I.

PARTE PRCTICA
COLORACION GRAM
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
1. La base terica y qumica de los procedimientos de tincin
diferencial.
2. La base qumica de la tincin de Gram.
3. El procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de
bacterias: Gram positivas y Gram Negativas.

PRINCIPIO:
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que
se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es
llamado tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a
todas las clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el
segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar
la clula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de
contraste, le da a las clulas decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por
clulas que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de
clulas o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del
colorante que es absorbido.
Esta coloracin es la ms usada en la bacteriologa porque nos permite
diferenciar a dos grupos diferentes de bacterias como Gram Positivas
(retienen el primer colorante que es el cristal violeta) y las Gram negativas
(no retiene el primer colorante se decoloran siendo finalmente teidas por el
colorante de contraste Safranina) Esto es esencial para la clasificacin y
diferenciacin de microorganismos.

ASPECTOS TERICOS EN RELACIN CON LA TINCIN GRAM:

Un microorganismo Gram positivo debe de presentar una pared
celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por
una u otra causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia
de la pared para la retencin o el escape del colorante.
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo
una laca insoluble en agua. El alcohol o acetona empleado para
aclarar deshidrata las paredes de los microorganismos Gram
positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera de laca no
puede atravesar. En las clulas de Gram negativas, los lpidos de la
pared (ms abundante que as Gram positivas), se disuelven por este

tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta

con yodo.

II.

PARTE PRCTICA
1.- MATERIALES.
- BIOLOGICOS
Muestra con hisopo
(Gradilla, mano, lavatorio,
autoclave)
- VIDRIOS
Laminas.
-PLASTICOS

Lamina

Dispensador.
Suero fisiolgico.
- REACTIVOS
Batera de colorantes para la tincin
Gram.
-INSTRUMENTOS
Microscopio

Suero
fisiolgico

Dispensador

Microscopio

2.- TOMA DE MUESTRA

CONSIDERACIONES GENERALES
Nada es ms importante que la apropiada
recoleccin y el transporte de una muestra clnica.

seleccin,

Seleccionar el sitio anatmico correcto del cual obtener la

muestra clnica y utilizar las tcnicas y los materiales estriles
apropiados para la recoleccin de las muestras. Recolectar un
volumen de muestra adecuado, para evitar los falsosnegativos.

3.-PROCEDIMIENTOS
1. Obtencin de muestra

La toma de muestra realizada en esta prctica fue con

hisopado en la mesa, mano, Gradilla, lavadero

2. Prepare un frotis con este cultivo sobre una lmina

portaobjetos desengrasado y fijarlo al mechero.

3.

3. Lleve la lmina al lavadero y realice la tincin de la

siguiente manera:

a) Cubra la preparacin con solucin acuosa de Cristal

violeta o Violeta de genciana dejando que el
colorante actu durante (2-3min).

b) Lavar con agua corriente (agua de cao).

c) Luego cubrir con solucin de Lugol o yodo dejando

actuar el mordiente durante (12 min).

d)

Lavar
con
agua
corriente (agua de cao).

e) Decolorar la preparacin con Alcohol Acetona durante

(20 a 30 seg.).

f)

Lavar con agua corriente (agua de cao).

g) Cubrir el frotis con solucin contraste de Safranina
por (1 a 2 min).

h) Lavar con agua corriente (agua de cao).

i) Dejar secar la preparacin o ponerlo al mechero.
j) Observar al microscopio a 100 x con Aceite de
Inmersin.

Dato 1:
En muchos laboratorios se utilizan otros mtodos
de diferenciacin, la tincin de contraste o ambas.

Para que sirve dichos colorantes:

Acetona, o un volumen de acetona con dos
volmenes de alcohol; es un decolorante
mucho ms rpido que el alcohol etlico de
70 por 100. La decoloracin rpida puede
ser desventajosa en ciertas bacterias o
cuando los microorganismos escasean en el
frotis, o bien en manos de tcnicos
inexpertos.
Safranina, se usa tambin para la tincin de
contraste, pero no tiene ventajas evidentes.
Dato 2:
Los siguientes microorganismos comunes son
Gram positivos, o sea que se tien de color Azul oscuro:

Estafilococos
Neumococos
ntrax y su grupo
Hongos
Estreptococos
Difteroires
Clostridios

III.
RESULTADOS
La accin del calor, introducido en este mtodo, hace que haga
accesible a la coloracin porque ya est fijada la muestra.

Despus de colorear con Gram es muy importante porque nos Permite

observar y diferenciar bacterias que son causante de producir
enfermedades.

IV.

CONCLUSIONES.

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se
presentan morfolgicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar
tincin de Gram en estas para identificar su grupo taxonmico, las
Gram positivas se tien de color violeta esto se debe a que gracias a que
contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de cidos
teicicos que permiten fijar y retener rpidamente el colorante inicial
y adems son resistentes a la decoloracin, mientras que las Gram
negativas se tien de color rosado las cuales poseen una pared delgada con
menos cantidad de peptidoglicano y lpidos, la cual requiere de un colorante
de contra tincin como la safranina o la fucsina.
Las colonias de bacterias a las que se les realiz tincin de Gram se
tomaron de una muestra de suelo, mesas, trpode, autoclave y mano, lo cual
explica
la
presencia
de
estas
bacterias,
debido
a
que
predominan las bacterias Gram negativas. Sin
embargo
tambin
se
encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor proporcin que las Gra
m negativas, lo cual tambin explica la presencia de estas bacterias en las
diferentes
muestras. De
acuerdo
a
esto
Fue
posible
observar bacterias Gram negativas con forma de cocos y bacilo (con forma
de barra o vara) y Gram positivas como Staphylococcus sp.

V.

BIBLIOGRAFIA
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedr
aMicro/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf
http://www.academia.edu/6245506/TINCI
%C3%93N_DE_GRAM_Y_OBSERVACI%C3%93N_MICROSC
%C3%93PICA