sensitivities
1.4
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
10
Fluxes
12
14
16
18
20
Figura 17 Sensibilidade do fluxo de H2 a variaes nos fluxos medidos. Grfico de

sada do ME Toolbox.
Infelizmente, a maior parte do glicerol alimentado seria usada para

produo de 1,3-propanodiol. O segundo fluxo mais importante a produo
de etanol, porm a Clostridium butyricum possui uma produo muito baixa de
etanol (Saint-Amans et al. 2001). Desta forma, reduzir ainda mais esse fluxo no
traria grande contribuio para produo de hidrognio. O fluxo que apresenta
o terceiro maior impacto para produo do hidrognio foi a produo de 1,3propanodiol. Este fluxo pode gerar a melhor estratgia para a obteno de uma
Clostridium butyricum super-produtora de hidrognio, uma vez que a deleo
desta via permitiria o uso de glicerol como substrato. Segundo a anlise de
sensibilidade, a deleo do gene produtor da enzima glicerol desidratase,
responsvel pela via de produo de 1,3-propanodiol, combinado com a
alimentao com glicerol, a ttica de manipulao gentica mais eficiente para
a produo de hidrognio.
77
4.1.5. Validao da hiptese de minimizao do gasto energtico. Anlise de

fluxo metablico para produo de hidrognio usando a funo
MFAOP
Com o objetivo de validar a metodologia usada na funo MFAOP,
funo que determina a anlise de fluxo metablico para sistemas
subdeterminados no ME Toolbox.
Como foi dito anteriormente, a hiptese utilizada como objetivo celular
foi a minimizao do gasto energtico (Equao 30). Todos os fluxos,
intracelulares e extracelulares, foram estimados usando a funo MFAOP, e os
resultados foram muito semelhantes aos obtidos pela anlise de fluxo
metablico para um sistema superdeterminado (Figura 18).
12
12
Measured rates
Unmeasured rates
10
10
-2
10
15
20
25
a)
10
15
20
25
Fluxes
Fluxes
b)
Figura 18 Comparao entre os fluxos obtidos pela funo MFA (a) e os estimados
pela funo MFAOP (b). Grficos de sada do ME Toolbox.
Tal resultado valida a hiptese de minimizao do gasto energtico,

bem como a metodologia utilizada para a construo da funo objetivo.
Como a anlise de sensibilidade independe de dados experimentais, o
MFAOP seleciona automaticamente os fluxos extracelulares atravs da funo
objetivo (Figura 19).
78
4.5
3.5
3.5
3
3
2.5
2.5
2
2
1.5
1.5
1
1
0.5
0.5
10
Fluxes
12
14
16
18
20
a)
10
Fluxes
12
14
16
18
20
14
16
18
20
b)
1.4
1.6
1.4
1.2
1.2
1
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
10
Fluxes
12
14
16
18
20
10
Fluxes
12
d)
c)
Figura 19 Comparao entre as sensibilidades acumuladas (a e b), e do H2 (c e d),

obtidas pela funo MFA (a e c) e as obtidas pela funo MFAOP (b e d). Grficos de
sada do ME Toolbox.
Apesar de usar a mesma metodologia, as analises de sensibilidade

foram diferentes. Por exemplo, utilizando a funo MFA, o fluxo de maior
impacto para a produo de hidrognio foi o consumo de glicerol para a
produo de dihidroxiacetona, r14, enquanto na funo MFAOP, o fluxo de
maior impacto para a produo de hidrognio foi a reao de produo de
etanol, r11. A diferena entre as anlises de sensibilidade tem uma explicao
simples. A funo MFA calcula as sensibilidades apenas com relao aos fluxos
medidos, enquanto a funo MFAOP seleciona todos os fluxos extracelulares, a
partir dos dados contidos na funo objetivo. Com isso, a funo MFAOP
computou tambm os fluxos 6 e 17. Pode-se dizer que, para a anlise de
sensibilidade, a MFAOP mais correta.
Segundo as sensibilidades obtidas pelo MFAOP, o fluxo que possui o
maior impacto sobre a produo de hidrognio o do etanol, r11, seguido
79
pelo consumo de glicerol para produo de dihidroxiacetona, r14. Como foi

dito anteriormente, a Clostridium butyricum tem uma produo de etanol bem
prxima de zero, tornando ineficiente qualquer deleo nessa via. Portanto, as
hipteses mencionadas anteriormente para a obteno de uma C. butyricum
super-produtora de hidrognio ainda continuam vlidas quando a funo
MFAOP utilizada.
Validada a hiptese de minimizao do gasto energtico, utilizou-se o
mesmo procedimento para a anlise de fluxo metablico para a produo de
violacena por Chromobacterium violaceum.
4.2.
Estudo de caso II: anlise de fluxo metablico para a produo de

violacena por Chromobacterium violaceum
Comprovada a eficcia da funo MFAOP, os dados mencionados em
materiais e mtodos foram utilizados para fazer a anlise de fluxo metablico

para produo de violacena. Todas as taxas dos 95 fluxos modelados para a C.
violaceum foram obtidas por programao linear a partir da funo objetivo de
minimizao do gasto energtico (Figura 20).
80
Formao
de X5P
4.5
Produo de PYR a
partir do MAL
Produo
de
biomassa
Produo de
violacena
3.5
2.5
1.5
0.5
10
20
30
40
50
Fluxes
60
70
80
90
100
Figura 20 Fluxos da Chromobacterium violaceum obtidos por otimizao linear usando

a minimizao do gasto energtico como funo objetivo. Os fluxos esto classificados
de acordo com a Tabela (12). Grfico de sada do ME Toolbox.
Analisando as sensibilidades acumuladas, pode-se observar que as

reaes de produo de metionina e valina so as que causam maior impacto na
via metablica como um todo, isto , so as reaes cujas variaes tm maior
influncia sobre toda a via (Figura 21).
81
Reaes de
produo de MET
30
Produo de VAL
25
20
15
10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Figura 21 Sensibilidade acumulada para todos os fluxos extracelulares. Grfico de

sada do ME Toolbox.
Analisando as sensibilidades relacionadas apenas a produo de

violacena, a reao de produo de cistena o fluxo de maior influncia,
seguida pela reao de produo de isoleucina. Isso significa que a produo de
violacena provavelmente ter uma grande resposta a pequenas variaes
nessas reaes (Figura 22).
82
0.4
Produo de CYS
Produo de ILE
0.35
0.3
0.25
Consumo
de glicerol
0.2
0.15
Consumo
de glicose
0.1
0.05
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Figura 22 Sensibilidade do fluxo de violacena a variaes nos fluxos extracelulares.

Grfico de sada do ME Toolbox.
Um
resultado
interessante,
que
havia
sido
comprovado
experimentalmente por Oliveira (2005), foi a influncia dos substratos glicose e

glicerol sobre a produo de violacena. A anlise de sensibilidade prev que a
C. violaceum produz mais violacena quando alimentada com glicerol, pois este
fluxo possui uma sensibilidade muito maior que o fluxo de glicose. Tal
evidncia vai contra a hiptese de inibio gnica da glicose, proposta por
Oliveira (2005). A anlise de sensibilidade, apesar de no conter todas as
reaes existentes em C. violaceum, comprova que o fato de a C. violaceum
produzir
muito
mais
violacena
quando
alimentada
com
glicerol
principalmente uma questo metablica. Segundo a anlise de sensibilidade, o

glicerol exerce uma resposta sobre a produo de violacena superior ao dobro
da obtida com glicose. A anlise de sensibilidade fornece ainda uma estratgia
que seria a mais eficiente para uma possvel mutao gentica, a inibio do
gene responsvel pela reao de produo de isoleucina, visto que a produo
83
de cistena, reao que teve a maior sensibilidade, apresentou taxa de reao

nula.
4.3.
Estudo de caso III: anlise de fluxo metablico para um modelo

simplificado do metabolismo central de uma clula animal
Como foi dito em materiais e mtodos, o uso da funo MFAIL foi
exemplificado com o exemplo simplificado do metabolismo central de uma

clula animal (Nielsen, 2001). A primeira resposta da funo MFAIL a mesma
obtida pelo MFA, os fluxos celulares obtidos pela Equao (6) e mostrados na
Figura (23).

100
Measured rates
Unmeasured rates
90
80
70
60
50
40
30
20
10
10
12
14
Fluxes
Figura 23 Taxas dos fluxos medidos e no medidos. Grfico de sada do ME Toolbox.
A resposta exclusiva da funo MFAIL so os estados de marcao dos

produtos. Cada estado de marcao dos substratos gera uma resposta diferente
nos estados de marcao nos produtos. Veja, por exemplo, o estado de
marcao descrito pela Equao (54) (Figura 24).
84
Fractional labelling state of Icit

4%
3%
Fractional labelling state of Pyr

1%
5%
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C4
C5
C6
16%
16%
57%
4%
94%
a)
b)
Fractional labelling state of AKG
3%
4%
C1
C2
C3
C4
C5
Fractional labelling state of Suc

3%
C1
C2
C3
C4
16%
17%
17%
16%
60%
62%
c)
d)
Fractional labelling state of Mal
C1
C2
C3
C4
40%
10%
Fractional labelling state of OAA
10%
C1
C2
C3
C4
40%
10%
10%
40%
40%
f)
e)
de piruvato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato, b) isocitrato, c) -cetoglutarato,
d) succinato, e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME Toolbox.
Percebe-se que, apesar de o piruvato entrar no metabolismo apenas com seu

terceiro carbono marcado, o produto do metabolismo tambm gera molculas
de piruvato marcadas no primeiro e no segundo carbono. Isso ocorre porque o
piruvato tambm produto de reao na via metablica a partir do malato.
Como o terceiro carbono marcado do piruvato passado para o quinto carbono
do isocitrato atravs da reao 4 (Tabela 14), era de se esperar que as molculas
de isocitrato marcadas no quinto carbono fossem mais numerosas.
85
Vejamos agora o que acontece quando o terceiro carbono do cetoglutarato o nico carbono marcado (Equao 55):
xpyr_in = [0;0;0],
xakg_in = [0;0;1;0;0].
(55)
A funo MFAIL passa a ter a seguinte resposta para os estados de

marcao (Figura 25).
Fractional labelling state of Icit
Fractional labelling state of Pyr

11%
C1
C2
C3
9%
C1
C2
C3
C4
C5
C6
7%
7%
9%
44%
34%
44%
34%
a)
b)
Fractional labelling state of AKG
3%
4%
3%
C1
C2
C3
C4
C5
C1
C2
C3
C4
16%
Fractional labelling state of Suc

3%
3%
17%
73%
76%
d)
c)
Fractional labelling state of Mal
C1
C2
C3
C4
40%
10%
Fractional labelling state of OAA
10%
C1
C2
C3
C4
40%
40%
10%
10%
40%
e)
f)
de -cetoglutarato marcadas no terceiro carbono. a) piruvato; b) isocitrato; c) cetoglutarato; d) succinato; e) malato e f) oxaloacetato. Grficos de sada do ME
Toolbox.
86
A mesma situao observada na Figura (24) ocorre agora quando as

molculas de -cetoglutarato esto marcadas no terceiro carbono. O produto do
metabolismo tambm gera molculas de -cetoglutarato marcadas nos demais
carbonos. Como o terceiro carbono do -cetoglutarato passado para o
segundo carbono do succinato atravs da reao 7 (Tabela 14), era de se esperar
que as molculas de succinato marcadas no segundo carbono fossem mais
numerosas.
4.4.
Exemplos hipotticos do uso das funes MCA e MCAB

Como ltima contribuio do ME Toolbox, sero mostrados alguns
exemplos hipotticos e as respostas obtidas pelas funes MCA e MCAB. Como

foi dito anteriormente, a funo MCA utilizada apenas para vias lineares, isto
, que no possuem ponto de bifurcao.
Suponha os seguintes dados de entrada para a funo MCA (Equao
56).
% Nvel de substrato
s = 1;
% Nvel de produto
p = 0.01;
% Constantes cinticas
En = [1,1,1,1];
kcat = [2,5,1,1];
Keq = [1,1,1,1];
km = [1,1,1,1];
% Enzima que ser superexpressa
o = 4;
% Nvel de superexpresso
lev = 5;
% H inibio?
answ = 'y';
% Que metablito "i" inibe a enzima "j"?
inhib = [3,2];
% Constantes de inibio
Ki = [0.1];
87
(56)
Os dados mostram uma via metablica de quatro reaes cujas

equaes cinticas so descritas pela Equao (33). Nessa via metablica
hipottica, o metablito 3 exerce inibio sobre a segunda enzima. O nvel de
expresso da quarta enzima gradativamente aumentado at alcanar cinco
vezes o valor original.
A partir da entrada de dados da Equao (56), a funo MCA gera o
seguinte resultado (Figura 26).
The effect of overexpression of the Enzyme 4
System variables
0.8
X1
X2
X3
J
0.6
0.4
0.2
1.5
2.5
3
Enzyme 4 level
3.5
4.5
0.5
C1
C2
C3
C4
System FCCs
0.4
0.3
0.2
0.1
1.5
2.5
3
Enzyme 4 level
3.5
4.5
Figura 26 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas com inibio
do metablito 3 sobre a enzima 2. O grfico mostra as concentraes de cada
metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico no estado estacionrio (J) e os coeficientes
de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de
sada do ME Toolbox.
Um dado importante a ser salientado com relao aos coeficientes de

controle de fluxo (FCCs). Relembrando a Equao (7), os coeficientes de
controle de fluxo so definidos como a taxa da variao relativa no fluxo sobre a
variao relativa na atividade da enzima. Como a variao da atividade
88
enzimtica da enzima 4 cada vez maior por ser esta a enzima que est sendo
superexpressa, previsvel que o controle desta enzima sobre o fluxo da via seja
cada vez menor. No entanto, o que explicaria a sensvel queda no FCC da
enzima 2? A resposta est na inibio que o metablito 3 est exercendo sobre
ela. A reduo na atividade enzimtica da enzima 2 faz com que aumente sua
variao e, conseqentemente, diminui
seu FCC. Para uma simples
comprovao, a inibio foi retirada (Figura 27).
System variables
0.8
X1
X2
X3
J
0.6
0.4
0.2
1.5
2.5
3
Enzyme 4 level
3.5
4.5
0.8
C1
C2
C3
C4
System FCCs
0.6
0.4
0.2
1.5
2.5
3
Enzyme 4 level
3.5
4.5
Figura 27 Modelagem de uma via metablica linear de quatro enzimas sem inibio.
O grfico mostra as concentraes de cada metablito (X1, X2 e X3), o fluxo metablico
no estado estacionrio (J) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via
metablica (C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox.
A queda no FCC da enzima 2 no mais existe.

Agora um exemplo de uma via bifurcada com uma reao de produo
e trs reaes de consumo (Figura 28).
89
Figura 28 Esquema de uma via bifurcada composta por

quatro reaes, uma de consumo do substrato e trs de
produo de produtos.
Suponha os seguintes dados de entrada para a funo MCAB (Equao

57).
% Nvel de substrato
s = [1];
% Nveis de produtos
p = [0.01,0.02,0.01];
En = [1,1,1,1];
kcat = [2,5,1,1];
Keq = [1,1,1,1];
km = [1,1,1,2];
(57)
% Vetor dos fluxos

J = [4,1.5,1,1.5];
% Fluxo dependente
dep = 2;
lev = 5;
Os dados de entrada mostram um ponto de bifurcao com um

substrato gerando trs produtos, constantes cinticas segundo as Equaes (35 e
36), um vetor dos fluxos no estado estacionrio (situao inicial). O nvel de
expresso da enzima 2 gradativamente aumentado at alcanar cinco vezes o
valor original.
A partir da entrada de dados da Equao (57), a funo MCAB gera o
seguinte resultado (Figura 29).
90
System variables
X
J1
J2
J3
J4
1.5
0.5
1.5
2.5
3
Enzyme 2 level
3.5
4.5
System FCCs
C1
C2
C3
C4
0.5
-0.5
1.5
2.5
3
Enzyme 2 level
3.5
4.5
Figura 29 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, uma

reao de produo e trs de consumo do metablito. O grfico mostra a concentrao
do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio (J1, J2, J3 e
J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica (C1, C2,
C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox.
Como mostrado na Figura (29), quanto maior o nvel de expresso da

enzima 2, menor a concentrao do metablito X. Isso ocorre porque a enzima
2 catalisa uma das reaes de consumo do metablito X e, portanto, quanto
maior a expresso, maior ser o consumo. A superexpresso obviamente
ocasiona um aumento no fluxo 2 (J2). Para que haja conservao da massa, o
fluxo 1 tembm precisa aumentar. O aumento do fluxo 1 gera um grande
aumento em seu FCC. Com relao ao fluxo 2, o mesmo teve uma grande
variao na atividade enzimtica, ocasionando diminuio do FCC.
Veja agora o que acontece quando dois substratos geram dois produtos
(Figura 30).
91
Figura 30 Esquema de uma via bifurcada composta por

quatro reaes, duas de consumo de substratos e duas de
produo de produtos.
Suponha os seguintes dados de entrada para a funo MCAB (Equao

58).
% Nvel de substrato
s = [1,2];
% Nveis de produtos
p = [0.01,0.02];
En = [1,1,1,1];
kcat = [2,5,1,1];
Keq = [1,1,1,1];
km = [1,1,1,2];
(58)
% Vetor dos fluxos

J = [4,1.5,2,3.5];
% Fluxo dependente
dep = 2;
lev = 5;
As constantes cinticas so as mesmas, mas agora a enzima 2 catalisa

uma reao de produo e no de consumo. A partir da entrada de dados da
Equao (58), a funo MCAB gera o seguinte resultado (Figura 31).
92

2
X
J1
J2
J3
J4
System variables
1.5
1
0.5
0
-0.5
1.5
2.5
3
Enzyme 2 level
3.5
4.5
1.5
C1
C2
C3
C4
System FCCs
1
0.5
0
-0.5
-1
-1.5
1.5
2.5
3
Enzyme 2 level
3.5
4.5
Figura 31 Modelagem de uma via metablica bifurcada de quatro enzimas, duas

reaes de produo e duas de consumo do metablito. O grfico mostra a
concentrao do metablito (X), cada um dos fluxos metablicos no estado estacionrio
(J1, J2, J3 e J4) e os coeficientes de controle de fluxo para cada enzima da via metablica
(C1, C2, C3 e C4). Grficos de sada do ME Toolbox.
Nessa nova situao, quanto maior o nvel de expresso da enzima 2,

maior a concentrao do metablito X, visto que agora a enzima 2 catalisa uma
das reaes de sua produo. Outro dado importante a ser observado que,
devido a variao na atividade enzimtica, o FCC da enzima 2 cai novamente.
93
CAPTULO V
Concluses e Sugestes
5.1.
Concluses
O presente trabalho mostrou o desenvolvimento e a utilizao de um
toolbox de Engenharia Metablica para o MATLAB, o ME Toolbox, que

executa a anlise de fluxo metablico (MFA) e a anlise de controle metablico
(MCA). A funo MFA do ME Toolbox permite a obteno de fluxos celulares
desconhecidos a partir da medida experimental de alguns fluxos, faz uma
reconciliao estatstica, recalculando todos os fluxos e melhorando os dados
experimentais, mostra dados de estado do sistema e faz uma anlise de
sensibilidade. A funo MFAIL permite a obteno dos fluxos intracelulares e
das fraes de distribuio dos carbonos marcados para as anlises de fluxo
metablico que utilizam mtodos de marcadores isotpicos. A funo MFAOP
uma poderosa ferramenta para sistemas subdeterminados. Ela calcula todos os
fluxos celulares a partir de apenas um nico dado experimental e da funo
objetivo baseada na minimizao do gasto energtico. Alm disso, a MFAOP
tambm executa a anlise de sensibilidade. As funes MCA e MCAB executam
uma anlise de controle metablico em vias lineares e bifurcadas,
respectivamente. Com elas possvel obter a evoluo dos controladores de
fluxo e das variveis do sistema quando a expresso de uma enzima
modificada, sendo facilmente ajustvel a vrias situaes de interesse.
Devido ao grande nmero de resultados e fcil operao, o ME Toolbox
uma ferramenta poderosa, integrando a grande maioria dos clculos que
constituem a anlise de fluxo metablico e anlise de controle metablico.
Com o uso da funo MFA foi realizada a anlise de fluxo metablico
da bactria Clostridium butyricum crescendo em glicose e glicerol. Atravs dessa
anlise foi possvel verificar a sensibilidade das vias metablicas e comparar os
meios de cultura. Quando o glicerol usado como principal fonte de carbono,
1,3-propanodiol produzido em grande quantidade. As enzimas glicerol94
dehidratase e 1,3-propanodiol desidrogenase so ativadas e o glicerol

convertido a 1,3-propanodiol. No entanto, a anlise de fluxo metablico
forneceu resultados que indicaram uma rota alternativa. Segundo a anlise de
sensibilidade, a deleo do gene produtor da enzima glicerol desidratase,
responsvel pela via de produo de 1,3-propanodiol, combinado com a
alimentao com glicerol a melhor estratgia para obteno de uma
Clostridium super-produtora de hidrognio. Sem o uso desta ferramenta no
seria possvel esta concluso. Desta forma, este trabalho demonstra uma
possvel rota biolgica, onde o glicerol pode ser usado como substrato em uma
bactria geneticamente modificada, produtora de hidrognio. Cabe ressaltar
que o glicerol subproduto da produo de biodiesel. A confirmao
experimental da hiptese obtida pela anlise de sensibilidade pode dar uma
finalidade altamente nobre e lucrativa ao glicerol gerado na produo de
biodiesel.
Utilizando a funo MFAOP foi possvel fazer a anlise de fluxo
metablico para a produo de violacena por Chromobacterium violaceum. O
resultado um mapa geral estimado da distribuio dos fluxos metablicos
supondo que o objetivo desta bactria ter o menor gasto de energia possvel.
Alm disso, a anlise de sensibilidade fornecida pela funo MFAOP confirmou
resultados experimentais relacionados alimentao com glicose e glicerol,
mostrando que o glicerol bem mais eficiente na produo de violacena. A
anlise de sensibilidade ainda indicou que o caminho mais eficiente para
mutao gentica seria inibir o gene responsvel pela produo de isoleucina.
5.2.
Sugestes para trabalhos futuros

Em cada um dos assuntos abordados neste trabalho, seja na produo
biolgica de hidrognio, seja na produo biolgica de violacena, seja no uso e

melhoramento do ME Toolbox, surgiram vrias possibilidades novas de
trabalho:
95
Executar a mutao gentica em Clostridium butyricum proposta

neste trabalho e seguir com alimentao com glicerol. A
confirmao da anlise feita neste trabalho pode ser uma
revoluo na produo energtica por via bacteriana;
Obter fluxos extracelulares da Chromobacterium violaceum para

fazer uma anlise de fluxo metablico de um sistema
determinado ou superdeterminado, como foi feito com a
Clostridium butyricum;
Executar a mutao gentica em Chromobacterium violaceum

proposta, tambm tendo glicerol como principal fonte de
carbono;
Tentar
tornar
funo
MFAIL
mais
automatizada.
necessidade de interao do usurio sobre sistema linear do

balano carbono a carbono torna esta funo muito complicada;
Melhoramentos nas demais funes do ME Toolbox, como, por

exemplo, a criao de uma interface grfica onde o usurio entre
com reaes e no com a matriz estequiomtrica.
96
CAPTULO VI
Referncias Bibliogrficas
August, P. R., Grossman, T. H., Minor, C., Draper, M. P., MacNeil, I. A.,
Pemberton, J. M., Call, K. M., Holt, D. e Osburne, M. S. (2000). Sequence
analysis and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway
from Chromobacterium violaceum. Journal of Molecular Microbiology and
Biotechnology 2: 513-519.
Bell, S. L. e Palsson, B. O. (2005). Phenotype phase plane analysis using interior
point methods. Computers and Chemical Engineering 29: 481-486.
Chatziiannou, A., Palaiologos, G. e Kolisis, F. N. (2003). Metabolic flux
analysis as a tool for the elucidation of the metabolism of neurotransmitter
glutamate. Metab Eng 5: 201-210.
Cortassa, S., Aon, M. A., Iglesias, A. A. e Lloyd, D. (2002). An Introduction to
Metabolic and Cellular Engineering. World Scientific. New Jersey, London,
Singapore, Hong Kong.
Debabrata, D. e Nejat, V. T. (2001). Hydrogen production by biological
processes: a survey of literature. International Journal of Hydrogen Energy 26: 1328.
Goudel, A. M., Mendes, E. e Porto, L. M. (2005). CvioCyc. Disponvel em:
<http://cviocyc.intelab.ufsc.br>. Acesso em: 14 fev. 2005.
Hallenbeck, P. C. e Benemann, J. R. (2002). Biological hydrogen production;
fundamentals and limiting processes. International Journal of Hydrogen Energy 27:
1185-1193.
Heijnen, J. J., van Gulik, W. M., Shimizu, H. e Stephanopoulos, G. (2004).
Metabolic flux control analysis of branch points: an improved approach to
obtain flux control coefficients from large perturbation data. Metabolic
Engineering 6: 391-400.
97
Levin, D. B., Pitt, L. e Love, M. (2004). Biohydrogen production: prospects and

limitations to practical application. International Journal of Hydrogen Energy 29:
173-185.
McCabe, B. J. e Previs, S. F. (2004). Using isotope tracers to study metabolism:
application in mouse models. Metab Eng 6: 25-35.
Metzler, D. E. (1977). Biochemistry: the chemical reactions of living cells. Academic
Press. New York.
Nadeau, I., Sabatie, J., Koehl, M., Perrier, M. e Kamen, A. (2000). Human 293
cell metabolism in low glutamine-supplied culture: interpretation of metabolic
changes through metabolic flux analysis. Metab Eng 2: 277-292.
Nielsen, L.K. (2001). Metabolic Engineering. University of Queensland,
Brisbana, Austrlia.
Oliveira, C.G. (2005). Regulao Gnica da Biossntese de Violacena e Quorum
Sensing em Chromobacterium violaceum. Tese (Doutorado), Engenharia Qumica,
Universidade Federal de Santa Catarina.
Ozkan, P., Sariyar, B., Utkur, F. O., Akman, U. e Hortacsu, A. (2005). Metabolic
flux analysis of recombinant protein overproduction in Escherichia coli.
Biochemical Engineering Journal 22: 167-195.
Saint-Amans, S., Girbal, L., Andrade, J., Ahrens, K. e Soucaille, P. (2001).
Regulation of carbon and electron flow in Clostridium butyricum VPI 3266 grown
on glucose-glycerol mixtures. J Bacteriol 183: 1748-1754.
Shimizu, H., Tanaka, H., Nakato, A., Nagahisa, K., Kimura, E. e Shioya, S.
(2003). Effects of the changes in enzyme activities on metabolic flux
redistribution around the 2-oxoglutarate branch in glutamate production by
Corynebacterium glutamicum. Bioprocess Biosyst Eng 25: 291-298.
Shirai, T., Nakato, A., Izutani, N., Nagahisa, K., Shioya, S., Kimura, E.,
Kawarabayasi, Y., Yamagishi, A., Gojobori, T. e Shimizu, H. (2005).
98
Comparative study of flux redistribution of metabolic pathway in glutamate

production by two coryneform bacteria. Metab Eng 7: 59-69.
Stephanopoulos, G., Aristidou, A. A. e Nielsen, J. (1998). Metabolic Engineering:
principles and methodologies. Academic Press. San Diego.
Stephanopoulos, G. (1998). Metabolic engineering. Biotechnol Bioeng 58: 119120.
Vallino, J. J. e Stephanopoulos, G. (1993). Metabolic Flux Distributions in
Corynebacterium glutamicum During Growth and Lysine Overproduction.
Biotechnology and Bioengineering 41: 633-646.
Varma, A., Boesch, B. W. e Palsson, B. O. (1993). Stoichiometric Interpretation
of Escherichia-Coli Glucose Catabolism under Various Oxygenation Rates.
Applied and Environmental Microbiology 59: 2465-2473.
Vasconcelos, A. T. R. d. et al. (2003). The complete genome sequence of
Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial
adaptability. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 11660-11665.
99
CAPTULO VII
Apndice
7.1.
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
Funo MFA do ME Toolbox
MFA.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the metabolic flux analysis.
[vc,R,rk,vmnew,vcnew,h,e,answ,C,accum,spec] = MFA(G,vm,p,pcs) Makes the
metabolic flux analysis of determined and overdetermined systems.
Authors: Erlon Mendes & Luismar Porto
Date: March 11, 2006
Local Parameters:
input:
G = stoichiometric matrix.
vm = rates of measured fluxes.
p = vector of relative positions of measured fluxes in the
stoichiometric matrix.
pcs = relative position of the unmeasured flux of interest
for specific sensitivity analysis.
output:
vc = rates of unmeasured fluxes.
R = redundancy matrix.
rk = redundancy matrix's rank.
vmnew = new rates of measured fluxes, by statistical
reconciliation.
vcnew = new rates of unmeasured fluxes, by statistical
reconciliation.
h = test function X^2 distributed.
e = residual vector.
answ = answer if the solution is unique or not.
C = condition number.
accum = accumulated sensitivities vector.
spec = specific sensitivities vector, related to the
"pcs" flux.
Ref.: Stephanopoulos, G., Aristidou, A. A. and Nielsen, J. (1998). Metabolic

Engineering : principles and methodologies. Academic Press. San Diego.
The toolbox is distributed under the GNU General Public Licence
(Free Software Foundation 1991; http://www.gnu.org)
function [vc,R,rk,vmnew,vcnew,h,e,answ,C,accum,spec] = MFA(G,vm,p,pcs)

Gt = G';
% Measured rates
Gtm = Gt(:,p);
% Unmeasured rates
sgt = size(Gt);
j = 1;
i = 1;
for k=1:sgt(2)
if j == length(p)+1
for l=k:sgt(2)
100
q(i) = l;
end
break;
end
if k == p(j)
j = j+1;
else
q(i) = k;
i = i+1;
end
end
Gtc = Gt(:,q);
vc = -pinv(Gtc)*Gtm*vm;
figure
hold on
title('Measured and calculated rates')
bar(p,vm,'r')
bar(q,vc,'b')
ylabel('Rates of fluxes (mmol/h/g [dry wt])')
xlabel('Fluxes')
legend('Measured rates','Unmeasured rates',2)
hold off
% Statistical reconciliation of the measurements
% Redundancy matrix
R = (Gtm - Gtc*pinv(Gtc)*Gtm);
rk = rank(R, 1e-10);
% Reduced redundancy matrix
sg = size(G);
K = [ones(1,rk),zeros(1,sg(2)-rk)];
Rred = K*R;
% Rred = R(1:rk,:);
% Test
e = Rred*vm;
h = e'*inv(Rred*Rred')*e;
% New estimates for the measured rates
vmnew = (eye(length(p))-Rred'*inv(Rred*Rred')*Rred)*vm;
% New estimates for the unmeasured rates
vcnew = -pinv(Gtc)*Gtm*vmnew;
figure
hold on
title('New measured and calculated rates')
bar(p',vmnew,'r')
bar(q',vcnew,'b')
xlabel('Fluxes')
hold off
Nc = null(Gtc);
if rank(Nc)==0
answ='This is an unique solution';
else
answ='This isnt an unique solution';
end
% Sensitivity analysis
C = norm(Gt)*norm(pinv(Gt));
sens = -pinv(Gtc)*Gtm;
101
accum = sum(abs(sens));
figure
hold on
title('Accumulated sensitivities')
bar(p,accum,'g')
hold off
pcs = find(q==pcs);
if isempty(pcs)
error('The flux for sensitivity is not a unmeasured flux')
else
spec = abs(sens(pcs,:));
figure
hold on
title('Specific sensitivities')
bar(p,spec,'m')
hold off
end
102
7.2.
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
Funo MFAIL do ME Toolbox
MFAIL.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the metabolic flux analysis by isotope labelling
methods.
[vc,answ,xpyr,xicit,xakg,xsuc,xmal,xoaa] = MFAIL(G,vm,p) Makes the
metabolic flux analysis of determined and overdetermined systems by
isotope labelling methods.
Local Parameters:
input:
vm = rates of measured fluxes.
p = vector of relative positions of measured fluxes in the
stoichiometric matrix.
output:
vc = rates of unmeasured fluxes.
answ = answer if the solution is unique or not.
x = fractional labelling states.
function [vc,answ,xpyr,xicit,xakg,xsuc,xmal,xoaa] = MFAIL(G,vm,p)

Gt = G';
% Measured rates
Gtm = Gt(:,p);
% Unmeasured rates
sgt = size(Gt);
j = 1;
i = 1;
for k=1:sgt(2)
if j == length(p)+1
for l=k:sgt(2)
q(i) = l;
end
break;
end
if k == p(j)
j = j+1;
else
q(i) = k;
i = i+1;
end
end
Gtc = Gt(:,q);
vc = -pinv(Gtc)*Gtm*vm;
figure
hold on
title('Measured and calculated rates')
103
bar(p,vm,'r')
bar(q,vc,'b')
xlabel('Fluxes')
hold off
Nc = null(Gtc);
if rank(Nc)==0
answ='This is an unique solution';
else
answ='This isnt an unique solution';
end
% Atomic mapping matrices
pyr = ['A','B','C'];
icit = ['d','c','b','a','C','B'];
pyr_icit = amm(pyr,icit);
oaa = ['a','b','c','d'];
icit = ['d','c','b','a','C','B'];
oaa_icit = amm(oaa,icit);
icit = ['A','B','C','D','E','F'];
akg = ['A','B','C','E','F'];
icit_akg = amm(icit,akg);
akg = ['A','B','C','D','E'];
suc = ['B','C','D','E'];
akg_suc = amm(akg,suc);
suc = ['A','B','C','D'];
mal = ['A','B','C','D'];
suc_mal8 = amm(suc,mal);
suc = ['A','B','C','D'];
mal = ['D','C','B','A'];
suc_mal9 = amm(suc,mal);
mal = ['A','B','C','D'];
oaa = ['A','B','C','D'];
mal_oaa = amm(mal,oaa);
mal = ['A','B','C','D'];
pyr = ['A','B','C'];
mal_pyr = amm(mal,pyr);
% Merging vm and vc
for i=1:length(p)
v(p(i)) = vm(i);
for j=1:length(q)
v(q(j)) = vc(j);
end
end
v = v';
% Initial labelling state
xpyr_in = [0;0;1];
xakg_in = [0;0;0;0;0];
% Frational labelling state
%
Pyr
AKG
MAL
A
=
zeros(length(pyr),length(icit))
zeros(length(pyr),length(suc))
zeros(length(pyr),length(oaa))];
ICit
SUC
OAA
[-sum(v(find(G(:,1)==-1)))*eye(length(pyr))
zeros(length(pyr),length(akg))
v(11)*mal_pyr
% Pyr
104
A = [A; sum(v(find(G(:,2)==1)))*pyr_icit
1)))*eye(length(icit))
zeros(length(icit),length(suc))
v(4)*oaa_icit];
-sum(v(find(G(:,2)==zeros(length(icit),length(akg))
zeros(length(icit),length(mal))
% ICit
A = [A; zeros(length(akg),length(pyr))
-sum(v(find(G(:,3)==-1)))*eye(length(akg))
zeros(length(akg),length(mal))
% AKG
v(5)*icit_akg
zeros(length(akg),length(suc))
zeros(length(akg),length(oaa))];
A
=
[A;
zeros(length(suc),length(icit))
-sum(v(find(G(:,4)==-1)))*eye(length(suc))
zeros(length(suc),length(oaa))];
zeros(length(suc),length(pyr))
sum(v(find(G(:,4)==1)))*akg_suc
zeros(length(suc),length(mal))
% SUC
A
=
[A;
zeros(length(mal),length(pyr))
zeros(length(mal),length(icit))
zeros(length(mal),length(akg))
(v(8)*suc_mal8+v(9)*suc_mal9)
-sum(v(find(G(:,5)==1)))*eye(length(mal))
zeros(length(mal),length(oaa))];
% MAL
A
=
[A;
zeros(length(oaa),length(pyr))
zeros(length(oaa),length(icit))
zeros(length(oaa),length(akg))
zeros(length(oaa),length(suc))
sum(v(find(G(:,6)==1)))*mal_oaa
-sum(v(find(G(:,6)==-1)))*eye(length(oaa))]; % OAA
b = [-v(1)*xpyr_in
zeros(length(icit),1)
-v(6)*xakg_in
zeros(length(suc),1)
zeros(length(mal),1)
zeros(length(oaa),1)];
x = A\b; % A*x = b
n(1)
n(2)
n(3)
n(4)
n(5)
n(6)
=
=
=
=
=
=
length(pyr);
n(1) + length(icit);
n(2) + length(akg);
n(3) + length(suc);
n(4) + length(mal);
n(5) + length(oaa);
xpyr = x(1:n(1));
figure
pie(xpyr*10);legend('C1','C2','C3',2);title('Fractional
Pyr')
labelling
state
of
xicit = x(n(1)+1:n(2));
figure
pie(xicit*10);legend('C1','C2','C3','C4','C5','C6',2);title('Fractional
labelling state of Icit')
xakg = x(n(2)+1:n(3));
figure
pie(xakg*10);legend('C1','C2','C3','C4','C5',2);title('Fractional
state of AKG')
xsuc = x(n(3)+1:n(4));
figure
pie(xsuc*10);legend('C1','C2','C3','C4',2);title('Fractional
of Suc')
xmal = x(n(4)+1:n(5));
figure
pie(xmal*10);legend('C1','C2','C3','C4',2);title('Fractional
of Mal')
xoaa = x(n(5)+1:n(6));
105
labelling
labelling
state
labelling
state
figure
pie(xoaa*10);legend('C1','C2','C3','C4',2);title('Fractional
of OAA')
106
labelling
state
7.3.
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Funo AMM do ME Toolbox
AMM.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the atomic mapping matrix.
mn = AMM(m,n) Makes the atomic mapping matrix.
Local Parameters:
input:
m = carbon configuration of reactant.
n = carbon configuration of product.
output:
mn = atomic mapping matrix.
function mn = AMM(m,n)
for i=1:length(m)
for j=1:length(n)
mn(i,j) = strcmp(m(i),n(j));
end
end
mn = mn';
107
7.4.
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Funo MFAOP do ME Toolbox
MFAOP.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the metabolic flux analysis.
[x,fval,exitflag,output,lambda,C] = MFAOP(f,SP,EF,G,pcs) Makes the
metabolic flux analysis of subdetermined systems.
Local Parameters:
input:
f = objective function.
SP = substrate positions.
EF = experimental flux.
pcs = relative position of the interest flux for specific
sensitivity analysis.
output:
x = metabolic flux vector.
fval = objective function value in "x".
exitflag = describes the exit condition. > 0 when LINPROG
converged with a solution X. 0 when LINPROG reached the maximum
number of iterations without converging. < 0 when the problem was
infeasible or LINPROG failed.
output = interactions number.
lambda = set of Lagrangian multipliers.
C = conditional number.

function [x,fval,exitflag,output,lambda,C] = MFAOP(f,SP,EF,G,pcs)

% ____Linear programming____
Gt = G';
sG = size(Gt);
% Equalities of the system
beq = zeros(sG(1),1);
% Inequalities of the system
A = zeros(2,sG(2));
sSP = size(SP);
for i=1:sSP(1)
A(SP(i,1),SP(i,2)) = 1;
end
b = ones(SP(i,1),1)*10;
% Lower bounds
lb = zeros(sG(2),1);
% Optimization solve
[x,fval,exitflag,output,lambda] = linprog(f,A,b,Gt,beq,lb);
108
% Use of experimental data

x = x.*EF(2)/x(EF(1));
% Flux display
figure
hold on
bar(x,'b')
xlabel('Fluxes')
hold off
% ____Sensitivity analysis____
p = find(f~=0);
pa2 = find(p==pcs);
p(pa2) = [];
% External rates
Gtm = Gt(:,p);
% Internal rates
sgt = size(Gt);
j = 1;
i = 1;
for k=1:sgt(2)
if j == length(p)+1
for l=k:sgt(2)
q(i) = l;
end
break;
end
if k == p(j)
j = j+1;
else
q(i) = k;
i = i+1;
end
end
Gtc = Gt(:,q);
C = norm(Gt)*norm(pinv(Gt));
sens = -pinv(Gtc)*Gtm;
% Accumulated sensitivities
accum = sum(abs(sens));
figure
hold on
title('Accumulated sensitivities')
bar(p,accum,'g')
hold off
% Specific sensitivities
pcs = find(q==pcs);
spec = abs(sens(pcs,:));
figure
hold on
title('Specific sensitivities')
bar(p,spec,'m')
hold off
109
7.5.
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Funo MCA do ME Toolbox
MCA.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the metabolic control analysis of linear pathways.
[xin,Ein,Cin,x,E,C,Xstore,Cstore,fcst,fcct] = MCA(o,lev) Makes the
metabolic control analysis of linear pathways.
Local Parameters:
input:
o = enzyme overexpression.
lev = overexpression level.
output:
xin = initial system variables vector.
Ein = initial elasticity matrix.
Cin = initial FCC matrix.
x = system variables vector.
E = elasticity matrix.
C = FCC matrix.
Xstore = system variables store.
Cstore = FCC store.
fcst = flux-control summation theorem.
fcct = flux-control connectivity theorem.
Global Parameters:
s = input substrate concentration.
p = input product concentration.
En = vector of En(i) kinetics constants.
kcat = vector of kcat(i) kinetics constants.
Keq = vector of Keq(i) kinetics constants.
km = vector of km(i) kinetics constants.
answ = inhibition activation parameter.
inhib = inhibition matrix, with dimension (n x 2) where
"n" is the number of inhibitions, the first column is the
inhibitor metabolite and the second one is the inhibited enzyme.
Ki = vector of inhibition constants.
Form of Kinetic Equations:
kcat(i)*(X(i-1) - _X(i)_)
Keq(i)
1
v(i) = En(i) * ------------------------- * ----------X(i-1) + km(i) + _X(i)_
1+_X(inhib)_
Keq(i)
Ki
where v(i) is the rate of the reaction "i" and X(inhib) is the
metabolite that exert inhibition for the reaction "i".
function [xin,Ein,Cin,x,E,C,Xstore,Cstore,fcst,fcct] = MCA(o,lev)

global s p En kcat Keq km answ inhib Ki
Xstore = [];
Cstore = [];
110
for i=1:0.2:lev
% Find steady state.
En(o)=i;
x = fminsearch('kinetics',ones(1,length(En)));
% Find elasticity coefficients.
e = elasticity(x);
el = e';
% Find control coefficients.
es = size(el);
E = [ones(1,es(2));el];
C = E\eye(es(2));
if i==1
xin = x;
Ein = E;
Cin = C;
end
Xstore = [Xstore,x'];
Cstore = [Cstore,C(:,1)];
end
% Flux-control theorems
Cs = size(C);
fcst = 0;
fcct = 0;
for i=1:Cs(1)
fcst = fcst+C(i,1);
for j=1:es(1)
fcct = fcct+C(i,1)*el(j,i);
end
end
if fcst==1
fcst='Flux-control summation theorem is complied';
else
fcst='Flux-control summation theorem is not complied';
end
if fcct<=1e-10
fcct='Flux-control connectivity theorem is complied';
else
fcct='Flux-control connectivity theorem is not complied';
end
111
7.6.
Funo KINETICS do ME Toolbox
% KINETICS.M (Part of ME Toolbox)

% Version: 1.0
%
% Description: Function used to find the system variables by minimum least
% square.
%
x = fminsearch('KINETICS',[1,1]) finds the system variables by minimum
least
%
square.
%
% Authors: Erlon Mendes & Luismar Porto
% Date: March 11, 2006
%
% Global Parameters:
%
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%
% Ref.: Stephanopoulos, G., Aristidou, A. A. and Nielsen, J. (1998). Metabolic
% Engineering : principles and methodologies. Academic Press. San Diego.
%
% The toolbox is distributed under the GNU General Public Licence
% (Free Software Foundation 1991; http://www.gnu.org)
function f = KINETICS(x)
if answ == 'y'
si = size(inhib);
for i = 1:si(1)
for j = 1:length(En)
if j == inhib(i,2)
it(j) = (1+x(inhib(i,1))/Ki(i));
else
it(j) = 1;
end
end
end
else
it(1:length(En)) = 1;
end
for i = 1:length(En)
if i == 1
v(i) = En(i)*kcat(i)*(s-x(i)/Keq(i))/(s+km(i)+x(i)/Keq(i))/it(i);
elseif i == length(En)
v(i) = En(i)*kcat(i)*(x(i-1)-p/Keq(i))/(x(i-1)+km(i)+p/Keq(i))/it(i);
else
v(i)
=
En(i)*kcat(i)*(x(i-1)-x(i)/Keq(i))/(x(i1)+km(i)+x(i)/Keq(i))/it(i);
end
end
f = 0;
for i=1:length(v);
f = f+(v(i)-x(length(v)))^2;
112
end
113
7.7.
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%
Funo ELASTICITY do ME Toolbox
ELASTICITY.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Calculates Elasticity Coefficients
e = ELASTICITY(x) solves the Elasticity Coefficients for linear
pathways
Local Parameters:
input:
output:
e = calculated elasticity.
Global Parameters:
function e = ELASTICITY(x)
for i = 1:length(En)
if i == 1
e(i,i)
=
-(x(i)/Keq(i))/(s-x(i)/Keq(i))(x(i)/Keq(i))/(s+km(i)+x(i)/Keq(i));
elseif i == length(En)
e(i,i-1) = x(i-1)/(x(i-1)-p/Keq(i))-x(i-1)/(x(i-1)+km(i)+p/Keq(i));
else
e(i,i)
=
-(x(i)/Keq(i))/(x(i-1)-x(i)/Keq(i))-(x(i)/Keq(i))/(x(i1)+km(i)+x(i)/Keq(i));
e(i,i-1)
=
x(i-1)/(x(i-1)-x(i)/Keq(i))-x(i-1)/(x(i1)+km(i)+x(i)/Keq(i));
end
if answ == 'y'
si = size(inhib);
for j = 1:si(1)
e(inhib(j,2),inhib(j,1))
(x(inhib(j,1))/Ki(j))/(1+x(inhib(j,1))/Ki(j));
end
end
end
114
7.8.
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%
Funo MCAB do ME Toolbox
MCAB.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Makes the metabolic control analysis of branched pathways.
[xin,Ein,Cin,x,E,C,Jstore,Xstore,Cstore,XJstore] = MCAB(J,dep,lev)
Makes the metabolic control analysis of branched pathways.
Local Parameters:
input:
J = flux vector
dep = dependent flux.
lev = overexpression level.
output:
xin = initial system variables vector.
Ein = initial elasticity matrix.
Cin = initial FCC matrix.
E = elasticity matrix.
C = FCC matrix.
Jstore = flux rates store.
Xstore = system variables store.
Cstore = FCC store.
XJstore = combination of Xstore and Jstore.
Global Parameters:
k = auxiliary parameter.
Form of Kinetic Equations:
kcat(i)*(X(i-1) - _X(i)_)
Keq(i)
v(i) = En(i) * ------------------------X(i-1) + km(i) + _X(i)_
Keq(i)
where v(i) is the rate of the i-flux.
function [xin,Ein,Cin,x,E,C,Jstore,Xstore,Cstore,XJstore] = MCAB(J,dep,lev)

global s p En kcat Keq km k
Jstore = [];
Xstore = [];
Cstore = [];
Js = 0;
Jp = 0;
for i=1:length(s)
Js = Js + J(i);
115
end
for i=1:length(p)
Jp = Jp + J(i+length(s));
end
if Js == Jp
% Stoichiometric matrix.
G = [ones(length(s),1);-ones(length(p),1)];
% Find fractional fluxes.
j=1;
for i=1:length(J)
F(dep,i) = J(i)/J(dep);
if dep~=i
f(j) = F(dep,i);
j = j+1;
end
end
f = f';
% Collect the rows of the stoichiometric matrix containing dependent
fluxes
% in the sub-matrix Gc and the remaining rows in the sub-matrix G0.
Gc = G(dep);
j=1;
for i=1:length(G)
if i~=dep
G0(j) = G(i);
j = j+1;
end
end
% Generate Ljf to solve the linear system (Ljf,-el)*(Cj,in;Cx)=P
aj = -inv(Gc')*G0';
ajf = aj.*f;
Lj = [eye(length(J)-1);aj'];
Ljf = [eye(length(J)-1);ajf'];
for i=1:0.2:lev
% Find steady state.
En(dep)=i;
k=dep;
x = fminsearch('kineticsb',[1,1]);
% Find elasticity coefficients.
e = elasticityb(x);
el = e';
% Find control coefficients.
E = [Ljf,-el];
C = E\eye(length(el));
if i==1
xin = x;
Ein = E;
Cin = C;
end
% Find all J fluxes.
for j=1:length(s)
J(j)
=
x(1)/Keq(j))/(s(j)+km(j)+x(1)/Keq(j));
end
En(j)*kcat(j)*(s(j)-
for j=1:length(p)
J(length(s)+j)
=
En(length(s)+j)*kcat(length(s)+j)*(x(1)p(j)/Keq(length(s)+j))/(x(1)+km(length(s)+j)+p(j)/Keq(length(s)+j));
end
116
Jstore = [Jstore,J'];
Xstore = [Xstore,x'];
Cstore = [Cstore,C(j,:)'];
end
XJstore = [Xstore(1,:);Jstore];
else
error('The fluxes "J" dont respect the mass balance')
end
117
7.9.
Funo KINETICSB do ME Toolbox
% KINETICSB.M (Part of ME Toolbox)

% Version: 1.0
%
% Description: Function used to find the system variables by minimum least
% square.
%
x = fminsearch('KINETICSB',[1,1]) finds the system variables by minimum
least
%
square.
%
% Authors: Erlon Mendes & Luismar Porto
% Date: March 11, 2006
%
% Global Parameters:
%
%
%
%
%
%
%
% Ref.: Stephanopoulos, G., Aristidou, A. A. and Nielsen, J. (1998). Metabolic
% Engineering : principles and methodologies. Academic Press. San Diego.
%
% The toolbox is distributed under the GNU General Public Licence
% (Free Software Foundation 1991; http://www.gnu.org)
function f = KINETICSB(x)
global s p En kcat Keq km k
for i=1:length(s)
v(i) = En(i)*kcat(i)*(s(i)-x(1)/Keq(i))/(s(i)+km(i)+x(1)/Keq(i));
end
for i=1:length(p)
v(length(s)+i)
=
En(length(s)+i)*kcat(length(s)+i)*(x(1)p(i)/Keq(length(s)+i))/(x(1)+km(length(s)+i)+p(i)/Keq(length(s)+i));
end
f = 0;
f = f+(v(k)-x(2))^2;
118
7.10.
%
%
%
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%
%
Funo ELASTICITYB do ME Toolbox
ELASTICITYB.M (Part of ME Toolbox)

Version: 1.0
Description: Calculates Elasticity Coefficients
e = ELASTICITYB(x) Calculates the Elasticity Coefficients for branched
pathways
Local Parameters:
input:
output:
e = calculated elasticity.
Global Parameters:
function e = ELASTICITYB(x)
global s p En kcat Keq km
for i=1:length(s)
e(i)
=
-(x(1)/Keq(i))/(s(i)-x(1)/Keq(i))(x(1)/Keq(i))/(s(i)+km(i)+x(1)/Keq(i));
end
for i=1:length(p)
e(length(s)+i)
=
x(1)/(x(1)-p(i)/Keq(length(s)+i))x(1)/(x(1)+km(length(s)+i)+p(i)/Keq(length(s)+i));
end
119

Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metabólica: Produção Bacteriana de Hidrogênio e de Violaceína

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Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metabólica: Produção Bacteriana de Hidrogênio e de Violaceína

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Universidade Federal de Santa Catarina

Uso Racional de Ferramentas de Engenharia Metablica:

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Engenharia Qumica da

Orientador: Prof. Dr. Luismar Marques Porto (EQA/UFSC)

Florianpolis, SC, Maro de 2006

Este trabalho parte integrante das pesquisas

Dedico este trabalho aos meus pais, Ausemir e

A anlise e o controle de fluxos metablicos___________________________________22

CAPTULO III ______________________________________________________ 39

4.1.5. Validao da hiptese de minimizao do gasto energtico. Anlise de fluxo metablico

CAPTULO VII _____________________________________________________ 100

Funo MFA do ME Toolbox _____________________________________________100

NDICE DAS FIGURAS

NDICE DAS TABELAS

resduo das medidas (mmol h 1 g 1 [clula seca ]) .

Xi coeficiente de elasticidade da i-sima taxa de reao, vi, em relao

concentrao do metablito j, Xj.

velocidade especfica de crescimento (h 1 ) .

das medidas mmol h 1 g 1 [clula seca ] .

vi taxa da reao i mmol h g

das medidas mmol h 1 g 1 [clula seca ] .

Xj concentrao do metablito j mmol g 1 [clula seca ] .

Xmet vetor das concentraes dos metablitos mmol g 1 [clula seca ] .

entendimento dos controles de fluxo importante para a modificao racional

variaes nos fluxos extracelulares pode indicar as rotas mais eficientes de

Desenvolvimento da tcnica de minimizao de energia livre para a

Anlise de fluxo metablico para a produo de hidrognio por

Anlise de fluxo metablico para a produo de violacena por

Integrao de tcnicas computacionais de engenharia metablica em um

Engineering Toolbox), que permite a realizao semi-automtica de anlises de

A anlise e o controle de fluxos metablicos

2.1.1. A anlise de fluxo metablico

principalmente no que diz respeito produo de produtos teis

Identificao dos controles dos pontos de bifurcao possvel, atravs da

estequiometria das reaes, que a base do MFA, requer conhecimento

Clculo de fluxos extracelulares no medidos Em alguns casos, o nmero de

Clculo de rendimentos tericos mximos A separao dos fluxos pode ser

dada pela seguinte equao diferencial (Stephanopoulos et al., 1998):

O primeiro termo do lado direito representa a rede de taxas de sntese

onde G representa a matriz dos coeficientes estequiomtricos, chamada matriz

0 = G'v = G'm v m + G'c v c ,

onde os ndices m e c representam os fluxos medidos e os que se deseja calcular

Para os sistemas superdeterminados, G c no inversvel e a soluo

Desta forma, a Equao (4) passa a ser:

Observe que, se G c uma matriz quadrada, sua pseudo-inversa ser a

2.1.2. A anlise de controle metablico

enzima. Tal informao permite uma modificao racional dos fluxos

Pela definio dos FCCs, a enzima com o maior coeficiente de controle

Outro conceito importante em MCA o coeficiente de elasticidade.

relativa na taxa de reao com relao a uma variao infinitesimal na

Se a reduo na atividade de uma enzima tem um efeito pequeno no

Este teorema diz como a cintica de uma enzima afeta localmente o

A abordagem tradicional, pela maximizao da biomassa

sistema, existe um nmero infinito de solues para os fluxos metablicos

Uma descrio bsica da programao linear apresentada por

Uma restrio comum a todos os problemas de programao linear

Fonte: Stephanopoulos et al., 1998.

Varma (1993) usaram MFA por programao linear para interpretar o

etanol), foi reproduzida com programao linear usando a maximizao da taxa

A minimizao da energia livre como alternativa biolgica

A produo biolgica de hidrognio

agravo que est causando aquecimento global, degradao do meio ambiente e

As microalgas verdes utilizam energia luminosa para gerar eltrons que

reduzida. A enzima hidrogenase combina os prtons (H+) do meio com eltrons