Caractersticas

de
crecimiento
acidophilus usando RSM y ANN

modelado

Ganga
Sahay
Meena I,* ; Nitin
Kumar I ; Gautam
I
II
Banerjee ; Pankaj Kumar Meena ; Vijesh Yadav II

Chandra

deLactobacillus
Majumdar I ;Rintu

Biotecnologa Microbiana y Laboratorio de Procesamiento de Downstream;Departamento de

Ingeniera Agrcola y Alimentaria; Instituto Tecnolgico de la India; Kharagpur II Por Laboratorio de
Productos; Dairy Dairy Research Institute Nacional de la Divisin de Tecnologa; Karnal - Haryana
RESUMEN

Las condiciones de cultivo a saber. contenido de carbono y de nitrgeno adicional, el tamao del
inculo, la edad, la temperatura y el pH de Lactobacillus acidophilus se optimizaron usando la
metodologa de superficie de respuesta (RSM) y de la red neuronal artificial (ANN). Modelos de
crecimiento cinticos se ajustaron a los cultivos de un Box-Behnken Diseo (BBD) experimentos de
diseo para diferentes variables. Este concepto de la combinacin de la optimizacin y modelado
presenta diferentes condiciones ptimas para el crecimiento de L. acidophilus de su estudio de
optimizacin inicial. A travs de estas herramientas estadsticas, el rendimiento del producto (masa
celular) de L. acidophilus se increment. Los coeficientes de regresin (R 2 ) de ambos las
herramientas estadsticas predijeron que ANN era mejor que la de RSM y la ecuacin de regresin
fue resuelto con la ayuda de algoritmos genticos (GA). El porcentaje normalizado error cuadrtico
medio obtenido a partir de los modelos de RNA y RSM fueron 0,06 y 0,2%, respectivamente. Los
resultados demostraron una mayor precisin de la prediccin de ANN en comparacin con RSM.
Palabras clave: metodologa de superficie de respuesta (RSM), redes neuronales artificiales
(ANN), algoritmos genticos (GA), Box-Behnken besign (BBD)

INTRODUCCIN
Lactobacillus son los miembros ms prominentes de la clase pltora de especies bacterianas con
propiedades probiticas. La popularidad de estas bacterias del grupo se basa en los milenios de su
uso en los alimentos y piensos que se utilizan en las bebidas lcteas y yogures probiticos, ya cien
aos (Sanders 1999). Mayora de las especies bacterianas de esta clase se clasifican formalmente
como GRAS (generalmente reconocidos como seguros) organismos. Actualmente, los
consumidores estn muy preocupados acerca de los atributos nutricionales y funcionales de los
alimentos en todo el mundo. Una serie de beneficios para la salud tales como efectos antimutagnicas, propiedades anti-cancergenas, la mejora en el metabolismo de la lactosa, la
reduccin del colesterol srico y la estimulacin del sistema inmunolgico han sido reclamados por
los alimentos probiticos, que caen en la categora de alimentos funcionales (Shah 2007). En
consecuencia, el mercado mundial de alimentos funcionales est prosperando con estimaciones
recientes indican hasta una cuota anual de $ 50 mil millones. El mercado probitico mundial se
estima en $ 15 mil millones, que inclua el 10% de las bacterias lcticas beben mercado. Hoy en
da, este mercado est creciendo a un ritmo del 5 al 30%, dependiendo del pas y del tipo de
producto. Aunque el mercado mundial de los probiticos est creciendo rpidamente, y sin
embargo, en la India, acaba de comenzar a gestar para hacer su primer movimiento con
compaas lderes como Amul, Nestle y Madre de Lechera (Bhadoria y Mahapatra 2011). Los
probiticos tienen un fuerte efecto estimulador tanto para el normal desarrollo de la microbiota y
maduracin del tejido linfoide asociado a intestino (Schezenmeir y De Vrese 2001). Las bacterias
probiticas tales como Lactobacillus y Bifidobacterium sp pueden jugar un papel importante en la
promocin de la salud humana en el tracto gastrointestinal (Mitsuoka, 1990). Contribuyen
activamente en la digestin, la estimulacin inmune y la inhibicin de patgenos tales

como Bacteroides, Escherichia, Clostriduim yProteus, que son potencialmente dainos que se
encuentran bacterias en el tracto gastrointestinal (Ziemer y Gibson 1998).
El principal mecanismo de accin de los probiticos se conoce como la colonizacin competitiva, o
la supresin competitiva. Se describe mejor como la proliferacin de bacterias probiticas en el
intestino humano, dejando poco espacio para el crecimiento de cualquier patgeno. Adems,
segregan subproductos tales como cido lctico y cido actico, que reducen el pH, creando as un
ambiente hostil para el crecimiento de microorganismo patgeno. Los cidos secretados tambin
aumentan el peristaltismo, que tambin ayudan a acelerar los agentes patgenos aunque los
intestinos (Ballongue 1992 y Biavati et al. 2000).
Para desarrollar el modelo de crecimiento de bacterias probiticas por el mtodo tradicional, es
decir, una variable a-la-vez (OVAT) lleva mucho tiempo y deja de lado las interacciones de las
diferentes variables que tambin pueden afectar el rendimiento. Optimizacin de procesos a travs
de mtodo estadstico es una tcnica en la que los cambios o ajustes se realizan en un proceso
para obtener mejores resultados (Myers y Montgomery, 2002).Existen varias tcnicas para la
optimizacin de procesos, tales como la metodologa de superficie de respuesta (RSM), Redes
Neuronales Artificiales (RNA), Algoritmos Genticos (GA), etc En estas aplicaciones de ingeniera,
una respuesta de inters suele ser influenciada por diversas variables y el objetivo de las
aplicaciones de la ingeniera es encontrar las variables que pueden optimizar la respuesta. RSM es
una herramienta para el estudio de los parmetros de proceso ptimos que producen un mximo o
el valor mnimo de la respuesta y representa los efectos directos e interactivas de los parmetros
del proceso a travs de dos y tres dimensiones parcelas (Gangadharan et al. 2008). ANN es
modelos computacionales del sistema nervioso. Organismos naturales, sin embargo, no poseen
slo el sistema nervioso, sino tambin la informacin gentica almacenada en el ncleo de sus
clulas (genotipo). El sistema nervioso es parte del fenotipo, que se deriva de este genotipo a
travs de un proceso, llamado desarrollo (Rajasekaran y Vijaylakshmi 2004). Utilizando el mtodo
de redes neuronales (NN), la relacin entre un conjunto de variables independientes X y las
variables dependientes Y se puede conseguir. De los pares dados de entrada X y salida Y. datos,
red neuronal aprende directamente y desarrolla una relacin entre ellos, pero no da ninguna
ecuacin matemtica que relaciona las variables. Despus de que el aprendizaje, esta red es
capaz de predecir la salida correcta a partir de un conjunto de datos de entrada que no se ha
utilizado previamente durante el aprendizaje. GA es una herramienta mediante la cual los
problemas de optimizacin se pueden resolver con precisin con un uso limitado de tiempo en la
computadora (Das 2005). Optimizacin de varias cepas bacterianas en matraces Erlenmeyer
usando diferentes herramientas de optimizacin se han reportado por otros autores (Nagarjun et al
2005;.. Kumari et al 2009; Negi y Banergee 2009;. Lima et al 2009; Usmiati y Marwati 2009; Coelho
et al. 2011).
En este estudio se ha desarrollado el modelo emprico para aumentar el crecimiento de las clulas
de L.acidophilus mediante la optimizacin de los parmetros de crecimiento tales como la
temperatura, el pH, el volumen de inculo, perodo de incubacin y el efecto adicional de diferentes
fuentes de carbono y nitrgeno utilizando el RSM, Ann y GA.

MATERIAL Y MTODOS
Productos Qumicos
Todos los disolventes y reactivos utilizados en el presente estudio se adquirieron de Merck,
Alemania.
Condiciones organismo y el crecimiento

Cultivo puro de L. acidophilus NCDC 14 se obtuvo en estado seco por congelacin de Coleccin
Nacional de Cultivos lcteos (CNDC), Lcteos Instituto Nacional de Investigacin, Karnal, Haryana,
India. El cultivo se mantuvo a 4 C y sub-cultivadas en las inclinaciones de MRS (De Man Rogosa
y Sharpe) medio de crecimiento dos veces en un mes. El mtodo utilizado para la extraccin de
activacin de cultivo y pellets microbiana fue misma que se informa por Sharma et al. (2013). El
crecimiento de L. acidophilus se llev a cabo en 250 ml de matraces Erlenmeyer que contena 50
ml de medio de agar MRS cada uno (pH 7,0) y se mantuvo a 37 C. La biomasa celular se
determin midiendo la densidad ptica (DO) del medio a 600 nm. Antes de medir la OD, el lquido
que contiene clulas se centrifugaron y se lav con agua destilada estril para dos veces para
eliminar los componentes del medio que se adhieren.
Diseo Experimental
Seleccin de los parmetros iniciales
Para la seleccin de los parmetros iniciales, se utiliz "una variable a un mtodo de tiempo '. Las
diferentes variables a saber. temperatura, el pH, el volumen de inculo, se seleccionaron edad de
inculo y fuentes de carbono y nitrgeno adicionales para el crecimiento de L. acidophilus .
El desarrollo de modelos empricos
Con el fin de encontrar el efecto de diferentes parmetros de crecimiento en el valor predicho de
crecimiento bacteriano Y p se obtuvo mediante la realizacin de los experimentos con diferentes
combinaciones de variables independientes (parmetros de crecimiento), que se obtuvo a partir de
un diseo experimental estndar. Durante los experimentos, se midi la respuesta, o valores de
variables dependientes obtenidos a partir de cada una de las combinaciones de variables
independientes. Se desarroll una relacin matemtica entre las variables independientes y
dependientes. Utilizando este modelo, el valor predicho de respuesta eran averiguar dentro del
dominio de valores de las variables independientes limitante.
Para los diferentes parmetros de crecimiento que se desea desarrollar un modelo polinomial entre
el Lactobacilluscrecimiento y los parmetros de crecimiento para desarrollar la siguiente relacin
entre los valores codificados x 1, x 2 , x 3 , x 4 , x 5 y x 6 de las variables independientes y variable
dependiente Y p , como se muestra a continuacin.
Yp=b o +b 1 x 1 +b 2 x 2 +b 3 x 3 +b 4 x 4 +b 5 x 5 +b 6 x 6 +b 7 x 1 2 +b 8 x 2 2 +b 9 x 3 2 +b 10 x 4 2 +b 11 x 5 2+
b 12 x 6 2 +b 13 x 1 x 2 +b 14 x 1 x 3 +bx 1 x 4
+b 16 x 1 x 5 +b 17 x 1 x 6 +b 18 x 2 x 3 +b 19 x 2 x 4 +b 20 x 2 x 5 +b 21 x 2 x 6 +b 22 x 3 x 4 +b 23 x 3 x 5 +b 24 x3
x 6 +b 25 x 4 x 5
+b 26 x 4 x 6 +b 27 x 5 x 6 (Eq. 1)
Donde b o , b 1 , b 2 ......... etc son las constantes de regresin.
Modelado experimental
Box-Behnken Diseo
Proceso de optimizacin que implica el mtodo OVAT slo se utiliz para la seleccin de los
parmetros iniciales, mientras que RSM se adopt para optimizar las condiciones de crecimiento
de L. acidophilus por diseo de Box-Behnken. MINITAB (versin 6.5) de software se utiliza para el
diseo experimental.
Optimizacin

Modelado de la red neuronal artificial

En la presente investigacin, se utiliz una red neuronal de propagacin hacia delante de nuevo de
alimentacin para evaluar su capacidad en la celda de prediccin de rendimiento msico
de L. acidophilus . En este proceso, ANN calcula el error entre la (predicha) deseado y la respuesta
real (experimental). El nmero de neuronas en la capa de entrada, capa oculta y la capa de salida
de esta red neuronal se mantuvieron como 6, 11 y 1, respectivamente ( . Fig. 1 ). Esta ANN fue
entrenado primero con los datos reportados de B. bifidum (Meena et al. 2011). Despus del
entrenamiento, que era capaz de predecir el rendimiento de la masa de clulas
de L.acidophilus con precisin a travs de la minimizacin de error que se compara con el valor
predicho de rendimiento de la masa de clulas obtenida a partir de RSM.

Figura 1 - Estructura bsica de un feed-forward back propagacin de redes neuronales (Meena et

al. 2011).
Algoritmos Genticos
Con el fin de maximizar el rendimiento de la masa de clulas de L. acidophilus , GA se aplic al
modelo basado ANN desarrollado ( . Fig. 2 ) mediante el control anteriormente mencionado seis
parmetros de crecimiento. Se hizo pasar por la minimizacin de problema asociado con los
estudios de optimizacin. Optimizacin gentica se continu hasta que el mximo rendimiento de
masa celular obtenida.
Software usado
Para la correcta ejecucin de ANN y GA, MATLAB 7.0 y 6.5 MINITAB se utiliz para desarrollar el
modelo emprico.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Seleccin de los parmetros iniciales
Diferentes variables de crecimiento de L. acidophilus fueron seleccionados por el mtodo de OVAT
y los resultados mostraron en la Figura 3 (a - f) . Todos estos parmetros, su variacin y los valores
ptimos se dan en la Tabla 1.

Figura 2 - Diagrama de flujo de los algoritmos genticos simples (Meena et al 2011.).

Figura 3 - Seleccin de los diferentes parmetros de crecimiento Lactobacillus acidophilus (A. Seleccin de la temperatura
inicial para el crecimiento de L. acidophilus, B. Seleccin de pH inicial de L. acidophilus. crecimiento, C. Seleccin de
volumen inoculo inicial de L. acidophilus 255 crecimiento, D. Seleccin de perodo de incubacin inicial para el crecimiento

de L. acidophilus, E. Seleccin de adecuada fuente de carbono para el crecimiento de L. acidophilus y F. Seleccin de la

fuente de nitrgeno adecuada para crecimiento).

Tabla 1 - Valores de los diferentes parmetros para la optimizacin de un solo parmetro.

El desarrollo de modelos empricos

A partir de la seleccin de parmetros inicial, los valores mximo y mnimo de seis parmetros
independientes paraL. acidophilus se fijaron como se muestra en la Tabla 2 . Era uno de los
objetivos para desarrollar el modelo entre los valores codificados x 1 , x 2 , x 3 , x 4 , x 5 y x 6 de las
variables independientes y la variable dependiente Yp . Por esta , los experimentos se llevaron a
cabo de acuerdo al diseo de Box-Behnken. Todas estas combinaciones se dan en la Tabla 3 con
su correspondiente valor experimental Y de correo para el crecimiento deL. acidophilus .
Tabla 2 - Limitar el valor de las variables independientes.

Tabla 3 - Diseo experimental de Lactobacillus acidophilus con valor experimental Ye.

RSM se usa principalmente para la optimizacin de las condiciones de crecimiento, el parmetro

de reaccin, o la ampliacin de la L. acidophilus condiciones de crecimiento (Sen y Babu
2005). Los datos experimentales se ajustaron a la ecuacin cuadrtica completa y la matriz de
diseo y la aptitud de cada trmino se analiz por medio de ANOVA (Kumari et al. 2008). Figura
4 muestra los coeficientes del modelo correspondientes ( R 2 0,796) junto con la regresin
coeficiente de determinacin, que era una medida de lo bien que se podra hacer el modelo de
regresin para ajustar los datos en bruto.

Figura 4 - Determinacin del coeficiente de la ecuacin de regresin R2 para el mtodo de Lactobacillus

acidophilus EMD.

Un mapa de caractersticas de la red de auto-organizacin se utiliz para predecir los parmetros

de condiciones de crecimiento. Diferentes factores, a saber. temperatura, el pH, el volumen de
inculo, inculos edad y fuentes de carbono y nitrgeno adicionales se utilizaron como cada unidad
de capa de entrada. La capa de salida se compone de una variable de respuesta, el crecimiento
de L. acidophilus . Se utiliz un conjunto de factores para la formacin y se introduce en el
ordenador. Varias iteraciones se llevaron a cabo con diferentes nmeros de neuronas de capa
oculta con el fin de determinar la estructura ptima ANN. El nmero ptimo de neuronas en la capa
oculta se determina iterativamente cambiando el nmero de neuronas. Comenz con dos neuronas
y se aument hasta seis. El valor mnimo MSE y una buena prediccin de los resultados del
entrenamiento y conjuntos de validacin se obtuvieron con cuatro neuronas en la capa oculta

(Dutta et al. 2004). El R 2 valor entre las respuestas reales y estimados se determin como 0.927 ( .
Fig. 5 ). En el modelado ANN, las repeticiones en el punto de centro no mejor la capacidad de
prediccin de la red debido a las entradas similares.

Figura 5 - Determinacin del coeficiente de la ecuacin de regresin R2 para Lactobacillus mtodo acidophilus
ANN.

Usando MATLAB 7.0, las constantes de la ecuacin de regresin y el valor predicho de la variable
dependiente (OD) fueron averiguarlo. El modelo obtenido para L. acidophilus fue como se indica a
continuacin.
Y p = 0,2838 a 0,2319 x 1 + 0,2335 x 2 + 0.0468x 3 + 0.738x 4 + 0.0215x 5 + 0.133x 6 - 0.082x 1 2 0.0627x 2 2+ 0.0575x 3 2 + 0.3429x 4 2 + 0.0327 x 5 2 + 0.0375x 6 2 - 0.1088x 1 x 2 - 0.1655x 1 x 3 +
0.0244x 1 x 4 + 0.0359x 1 x 5 - 0.1597x 1 x 6 - 0.0689x 2 x 3 - 0.0154x 2 x 4 - 0.1625 x 2 x 5 - 0.0487
x 2 x 6 + 0,603 x 3 x 4 - 0,1381 x 3 x 5 -0.0592x 3 x 6 - 0.0873x 4 x 5 - 0.1972x 4 x 6 - 0.083x 5 x 6 (Ec. .
2)
El valor predicho de valor experimental variable y correspondiente independiente
para L. acidophilus se muestra en la Tabla 4 . Los algoritmos genticos se han aplicado sobre los
datos obtenidos de red neuronal utilizando MATLAB7.0.
Tabla 4 - Valores experimentales y predichos para Lactobacillus acidophilus usando RSM y ANN.

Tabla 5 mostr el valor ptimo, o una combinacin de diferentes parmetros de proceso en el que
el crecimiento bacteriano se mide por la densidad ptica (DO) fue mxima para L. acidophilus .
Tabla 5 - valor ptimo de los parmetros del proceso de Lactobacillus acidophilus.

CONCLUSIN
En el presente estudio, se utilizaron metodologas de RSM y RNA para predecir el modelo de
crecimiento de L.acidophilus y optimizado los parmetros de crecimiento. Ambos modelos
proporcionan predicciones similares de calidad para las variables independientes por encima de las
condiciones de crecimiento de L. acidophilus con ANN mostrando una mayor precisin en la
estimacin. Coeficiente de regresin ( R 2 ) de la ANN y RSM reflexion que ANN era mejor que
RSM. RSM fue til para obtener informacin visin (por ejemplo, las interacciones entre los
diferentes componentes) del sistema directamente, pero ANN tambin fue igualmente til en el
anlisis de sensibilidad. ANN mostr mejor tcnica de modelado para el grupo que muestra la
relacin no lineal sobre RSM datos. Por lo tanto, ANN podra ser una herramienta muy potente y
flexible muy adecuado para el desarrollo del modelo de crecimiento emprico debido a una accin
correctiva implcita que surge de la metodologa de la formacin y el procedimiento de estimacin
asociado. Presentar los resultados mostraron que el mayor rendimiento de la masa de clulas
de L. acidophilus se observ a 37,7 C, pH de 6,08, el volumen de inculo y la edad de 0,79 ml y
13,04 h, respectivamente, el contenido de carbono 42,62% (w / v) y el contenido de nitrgeno
(39,92% (w / v). Esta combinacin de variables independientes podra ser de buena importancia al
motor de arranque industrias productoras de cultura con el fin de aumentar la escala de la
produccin de L. acidophilus en escala comercial ms econmica debido a la alta produccin de
masa celular.