INGENIERA BIOTECNOLGICA

JENIFFER FERRETTI VERGARA

FUNDAMENTOS DE LAS PRCTICAS DE

LABORATORIO
INMUNOLOGA GENERAL
EQUILAVENTE A: BIOTECNOLOGA DE LA RESPUESTA INMUNE

RESISTENCIA NO ESPECFICA. FAGOCITOSIS.

Quimiotaxis
Adherencia
Opsonizacin
Ingestin
Desgranulacin
Destruccin
Exocitosis

Puestas en evidencia en la prctica

Reconocimiento

Pocos segundos despus del contacto de las celulas fagociticas con agentes quimiotcticos y con
microorganismos, se detectan en las celulas alteraciones metablicas que incluyen cambios en
el potencial elctrico de la membrana, produccin y liberacin de cAMP, liberacin del anin
superxido y liberacin de enzimas lisosomales. Dentro de los cambios oxidativos que
acompaan al proceso de la endocitosis se encuentran los incrementos en:
a) Consumo de oxgeno
b) Consumo de glucosa
c) Actividad del ciclo de las pentosas o hexosas
Estallido respiratorio
monofosfato
d) Produccin de perxido de hidrgeno y otros perxidos

G-SH : Glutatin en estado reducido

(90%) G-S-S-G : Glutatin en estado oxidado (10%)

1. Reconocimiento
En levaduras opsonizadas.
Previamente estas levaduras se pusiern con suero inmunolgico, los Acs del suero las
reconociern como Ags y se acoplarn a ellas (fueron opsonizadas). En la prctica se
desfibrino la sangre recientemente obtenida y quedo libre de anticuerpos. Entonces, al
ponerse en contacto con las levaduras opsonizas estas van a ser activadoras de la va
alterna del complemento, por que el zimosan de Saccharomyces cerevisiae es un
activador de ella. No puede ser va de la lectina porque la fagocitosis no se estaba
dando en un estado de infeccin aguda, ni via clasica porque no haba presencia de
Acs.
La ventaja de ingestin de levaduras se dio porque al estar opsonizadas, los neutrofilos
tienen en su membrana los receptores para la fraccin de complemento acoplada a
levadura (C3b) CD35 adems de los TLRs (Receptores tipo toll), teniendo dos
receptores para Ag en lugar de uno solo.
En levaduras no opsonizadas.
Al quedar sin Acs acoplados a sus membranas aqu la fagocitosis no se vio ms
favorecida, pues el reconocimiento de ellas solo estuvo determinado por los TLRs.
2. Mecanismos de destruccin
Las clulas fagociticas destruyen microorganismos a travs de mecanismos dependiente e
independientes del O 2 . Los primeros incluyen la liberacin de radicales libres del oxigeno
(ROI) generados por el sistema de la NADPH-oxidasa al transformar al oxigeno molecular
en anin superxido. Los mecanismos independientes del oxgeno incluyen a hidrolasas
lisosomales y a peptidos y proteinas microbicidas. Las hidrolasas lisosomales se activan al
acidificarse el medio fagosomal a travs de la actividad de una bomba de protones (protn
ATPasa) presente en un tipo de endosomas.
La actividad conjunta de los ROI y los componentes lisosomales es la causa de la muerte
de los microrganismos ingeridos.
MECANISMO INDEPENDIENTE DE OXGENO.
Estos mecanismos dependen de protenas antimicrobianas preformadas y acumuladas en
los grnulos:
Protenas catinicas, con actividades de tipo antibitico:
Defensinas (en macrfagos de conejo y en PMN neutrfilos humanos). Son pptidos
catinicos , de unos 30 aminocidos, ricos en cys y arg. Forman canales permeables a
los iones en las bicapas lipdicas de los microrganismos. Actan antes de que tenga
lugar la acidificacin del fagolisosoma.

 Catepsina G
Azurozidina
Lisozima,
que
acta
rompiendo
el
peptidoglucano de bacterias (sobre todo de
Gram-negativas).
Lactoferrina (producida por neutrfilos):
secuestra hierro, indispensable para las
bacterias.
MECANISMO DEPENDIENTE DE OXGENO.
Con
esta
reaccin se definen los 3 cambios metabolicos
observados en la fagocitosis, ya que esta
oxidasa produce directamente un aumento en
la concentracin de NADP+, que a su vez es el
sustrato limitante del Ciclo de las Hexosas Monofosfato (HMP) y tambien explica el
aumento en el consumo de oxgeno. La activacin del ciclo HMP es importante para los
eritrocitos pues es la unica manera que tienen para mantener los niveles de poder
reductor necesarios para mantener el grupo hemo en la hemoglobina en estado reducido.
En los eritrocitos que no pueden neutralizar los peroxidos correctamente, se producen
peroxidaciones de lipidos de membrana, que lleva a deformacin de membranas y rotura
(hemlisis).
Antes de que el lisosoma se fusione con el
fagosoma, en ste tiene lugar la reduccin
de oxgeno molecular (O2) catalizada por la
NADH-oxidasa
de
la
membrana
del
fagosoma; el anin superxido resultante
(O-2) es txico por s mismo, pero a su vez
da lugar a otros radicales txicos de vida
corta, como el perxido de hidrgeno (H 2O2),
el radical hidroxilo (OH) y el oxgeno
singlete.
Una vez que el lisosoma se fusiona con el fagosoma, aqul libera la mieloperoxidasa, que
acta sobre los perxidos en presencia de haluros (I- y Cl-), para producir compuestos
halogenados (hipohaluros) muy txicos y de vida larga: cido hipocloroso (ClOH), e
hipoiodoso (IOH).

3. Pinocitosis del Nitroazul de Tetrazolio

Esta ocurre despues de la ingestin de las levaduras, al estar compitiendo el NAT con el
O2 por ser reducidos por la NADPH oxidasa, el NAT que esta siendo interiorizado al
citoplasma del neutrofilo se encuentra de forma insoluble y azul. Entonces, en el
citolplasma del neutrofilo se encuentran tanto el NAT como las levaduras ingestadas, lo
que lleva a Saccharomyces cerevisiae a pinocitar al NAT.
4. Reduccin del Nitroazul de Tetrazolio
Durante la fagocitosis tambien se observa un incremento en la capacidad de las celulas
fagociticas para reducir el NBT. Su reduccin ocurre cuando, compitiendo con el oxigeno,
la molecula es reducida por la NADPH-oxidasa hasta su estado de formazan (producto
insoluble de color azul). La reduccin tambin se puede dar por efecto directo del anin
superxido.
Y

LO QUE SUCEDI CON LAS LEVADURAS OPSONIZADAS FUE:

Notas:
No
se
considera que
los
endosomas
sean
orgnulos
celulares sino compartimentos dentro del citoplasma que funcionan como transportadores de
material procedente del exterior que entra a la clula por endocitosis.
El G-SH es el mayor antioxidante endgeno producido por las clulas, participando
directamente en la neutralizacin de radicales libres y compuestos de oxgeno reactivo.
NAT (Espaol) = NBT (Ingls)

ANATOMA DEL SISTEMA INMUNOLGICO

1. Trfico Linfocitario
El
clulas,
el

sistema inmune acta gracias a la participacin de diferentes poblaciones

celulares conocidas como clulas inmunocompetentes. Estas
que mayoritariamente son leucocitos, que encuentran en todo
organismo y principalmente en los rganos linfoideos. Estos
rganos linfoides, se comunican entre s a travs de la circulacin
sangunea y linftica que es por donde circulan estas clulas de
unos lugares a otros. Esto hace posible el encuentro de
las clulas inmunocompetentes con los antgenos y adems
que ellas mismas interacten, aspectos stos que son
necesarios para una respuesta inmune adecuada.
Las clulas con funcin inmune proceden por diferenciacin
de las clulas madre CD34+ presentes en la mdula sea.
Este proceso se conoce como hematopoyesis.

2.

Hematopoyesis
Las
clulas madre que en el adulto se encuentran en la mdula sea son las
responsables de formar todas las clulas y derivados celulares que circulan por la sangre.

Durante las primeras semanas embrionarias se encuentran clulas madres en el saco

vitelino, las cuales van diferencindose en clulas eritroides, provistas de hemoglobina
embrionaria.

Desde el tercer mes hasta el sptimo de embarazo, las clulas madre migran, primero
al hgado fetal, y despus al bazo fetal, donde sigue la heamtopoyesis.
Desde el sptimo mes, va disminuyendo la hematopoyesis en el hgado y bazo, hasta
que desaparece para la poca del nacimiento, y va adquiriendo preeminencia el papel
de la mdula sea.

En concreto de las clulas madre pluripotentes, se diferencian, hacia dos tipos distintos de
clulas algo ms maduras. Son los progenitores de estirpe mieloide y los progenitores de
estirpe linfoide o glbulos blancos. Estos procesos de diferenciacin no ocurren al azar,
sino que estn estrechamente regulados por sustancias conocidas como factores
estimuladores de colonias que producidos por el estroma y macrfagos de la mdula sea.
3. Clulas Polimorfonucleares
Neutrfilos
Estas clulas tienen
como funcin principal
la
de
fagocitar
y
destruir patgenos. Se
encuentran en continua
renovacin debido a
que su vida media es
de tan slo varios das.
Son clulas de
gran
tamao con un ncleo
segmentado en varios
lbulos y gran cantidad
de grnulos en su
citoplasma.
Proceden
de la unidad formadora
de
colonias
granulocticomacrofgicas CFU-GM,
presente en la mdula
sea.

Eosinfilos

Estn recubiertos de
IgE e IgG y son muy
ricos
en
grnulos
repletos de histamina
que
la
vierten
al
exterior produciendo fuertes respuestas inflamatorias.

Basfilos

Los basfilos suelen encontrarse en la circulacin, posee receptores para el extremo Fc de las
Igs y participan en reacciones alrgicas.
4. APC
Las clulas dendrticas son las clulas presentadoras de antgenos (APCs) por excelencia y
adems poseen la capacidad de trasportar estos antgenos desde los tejidos hasta los ganglios.

Se encuentran distribuidos por todos los tejidos. Las clulas dendrticas derivan de progenitores
de la medula sea y circulan por la sangre como precursores inmaduros hasta que migran a los
tejidos donde maduran y se diferencian.
5. Organos linfoides primarios
Los rganos linfoides primarios son la mdula sea y el timo, donde maduran los linfocitos
B y T respectivamente y aprenden a discriminar entre antgenos propios (auto antgenos),
que sern tolerados y antgenos extraos en cuya destruccin colaborarn una vez
maduros.
Funciones:
Seleccin
Diferenciacin
Maduracin
Mdula sea. Est formada por un tejido esponjoso de color rojizo que se encuentra en
el interior de los grandes huesos y albergan una gran cantidad de clulas madre de
donde derivan las restantes clulas de la sangre, entre ellas los leucocitos. Aqu
maduran los linfocitos B a travs de n proceso conocido como linfopoyesis B que es
independiente de los estmulos antignicos.
Timo. El timo est constituido por una malla de clulas epiteliales rellena de clulas,
timocitos, que es como se denominan a los linfocitos en fase de maduracin en el timo.
El timo se organiza en lobulillos tabicados por trabculas conjuntivas y dentro de cada
uno de ellos se distingue una zona externa o corteza, que contiene la gran mayora de
los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos. Las clulas
epiteliales del timo, tanto de la corteza como de la mdula, expresan altas cantidades
de molculas de histocompatibilidad, imprescindibles para el reconocimiento de
antgenos propios por los linfocitos T.
La
Lobulillo tmico

sea.
los

LcT inmaduros

que
LcT maduros

linfocitos
doble

Lobulillo tmico
Trabculas

6. Organos

maduracin de los linfocitos T en el timo o

linfopoyesis T comienza con la llegada de sus
precursores al timo procedentes de la mdula
Durante este proceso mueren la mayora de
timocitos, aprox. el 95 % de ellos. Estos
timocitos que mueren son precisamente los
reconocen
a los antgenos propios del
organismo,
mientras que el resto, 3-4%,
abandonarn el timo, va sangunea, como
T maduros. Todo ello se realiza mediante un
proceso conocido como seleccin positiva y
negativa.
linfoides secundarios

Funciones:
Facilitar el trabajo de los Lc.
Son sitios de encuentro entre las APC y Lc.
Optimizan la activacin de LcB.
Los rganos linfoides secundarios son:

o
o
o

Los ganglios linfticos, que recogen Ag de los tejidos

El bazo, que recoge Ag de la sangre
Tejidos linfoides asociados a mucosas (MALT), que recogen Ag de las mucosas

El MALT es el encargado de proteger las mucosas del ataque de los agentes patgenos,
tanto en una respuesta primaria como secundaria. Est formado por ndulos de tejido
linfoide que, segn su localizacin, se denominan: GALT, NALT y BALT.

GALT. Tejido linfoide asociado al intestino. El GALT est formado por todo el tejido que
se encuentra en las paredes intestinales .
NALT. Tejido Linfoide Asociado a Nasofaringeo. Ganglios cervicales, adenoides y
amigdalas.
BALT. Tejido linfoide asociado a los bronquios. Est formado por todo el tejido linfoide
localizado en las mucosas respiratorias, desde las fosas nasales hasta los pulmones.

Una vez que los linfocitos B y T abandonan los rganos primarios donde han madurado,
pasan al torrente circulatorio, a travs del cual se mueven por todos los tejidos del
organismo, y alcanzan de nuevo los ganglios linfticos, y as sucesivamente.
Si se analiza la cantidad de linfocitos en
cada uno de los compartimentos, se
observa que la mayor parte de los linfocitos
se encuentran en los rganos linfoides,
mientras que en la sangre y el bazo se
encuentra una proporcin baja de los
mismos.

Corpsculo de Malpighi
Arteriola
esplnica
T. linfoide periarteriolar
Bazo. Se trata de un rgano situado en el
hipocondrio izquierdo, detrs del estmago y
cerca del diafragma. En el bazo se distingue la
pulpa roja que es un reservorio de hemates y la
Zona marginal
pulpa blanca que contiene el tejido linfoide, el
cual se dispone alrededor de una arteriola
central, presentando reas mas ricas en linfocitos T y otras en linfocitos B. Se da la
filtracin de la sangre, eliminacin de clulas sanguineas viejas o defectuosas y el
reciclado del Fe del organismo.

Ganglios linfaticos. Los ganglios linfticos conforman, junto a los vasos linfticos, una
compleja red corporal cuya funcin es filtrar los antgenos procedentes del espacio
extracelular y la linfa durante su circulacin desde la periferia hasta el conducto
torcico. Los ganglios linfticos, en el humano, son redondeados y presentan un hilio
donde los vasos sanguneos entran y salen.

Bsicamente, se distingue un rea B denominada crtex, un rea T denominada

paracrtex y un rea medular central. La corteza contiene agregados de linfocitos B
dispuestos formando folculos primarios y secundarios, segn que posean centros
geminares o no en funcin de que hayan recibido estmulos antignicos. La
paracorteza, contiene linfocitos T y abundantes clulas presentadoras de antgeno
(clulas dendrticas), quienes presentan abundantes antgenos MHC clase II en
superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por
espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las clulas
plasmticas y los macrfagos sinusales de los ganglios linfticos.
7. Endotelio vascular
El endotelio vascular regula el paso a tejidos de molculas y leucocitos. Para que stos
pasen desde la sangre al tejido inflamatorio o al rgano linfoide, deben de atravesar la
lnea de clulas endoteliales. Para ello deben adherirse a estas clulas y luego pasar entre
ellas (un proceso llamado extravasacin). Esto lo consiguen por medio de contactos
especficos entre el leucocito y la clula endotelial, a travs de molculas de adhesin
celular (CAM).
Existen tres familias de CAM:
I.
De la superfamilia de las Ig: ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1
II.
De la familia de la integrina (subfamilia con cadenas tipo b 2): VLA-4, LFA-1
III.
De la familia de las selectinas: L-selectina, E-selectina, P-selectina.
En la inflamacin se producen factores que activan a las clulas endoteliales normales,
que producen selectinas E y P, y que inician la extravasacin de granulocitos neutrfilos .
En cambio, los linfocitos en reposo tienen la capacidad de extravasarse desde circulacin
a ganglios y MALT a travs de las vnulas de endotelio alto (HEV). Las clulas de este
endotelio especial son cuboidales, pero de hecho no son ms que producto de la
diferenciacin de clulas de endotelio normal de los rganos linfoides secundarios, ante
citoquinas producidas en respuesta a antgenos.
8. Descripcin macrscopica de organos linfoides del ratn

Timo: Rosaseo, bilovulado, de 2 cm de largo y 1.2 cm de ancho en la parte superior.

Ganglio cervical: Estructura planada y forma ovoide. Con una depresin pequea
(hilio). Blanquecino de largo 0.6 cm.
Bazo: Rojo intenso, de 3.3 cm de largo, la pulpa blanca con aspecto brilloso.

PREPARACIN DE
PURIFICACIN DE
GLOBULINA.
ANIMALES
Los antigenos que se
para inmunizar por
conejos
fueron
suero humano. De acuerdo a las clasificaciones de los Ags, estos son:

ANTGENOS.
GAMMA
INMUNIZACIN DE
usaron en la prctica
primera vez a los
gamma globulina y

Solubles
Naturales
Timo dependientes
Protenas

1. Adyuvantes
Los adyuvantes son agentes heterogeneos e inespecificos que asociados a los antigenos
vacunales inducen una respuesta inmunitaria mas potente y prolongada.
Mecanismos de accin
Pueden actuar a travs de dos mecanismos principales:
I.
Actuando a travs del sistema de liberacin de antgeno, aumentando la
disponibilidad de antgeno en las clulas presentadoras de antgeno. Se consigue
un retraso en el aclaramiento antignico y aumento de la respuesta al antgeno
en localizaciones fisiolgicas especficas. Se incluyen en este grupo de
adyuvantes las sales insolubles de aluminio, liposomas, virosomas,
micropartculas (PLG), emulsiones y partculas virus-Like.
II.
Inmunopotenciadores: Activan directamente los receptores celulares e inducen
la liberacin de citokinas. Actan como inmunopotenciadores el monofosforil
lpido A (MPL) y derivados, Muramil dipptido (MDP) y derivados,
oligonucletidos (CpG), RNA de doble cadena, patrones alternativosmoleculares
asociados a patgenos, quils, resiquimod.

Ejemplos de
adyuvantes

Vacunas
de la
cartilla de
vacunacin (Adyuvantes y va de administracin)
1. SABIN (polio)
Se adquiere el virus va oral. No necesita adyuvante. Esta vacuna contiene el virus
vivo debilitado. Su presentacin es en forma lquida y se administra por va oral. La
forma trivalente (TOPV) es la ms efectiva contra todas las formas conocidas de la
polio.
2. BCG (tuberculosis)
La tuberculosis se contagia por va area, cuando las personas infectadas tosen,
estornudan o escupen. Cuando esta vacuna es usada para dar proteccin contra la
tuberculosis, se inyecta en la piel (intradrmica). La vacuna consiste en un
preparado en el que se usan bacilos de tuberculosis (de Koch) atenuados

(atontados), incapaces de provocar la enfermedad, pero capaces de estimular las

defensas del cuerpo. No necesita adyuvante.
3. Pentavalente
Es una vacuna combinada totalmente liquida conteniendo toxoides de difteria y
ttanos, suspensin celular inactivada de Bordetella pertussis, antgeno de
superficie de hepatitis B (HBsAg), y oligosacrido conjugado de Haemophilus
influenzae tipo B. La va de administracin es intramuscular profunda, el sitio de
aplicacin vara de acuerdo a la edad; a los menores de 3 aos en la cara antero
lateral externa del tercio medio superior del muslo. Y 3 aos y ms en el brazo, a
nivel del musculo deltoides. Usa como adyuvante fosfato de aluminio.
4. DPT
La vacuna absorbida antidiftrica, antitetnica y contra la tos ferina, se prepara
combinando el toxoide diftrico purificado, el toxoide tetnico purificado y bacilos
muertos de Bordetella pertussis. Los antgenos se absorben en el fosfato de
aluminio en la forma de adyuvante. La va de administracin es intramuscular
profunda.
5. Triple viral (SRP)
La vacuna triple viral o SRP est hecha de virus vivos atenuados (debilitados),
protege contra el sarampin, la rubola y la parotiditis. La vacuna se administra
mediante una inyeccin en el brazo izquierdo.
6. Doble viral (SR)
La vacuna doble viral o SR se elabora utilizando virus vivos atenuados (debilitados)
de sarampin, y virus vivos atenuados de rubola. La vacuna se aplica en el brazo
izquierdo mediante una inyeccin, como dosis nica.
7. Toxoide Tetnico Diftrico (TD)
La vacuna adsorbida antidiftrica y antitetnica para adultos y adolescentes se
prepara combinando el toxoide diftrico purificado y el toxoide tetnico purificado.
Los antgenos se absorben en el fosfato de aluminio en la forma de adyuvante. La
va de administracin es intramuscular profunda, a nivel del msculo deltoides.
8. Hepatitis B
La vacuna contiene antgeno de superficie de la hepatitis B, la vacuna actualmente
se fabrica usando ADN recombinante (son protenas producidas mediante levaduras
modificadas). La vacuna se aplica mediante inyeccin, en el muslo izquierdo en los
menores de 18 meses de edad. Despus se aplica en el brazo derecho mediante
una inyeccin. Usa como adyuvante alumbre.
9. Neumoccica
Para adultos contiene 23 tipos (serotipos) distintos de protenas que cubren a la
bacteria Streptococcus pneumoniae (neumococo) y contiene conservador. Se aplica
en el brazo derecho mediante una inyeccin. Usa fosfato de aluminio como
adyuvante.
10.Rotavirus
Existen dos tipos de vacuna hasta el momento:
I.
Una vacuna llamada monovalente que est hecha de virus vivos atenuados
(debilitados) que contiene un serotipo del virus. Se presenta en un frasco que
contiene la vacuna y una jeringa que contiene un lquido llamado carbonato
de calcio, el cual disminuye la acidez del estmago evitando que se inactive
el virus de la vacuna.
II.
Otra vacuna es la llamada pentavalente la cual se elabora con virus vivos que
originalmente se aislaron en humanos y en bovinos, contiene 5 serotipos de

virus vivos atenuados. Se presenta en un tubo de plstico con tapa de rosca

que contiene una sola dosis de la vacuna.
Ambas vacunas se administran por la boca (va oral). Ninguna contiene adyuvante.

Parmetros que influyen en la obtencin de Acs

1. Antgeno
o Carcter de extrao
o Tamao
o Composicin qumica, conformacin y complejidad
2. Animal
o Especie
o Sexo
o Edad
o Integridad biolgica
3. Proceso de inmunizacin
o Dosis
o Va de administracin
o Presencia de adyuvante
Mtodos de purificacin de protenas de alto peso molecular
1. Filtracin en gel. La fase estacionaria est constituida por partculas de polmeros de
diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las partculas.
2. Electroforesis en gel SDS.
3. Precipitacin por pH.
Efecto acarreador Hapteno Proteina
Los haptenos son antignicos pero incapaces de inducir por si mismas una reaccin
inmunitaria especfica, es decir, carecen de inmunogenicidad. El acoplamiento qumico
de un hapteno a una protena inmungena grande, llamada portador, genera un
conjugado hapteno-portador inmungeno. La inmunizacin con tal conjugado produce
anticuerpos especficos para tres tipos de determinantes antignicos, anticuerpos
contra el hapteno (principalmente), anticuerpos contra el portador y anticuerpos contra
el hapteno y el portador.