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CAPTULO 2.3.6.

TUBERCULOSIS AVIAR

RESUMEN
La tuberculosis aviar es una enfermedad importante de las aves que afecta a aves de compaa,
aves exticas cautivas, aves silvestres y domsticas. La enfermedad est causada a menudo por
Mycobacterium avium (serotipos 1, 2, 3) y M. genavense. La causa ms importante de la
enfermedad de las aves de corral es M. avium.
Los signos clnicos de la enfermedad varan dependiendo de los rganos implicados. La
presentacin clsica se caracteriza por un deterioro y debilitamiento crnicos y progresivos. Es
comn la diarrea. Algunas aves pueden mostrar signos respiratorios y ocasionalmente puede
ocurrir la muerte sbita. Algunas aves pueden desarrollar lesiones oculares granulomatosas.
Mycobacterium tuberculosis es menos comn como causante de la infeccin en las aves,
generalmente como resultado de la transmisin por propietarios de aves domsticas y los signos
clnicos difieren de los causados por las especies ms comunes de micobacterias.
Mycobacterium avium complex y M. intracellulare pueden afectar tambin a una amplia variedad
de diferentes especies animales tales como cerdos, ganado bovino, ciervos, ovejas, cabras,
caballos, gatos, perros y especies exticas. Tambin se ha descrito el bacilo M. genavense en un
perro y en un gato inmunocomprometido. La aparicin de la enfermedad en las aves es
generalmente ms rpida con M. genavense que con M. avium.
En los humanos, M. avium y M. genavense son capaces de inducir una enfermedad progresiva que
es resistente al tratamiento principalmente en hospedadores inmunocomprometidos. Todas las
manipulaciones que impliquen el manejo de cultivos vivos abiertos, o de material de aves
infectadas, deben realizarse con un nivel adecuado de contencin del bioriesgo.
El diagnstico de la tuberculosis en aves depende de la demostracin de Mycobacterium spp. en
aves muertas o de la deteccin de una respuesta inmune, celular o humoral en aves vivas.
Identificacin del agente: Para establecer un diagnstico positivo es suficiente la observacin de
sntomas clnicos en la poblacin, la presencia de lesiones tpicas de la tuberculosis en las
necropsias de las aves o la demostracin de los bacilos cido-alcohol resistentes en los frotis o
secciones de los rganos de los animales afectados. Si las aves presentan sntomas o lesiones
tpicas pero no se detectan bacilos cido-alcohol resistentes, debe intentarse el cultivo del
microorganismo. Cualquier microorganismo cido-alcohol resistente aislado debe identificarse
mediante criterios bioqumicos, por pruebas basadas en cido nucleico, por mtodos serolgicos o
cromatogrficos (por ejemplo, cromatografa lquida de alto rendimiento [HPLC]).
Prueba de la tuberculina y las pruebas serolgicas: Normalmente estas pruebas se emplean
para determinar la prevalencia de la enfermedad en una poblacin o para detectar a las aves
infectadas. Cuando se utilizan para detectar la presencia de tuberculosis en una poblacin, las
pruebas deben confirmarse en la necropsia de cualquier ave que presente reacciones positivas.
En las aves de corral, la prueba preferida es la prueba de la tuberculina en la barbilla. Esta prueba
es menos til en otras especies de aves. Una prueba mejor, especialmente para aves acuticas,
es la prueba de aglutinacin de sangre ntegra con antgeno coloreado (Rozanska), que resulta
ms fiable y tiene la ventaja de dar resultados en unos cuantos minutos, mientras an se inmoviliza
al ave. Estas pruebas no son fiables en aves enjauladas.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: No existen vacunas para la
utilizacin en aves. Se dispone de una preparacin de antgeno coloreado con un 1% de verde
malaquita para la prueba de aglutinacin de sangre ntegra. En la prueba de la tuberculina en las

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aves domsticas, la preparacin estndar es un derivado proteico purificado de la tuberculina


aviar.

A. INTRODUCCIN
Varias especies de micobacterias pueden estar implicadas en la etiologa de la tuberculosis aviar. La enfermedad
se produce muy a menudo por la infeccin con el bacilo Mycobacterium avium complex (serotipos 1, 2, 3) y
M. genavense (25). Otras especies, tales como M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. fortuitum, M. tuberculosis y
M. bovis, son los causantes menos frecuentes de la tuberculosis aviar (25). Mycobacterium avium complex y
M. intracellulare son capaces de infectar un espectro muy amplio de diferentes especies de animales tales como
cerdos, ganado bovino, ciervos, ovejas, cabras, caballos, gatos, perros y especies exticas (26, 27).
Mycobacterium avium complex se compone de 3 subespecies: M. avium subsp. avium, M. avium subsp.
sylvaticum y M.avium subsp. paratuberculosis (28). Esta ltima es el agente etiolgico de la enfermedad de
Johne, o paratuberculosis, en rumiantes y otras especies de mamferos (vase el captulo 2.1.11.
Paratuberculosis). Aunque se ha informado sobre infecciones experimentales con M. a. paratuberculosis en aves
de corral (11), no existen pruebas de que este microorganismo est implicado en la etiologa de la tuberculosis
aviar.
La mayor parte de los aislamientos de M.a. avium a partir de aves tienen la secuencia repetitiva IS901 en su
genoma y producen un patrn de 3 bandas caracterstico en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de
restriccin (RFLP) de la IS1245 (20). Existen pruebas convincentes de que la presencia de IS901 se correlaciona
con la patogenicidad en aves (6, 15). Esta secuencia repetitiva tambin est presente en M.a. sylyaticum, que es
capaz de producir la tuberculosis en las aves. La IS901 slo se ha detectado en cepas de M. avium con los
serotipos 1, 2 y 3 (15, 20), que son aparentemente ms patgenos para las aves que otros serotipos (25). En
base a las diferencias genticas y fenotpicas, recientemente se ha propuesto dividir M. a. avium en dos
subespecies: M. a. hominissuis para los aislamientos en humanos y en porcinos y M. a. avium para los
aislamientos en aves (13). Los aislamientos designados como M. a. hominissuis tenan patrones polimrficos con
mltiples bandas en la IS1245 y eran capaces de crecer a 24 y 45C. Comparndolos, los aislamientos aviares
designados como M.a. avium tenan el patrn conservado de 3 bandas en el RFLP de la IS1245 y fueron
incapaces de crecer a 24 y 45C (13). Es importante tener en cuenta que las caractersticas tpicas de los
aislamientos en las aves, el patrn de mltiples bandas en la IS1245 y la presencia de la IS901, se han
encontrado tambin en aislamientos de M. a. avium en crvidos y bovinos (14).
La tuberculosis aviar es muy frecuente en pollos y en aves salvajes criadas en cautividad. Los pavos son muy
susceptibles, pero los patos y los gansos son comparativamente resistentes. La dispersin de la tuberculosis se
favorece con la prctica de permitir a las aves estar sueltas en las granjas y de mantener las reproductoras
durante varios aos. La principal fuente de infeccin (25) son los individuos infectados y el medio ambiente
contaminado (el agua y la tierra). Mycobacteria puede sobrevivir durante varios meses en el medio ambiente
(25).
En muchos casos, las aves infectadas no muestran sntomas clnicos pero eventualmente se vuelven letrgicas y
esculidas. Muchas aves afectadas muestran diarrea y tanto la cresta como las barbillas se vuelven flcidas y
plidas. Las aves afectadas tienen generalmente ms de un ao. Algunas muestran signos respiratorios y
pueden morir sbitamente. La disnea es menos comn, y se han descrito lesiones oculares granulomatosas (16)
y lesiones de la piel. Bajo condiciones de produccin intensiva pueden ocurrir muertes sbitas asociadas con
frecuencia a lesiones hepticas graves; tales lesiones se observan con facilidad en un examen post mrtem (25).
En las aves, las lesiones primarias de tuberculosis casi siempre se presentan en el tracto intestinal. Toman la
forma de lceras profundas, llenas de material caseoso que contiene muchos microorganismos que pasan al
lumen y aparecen en las heces. Antes de abrir el tracto intestinal, las reas ulceradas se asemejan a masas
tumorales adheridas a la pared intestinal, pero cuando se abre el intestino se hace evidente su verdadera
naturaleza. Frecuentemente las lesiones caseosas tpicas se encuentran en el hgado y en el bazo, y estos
rganos estn normalmente inflamados debido a la formacin de un nuevo tejido tuberculoso. Incluso en casos
avanzados, los pulmones y otros tejidos suelen estar libres de lesiones.
En la mayora de las especies de aves afectadas, se encuentran lesiones similares a las de la tuberculosis
principalmente en el tracto intestinal, en el hgado y en el bazo. Son menos comunes las lesiones en otros
rganos. Son excepcionales los casos en las palomas, las aves acuticas y algunos pinzones, en los que la
enfermedad empieza sobre todo en el tracto respiratorio.
Es importante tener en cuenta que M. avium, M. intracellulare y M. genavense son capaces de causar una
enfermedad progresiva en el hombre que es resistente al tratamiento, especialmente en individuos
inmunocomprometidos (25). Todas las operaciones que impliquen el manejo de cultivos vivos abiertos de

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M. avium o de material de aves infectadas, deben realizarse con un nivel adecuado de contencin del bioriesgo
(vase el captulo 1.1.2 Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en
las instalaciones de los animales.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.

Identificacin del agente

Para establecer un diagnstico, normalmente es suficiente que se presente en la poblacin aviar un historial
caracterstico de tuberculosis y que en las aves aparezcan las lesiones tpicas post mrtem, as como que se
detecten bacilos cido-alcohol resistentes en los frotis o los cortes de rganos afectados teidos por el mtodo
de ZiehlNeelsen. En ocasiones se puede presentar algn caso en el que los rganos afectados, en particular el
hgado, tengan aspecto de cuero marroqu con pequeas manchas grises o amarillentas, que es el resultado de
la gran dosis infectante que ocasiona la enfermedad aguda. En tales casos pueden no detectarse los bacilos
cido-alcohol resistentes, pero un anlisis cuidadoso revelar la existencia de cmulos paralelos de bacilos
refrctiles de color pardo. En la tincin de ZiehlNeelsen, una prolongacin a 10 minutos de la fase de tincin con
fucsina fenicada, revelar que aquellos son de hecho, bacilos cido-alcohol resistentes que muestran una
elevada resistencia a la penetracin del colorante. Recientemente, se han utilizado las tcnicas con sondas de
ADN y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificacin del agente. Tradicionalmente,
M. avium se distingue de otros microorganismos no cromgenos de crecimiento lento por su capacidad para
crecer a 42C (M. a. avium) y por las pruebas bioqumicas, como las de la hidrlisis del Tween, la
pirazinamidasa, el crecimiento en medios con hidrazida del cido tiofn-2-carboxlico (TCH) y la reduccin del
telurito. El bacilo Mycobacterium genavense es particularmente difcil de cultivar y requiere condiciones
especiales para su crecimiento e identificacin.

Cultivo

Si existe un historial caracterstico en la poblacin y se encuentran lesiones llamativas en las necropsias, pero no se
observan bacilos cido-alcohol resistentes en los frotis o en los cortes, debe intentarse el aislamiento del
microorganismo causal a partir del material de las necropsias. Los mejores rganos son el hgado o el bazo, pero si
las canales estn descompuestas, la mdula sea puede resultar ms adecuada por estar menos contaminada. Al
igual que con el cultivo de M. Boris, se necesitan muestras sin esterilizar para ser procesadas con detergentes,
lcalis o cidos para eliminar los microorganismos de crecimiento rpido antes del cultivo (vase el captulo 2.4.7
Tuberculosis bovina). Mycobacterium avium crece bien en medios del tipo de LowensteinJensen, Herrold,
Middlebrook 7H10 y 7H11 o Coletsos, con adicin de piruvato sdico al 1%. A veces puede ser necesario aadir
mycobactina, como se usa para aislar M. paratuberculosis y M. silvaticum. El crecimiento puede limitarse al borde
del agua de condensacin. Los cultivos deben incubarse durante al menos 8 semanas. Tpicamente, M. avium
produce colonias lisas en 2 o 4 semanas, aunque tambin ocurren variantes rugosas. Se pueden conseguir
tiempos de incubacin ms cortos utilizando el sistema BACTEC de cultivo lquido.
Para el bacilo M. genavense se recomienda utilizar el sistema BACTEC sin aditivos pero con pH 6,0 y una
tensin de oxgeno reducida (18, 19). El mejor medio slido es el medio Middlebrook 7H11 acidificado hasta pH 6
y suplementado con sangre y carbn (17).
La tipificacin de las micobacterias a nivel de especie y subespecie requiere un laboratorio especializado. Las
pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de especies son lentas y no distinguen entre M. avium
y M. intracellulare. Por ello, se suele clasificar a un variado grupo de bacterias que incluye ambas especies bajo
la denominacin de complejo M. avium (MAC). La seroaglutinacin, que se basa en la especificidad de los
azcares de los glicopeptidolpidos superficiales, permite clasificar a los microorganismos MAC en 28 serotipos.
En la actualidad se dispone de mtodos ms sofisticados para la tipificacin que estn orientados a dianas de la
pared celular, como el enzimoinmunoensayo con anticuerpos monoclonales para los principales serotipos, y la
cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Los serotipos 1 a 6, 8 a 11, y 21, se consideran actualmente
como M. avium, y los serotipos 7, 12 a 20, y 25, como M. intracellulare. Sin embargo, no existe acuerdo respecto
a otros serotipos, y algunos aislamientos no pueden tiparse (9). Normalmente, la tuberculosis en aves est
causada por M. avium de los tipos 1, 2 o 3. Si se encuentra uno de estos, puede suponerse que es la causa de la
enfermedad. En caso contrario, cuando an se sospecha que es la causa de la enfermedad, deben realizarse
pruebas adicionales de identificacin. No obstante, debe considerarse que las lesiones tuberculosas superficiales
en aves enjauladas, sobre todo en aves psitcidas, pueden estar causadas por M. tuberculosis. Por tanto, si se
aslan colonias de micobacterias rugosas de tales aves, deben probarse en cuanto a crecimiento a 42C. Si el
aislamiento no crece a 42C, debe sospecharse que se trata de M. tuberculosis.

Mtodos de identificacin de los cidos nucleicos

En la actualidad existen pruebas genticas especficas y fiables para la especificacin (22). A efectos de
distinguir entre M. avium y M. intracellulare, hay sondas comerciales para hibridacin con cidos nucleicos que

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constituyen una norma de oro. M. genavense tambin puede distinguirse con estas pruebas. Se ha desarrollado
otra sonda posterior que cubre todo el espectro MAC, ya que existen cepas MAC que no reaccionan con las
sondas especficas para M. avium y M. intracellulare (23). Estas pruebas utilizan una sonda de ADN de una
cadena que est marcada con quimioluminiscencia y que es complementaria del ARN ribosmico del
microorganismo diana. Los hbridos ADNARN se miden en un luminmetro. Se han descrito varios mtodos
moleculares caseros para identificar los cultivos de micobacterias, que incluyen a MAC. Un mtodo de PCR
mltiple para diferenciar el complejo de M. avium del complejo de M. intracellulare y del complejo de
M. tuberculosis tiene algunas ventajas. (4). Tambin puede utilizarse la secuenciacin del ARNr 16S (10) o la
amplificacin por PCR y a continuacin analizar mediante la hibridacin con sondas especficas de especie o
enzimas de restriccin (5, 24, 29). Aunque tericamente alguno de estos mtodos sirve para detectar
directamente el agente en las muestras de tejido, ninguno de ellos se ha validado para dicho uso. Por
consiguiente, la identificacin molecular de MAC se lleva a cabo en la actualidad con los microorganismos que se
han aislado previamente mediante cultivo. Tambin se ha considerado til la secuenciacin del hsp65 para
distinguir entre los subconjuntos de M. avium (30).
Con respecto al genotipo intraespecfico, una prueba muy sensible es la electroforesis en campo pulsante de
grandes fragmentos de restriccin de ADN (12). Adems, se han identificado algunos elementos de ADN mvil
que pueden explotarse con esta finalidad. La secuencia de insercin IS1245, que es prcticamente especfica de
M. avium, parece la ms adecuada para analizar la relacin entre cepas (2, 7). Recientemente se ha propuesto
un mtodo estandarizado que consiste en el anlisis del polimorfismo de fragmentos largos de restriccin de
ISI1245 (RFLP) (31). La infeccin de las aves est causada por un conjunto particular de cepas de M. avium
caracterizadas por modelos de RFLP especficos y muy conservados, con IS1245 e IS901, adems de los
serotipos 1, 2 o 3 (20).
OGrady et al. han llevado a cabo una investigacin reciente por RFLP utilizando sondas derivadas de IS901,
IS1245 e IS1311 para estudiar la epidemiologa molecular de infecciones por M. avium y M. intracellulare, a fin
de analizar el origen de la infeccin en humanos (14).
Si no se dispone de servicios especializados para tipificacin, se puede establecer que el microorganismo
aislado sea la causa de la enfermedad mediante pruebas de patogenicidad. Es preferible realizar estas pruebas
con la especie aviar investigada, pero, a falta de esta, se pueden utilizar aves de corral o codornices. Las aves
adultas jvenes son las mejores. Se prepara un inculo poniendo un trozo de papel de aluminio y bolas de cristal
en un recipiente con tapn de rosca, que se esteriliza y se pesa. Se coloca luego sobre el papel de aluminio un
asa de siembra del cultivo y se vuelve a pesar todo otra vez. Finalmente, se aade suficiente solucin salina
normal como para preparar una suspensin del cultivo de 0,1 mg/ml. A continuacin se inoculan las aves
intravenosamente con 1 ml de la suspensin. Si el microorganismo es virulento, las aves morirn en 5
6 semanas o, en dicho tiempo, tendrn lesiones extensas con bacilos cido-alcohol resistentes.

2.

Mtodos inmunolgicos

Las pruebas utilizadas en la exportacin dependen de los requisitos de importacin de cada pas. En general, la
prueba de la tuberculina o la prueba de la hemoaglutinacin (antgeno coloreado) se utilizan en la mayora de las
ocasiones para la exportacin de las aves de corral

a)

Prueba de la tuberculina
La prueba de la tuberculina es la de uso ms extendido en las aves de corral y la nica prueba para la que
existe un reactivo estndar internacional. La tuberculina es un derivado de la protena estndar aviar
purificada (PPD). Las aves se prueban por inoculacin intradrmica en la barbilla con 0,05 ml o 0,1 ml de
tuberculina (que contiene 2.000 Unidades Internacionales [UI]), utilizando para ello una aguja muy fina de
aproximadamente 10 mm 0,5 mm. El resultado se comprueba a las 48 horas, siendo la reaccin positiva
cuando se produce una inflamacin local, que puede variar desde un pequeo ndulo duro de unos 5 mm
de dimetro a un gran edema que se extiende a la otra barbilla y hacia abajo por el cuello. Con prctica, se
pueden inocular incluso las pequeas barbillas de aves inmaduras. Sin embargo, en aves inmaduras se
pueden usar las crestas, aunque los resultados no son tan fiables. La prueba de la tuberculina en el moco
(barbilla) de los pavos es mucho menos fiable que en las gallinas domsticas. Se ha recomendado como
ms eficaz la inoculacin en la membrana del ala, pero no es una zona tan buena como en las gallinas
domsticas. Tambin se ha probado la membrana del ala en otras aves, pero en general los resultados no
son satisfactorios. Se pueden usar las reas ornamentales desnudas de la piel en los patos Muscovy y de
algunas especies de faisanes, pero la fiabilidad es dudosa y la interpretacin difcil. Tambin se ha descrito
la prueba en la membrana interdigital de las aves acuticas, pero no resulta muy sensible y a menudo se
complica con las infecciones en el punto de la inoculacin.
En los faisanes la prueba de la tuberculina se puede realizar de dos maneras. En la primera, se inyectan
0,05 ml o 0,1 ml de la tuberculina en la piel del prpado inferior. Un resultado positivo se detecta como una
inflamacin marcada en el sitio de la inyeccin a las 48 horas. Alternativamente, se inyectan 0,25 ml de

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tuberculina en los msculos torcicos y se observan las aves durante 610 horas. Las aves infectadas
muestran sntomas de depresin y se mantienen apartadas, y pueden aparecer casos de muerte sbita. En
aves no infectadas, no se provocan sntomas clnicos.

b)

Prueba del antgeno coloreado

Preparacin del antgeno

Para la prueba rpida de aglutinacin de sangre ntegra se utiliza un antgeno coloreado con 1% de verde
malaquita (21). La cepa utilizada en la preparacin del antgeno coloreado debe ser lisa y no
autoaglutinable en suspensin salina. Debe presentar las caractersticas de la especie M. avium.
En vez de emplear el serotipo ms probable encontrado (en Europa, el serotipo 2 para aves de corral, y el
serotipo 1 para aves acuticas), se recomienda utilizar una cepa que detecte la infeccin con cualquier
serotipo. Puede ser preferible utilizar una cepa muy especfica para el serotipo que detecta. La
especificidad de las cepas solo se puede determinar probndolas como antgeno, aunque en general un
antgeno del serotipo 2 siempre detectar la infeccin por el serotipo 3 y viceversa. Las cepas del serotipo
1 parecen detectar un amplio espectro de infeccin ms a menudo, y con frecuencia detectarn tambin las
infecciones por micobacterias dependientes de mycobactina o infecciones por M. silvaticum. No hay motivo
para no utilizar un cultivo que contenga ms de una cepa de M. avium, con tal de que muestre las
propiedades deseadas de sensibilidad y especificidad. La repeticin de los resultados entre diferentes lotes
ser ms fcil utilizando cultivos puros.
El microorganismo debe crecer en un medio lquido apropiado, como el Middlebrook 7H9 que contenga 1%
de piruvato sdico para un mejor crecimiento. En aproximadamente 7 das debe obtenerse un buen
crecimiento. El cultivo lquido se utiliza como inculo para la preparacin de antgeno en masa.
El antgeno para las pruebas de aglutinacin crece preferiblemente en medio slido, como el de
LowensteinJensen o 7H11, con 1% de piruvato sdico en vez de glicerol, empleando frascos Roux o
botellas grandes. El empleo de medios slidos favorece la deteccin de cualquier contaminacin, y adems
los antgenos obtenidos de algunos medios lquidos no son aglutinados por el anticuerpo especfico. Los
cultivos lquidos de siembra deben diluirse (segn la experiencia) para dar colonias aisladas en medio
slido. Esto proporcionar un mayor rendimiento y, de nuevo, facilitar la deteccin de contaminantes.
Normalmente, son suficientes unos 10 ml de inculo para cubrir toda la superficie y suministrar la humedad
suficiente para mantener el aire del frasco con una humedad prxima al 100%.
Los frascos se incuban a 37C y en la mayora de las cepas se obtiene buen crecimiento despus de 14
21 das. El antgeno se recoge aadiendo perlas de vidrio estriles y el doble del volumen de solucin
salina normal (con 0,3% de formalina) que se utiliz para inocular la botella. A continuacin se agita
cuidadosamente el frasco para arrastrar todo el crecimiento, y el lavado se recoge en otra botella estril que
se vuelve a incubar a 37C durante 7 das. Los bacilos muertos se lavan dos veces en solucin salina
normal estril con 0,2% de formalina mediante centrifugacin y resuspensin. Esta secuencia es ms
segura que el mtodo original en el que el lavado se realizaba antes de la incubacin que inactiva los
microorganismos. Finalmente, los microorganismos se centrifugan de nuevo y se resuspenden en solucin
salina normal estril que contiene 0,2% de formalina y 0,4% de citrato sdico, hasta una concentracin de
10
10 bacterias por ml. Esto corresponde a una concentracin equivalente a diez veces la del tubo nmero 4
de la escala de McFarland.
Los cultivos para el antgeno deben examinarse diariamente durante los cinco primeros das de incubacin
a fin de detectar una posible contaminacin, La suspensin hecha con los lavados del cultivo se reexamina
tambin microscpicamente (para detectar la contaminacin por levaduras) y se vuelve a comprobar
mediante cultivo para confirmar que la formalina ha provocado la muerte de las micobacterias.

Validacin del antgeno

Los cultivos se deben someter a una tincin Gram para determinar la presencia de microorganismos
distintos a las micobacterias.
Se debe probar la eficacia de uno o ms lotes de antgeno aglutinante en aves con infeccin tuberculosa
natural o provocada mediante la comparacin con una preparacin estndar de potencia conocida. La
potencia relativa respecto a la preparacin estndar no debe diferir significativamente de la declarada en la
etiqueta. Cada frasco de antgeno debe probarse con un suero normal de pollo (para detectar
autoaglutinacin) y con un suero de pollo positivo frente a M. avium de alto y bajo contenido en anticuerpos.
Esto debe realizarse cuando sea posible, en paralelo con un lote previo de antgeno coloreado. Los frascos
que den reacciones de aglutinacin satisfactorias con los antisueros se juntan, y se tie el antgeno
aadiendo 3 ml de una solucin de verde malaquita al 1% por cada 100 ml de suspensin. Si es posible, el
antgeno coloreado debera ser probado de nuevo con sangre ntegra como se prob con suero el antgeno

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sin colorear. El antgeno aglutinante puede mantenerse por lo menos 6 meses a 4C en el refrigerador y
mucho ms tiempo si se congela a 20C o a una temperatura inferior. Si un lote no se utiliza durante
mucho tiempo, ha de ser comprobado de nuevo, especialmente para la autoaglutinacin.
La nica prueba de seguridad necesaria es la prueba de cultivo del antgeno sin lavar tras 7 das de
incubacin, para confirmar que todos los bacilos estn muertos.

Procedimiento de la prueba

La prueba de aglutinacin con antgeno coloreado se ha utilizado con muy buenos resultados,
especialmente en aves acuticas domsticas y ornamentales., Se mezcla una gota del antgeno (0,05
0,1 ml) con el mismo volumen de sangre ntegra fresca, obtenida por puncin de una vena. La mezcla se
agita suavemente durante 2 minutos en una placa de porcelana o con esmalte blanco y se observa la
aglutinacin. La aglutinacin puede ser gruesa, en cuyo caso es evidente, o muy fina, en cuyo caso puede
verse ms claramente como una acumulacin de antgeno teido con verde malaquita en el borde de la
gota, dejando el centro del color rojo normal de la sangre. Esta prueba es especialmente til para analizar
grandes poblaciones inmediatamente antes de su sacrificio, y por tanto tiene ventajas sobre la prueba de la
tuberculina para el control de la enfermedad, incluso en aves domsticas. Tambin se ha descrito que en
las aves domsticas es ms fiable que la prueba de la tuberculina.

Nota sobre limitaciones de uso


Ni la prueba de la tuberculina con la tuberculina aviar ni la prueba de la aglutinacin con antgeno coloreado
tienen valor en los casos de infeccin por M. tuberculosis de animales enjaulados.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO


No hay vacunas disponibles.
La tuberculina aviar es una preparacin con productos del crecimiento de M. avium desnaturalizados por el calor.
Se utiliza mediante una inyeccin intradrmica para revelar la hipersensibilidad retardada como medio para
identificar aves infectadas con la misma especie de bacilo tuberculoso, o sensibilizadas con l.
Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el captulo 1.1.8. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el captulo 1.1.8 son de carcter general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

1.

Control del inculo

a)

Caractersticas del inculo


Se deben identificar las cepas de M. avium que se utilizan para preparar los cultivos de inculo mediante las
pruebas adecuadas. Han de estar libres de microorganismos contaminantes y ser capaces de generar un
producto de calidad satisfactorio. Las cepas recomendadas por la Unin Europea (UE) son, por ejemplo, la
D4ER y la TB56. Tambin se puede tener como referencia la Organizacin Mundial de la Salud (32).

b)

Mtodo de cultivo
El material que se ha de inocular se mantiene como stock de cultivos liofilizados. Si los cultivos han crecido
en medios slidos, ser necesario adaptar el microorganismo para que crezca en cultivos lquidos. Esto se
realiza con facilidad incorporando un trozo de patata a los recipientes con medio lquido (por ejemplo, medio
de Watson Reid). Cuando el cultivo se ha adaptado al medio lquido, puede mantenerse mediante pases
cada 24 semanas (1, 8).
El substrato para el cultivo de produccin debe ser tal que origine un producto adaptado a los estndares
de la Farmacopea Europea u otros estndares internacionales (3). Debe de estar libre de ingredientes que
causen reacciones txicas o alrgicas.

c)

Validacin
Las cepas de M. avium utilizadas como cultivos de inculo deben estar libres de microorganismos
contaminantes.

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Captulo 2.3.6. Tuberculosis aviar

Los lotes de inculo deben ser eficaces para la produccin de tuberculina con potencia suficiente. Las
pruebas necesarias se describen ms adelante en la seccin C.4.

2.

Mtodo de produccin

La tuberculina aviar puede obtenerse por los tres mtodos siguientes.

a)

Tuberculina vieja
El microorganismo se cultiva en medio lquido con glicerol, se inactiva mediante su calentamiento con una
corriente de vapor y luego se filtra para eliminar las clulas. El filtrado se concentra por calor y se esteriliza
por filtracin.

b)

Tuberculina de medio sinttico concentrada por calor


Como en el caso de la tuberculina vieja pero el medio lquido con glicerol se sustituye por un medio sinttico
(medio sinttico de DorsetHenley modificado).

c)

Derivado de protena purificada.


La protena del filtrado se precipita qumicamente (utilizando sulfato amnico o cido tricloroactico [TCA])
como en el caso de la tuberculina de medio sinttico concentrada (HCSM) pero, en lugar de concentrarse
por calor, se lava y se resuspende. Se recomienda la tuberculina PPD porque produce menos reacciones
positivas falsas y puede estandarizarse de modo ms preciso. Se puede aadir un conservante
antimicrobiano que no origine reacciones positivas falsas, como el fenol (no ms de 0,5% [p/v]). No deben
usarse derivados mercuriales. Como estabilizador puede aadirse glicerol (no ms de 10% [p/v]) o glucosa
(2,2% [p/v]). El producto se distribuye aspticamente en recipientes estriles de vidrio neutro, que se sellan
para evitar la contaminacin. El producto puede liofilizarse.

3.

Control del proceso

Los recipientes de produccin, inoculados con cultivos de siembra adecuados, se incuban durante el tiempo
apropiado. Cualquier recipiente con contaminacin o con crecimiento anormal debe desecharse tras su
tratamiento en autoclave. A medida que progresa la incubacin, la superficie de crecimiento de muchos cultivos
puede humedecerse y hundirse en el medio o al fondo del recipiente. En las tuberculinas PPD, el pH del
precipitado disuelto (la llamada tuberculina concentrada) debe ser 6,66,7. El nivel de protena del concentrado
de PPD se determina por el mtodo de Kjeldahl. Normalmente se compara el nitrgeno total y el nitrgeno
precipitable por el cido tricloroactico.

4.

Control de los lotes

a)

Esterilidad
Por lo general, las pruebas de esterilidad se llevan a cabo siguiendo la Farmacopea Europea u otras
normas (vase tambin el captulo 1.1.9 Pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de
contaminacin de los productos biolgicos.

b)

Inocuidad
Puede examinarse la tuberculina PPD para comprobar que est libre de micobacterias vivas utilizando el
mtodo de cultivo descrito previamente. Este mtodo de cultivo, que no requiere el uso de animales, se
utiliza en muchos laboratorios y se recomienda su uso en lugar de utilizar animales para este propsito. El
siguiente es el mtodo descrito anteriormente en el que se utilizan animales experimentales, para evaluar la
seguridad de PPD. Se inyectan subcutneamente con 0,5 ml de la tuberculina problema dos cobayas, de
peso no menor a 250 g cada uno y que no hayan sido tratados previamente con ningn material que
interfiera con la prueba. No deben presentarse efectos anormales en 7 das.

c)

Infectividad residual
La prueba para detectar micobacterias vivas en la tuberculina puede realizarse con la tuberculina antes de
su distribucin en los recipientes finales o en las muestras tomadas de los mismos recipientes finales. Debe
tomarse una muestra de por lo menos 10 ml e inyectarse intraperitoneal o subcutneamente en un mnimo
de dos cobayas, dividiendo el volumen probado por igual entre los cobayas. Es preferible tomar una
muestra mayor, 50 ml, y concentrar cualquier bacteria residual por centrifugacin o por filtracin en
membrana. Los cobayas se observan durante un mnimo de 42 das y se examinan macroscpicamente
post mrtem. Cualquier lesin que se encuentre se analiza microscpicamente y por cultivo.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.6. Tuberculosis aviar

Cada recipiente lleno debe ser inspeccionado antes de su etiquetado, y el que muestre cualquier
anormalidad se desecha.

d)

Efecto de sensibilidad
Para probar este efecto, se inyectan intradrmicamente en tres ocasiones distintas cada uno de tres
cobayas no tratados previamente con ninguna sustancia que pueda interferir con la prueba, con el
equivalente a 500 UI de la preparacin problema en un volumen de 0,1 ml. Cada cobaya, junto con los tres
cobayas de control que no se han inyectado con anterioridad, se inoculan intradrmicamente con la misma
dosis de la misma tuberculina 21 das despus de la tercera inyeccin. Cuando se comprueban 24
28 horas ms tarde, las reacciones de los dos grupos de cobayas no deben ser diferentes.

e)

Potencia
La potencia de la tuberculina aviar se determina en cobayas sensibilizados con M. avium, mediante
comparacin con una preparacin estndar calibrada en UI.
Se requieren por lo menos nueve cobayas albinos, de 400600 g cada uno. Los cobayas se sensibilizan
administrando a cada uno una dosis adecuada de M. avium inactivado o vivo por inyeccin intramuscular
profunda. La prueba se realiza 46 semanas ms tarde del siguiente modo: Se afeitan los costados de los
cobayas para disponer de espacio para 34 inyecciones a cada costado. Se preparan por lo menos tres
diluciones de la tuberculina problema y otras tres diluciones de la preparacin estndar en tampn isotnico
que contenga 0,0005% (p/v) de polisorbato 80 (Tween 80). Las diluciones se escogen de tal modo que las
reacciones producidas muestren dimetros superiores a 8 mm e inferiores a 25 mm. Se distribuyen las
diluciones al azar en los sitios de inoculacin, siguiendo el diseo del cuadrado latino. Las diluciones se
inyectan intradrmicamente en volmenes de 0,1 o 0,2 ml.
Entre 2428 horas ms tarde, se miden los dimetros de las reacciones y se calculan los resultados por
mtodos estadsticos estndar, considerando que los dimetros son directamente proporcionales a los
logaritmos de las concentraciones de las tuberculinas. La potencia estimada no debe ser inferior al 75% ni
superior al 133% de la indicada en la etiqueta. La prueba no resulta vlida a menos que los lmites de error
(p = 0,95) sean superiores al 50% e inferiores al 200% de la potencia estimada. Si un lote no supera una
prueba de potencia, puede repetirse la prueba una o ms veces con tal de que la estimacin final de la
potencia y los lmites de error se basen en los resultados combinados de todas las pruebas.
Se recomienda que la tuberculina aviar contenga el equivalente a 25.000 UI/ml como mnimo, lo que para
uso prctico supone una dosis de 2.500 UI/ 0,1 ml.

f)

Especificidad
Utilizando un procedimiento similar al descrito en la seccin C.4.d., se pueden probar uno o ms lotes para
determinar la especificidad junto con una preparacin estndar de tuberculina bovina, a efectos de
comparar las reacciones producidas en cobayas sensibilizados frente a M. bovis. En cobayas sensibilizados
frente a M. bovis, la potencia de la preparacin de la tuberculina aviar no debe superar el 10% de la
potencia de la preparacin estndar de tuberculina bovina empleada en la prueba de potencia.

g)

Estabilidad
La tuberculina aviar lquida debe protegerse de la luz y mantenerse a una temperatura de 5C ( 3C)
durante la conservacin. Las preparaciones liofilizadas pueden mantenerse a temperaturas superiores
(pero sin superar los 25C) y protegidas de la luz. Durante su utilizacin, deben reducirse al mnimo los
perodos de exposicin a temperaturas ms elevadas o a la luz solar directa.
Con tal de que se mantengan a una temperatura entre 2C y 8C y estn protegidas de la luz, las
tuberculinas pueden utilizarse hasta el final de los siguientes perodos tras la ltima prueba satisfactoria de
potencia: tuberculinas PPD lquidas: 2 aos; tuberculinas PPD liofilizadas: 8 aos; tuberculinas HCSM
diluidas: 2 aos.

h)

Conservantes
Los conservantes antimicrobianos u otras sustancias que se puedan aadir a una tuberculina no deben
afectar la seguridad y eficacia del producto. La concentracin mxima permitida de fenol es 0,5% (p/v) y de
glicerol es 10% (v/v). El pH debe estar entre 6,5 y 7,5.

i)

Precauciones (riesgos)
En experiencias en humanos y en animales se ha observado que la tuberculina convenientemente diluida e
inyectada intradrmicamente origina una reaccin localizada en el sitio de la inyeccin sin manifestaciones

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.6. Tuberculosis aviar

generalizadas. Incluso en personas muy sensibles, las reacciones generalizadas graves son
extremadamente raras y limitadas.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad
Se debe llevar a cabo una prueba para confirmar la ausencia de propiedades txicas o irritantes segn las
especificaciones de la Farmacopea Europea (vase tambin la seccin C.4.b).

b)

Potencia
La potencia de las tuberculinas debe estimarse por mtodos biolgicos. Estos mtodos deben usarse para
tuberculinas HCSM y PPD, y se basan en la comparacin de las tuberculinas problema con tuberculinas
estndar (vase tambin la seccin C.4.d).

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*
* *
NOTA: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la tuberculosis aviar (vase el cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE:
www.oie.int)

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