Ao de la Diversificacin Productiva y del Fortalecimiento de la Educacin

Facultad de Ingeniera Industrial

Escuela Profesional de Ingeniera Agroindustrial e
Industrias Alimentarias
CURSO

: TECNOLOGIA DE LA FERMENTACION
ALIMENTARIA

TEMA

: CRECIMIENTO MICROBIANO

DOCENTE

: ING. WILLIAN CHUNGA TRELLES

INTEGRANTE: BERMEO GUERRERO MARLY

DOMINGUEZ CHOZO JUNIOR
QUINDE GUTIRREZ LISET
RODRIGUEZ ARCELA ALICIA

Piura, Mayo del 2015

PRACTICA N 02
CRECIMIENTO MICROBIANO
I.

INTRODUCCION:

La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms

utilizadas por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es
menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, as como, la forma
de cuantificacin de los mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y
desventajas de los diferentes mtodos, y sobre todo el monto econmico de cada
uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una
informacin general acerca de los diferentes mecanismos de reproduccin
bacteriana, as como de dar una idea acerca de la utilizacin de los mismos, sus
caractersticas, especificaciones, y un anlisis de las ventajas y desventajas de
cada uno de ellos.
Podemos

definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el

incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo

cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la
multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se
traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares
que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la
poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del
genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en
aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano
podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y escala
poblacional.
II.

OBJETIVO :

Determinar el nmero de levaduras viables en la preparacin de inculos

para bebidas alcohlicas y durante el proceso de fermentacin.

III.

FUNDAMENTO TEORICO

II.1.- METODOS DIRECTOS

Los mtodos directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de
clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas
microscpicas y de contadores de partculas).
a)

Cuantificacin del nmero de clulas

Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el

alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos
por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe
considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del
alimento.
Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio
limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos
fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesofilos, psicrfilos) los
microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En
general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes
(anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados
al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales.

b)

Contaje de clulas viables:

Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente

disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir
de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con
colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el
llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en
las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.
Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza
al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o
medios mnimos sin fuente de carbono).
Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley, Petroff-Hausser y la de
Neubauer. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de
inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Fig. Cmara de recuento de Petroff-Hausser

Fig. Cmara de recuento de Neubauer

Limitaciones:
Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras.
No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean
observadas al microscopio.
No distinguen clulas vivas de muertas.
c) Contaje en placa
En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se
suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable
cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar
descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas
de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio
slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus
del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en
cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil
deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original.
Precauciones:
o Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar
5 placas de cada dilucin.
o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin
o Contar las placas donde existan entre 30 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un
individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman
agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables
reales sino a unidades formadoras de colonias (UFC). Por lo tanto, una UFC
corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con
agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el nmero real de

individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que

estaban juntos al ser sembrados en placa.

II.2.- METODOS INDIRECTOS

Los mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo
que nos permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de
microorganismos.
a) Determinacin del peso hmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la
separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para
grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente
queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa.
La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de
clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular
que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular.
Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda
retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se
utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden

ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes

bacterianas.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya
cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.
b) Determinacin del peso seco
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran
en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C
hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un
gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes
voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el
pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
El aumento de volumen con la humedad tiene un lmite. Este va creciendo hasta
que la clula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de
saturacin de la pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las
especies en clculos tcnicos. A partir de ste valor el volumen permanece
constante, ya que el agua que penetra en el volumen de las clulas no produce
hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 % es un valor para
utilizarlo prcticamente, si bien cada especie tiene su punto de saturacin de la
pared celular.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes
errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales
de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10 9 bacterias.
IV.

MATERIALES:
-

2 litros de mosto

Cmara de Neubaue

V.

Micro Pipeta volumtrica

cubre objetos
PROCEDIMIENTO:

Contaje de clulas viables

Homogenizar el mosto
En un vaso precipitado tomar 10-20ml de jugo del reactor en
funcionamiento.
Aspirar el jugo con el micro pipeta par hasta la marca 0.5 y limpiar
cualquier exceso con algodn o papel filtro.
Poner en contacto una gota, en el borde del cubreobjetos que se ha
colocado sobre la cmara de manera que el lquido difunda por debajo,
llenando la cmara.
Colocar la cmara bajo el microscopio y localizar el campo con
pequeo aumento, pasando despus a un mayor aumento (40X).
Contar las clulas en los 4 cuadrados de 1mm2 de las esquinas y luego
sumarlos.
Calcular el nmero promedio de levaduras.
VI.

RESULTADOS

Para la observacin microscpica se procedi a contar todas las clulas en un

cuadrado, en las cual se pudo observar 100 clulas hallando as la media de
varios cuadrados, cada rejilla tiene 25 cuadrados grandes y un rea total de
12 y un volumen de 0.02 3 . Para calcular el nmero por mililitro de
muestra:
100 clulas x 25 cuadrados (numero por 2 ) = 2500 clulas/2
2500 x 50 (numero por 3 ) = 125 000 clulas/3

125 000 x 1000 (numero por 3 (ml)) = 1,25 x 108 /

Cuando la muestra no est teida se requiere un microscopio de contraste de
fases.
VII.

CONCLUSION
Se pudo conocer el nmero de clulas que existen en una muestra
de mosto de uva mediante el mtodo de reencuentro de clulas
viables usando la cmara de Neubaue

VIII.

RECOMENDACIONES
El recuento debe hacerse tan pronto como sea posible despus de
realizada la dilucin y si esto no es posible, debe agitarse
nuevamente antes del recuento ya que las levaduras tienden a
decantar dentro de la pipeta.
La cmara de Neubaue debe estar completamente limpia, seca y
sin ninguna alteracin en la estructura que pueda afectar nuestros
resultados

IX.

BIBLIOGRAFIA
http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm
http://www.uib.es/depart/dba/microcore/